一种紫芝总三萜及其制备方法
文献发布时间:2023-06-19 19:28:50
技术领域
本发明涉及药材提取技术领域,尤其涉及一种紫芝总三萜及其制备方法。
背景技术
紫灵芝(学名:Ganoderma sinense J.D.Zhao,L.W.Hsu&X.Q.Zhang)是灵芝科、灵芝属真菌,菌盖半圆形、近圆形或近匙形,表面紫褐色、紫黑色到近黑色;边缘薄或钝,常近似截形,与菌盖同色或较淡或呈淡黄褐色;菌肉呈均匀的褐色到深褐色;菌管褐色、深褐色或灰褐色。菌柄侧生、背侧生或偏生,圆柱形或略扁平。皮壳构造呈典型的拟子实层型,淡褐色到褐色。菌丝系统三体型。担孢子卵圆形,顶端脐突或稍平截,双层壁,外壁无色透明,平滑,内壁淡褐色,具明显小刺。
紫灵芝属于药食同源,有滋补强壮,健脑,消炎,抗缺氧和增加冠脉流量的作用,对提高机体免疫力、耐缺氧能力、抗疲劳、镇静有显著效果,临床上还能够治疗神经衰弱、气喘、冠心病等症。随着现代科学的深入研究,到目前为止,从紫芝中分离得到的化合物多达上百种,包括三萜类、多糖类、生物碱类、脂肪酸类等。其中,三萜类化合物具有显著的保肝、抗肿瘤、提高免疫力等多种功效,受到人们的亲睐。目前,三萜类化合物的提取通常采用溶剂提取、超声波提取,以及高压超临界CO
鉴于此,提供一种新的紫芝总三萜的提取方法,提高紫芝总三萜的收率以及活性,降低成本,成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种紫芝总三萜及其制备方法。本发明采用酶解处理和双水相萃取结合技术,对紫芝总三萜进行提取和纯化,提高了紫芝总三萜的提取率,更大程度的保留了紫芝总三萜的活性,提高了紫芝药材的利用率。同时减少大型仪器的使用,降低生产成本,更适合大规模生产制备。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种紫芝总三萜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将紫芝子实体粉碎后与水混合,加入复合酶进行酶解,得到酶解液;
(2)将酶解液加热后,取酶解上清液;
(3)将酶解上清液与双水相体系混合,静置后离心,取上层溶液,经干燥,得到所述紫芝总三萜。
优选的,所述步骤(1)中紫芝子实体粉碎后的粒径为80~120目,所述紫芝子实体与水的质量体积比为1g:(15~30)ml。
优选的,所述复合酶包括中性蛋白酶和纤维素酶;所述中性蛋白酶的酶活为8~12万U/g;所述纤维素酶的酶活为4~6万U/g;所述中性蛋白酶的添加量为所述紫芝子实体质量的0.1~0.5%;所述纤维素酶的添加量为所述紫芝子实体质量的1~2%。
优选的,所述酶解的温度为30~40℃,所述酶解的时间为60~90min;所述酶解时的转速为150~300rpm。
优选的,所述酶解液加热至70~80℃,所述加热的时间为8~12min。
优选的,所述酶解上清液与双水相体系混合的过程为:在酶解上清液中加入磷酸氢二钾,搅拌溶解后,再加入无水乙醇。
优选的,所述磷酸氢二钾与所述酶解上清液的质量体积比为1g:(8~12)ml;所述无水乙醇与所述酶解上清液体积比为(0.5~2):(0.5~2)。
优选的,所述静置的时间为15~25min;所述离心的转速为2000~3000rpm,时间为1~4min。
本发明还提供了一种上述制备方法得到的紫芝总三萜。
本发明提供了一种紫芝总三萜及其制备方法。本发明采用复合酶对紫芝子实体进行酶解破壁,达到使木质化的细胞壁松散的目的,有利于紫芝中的化合物从细胞壁内部释放出来。本发明利用三萜化合物更易溶于热溶剂的性质,直接将酶解液加热,灭活复合酶的同时使三萜化合物溶于溶剂中,通过离心去除不溶性杂质。最后,本发明采用双水相萃取系统,将三萜类化合物溶解于上层溶液中,去除溶剂后即可得到纯化的紫芝总三萜。采用本发明方法可以有效提取紫芝总三萜,提取率高,制备得到的紫芝总三萜活性高,提高了紫芝药材的利用率。本发明避免大型设备的使用,所用试剂均可从市面购得,成本低,收益高,更适合大规模生产。
具体实施方式
本发明提供了一种紫芝总三萜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将紫芝子实体粉碎后与水混合,加入复合酶进行酶解,得到酶解液;
(2)将酶解液加热后,取酶解上清液;
(3)将酶解上清液与双水相体系混合,静置后离心,取上层溶液,经干燥,得到所述紫芝总三萜。
本发明将紫芝子实体粉碎后与水混合,加入复合酶进行酶解,得到酶解液。
在本发明中,所述紫芝子实体粉碎前,优选进行干燥处理。
在本发明中,所述紫芝子实体干燥的温度优选为60~75℃,进一步优选为70℃。
在本发明中,所述紫芝子实体干燥的时间优选为5~8h,进一步优选为6h。
在本发明中,所述紫芝子实体粉碎后的粒径优选为80~120目,进一步优选为100目。
在本发明中,所述紫芝子实体与水的质量体积比优选为1g:(15~30)ml,进一步优选为1g:25ml。
在本发明中,所述复合酶优选包括中性蛋白酶和纤维素酶。
在本发明中,所述中性蛋白酶的酶活优选为8~12万U/g,进一步优选为10万U/g。
在本发明中,所述纤维素酶的酶活优选为4~6万U/g,进一步优选为5万U/g。
在本发明中,所述中性蛋白酶的添加量优选为所述紫芝子实体质量的0.1~0.5%,进一步优选为0.3%。
在本发明中,所述纤维素酶的添加量优选为所述紫芝子实体质量的1~2%,进一步优选为1.5%。
在本发明中,所述酶解的温度优选为30~40℃,进一步优选为35℃。
在本发明中,所述酶解的时间优选为60~90min,进一步优选为80min。
在本发明中,所述酶解时的转速优选为150~300rpm,进一步优选为200rpm。
本发明将酶解液加热后,取酶解上清液。
在本发明中,所述酶解液优选加热至70~80℃,进一步优选加热至75℃。
在本发明中,所述加热的时间优选为8~12min,进一步优选为10min。
在本发明中,所述酶解液加热完成后,优选冷却至室温进行离心,取酶解上清液。
在本发明中,所述离心的转速优选为6000~10000rpm,进一步优选为8000rpm。
在本发明中,所述离心的时间优选为8~15min,进一步优选为10min。
本发明将酶解上清液与双水相体系混合,静置后离心,取上层溶液,经干燥,得到所述紫芝总三萜。
在本发明中,所述酶解上清液与双水相体系混合的过程优选为:在酶解上清液中加入磷酸氢二钾,搅拌溶解后,再加入无水乙醇。
在本发明中,所述磷酸氢二钾与所述酶解上清液的质量体积比优选为1g:(8~12)ml,进一步优选为1g:10ml。
在本发明中,所述无水乙醇与所述酶解上清液体积比优选为(0.5~2):(0.5~2),进一步优选为1:1。
在本发明中,所述静置的时间优选为15~25min,进一步优选为20min。
在本发明中,所述离心的转速优选为2000~3000rpm,进一步优选为2500rpm。
在本发明中,所述离心的时间优选为1~4min,进一步优选为3min。
在本发明中,所述干燥优选为冷冻干燥。
在本发明中,所述冷冻干燥的温度优选为-80~-40℃,进一步优选为-80℃。
在本发明中,所述冷冻干燥的压力优选为20~30Pa,进一步优选为25Pa。
在本发明中,所述冷冻干燥的时间优选为16~24h,进一步优选为18h。
本发明还提供了一种上述制备方法得到的紫芝总三萜。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本发明提供了一种紫芝总三萜,具体制备过程如下:
将紫芝子实体在70℃下干燥6h,粉碎过100目筛,取筛下物4g与100ml的水混合,加入12mg的中性蛋白酶(10万U/g)和60mg的纤维素酶(5万U/g),搅拌均匀后,于35℃下,以200rpm的转速搅拌80min,进行酶解。酶解结束后,将水温加热至75℃,保温10min,使酶失活,同时使三萜类化合物充分溶解于水中。冷却至室温后,以8000rpm离心10min取酶解上清液。
按照1g:10ml的比例,在酶解上清液中加入磷酸氢二钾,搅拌溶解后,加入与酶解上清液等体积的无水乙醇,搅拌均匀后静置20min,静置结束后,2500rpm离心3min使溶液分层,取上层溶液在真空度为25Pa、温度为-80℃下冷冻干燥18h,得到紫芝总三萜。
实施例2
本发明提供了一种紫芝总三萜,具体制备过程如下:
将紫芝子实体在70℃下干燥6h,粉碎过80目筛,取筛下物6g与90ml的水混合,加入30mg的中性蛋白酶(10万U/g)和120mg的纤维素酶(5万U/g),搅拌均匀后,于30℃下,以200rpm的转速下搅拌90min,进行酶解。酶解结束后,将水温加热至80℃,保温8min,使酶失活,同时使三萜类化合物充分溶解于水中。冷却至室温后,以8000rpm离心10min取酶解上清液。
按照1g:8ml的比例,在酶解上清液中加入磷酸氢二钾,搅拌溶解后,加入与酶解上清液等体积的无水乙醇,搅拌均匀后静置25min,静置结束后,3000rpm离心4min使溶液分层,取上层溶液在真空度为25Pa、温度为-80℃下冷冻干燥18h,得到紫芝总三萜。
实施例3
本发明提供了一种紫芝总三萜,具体制备过程如下:
将紫芝子实体在70℃下干燥6h,粉碎过120目筛,取筛下物3g与90ml的水混合,加入3mg的中性蛋白酶(10万U/g)和30mg的纤维素酶(5万U/g),搅拌均匀后,于40℃下,以200rpm的转速下搅拌60min,进行酶解。酶解结束后,将水温加热至70℃,保温12min,使酶失活,同时使三萜类化合物充分溶解于水中。冷却至室温后,以8000rpm离心10min取酶解上清液。
按照1g:12ml的比例,在酶解上清液中加入磷酸氢二钾,搅拌溶解后,加入与酶解上清液等体积的无水乙醇,搅拌均匀后静置15min,静置结束后,2000rpm离心3min使溶液分层,取上层溶液在真空度为25Pa、温度为-80℃下冷冻干燥18h,得到紫芝总三萜。
对比例1
将中性蛋白酶替换为果胶酶,其他参数和操作过程与实施例1相同。
对比例2
将中性蛋白酶替换为木瓜蛋白酶,其他参数和操作过程与实施例1相同。
对比例3
将磷酸氢二钾与酶解上清液的质量体积比调整为1g:5ml,其他参数和操作过程与实施例1相同。
对比例4
将磷酸氢二钾与酶解上清液的质量体积比调整为1g:15ml,其他参数和操作过程与实施例1相同。
对比例5
将无水乙醇替换为体积分数为60%的乙醇,其他参数和操作过程与实施例1相同。
对比例6
将无水乙醇替换为体积分数为75%的乙醇,其他参数和操作过程与实施例1相同。
试验例
根据《中国药典》2015年版一部中灵芝三萜含量的测定方法,分别测定实施例1~3以及对比例1~6的含量,测定结果如表1所示。
表1各组紫芝总三萜质量以及提取率
试验例2
检测实施例1~3以及对比例1~6制备的紫芝总三萜的抗氧化活性,具体检测过程如下:
取实施例1~3以及对比例1~6制备的紫芝总三萜样品,溶于蒸馏水,制成浓度为100μg/mL的样品溶液,备用,进行以下实验。
1.还原力的测定
分别在试管中加入0.5ml的上述样品溶液,2.5ml磷酸缓冲液(200mmol/L,pH=6.6),2.5ml的质量分数1%的铁氰化钾溶液,在50℃下孵育20min,冷却后加入2.5ml 10%的三氣乙酸溶液,并在2500rpm转速下离心10min,取上清液2.5ml,加入2.5ml蒸馏水,0.5mL0.5%FeCl
表2各组紫芝总三萜的还原力测定结果
2.过氧化氢清除能力的测定
分别在试管中加入0.4ml的上述样品溶液、3ml的磷酸缓冲液(pH=7.4),600μl100mmol/l的H
过氧化氢清除率(%)=[A
式中:A
表3各组紫芝总三萜的过氧化氢清除率测定结果
3.DPPH自由基清除能力的测定
分别在试管中加入1ml的上述样品溶液、1mL 0.2mmol/l DPPH无水乙醇溶液,混匀,在常温下避光反应30min,在517nm波长处测定反应液的吸光度。按照以下公式计算DPPH自由基清除率,计算结果如表4所示。
DPPH自由基清除率(%)=[(A
式中:A
表4各组紫芝总三萜的DPPH自由基清除率测定结果
从表1~4可以看出,实施例1~3制备的紫芝总三萜的提取率可达2.85%以上,还原力较强,对过氧化氢的清除率可达85%,对DPPH自由基清除率可达94%。而对比例1~6紫芝总三萜的提取率以及抗氧化活性均较实施例低。其中,对比例1采用果胶酶和纤维素酶组成的复合酶酶解处理,未能有效破坏紫芝子实体细胞壁,使得活性成分含量较少;对比例2采用木瓜蛋白酶酶和纤维素酶组成的复合酶酶解处理,有效破坏了紫芝子实体细胞壁,提取率较高,但活性受到了影响,导致DPPH自由基清除率较低;对比例3和4调整了双水相体系中磷酸氢二钾的质量浓度,改变了紫芝总三萜的溶解度,导致提取率降低;对比例5和6调整了乙醇的体积分数,也会改变紫芝总三萜的溶解度,从而导致提取率低。
综上,本发明提供的制备方法能够从紫芝子实体中充分提取紫芝总三萜,提取率高,并且可有效保留紫芝总三萜的活性,提高了紫芝药材的利用率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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