一株耐铬唾液乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物分离技术领域，具体涉及一株耐铬唾液乳杆菌及其应用。

背景技术

唾液乳杆菌在自然界中广泛分布，具有快速生长和稳定的良好特性，易于分离和培养，对人类和动物无害，不污染环境。其代谢产物丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗应激能力，因此该细菌在农业、环境和发酵工业等许多领域发挥着越来越重要的作用。

唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius)为革兰阳性杆菌，无过氧化氢酶和氧化酶，能产生乳酸和细菌素。唾液乳杆菌是人类、畜禽和水产动物肠道中的常在菌群，通过与有害微生物竞争或表达有益物质，在宿主的营养代谢、生理和免疫过程中发挥重要的作用。当给予适当的施用量时，唾液乳杆菌可作为益生菌提高宿主的健康水平，如调节肠道微生物菌群、抗菌、刺激保护性免疫反应和使肠道适宜酸化等。唾液乳杆菌可作为提高畜禽生长性能、免疫功能和抗病能力的饲料添加剂。

铬在环境中主要以三价铬和六价铬的形态存在，铬被认为是地球上第二大严重污染环境的污染物。铬及其化合物在电镀、冶金、染料生产、金属加工、制革、肥料和印染等行业被广泛应用，在生产应用过程中可产生大量含铬废水和废渣，污染水体、大气及土壤。具有环境稳定性和不易降解等特征的铬还可能通过食物链的富集和放大作用对人体健康造成危害。

研究表明，消化系统对铬的吸收主要发生在小肠，其次是大肠。吸收的铬随后通过血液运输到身体的不同组织和器官(例如肝、肾、脾和肺)。然而，由于新陈代谢较慢，它可以在组织和器官中大量积累。早期调查表明，长期接触高浓度Cr(VI)可导致明显的胃肠道症状，并伴有体重减轻。此外，尸检发现胃粘膜出血和溃疡，提示胃肠道的形态和生理也受到严重影响。此外，相关研究还证实六价铬与器官衰竭、哮喘、鼻炎甚至癌症有关。铬在动物饲料中是一种有毒有害的成分，如果动物摄入铬含量超标，铬会在体内积蓄，损害畜禽的健康，然后通过食物链影响人的健康。

饲料中本身具有一定的本底铬含量。环境污染是饲料铬污染的重要来源。控制饲料中铬(Ⅵ)含量是保护畜禽健康的必要措施。为防范和降低铬对动物和人的危害和风险，有必要寻找到降低饲料铬(Ⅵ)对动物的危害方法。但目前铬(Ⅵ)中毒并无特效解毒药，为了降低饲料铬(Ⅵ)污染对家禽的危害，我们借鉴微生物在环境污染修复中的作用机制，在家禽肠道微生物中筛选对铬(Ⅵ)具有耐受和吸附能力的益生菌，通过在饲料中添加耐铬益生菌从而有效降低铬对家禽的毒性损伤以及在禽产品中的蓄积。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种耐六价铬唾液乳杆菌，耐铬唾液乳杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 20221599，该唾液乳杆菌可以在高浓度的铬(Ⅵ)环境生存，并对六价铬具有较强的吸附效果，可用于去除动物饲料中的六价铬元素。

本发明的第二个目的是提供一种如上述的耐铬唾液乳杆菌的分离方法。

本发明的第三个目的是提供上述的耐铬唾液乳杆菌在吸附铬污染基质中的应用。

本发明的第四个目的是提供上述的耐铬唾液乳杆菌在制备铬吸附剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种铬吸附剂，包括上述的耐铬唾液乳杆菌。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明耐铬唾液乳杆菌及其分离方法与应用采用的如下技术方案：

一种耐铬唾液乳杆菌，分类命名为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，2022年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M20221599，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。

优选的，所述耐铬唾液乳杆菌的16S rRNA如序列表SEQ ID NO.1所示。

一种耐铬唾液乳杆菌的分离方法，包括如下步骤：取散养健康鸡群新鲜鸡粪，加入无菌PBS溶液，震荡混匀，并离心取上清液，然后用无菌PBS溶液逐级稀释，并将逐级稀释液涂布在含铬的MRS固体培养基上，37℃厌氧培养24h后，挑取单菌落，继续接种在含铬(Ⅵ)的MRS固体培养基上，继续厌氧培养24h后，挑取单菌落，重复接种在含铬(Ⅵ)的MRS固体培养基上，培养24h后获得的单菌落为耐铬(Ⅵ)的唾液乳杆菌。

优选的，所述MRS固体培养基中的铬(Ⅵ)浓度为80mg/L。

上述的耐铬唾液乳杆菌在吸附铬污染基质中的应用。

优选的，在铬污染基质中加入耐铬唾液乳杆菌，所述的铬污染基质为动物饲料。

上述的耐铬唾液乳杆菌在制备铬吸附剂中的应用。

一种铬吸附剂，包括上述的耐铬唾液乳杆菌。

有益效果：本发明提供一种耐铬唾液乳杆菌，该唾液乳杆菌能够在高浓度的铬环境生存，并对铬具有较强的吸附效果，可用于去除动物饲料中的铬元素，该耐铬唾液乳杆菌来源于健康鸡粪便，通过含铬(Ⅵ)的MRS固体培养基培养筛选得到；将耐铬(Ⅵ)唾液乳杆菌制备成铬吸附剂，能够大规模的应用在动物饲料中，尤其在pH为3-5的条件下，具有较好的铬吸附率。

附图说明

图1为本发明培养的耐铬唾液乳杆菌的菌落形态图；

图2为实施例1中分离的耐铬唾液乳杆菌的革兰氏染色结果图；

图3唾液乳杆菌生长曲线。

具体实施方式

下面是实施例对本发明方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例1

耐铬唾液乳杆菌的分离方法，包括如下步骤：

(1)取健康蛋鸡新鲜鸡粪1g于无菌15ml离心管中，然后加入无菌PBS溶液10ml，震荡30min；

(2)置于离心机中离心，离心机的转速为4000rpm，离心10min，取上清1ml于新的15ml离心管中；

(3)并用无菌PBS逐级稀释至10

(4)将步骤(3)中挑去的单菌落一继续接种在含Cr(Ⅵ)80mg/L的MRS固体培养基上，继续培养24h后，挑取单菌落二；

(5)将步骤(4)中挑取的单菌落二重复接种在含Cr(Ⅵ)80mg/L的MRS固体培养基上，培养24h后获得的单菌落为耐Cr(Ⅵ)80mg/L的唾液乳杆菌。

将步骤(5)中分离的唾液乳杆菌应用于动物饲料中吸附铬，也可以用于制成铬吸附剂。

鉴定：

1、革兰氏染色

挑一个实施例1中分离到的耐铬唾液乳杆菌单菌落于10μL无菌PBS溶液中混匀，涂布在无菌载玻片上，快速在火焰上固定，冷却后，按照革兰氏染色步骤操作，在显微镜下用油镜观察，菌体为杆状，蓝紫色，两端浓染，单在或成串。确定为革兰氏阳性杆菌，如图2所示。

2、16S rRNA生物学鉴定

上述实施例1中分离到的耐铬唾液乳杆菌经MRS液体培养基37℃震荡培养24h后，取2mL培养液，按照天根细菌DNA提取试剂盒(No：W9125)的要求，提取菌株DNA；并利用细菌16S rRNA基因通用引物PCR扩增菌株16S rRNA基因，上游引物序列为27F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；下游引物序列为1492R：5＇-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3＇；产物大小为1451；PCR扩增程序为：95℃:1min，95℃:30s，52℃:30s，72℃：2min，重复35个循环；4℃保存。

取5μL PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳，剩余PCR产物送生物技术公司测序，测序得到的基因序列如SEQ ID NO.1所示。将测序得到的基因序列与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)比对，确定乳酸菌种属。

测序结果如序列表(SEQ ID NO.1)所示：根据革兰氏染色和16S rRNA生物学鉴定，确定本发明实施例1中分离的菌株为唾液乳杆菌。

3生长曲线测定

将菌株活化24h后按照3％的接种量接种到MRS液体培养基中，设置3个平行，37℃下培养，每隔2h，使用紫外分光光度计在600nm处测定OD600值。根据测定结果的平均值绘制耐铬唾液乳杆菌的生长曲线图。结果见图3，前12h，菌株生长缓慢，12h后进入对数期，并与18h达到最大值。18-36h菌株稳定生长，36h以后OD

实施例2(最大铬耐受量)

将实施例1得到的耐铬(Ⅵ)唾液乳杆菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基中培养24h，调吸光度为1(OD600)，逐级稀释至10

实施例3(对溶液中铬离子的吸附性)

将实施例1得到的唾液乳杆菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基震荡培养24h后，以10000r/min转速离心10分钟，去上清，超纯水清洗沉淀后，调吸光度为1(OD600)，取0.5mL溶液仍以10000r/min转速，离心10分钟，去上清，在沉淀物质中分别加入0.5mL pH为3.0、4.0、5.0和6.0的50mg/L铬溶液悬浮沉淀，37℃，中速震荡2h后，10000r/min转速，离心10分钟，取上清液，经适当倍数稀释后，用石墨炉法测定溶液中的铬含量。利用公式(1)计算唾液乳杆菌铬吸附率。

公式(1)如下：

吸附率(％)＝100％-(C

其中，C

结果见下表1

表1本发明实施例1分离得到的唾液乳杆菌对铬溶液的吸附率

根据上表1的结果显示，pH值对菌株吸附铬(Ⅵ)的影响较大。在pH值为2～5时，唾液乳杆菌对50mg/L铬溶液铬的吸附率逐渐升高，pH为5.0时，铬吸附率接近35％。随着pH值再次升高，铬的吸附率下降，pH为6.0时铬吸附率18.8％。

实施例4(抑菌性质)

将实施例1得到的耐铬唾液乳杆菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基中培养24h，调吸光度为1(OD600)，取1mL MRS培养液于无菌管中，将6mm的无菌滤纸片分别浸入MRS培养液中。调节金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌吸光度为0.08-0.1(OD600)，分别取50μL金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌均匀涂满MRS培养基，将滤纸片分别铺在细菌培养板上，金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌37℃培养24h后观察结果，确定唾液乳杆菌的抑菌性质。

结果显示下表2

表2本发明实施例1分离得到的唾液乳杆菌抑菌试验结果

根据上表2的结果显示：该唾液乳杆菌可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的生长。

实施例5(胆盐耐受性)

将实施例1得到的耐铬唾液乳杆菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基中培养18h，调吸光度为1(OD600)，逐级稀释至10

结果显示，该唾液乳杆菌可耐受0.5％的胆盐。

综上，本发明实施例1分离的唾液乳杆菌最大耐受铬(Ⅵ)浓度为1280mg/L，对50mg/L铬溶液(pH＝5)铬吸附率大于30％，且能耐受0.5％的胆盐，可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的生长。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请。