一种紫芝总三萜及其制备方法

技术领域

本发明涉及药材提取技术领域，尤其涉及一种紫芝总三萜及其制备方法。

背景技术

紫灵芝(学名：Ganoderma sinense J.D.Zhao,L.W.Hsu&X.Q.Zhang)是灵芝科、灵芝属真菌，菌盖半圆形、近圆形或近匙形，表面紫褐色、紫黑色到近黑色；边缘薄或钝，常近似截形，与菌盖同色或较淡或呈淡黄褐色；菌肉呈均匀的褐色到深褐色；菌管褐色、深褐色或灰褐色。菌柄侧生、背侧生或偏生，圆柱形或略扁平。皮壳构造呈典型的拟子实层型，淡褐色到褐色。菌丝系统三体型。担孢子卵圆形，顶端脐突或稍平截，双层壁，外壁无色透明，平滑，内壁淡褐色，具明显小刺。

紫灵芝属于药食同源，有滋补强壮，健脑，消炎，抗缺氧和增加冠脉流量的作用，对提高机体免疫力、耐缺氧能力、抗疲劳、镇静有显著效果，临床上还能够治疗神经衰弱、气喘、冠心病等症。随着现代科学的深入研究，到目前为止，从紫芝中分离得到的化合物多达上百种，包括三萜类、多糖类、生物碱类、脂肪酸类等。其中，三萜类化合物具有显著的保肝、抗肿瘤、提高免疫力等多种功效，受到人们的亲睐。目前，三萜类化合物的提取通常采用溶剂提取、超声波提取，以及高压超临界CO

鉴于此，提供一种新的紫芝总三萜的提取方法，提高紫芝总三萜的收率以及活性，降低成本，成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种紫芝总三萜及其制备方法。本发明采用酶解处理和双水相萃取结合技术，对紫芝总三萜进行提取和纯化，提高了紫芝总三萜的提取率，更大程度的保留了紫芝总三萜的活性，提高了紫芝药材的利用率。同时减少大型仪器的使用，降低生产成本，更适合大规模生产制备。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种紫芝总三萜的制备方法，包括如下步骤：

(1)将紫芝子实体粉碎后与水混合，加入复合酶进行酶解，得到酶解液；

(2)将酶解液加热后，取酶解上清液；

(3)将酶解上清液与双水相体系混合，静置后离心，取上层溶液，经干燥，得到所述紫芝总三萜。

优选的，所述步骤(1)中紫芝子实体粉碎后的粒径为80～120目，所述紫芝子实体与水的质量体积比为1g：(15～30)ml。

优选的，所述复合酶包括中性蛋白酶和纤维素酶；所述中性蛋白酶的酶活为8～12万U/g；所述纤维素酶的酶活为4～6万U/g；所述中性蛋白酶的添加量为所述紫芝子实体质量的0.1～0.5％；所述纤维素酶的添加量为所述紫芝子实体质量的1～2％。

优选的，所述酶解的温度为30～40℃，所述酶解的时间为60～90min；所述酶解时的转速为150～300rpm。

优选的，所述酶解液加热至70～80℃，所述加热的时间为8～12min。

优选的，所述酶解上清液与双水相体系混合的过程为：在酶解上清液中加入磷酸氢二钾，搅拌溶解后，再加入无水乙醇。

优选的，所述磷酸氢二钾与所述酶解上清液的质量体积比为1g：(8～12)ml；所述无水乙醇与所述酶解上清液体积比为(0.5～2)：(0.5～2)。

优选的，所述静置的时间为15～25min；所述离心的转速为2000～3000rpm，时间为1～4min。

本发明还提供了一种上述制备方法得到的紫芝总三萜。

本发明提供了一种紫芝总三萜及其制备方法。本发明采用复合酶对紫芝子实体进行酶解破壁，达到使木质化的细胞壁松散的目的，有利于紫芝中的化合物从细胞壁内部释放出来。本发明利用三萜化合物更易溶于热溶剂的性质，直接将酶解液加热，灭活复合酶的同时使三萜化合物溶于溶剂中，通过离心去除不溶性杂质。最后，本发明采用双水相萃取系统，将三萜类化合物溶解于上层溶液中，去除溶剂后即可得到纯化的紫芝总三萜。采用本发明方法可以有效提取紫芝总三萜，提取率高，制备得到的紫芝总三萜活性高，提高了紫芝药材的利用率。本发明避免大型设备的使用，所用试剂均可从市面购得，成本低，收益高，更适合大规模生产。

具体实施方式

本发明提供了一种紫芝总三萜的制备方法，包括如下步骤：

(1)将紫芝子实体粉碎后与水混合，加入复合酶进行酶解，得到酶解液；

(2)将酶解液加热后，取酶解上清液；

(3)将酶解上清液与双水相体系混合，静置后离心，取上层溶液，经干燥，得到所述紫芝总三萜。

本发明将紫芝子实体粉碎后与水混合，加入复合酶进行酶解，得到酶解液。

在本发明中，所述紫芝子实体粉碎前，优选进行干燥处理。

在本发明中，所述紫芝子实体干燥的温度优选为60～75℃，进一步优选为70℃。

在本发明中，所述紫芝子实体干燥的时间优选为5～8h，进一步优选为6h。

在本发明中，所述紫芝子实体粉碎后的粒径优选为80～120目，进一步优选为100目。

在本发明中，所述紫芝子实体与水的质量体积比优选为1g：(15～30)ml，进一步优选为1g：25ml。

在本发明中，所述复合酶优选包括中性蛋白酶和纤维素酶。

在本发明中，所述中性蛋白酶的酶活优选为8～12万U/g，进一步优选为10万U/g。

在本发明中，所述纤维素酶的酶活优选为4～6万U/g，进一步优选为5万U/g。

在本发明中，所述中性蛋白酶的添加量优选为所述紫芝子实体质量的0.1～0.5％，进一步优选为0.3％。

在本发明中，所述纤维素酶的添加量优选为所述紫芝子实体质量的1～2％，进一步优选为1.5％。

在本发明中，所述酶解的温度优选为30～40℃，进一步优选为35℃。

在本发明中，所述酶解的时间优选为60～90min，进一步优选为80min。

在本发明中，所述酶解时的转速优选为150～300rpm，进一步优选为200rpm。

本发明将酶解液加热后，取酶解上清液。

在本发明中，所述酶解液优选加热至70～80℃，进一步优选加热至75℃。

在本发明中，所述加热的时间优选为8～12min，进一步优选为10min。

在本发明中，所述酶解液加热完成后，优选冷却至室温进行离心，取酶解上清液。

在本发明中，所述离心的转速优选为6000～10000rpm，进一步优选为8000rpm。

在本发明中，所述离心的时间优选为8～15min，进一步优选为10min。

本发明将酶解上清液与双水相体系混合，静置后离心，取上层溶液，经干燥，得到所述紫芝总三萜。

在本发明中，所述酶解上清液与双水相体系混合的过程优选为：在酶解上清液中加入磷酸氢二钾，搅拌溶解后，再加入无水乙醇。

在本发明中，所述磷酸氢二钾与所述酶解上清液的质量体积比优选为1g：(8～12)ml，进一步优选为1g：10ml。

在本发明中，所述无水乙醇与所述酶解上清液体积比优选为(0.5～2)：(0.5～2)，进一步优选为1：1。

在本发明中，所述静置的时间优选为15～25min，进一步优选为20min。

在本发明中，所述离心的转速优选为2000～3000rpm，进一步优选为2500rpm。

在本发明中，所述离心的时间优选为1～4min，进一步优选为3min。

在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥。

在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-80～-40℃，进一步优选为-80℃。

在本发明中，所述冷冻干燥的压力优选为20～30Pa，进一步优选为25Pa。

在本发明中，所述冷冻干燥的时间优选为16～24h，进一步优选为18h。

本发明还提供了一种上述制备方法得到的紫芝总三萜。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本发明提供了一种紫芝总三萜，具体制备过程如下：

将紫芝子实体在70℃下干燥6h，粉碎过100目筛，取筛下物4g与100ml的水混合，加入12mg的中性蛋白酶(10万U/g)和60mg的纤维素酶(5万U/g)，搅拌均匀后，于35℃下，以200rpm的转速搅拌80min，进行酶解。酶解结束后，将水温加热至75℃，保温10min，使酶失活，同时使三萜类化合物充分溶解于水中。冷却至室温后，以8000rpm离心10min取酶解上清液。

按照1g：10ml的比例，在酶解上清液中加入磷酸氢二钾，搅拌溶解后，加入与酶解上清液等体积的无水乙醇，搅拌均匀后静置20min，静置结束后，2500rpm离心3min使溶液分层，取上层溶液在真空度为25Pa、温度为-80℃下冷冻干燥18h，得到紫芝总三萜。

实施例2

本发明提供了一种紫芝总三萜，具体制备过程如下：

将紫芝子实体在70℃下干燥6h，粉碎过80目筛，取筛下物6g与90ml的水混合，加入30mg的中性蛋白酶(10万U/g)和120mg的纤维素酶(5万U/g)，搅拌均匀后，于30℃下，以200rpm的转速下搅拌90min，进行酶解。酶解结束后，将水温加热至80℃，保温8min，使酶失活，同时使三萜类化合物充分溶解于水中。冷却至室温后，以8000rpm离心10min取酶解上清液。

按照1g：8ml的比例，在酶解上清液中加入磷酸氢二钾，搅拌溶解后，加入与酶解上清液等体积的无水乙醇，搅拌均匀后静置25min，静置结束后，3000rpm离心4min使溶液分层，取上层溶液在真空度为25Pa、温度为-80℃下冷冻干燥18h，得到紫芝总三萜。

实施例3

本发明提供了一种紫芝总三萜，具体制备过程如下：

将紫芝子实体在70℃下干燥6h，粉碎过120目筛，取筛下物3g与90ml的水混合，加入3mg的中性蛋白酶(10万U/g)和30mg的纤维素酶(5万U/g)，搅拌均匀后，于40℃下，以200rpm的转速下搅拌60min，进行酶解。酶解结束后，将水温加热至70℃，保温12min，使酶失活，同时使三萜类化合物充分溶解于水中。冷却至室温后，以8000rpm离心10min取酶解上清液。

按照1g：12ml的比例，在酶解上清液中加入磷酸氢二钾，搅拌溶解后，加入与酶解上清液等体积的无水乙醇，搅拌均匀后静置15min，静置结束后，2000rpm离心3min使溶液分层，取上层溶液在真空度为25Pa、温度为-80℃下冷冻干燥18h，得到紫芝总三萜。

对比例1

将中性蛋白酶替换为果胶酶，其他参数和操作过程与实施例1相同。

对比例2

将中性蛋白酶替换为木瓜蛋白酶，其他参数和操作过程与实施例1相同。

对比例3

将磷酸氢二钾与酶解上清液的质量体积比调整为1g：5ml，其他参数和操作过程与实施例1相同。

对比例4

将磷酸氢二钾与酶解上清液的质量体积比调整为1g：15ml，其他参数和操作过程与实施例1相同。

对比例5

将无水乙醇替换为体积分数为60％的乙醇，其他参数和操作过程与实施例1相同。

对比例6

将无水乙醇替换为体积分数为75％的乙醇，其他参数和操作过程与实施例1相同。

试验例

根据《中国药典》2015年版一部中灵芝三萜含量的测定方法，分别测定实施例1～3以及对比例1～6的含量，测定结果如表1所示。

表1各组紫芝总三萜质量以及提取率

试验例2

检测实施例1～3以及对比例1～6制备的紫芝总三萜的抗氧化活性，具体检测过程如下：

取实施例1～3以及对比例1～6制备的紫芝总三萜样品，溶于蒸馏水，制成浓度为100μg/mL的样品溶液，备用，进行以下实验。

1.还原力的测定

分别在试管中加入0.5ml的上述样品溶液，2.5ml磷酸缓冲液(200mmol/L，pH＝6.6)，2.5ml的质量分数1％的铁氰化钾溶液，在50℃下孵育20min，冷却后加入2.5ml 10％的三氣乙酸溶液，并在2500rpm转速下离心10min，取上清液2.5ml，加入2.5ml蒸馏水，0.5mL0.5％FeCl

表2各组紫芝总三萜的还原力测定结果

2.过氧化氢清除能力的测定

分别在试管中加入0.4ml的上述样品溶液、3ml的磷酸缓冲液(pH＝7.4)，600μl100mmol/l的H

过氧化氢清除率(％)＝[A

式中：A

表3各组紫芝总三萜的过氧化氢清除率测定结果

3.DPPH自由基清除能力的测定

分别在试管中加入1ml的上述样品溶液、1mL 0.2mmol/l DPPH无水乙醇溶液，混匀，在常温下避光反应30min，在517nm波长处测定反应液的吸光度。按照以下公式计算DPPH自由基清除率，计算结果如表4所示。

DPPH自由基清除率(％)＝[(A

式中：A

表4各组紫芝总三萜的DPPH自由基清除率测定结果

从表1～4可以看出，实施例1～3制备的紫芝总三萜的提取率可达2.85％以上，还原力较强，对过氧化氢的清除率可达85％，对DPPH自由基清除率可达94％。而对比例1～6紫芝总三萜的提取率以及抗氧化活性均较实施例低。其中，对比例1采用果胶酶和纤维素酶组成的复合酶酶解处理，未能有效破坏紫芝子实体细胞壁，使得活性成分含量较少；对比例2采用木瓜蛋白酶酶和纤维素酶组成的复合酶酶解处理，有效破坏了紫芝子实体细胞壁，提取率较高，但活性受到了影响，导致DPPH自由基清除率较低；对比例3和4调整了双水相体系中磷酸氢二钾的质量浓度，改变了紫芝总三萜的溶解度，导致提取率降低；对比例5和6调整了乙醇的体积分数，也会改变紫芝总三萜的溶解度，从而导致提取率低。

综上，本发明提供的制备方法能够从紫芝子实体中充分提取紫芝总三萜，提取率高，并且可有效保留紫芝总三萜的活性，提高了紫芝药材的利用率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。