检测结直肠癌多基因变异的引物、探针、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体地，涉及一种检测结直肠癌多基因变异的引物、探针、试剂盒及其应用。

背景技术

结直肠癌发生、发展是多个基因突变、多个步骤积累造成的。多个信号通路激活，特别是EGFR依赖的导RAS-RAF-MAPK和PI3K-PTEN-AKT下游信号传导通路，在调节细胞增殖、血管生成、细胞运动和细胞凋亡中起到重要作用。研究表明，在结直肠癌患者中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA的基因突变频率分别为20-50％、1-6％、 8-15％和10-30％。

临床研究发现，KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF突变的结直肠癌患者用抗EGFR抗体类药物治疗有效率偏低，2020年结直肠癌NCCN指南、中国结直肠癌诊疗规范(2020 年版)及CSCO结直肠癌诊疗指南2020版都推荐对临床确诊为复发或转移性结直肠癌病人进行KRAS、NRAS基因突变检测，以指导肿瘤靶向治疗。BRAF V600E突变状态的评估应在RAS检测时同步进行，以对预后进行分层，指导临床治疗。

目前用于基因检测的技术主要为PCR技术、ddPCR技术和NGS技术。ddPCR技术虽然具有敏感度高，精确度高、可绝对定量等优点，但通量低，操作要求高，技术有待普及，试剂盒研发不易，目前还未能在临床检测上推广应用。而NGS技术检测周期长，成本高，且不仅需要专业的操作人员同时需配备专业的生物信息专业人员进行结果解读。PCR技术普及度高，适合医院广泛开展，简便快速，特异性好，是目前医疗市场主流的肿瘤基因突变检测产品。在目前获批靶向药物靶点有限的情况下，PCR 技术在一段时间内依然是主要技术。然而，目前仍然缺少能够满足临床需要的检测结直肠癌多基因的试剂盒。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在提供一种联合检测结直肠癌相关的多基因的变异情况检测的荧光PCR引物、探针、Blocker，以提高结直癌基因变异检测的灵敏度和特异性。为此，本发明采取的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种检测多基因变异的引物组合，所述多基因包括KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA，其中，用于检测KRAS基因变异的引物分别如SEQ ID No. 1～9、SEQ IDNo.12～16、SEQ ID No.18～20和SEQ ID No.23～26所示；用于检测NRAS 基因变异的引物如SEQ ID No.28～34、SEQ ID No.37～41、SEQ ID No.44～46和SEQ ID No.48～49所示；用于检测BRAF基因变异的引物如SEQ ID No.51～52所示；用于检测PIK3CA基因变异的引物如SEQ ID No.54～59和SEQ ID No.62～63所示。

在结直肠癌中，KRAS突变中95％为第12、13密码子突变，该突变不影响KRAS 蛋白与GDP和GTP的结合，但却降低了KRAS蛋白自身GTP酶活性，使其水解GTP 的速率大为降低，不断激活靶分子，从而使KRAS蛋白维持于活化状态，引起信号传导的持续效应，导致细胞大量增殖，从而发生恶性转化。NRAS基因编码的蛋白可将来自细胞外的信号传导至细胞核内，这些信号可指示细胞生长和增殖、分化。NRAS 基因突变导致N-Ras蛋白处于持续激活状态，导致细胞增殖失控，进而形成肿瘤。

BRAF是一类丝氨酸-苏氨酸激酶，位于EGFR下游，是EGFR信号通路的重要转导因子。在结直肠癌中，最常见的是V600E突变，该突变造成BRAF激酶活性比野生型增强130-700倍，从而导致信号通路自发持续异常激活，从而参与结直肠癌细胞的发生发展及对EGFR单抗耐药。此外，在其他肿瘤类型中也会发生BRAF基因突变，黑色素瘤40％-60％，甲状腺癌10％-70％(取决于组织学分类)，非小细胞结直肠癌 3％-5％。

PIK3CA基因编码的p110α蛋白为PI3K酶的其中一个催化亚基，参与PI3K-AKT 信号通路。PIK3CA基因突变会引起PI3K酶处于持续激活状态，增强细胞内信号的传导，导致信号通路紊乱，引起癌症、神经病变、自身免疫等一系列疾病。PIK3CA80％的突变发生在螺旋区和激酶区。目前有研究证实PIK3CA突变在不同实体肿瘤中均有发生，其中频率最高的主要有结直肠癌(鳞癌3.9％，腺癌2.7％)、结直肠癌(10％-30％) 和乳腺癌(约30％)。在结直肠癌中往往与KRAS、NRAS、BRAF发生交叉突变。在结直肠癌中，既往发表的meta分析显示PIK3CA的患者相对于野生型的患者化疗客观有效率明显降低。PIK3CA突变的结直肠癌患者使用阿司匹林能够显著延长总生存时间，而野生型患者无收益。在乳腺癌中，PI3K与某些单抗类药物的作用途径相关，因此PIK3CA突变可能导致其他药物耐药。

本发明第二方面提供本用于靶向本发明第一方面所述引物组合扩增产物的探针组合，其中，靶向用于检测KRAS基因变异的引物的扩增产物的探针分别如SEQ ID No. 10、SEQ ID No.17、SEQ ID No.21和SEQ ID No.27所示；靶向用于检测NRAS基因变异的引物的扩增产物的探针如SEQ ID No.35、SEQ ID No.42、SEQ ID No.47和SEQ ID No.50所示；靶向用于检测BRAF基因变异的引物的扩增产物的探针如SEQ ID No. 53所示；靶向用于检测PIK3CA基因变异的引物的扩增产物的探针分别如SEQ ID No. 60和SEQ ID No.64所示。

本发明第三方面提供一种联合检测多基因变异的试剂盒，包括本发明第一方面所述的引物组合和本发明第二方面所述的探针组合。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括阻滞所述多基因中的至少一种的野生型基因扩增的Blocker引物组合。在本发明中，所述阻滞野生型基因扩增是指阻滞相应区域的基因片段的扩增。

在本发明的一些具体实施方案中，用于阻滞野生型KRAS基因扩增的Blocker引物分别如SEQ ID No.11和SEQ ID No.22所示；用于阻滞野生型NRAS基因扩增的 Blocker引物分别如SEQ ID No.36和SEQ ID No.43所示；用于阻滞野生型PIK3CA 基因扩增的Blocker引物分别如SEQ ID No.61所示。在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测内参基因ACTB的引物和探针，用于检测内参基因ACTB的引物分别如SEQ ID No.66和SEQ IDNo.68所示，相应的探针如SEQ ID No.67所示。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和/或PCR扩增缓冲液。

本发明第四方面提供本发明第一方面所述的引物和本发明第二方面所述的探针在制备用于诊断或预测结直肠癌的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒阻滞所述多基因中的至少一种的野生型基因扩增的Blocker引物组合。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒基于以下步骤诊断或预测结直肠癌：

S1，获得待测生物样本的DNA和RNA样本；

S2，利用所述试剂盒对待测生物样本的DNA和RNA样本进行检测，获得探针的荧光信号；

S3，根据探针荧光信号判断所述待测生物样本是否存在相应的基因变异。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明建立了可以一次性检测结直肠癌4种基因的四重荧光PCR体系，包括KRAS基因17种突变、NRAS基因13种突变和BRAF V600E基因突变和PIK3CA 基因7种突变；覆盖了2021年NCCN指南建议的传统及新兴检测靶点基因。根据各靶基因的突变/融合频率，本试剂盒检测的位点可以覆盖约80％以上的结直肠癌患者，可以为临床医生对肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。

(2)本发明的试剂盒检测样本类型不局限于石蜡包埋组织，新鲜病理组织、石蜡包埋组织或石蜡切片、全血、血液、血浆胸腔积液、脑脊液均能检测；所需样本量少，使用多重荧光PCR技术进行检测，含有内控系统，能更加准确、稳定地对样本进行检测，确保结果真实可信；检测周期短，2个小时就能完成检测。

(3)本发明采用了特异性引物、探针、blocker及高效率酶系，可以特异性地检出基因突变。根据位点的检测难易程度；引物之间的相互影响、竞争；探针序列相互影响竞争、信号之间的干扰、荧光PCR仪检测通路敏感性、干扰限制等多方面综合因素，将68条DNA序列(包括引物、探针和blocker)组合优化进5个反应体系。具体优点表现为：①各反应体系内引物、探针、blocker之间不会相互干扰，确保目标检测位点能特异、有效扩增；②采用兼并引物、探针设计，能同一反应体系内检测位点对应的检测引物探针数少于理论数(理论上一个位点对应2条引物1条探针，N个位点对应2N条引物N条探针)，降低试剂成本增加单个反应内检测位点数量；③采用5 个反应体系检测4个基因，每个体系内含有内参基因，对样本DNA质量及操作本身进行质控；④每个位点检测扩增子均小于120bp，能有效避免因FFPE样本中DNA易交联断裂、血液游离DNA(ctDNA)片段小造成的漏检。

附图说明

图1示出了本发明实施例1针对KRAS G12C组合1的引物探针的检测结果。

图2示出了本发明实施例1针对KRAS G12C组合2的引物探针的检测结果。

图3示出了本发明实施例1针对KRAS G12C组合3的引物探针的检测结果。

图4示出了本发明实施例1针对BRAF V600E组合1的引物探针的检测结果。

图5示出了本发明实施例1针对BRAF V600E组合2的引物探针的检测结果。

图6示出了本发明实施例1针对BRAF V600E组合3的引物探针的检测结果。

图7示出了本发明实施例1针对PIK3CA E542K组合1的引物探针的检测结果。

图8示出了本发明实施例1针对PIK3CA E542K组合2的引物探针的检测结果。

图9示出了本发明实施例1针对PIK3CA E542K组合3的引物探针的检测结果。

图10示出了本发明实施例2针对PIK3CA E542K未加入Blocker检测结果。

图11示出了本发明实施例2针对PIK3CA E542K加入PIK-E542KB1的检测结果。

图12示出了本发明实施例2针对PIK3CA E542K加入PIK-E542KB2的检测结果。

图13示出了本发明实施例2针对PIK3CA E542K加入PIK-E542KB3的检测结果。

图14示出了本发明实施例3针对KRAS Q61H的检测结果。

图15示出了本发明实施例3针对KRAS Q61K的检测结果。

图16示出了本发明实施例3针对KRAS Q61R的检测结果。

图17示出了本发明实施例3针对KRAS Q61L的检测结果。

图18示出了本发明实施例3针对PIK3CA H1047R的检测结果。

图19示出了本发明实施例3针对PIK3CA H1047L的检测结果。

图20示出了本发明实施例3针对NRAS A146T的检测结果。

图21示出了本发明实施例5针对样本1检测结果(KRAS Exon2突变)。

图22示出了本发明实施例5针对样本4检测结果(KRAS Exon2、PIK3CA Exon21 突变)。

图23示出了本发明实施例5针对样本21检测结果(KRAS G12C突变)。

图24示出了本发明实施例5针对样本31检测结果(KRAS Exon3突变)。

图25示出了本发明实施例5针对样本40检测结果(PIK3CA Exon9突变)。

图26示出了本发明实施例5针对样本41检测结果(KRAS Exon2、BRAF V600E 突变)。

图27示出了本发明实施例5针对样本50检测结果(KRAS Exon4突变)。

图28示出了本发明实施例5针对样本67检测结果(KRAS Exon4、NRAS Exon3 突变)。

图29示出了本发明实施例5针对阴性临床样本检测结果。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1不同引物探针组合对基因检测结果的影响

本实施例以基因突变位点KRAS G12C、BRAF V600E、PIK3CA E542K突变为例，说明不同的引物探针组合进行基因检测的结果的影响。

(1)根据目的基因突变信息选择合适的扩增子，并设计不同的引物、探针对，并根据筛选结果增加设计Blocker。具体的引物探针序列如表1所示：

表1引物、探针序列

(2)细胞系DNA/RNA处理

细胞系DNA/RNA(购自菁良基因科技(深圳)有限公司)经分光光度计进行浓度、纯度测定，分别以TE稀释成DNA 2ng/μL，RNA稀释成200ng/μL。配制成检测限参考品(1％)；特异性参考品(WT 10ng)。

(3)反应体系制备

按表2所示进行反应体系制备：

表2反应体系

计算并配制反应混合液，将配制好的反应混合液分别分装到八联PCR反应管或 96孔反应板。

分别将检测限参考品、特异性参考品、阳性对照品、阴性对照品加入到对应PCR 反应管中。进行多重荧光定量PCR检测，荧光PCR扩增程序为：

52℃10分钟；95℃1分钟；95℃10秒，60℃30秒(收集FAM、VIC/HEX、CY5、 ROX荧光信号)，45个循环。

(4)检测结果分析

比较不同引物探针组合的扩增效率及特异性，对于检测限参考品，Ct值越小说明该引物探针组合扩增效率越高；对于特异性参考品，无扩增或Ct值越大说明该引物探针组合特异性越高。

对KRAS G12C的检测结果如图1～图3所示。由图1可知，利用组1的引物和探针进行检测，对于检测限参考品，呈现典型的扩增曲线，Ct值为33.06，扩增效率高；对于特异性参考品，呈现无扩增，表明组1的引物和探针检测特异性非常高。由图2 和图3可知，利用组2或组3的引物和探针进行检测，检测限参考品和特异性参考品均有典型的扩增曲线，表明组2和组3的引物和探针检测的特异性均不理想。因此，选择组1的引物和探针对KRAS G12C进行检测。

对BRAF V600E的检测结果如图4～图6所示。由图4可知，利用组1的引物和探针进行检测，对于检测限参考品，呈现典型的扩增曲线，Ct值为32.54，扩增效率高；对于特异性参考品，呈现无扩增，表明组1的引物和探针检测特异性非常高。由图5 和图6可知，利用组2的引物和探针进行检测，检测限参考品Ct值较高，且与特异性参考品的Ct值比较接近，利用组3的引物和探针进行检测，检测限参考品Ct值略高，扩增效果较好，但特异性参考品也有扩增，表明组2和组3的引物和探针检测的灵敏度和特异性均不理想。因此，选择组1的引物和探针对BRAF V600E进行检测。

对PIK3CA E542K的检测结果如图7～图9所示。由图7可知，利用组1的引物和探针进行检测，对于检测限参考品，呈现典型的扩增曲线，Ct值为30.67；对于特异性参考品，Ct值为36.83，两者Ct值相差最大，表明组1的扩增的灵敏性和特异性均较高。由图8可知，利用组2的引物和探针进行检测，对于检测限参考品，呈现典型的扩增曲线，Ct值为29.77；对于特异性参考品，Ct值为30.92，两者Ct值相差相对不大，表明组2的扩增的灵敏性和特异性一般。由图9可知，利用组3的引物和探针进行检测，检测限参考品和特异性参考品的Ct值比较接近，表明组3的引物和探针检测的特异性均不理想。因此，选择组1的引物和探针对PIK3CAE542K进行检测。

实施例2增加Blocker引物对基因检测特异性的影响

本实施例以基因突变检测位点PIK3CA E542K检测为例，设计Blocker引物进行基因检测，以期获得合适的Blocker，在提高特异性的同时对灵敏度影响较小。

(1)根据引物探针组合检测结果，结合突变位点及扩增子具体序列特征设计Blocker，具体选择的引物、探针及设计的Blocker引物序列如表3所示：

表3引物、探针、Blocker序列

(2)细胞系DNA/RNA处理

商业化细胞系DNA/RNA(购自菁良基因科技(深圳)有限公司)经分光光度计进行浓度、纯度测定，分别以TE稀释成DNA 2ng/μL。配制成检测限参考品(1％)；特异性参考品(WT10ng)。

(3)反应体系制备

按表4所示进行反应体系制备：

表4反应体系

反应条件同实施例1。

(4)检测结果分析

比较不同Blocker的阻滞效果，检测限参考品Ct值越小、特异性参考品Ct值越大表明Blocker“阻滞”效果越好。

对PIK3CA E542K的检测结果如图10～图13所示。由图10可知，未加入Blocker 时，阴性模板仍有扩增。由图11～图13可知，加入不同的Blocker时，对阴性模板扩增的“阻滞”效果不同，加入PIK-E542KB1时，阻断效果最佳，阴性模板没有扩增，阳性模板的Ct值没有变化，表明PIK-E542KB1提高了引物的特异性并且对灵敏性没有影响。而加入PIK-E542KB2和PIK-E542KB3时，阳性模板Ct值变大，检测灵敏度降低，其中PIK-E542KB3对灵敏度的影响最大。由此可见，针对PIK3CA E542K的检测，加入Blocker1效果最好。

针对其他突变位点，依次筛选出效果最好的Blocker。

实施例3引物、探针、Blocker对检测效果的影响

本实施例以基因突变检测位点KRAS Q61H、KRAS Q61K、KRAS Q61R、KRAS Q61L、NRAS A146T、PIK3CA H1047R、PIK3CA H1047L为例，说明设计的引物、探针和Blocker组合需要经过不断多位点整合优化，形成多重荧光PCR体系后才能稳定高效特异检测上述基因。

(1)根据目标基因序列设计特异性引物、探针、Blocker。具体引物、探针、Blocker如表5所示：

表5引物、探针、Blocker序列

(2)细胞系DNA/RNA处理

细胞系DNA/RNA经分光光度计进行浓度、纯度测定，分别以TE稀释成DNA 2ng/μL，RNA稀释成10ng/μL。

(3)反应体系制备

按表6所示进行反应体系制备：

表6反应体系

根据待检测样本数、1个阳性对照品和1个阴性对照品，计算并配制反应混合液，将配制好的反应混合液分别分装到八联PCR反应管或96孔反应板。

反应条件同实施例1。

(4)检测结果分析

1)基线和阈值设定：根据不同机型设定基线和阈值按体系进行分析，同时选择阳性对照管、样本检测管和阴性对照管，以阳性对照扩增曲线的拐点为阈值；基线选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点比最早出现指数扩增的样本Ct值减少1～2个循环。

2)阴性对照(NC)应无扩增曲线升起；阳性对照(PC)FAM、VIC/HEX、CY5 和ROX均有显著扩增曲线，且Ct值＜30；

3)样品的内参基因Ct值应控制在30之内，以用于评估反应体系中的DNA模板量。若内参基因Ct值大于30，说明加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量太少，需重新提取或增大DNA加入量再重复实验，若检测结果为阳性，则结果仍有效无需重新检测

4)根据FAM和HEX/VIC、CY5信号的Ct值进行结果判定

①如果检测样品在FAM和HEX/VIC、CY5通道无扩增曲线或Ct值≥40，ROX 通道有扩增曲线，且Ct≤30，可判样品为不含有相应的KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA 基因突变位点；

②如果检测样品在FAM或HEX/VIC或CY5通道Ct<值40，且曲线有明显的扩增曲线，△Ct值满足表7所示，则可判定对应DNA突变信息；

表7结果判定

△Ct值的计算：△Ct值＝目标Ct值-内参Ct值，目标Ct值指样本孔内突变信号(FAM、VIC/HEX、CY5)对应的Ct值)，内参Ct值指样本孔内内参对应(ROX) 的Ct值。

检测限评估：将细胞系DNA稀释后配制成1％1ng/μL，1％2ng/μL，1％10ng/μL 的检测限DNA参考品，以5μL/孔分别进行检测。

特异性评估：将野生型细胞系DNA稀释成10ng/μL的特异性DNA参考品，以5μL/ 孔分别进行检测。

结果如图14～图20所示。以上结果表明，本实施例的体系的荧光PCR方法灵敏度高、特异性好。

检测结果还表明，本发明的检测体系可以一次性准确检测结直肠癌多重基因，在5-50ng野生型基因组DNA背景下，对1％的突变DNA能准确检出；可以耐受50ng 野生型人类基因组DNA。

实施例4联合检测结直肠癌多基因的特异性引物、探针和Blocker组合

本实施例针对KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA突变位点设计特异性引物和探针，为了进一步提高检测的特异性，还针对部分位点设计了Blocker引物，针对的检测位点如表8所示。

表8检测位点信息

利用实施例1的方法分别设计特异性引物和探针并进行筛选，同时，为了进一步提高检测的特异性，还针对部分基因利用实施例2的设计了Blocker，同样进行选择和优化。最终得到特异性引物、探针、Blocker分别如表9所示。

表9特异性引物、探针、Blocker序列

将上述引物、探针和Blocker分装于不同的管中，用于制备试剂盒。本实施例中，将上述引物探针按表10所示进行分装：

表10试剂盒组分

利用上述试剂盒可以对结直肠癌样本进行多重荧光PCR检测。样本类型包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或石蜡切片、全血、血液、血浆胸腔积液、脑脊液等。样本 DNA、RNA定量后作为检测模板。

利用实施例3的方法对上述试剂的使用方法进行优化：

(1)反应混合液配制

具体各反应体系如表11所示：

表11反应体系

根据待检测样本数、1个阳性对照品和1个阴性对照品，计算并配制反应混合液，将配制好的反应混合液分别分装到八联PCR反应管或96孔反应板。

分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应PCR反应管中。

反应条件同实施例1。

(2)检测结果分析

基因突变检测结果的判断同实施例3。不同的检测体系的判断标准如图12所示。

表12结果判定

△Ct值的计算：△Ct值＝目标Ct值-内参Ct值，目标Ct值指样本孔内突变信号(FAM、VIC/HEX、CY5)对应的Ct值)，内参Ct值指样本孔内内参对应(ROX) 的Ct值。

实施例5实施例4的试剂盒和方法对临床样本的检测

本实施例采用本发明实施例4试剂盒和检测方法对结直肠癌患者FFPE组织样本进行一次多基因突变联合检测，方法如下：

(1)待测肿瘤样本DNA提取和样本DNA定量

70例结直肠癌肿瘤FFPE组织采用商业化试剂盒提取DNA，按照试剂盒说明书操作提取样本DNA，样本DNA提取后立即使用紫外分光光度计检测浓度与纯度，DNA 浓度不低于2ng/μL，A260/A280在1.8～2.1。将上述提取的DNA稀释至1～10ng/μL 用作结直肠癌基因检测模板。

(2)反应混合液配制

将试剂盒中所有组分平衡至室温融化，根据待检测样本数，计算并配制反应混合液(见表13)。

表13反应混合液配制表

将配制好的检测反应液涡旋振荡混匀，短暂离心。按照每个PCR反应管35μL的量分别将此混合液分装到每个PCR反应管中。

分别将待检样本DNA、RNA、阳性对照品D、阳性对照品R、和阴性对照品(NC) 按每个反应管5μL的量加入对应PCR管中。

(3)PCR扩增

PCR扩增程序同实施例1。

(4)结果分析

1)基线和阈值设定：根据不同机型设定基线和阈值按体系进行分析，同时选择阳性对照管、样本检测管和阴性对照管，以阳性对照扩增曲线的拐点为阈值；基线选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点比最早出现指数扩增的样本Ct值减少1-2个循环。

2)结果要判断同实施例4。

(5)检测结果

①70例临床样本的检测结果如表14所示。

表14检测结果

备注：“+”阳性，“-”阴性

部分检测结果如图21～图29所示。

②检测结果与数字PCR结果比较

利用实施例4的试剂盒对结直肠癌多基因进行检测的结果与数字PCR结果进行比较。结果如表15、表16所示。

表15基本结果

表16可靠性分析

检测结果表明，利用实施例4的试剂盒可一次性同时检测多个结直肠癌基因，检测方便快捷，准确性高，可满足结直肠癌基因的快速检测。该检测方法和数字PCR结果的符合率为100％。但是相对于数字PCR，本发明的试剂盒和方法检测通量大，检测周期短，成本低，适用于临床大规模检测。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。