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基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法及其筛选的多核苷酸

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

技术领域

本公开属于生物信息学和生物工程技术领域，具体来说，本公开涉及一种多核苷酸在起始环状核酸分子的翻译中的用途，具有起始环状核酸分子的翻译活性的多核苷酸，包含多核苷酸的环状核酸分子、环化前体核酸分子、重组核酸分子、重组表达载体、重组宿主细胞及用途。

背景技术

信使核糖核酸(messenger Ribonucleic Acid，mRNA)是由DNA转录而来，并为下一步蛋白质的翻译提供所需的遗传信息。当编码抗原蛋白的mRNA被注射进人体后，能够在体内合成抗原蛋白，从而诱导强烈的细胞免疫与体液免疫反应，并表现出自身免疫佐剂的特点，是一种绝佳的疫苗手段。此外，mRNA作为疫苗或产生治疗性蛋白还存在其他诸多优势，例如，与DNA载体相比，mRNA在细胞内瞬时表达，不存在整合到基因组的风险，且不依赖于细胞周期，因而具有更高的安全性；与病毒载体相比，mRNA不存在载体本身带来的免疫抵抗，因此蛋白表达更容易实现；与重组蛋白、病毒等相比，mRNA的生产过程为无细胞体系，仅涉及体外的酶催化反应，因此生产过程更加简单，可控而且低成本。目前，mRNA作为疫苗，产生治疗性蛋白以及作为基因治疗的手段等展现出广泛的应用潜力。

目前在临床或临床前应用的mRNA主要为线性mRNA，线性mRNA的结构包括5’帽子结构(5’Cap)，3’多聚腺苷尾巴(PolyA tail)，5’非翻译序列(5’untranslational region，5’UTR)，3’非翻译序列(3’untranslational region，3’UTR)以及开放阅读框(Open readingframe，ORF)等。5’帽子结构是真核生物mRNA的基本特征，通过在mRNA 5’末端加入N7-甲基鸟苷而得。研究发现，5’帽子结构通过与翻译起始复合物eif4E结合而促进mRNA翻译，并能有效防止mRNA降解，降低mRNA的免疫源性。3’多聚腺苷尾巴的主要功能是通过与PolyA结合蛋白(PolyA binding protein，PABP)结合，后者与eiF4G及eiF4E相互作用，介导mRNA形成环形，并促进翻译进程，防止mRNA降解。5’及3’非翻译序列，例如采用beta-globin的5’及3’非翻译序列，能有效防止mRNA降解，并促进mRNA翻译成蛋白。

环状RNA(circular RNAs，circRNAs)是真核生物常见的一种RNA类型。天然存在的circRNAs主要是通过细胞内一种称之为“反向剪切”(back splicing)的分子机理产生。目前已发现真核生物circRNAs具有多种分子细胞调控功能。例如，环状RNA可通过结合微小RNA(microRNAs，miRNA)而调节靶标基因的表达；环状RNA可通过与靶蛋白直接结合进而调节基因表达等。目前已确认的环状RNA主要以非编码RNA发挥功能。然而，自然界也存在可编码蛋白的环状RNA，即环状mRNA。环状mRNA由于其环状属性，往往具有较长的半衰期，因此推测环状mRNA可能具有较好的稳定性。体外形成环状RNA的方法包括化学法，蛋白酶催化法以及核酶催化法等。

内部核糖体进入位点(IRES)是一种顺式作用的RNA序列，能够在不依赖5’端帽子结构的情况下，招募核糖体亚基到mRNA的翻译起始位点，介导病毒、某些真核生物等的翻译过程。环状RNA呈封闭环状结构，缺乏典型的翻译起始元件，但仍可通过IRES介导核糖体与mRNA结合来发挥翻译功能。与线性mRNA相比，环状mRNA分子的稳定性高，在蛋白表达、临床治疗中具有重要的应用前景。环状mRNA分子的蛋白表达水平受翻译起始元件的影响，因此，发现更多能够起始环状mRNA分子翻译的IRES元件，对于提高环状mRNA分子的蛋白表达水平，拓展其在临床及工业生产中的应用，具有重要意义。

目前，由于序列中IRES的确认、作用机制研究和结构研究主要依赖于实验验证，对于大量功能未知的序列进行IRES活性序列筛选需要消耗大量的时间和成本，因此，目前发现并得到了验证的IRES数量较少，限制了环状RNA分子在蛋白表达、临床治疗等方面的应用。

发明内容

发明要解决的问题

鉴于现有技术中存在的问题，例如，对包含IRES的序列筛选耗时久、成本高，导致目前已验证的IRES序列数量少，限制了环状mRNA分子在蛋白表达、临床治疗等方面的应用。为此，本公开提供一种基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，能够高效、快速地筛选包含IRES的待预测序列，且筛选结果准确，有利于新的IRES序列的发现。

在一些实施方式中，本公开提供了包含如(i)所示的任一核苷酸序列的多核苷酸，上述多核苷酸能够起始环状核酸分子的翻译过程，且IRES活性高，能够提高环状核酸分子的蛋白表达水平，为环状核酸分子的进一步应用提供了丰富的翻译起始元件。

用于解决问题的方案

第一方面，本公开提供了一种基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其包括如下步骤：

(1)选取n条含有IRES的序列作为样本序列；其中，n≥1且n为自然数；

(2)将所述样本序列和待预测序列分别进行One-Hot编码，分类变量为A、T、C、G；

(3)遍历所述样本序列，计算每条样本序列与所述待预测序列的莱文斯坦距离；

(4)计算所有样本序列与所述待预测序列的莱文斯坦距离的均值；

(5)基于所述均值判断待预测序列是否包含IRES。

在一些实施方式中，根据本公开所述的基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其中，所述步骤(5)中，如果均值不小于设置的预测阈值，则判断待预测序列包含IRES，否则判断待预测序列为不包含IRES。

在一些实施方式中，根据本公开所述的基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其中，所述预测阈值不小于0.5。

在一些实施方式中，根据本公开所述的基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其中，所述预测阈值为0.75。

在一些实施方式中，根据本公开所述的基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其中，所述方法还包括如下步骤：

如果待预测序列判断为包含IRES，则遍历样本序列，分别查找每条样本序列与待预测序列的最长公共子串。

在一些实施方式中，根据本公开所述的基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其中，所述方法还包括如下步骤：

预测判断为包含IRES的待预测序列的二级结构，并结合最长公共子串，判断IRES在待预测序列中存在的位置。

在一些实施方式中，根据本公开所述的基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其中，所述预测判断为包含IRES的待预测序列的二级结构包括：使用RNAfold、Mfold、RNAfoldweerver、Vienna RNA软件中的至少一种预测判断为包含IRES的待预测序列的二级结构。

在一些实施方式中，根据本公开所述的基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其中，使用RNAfold软件预测判断为包含IRES的待预测序列的二级结构。

在一些实施方式中，根据本公开所述的基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其中，所述方法还包括如下步骤：对判断为包含IRES的待预测序列进行实验验证，判断所述待预测序列的IRES活性。

在一些实施方式中，根据本公开所述的基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其中，所述实验验证的步骤包括：

使用判断为包含IRES的待预测序列构建环状核酸分子，所述环状核酸分子中，所述待预测序列与编码荧光蛋白的核苷酸序列可操作地连接；

获取所述环状核酸分子释放的荧光信号，根据所述荧光信号判断所述待预测序列的IRES活性。

第二方面，本公开提供了一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(i)-(iv)组成的组中的至少一项：

(i)包含如SEQ ID NO:1、2、3、4、9、10、11、13、14、15、17、18、19、20、25、26、27、28、41、42、45、46、51、56、59、72、79、91、98、101、104、106、107、110、115、116、117、118、119、122、123、125、127、129、130、135、139、165、179、180、183、186、188、198、200、215、216、217、218、219、220、221、222、223、225、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、239、240、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、272、273、274、275、276、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、289、291、293、294、296、298、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、314、315、317、318、319、321、322、323、324、326、329、331、332、333、334、335、336、348、385、387、389、392、393、394、395、406、436、438、439、441、445、457、460、496、504、507、509、511、514、534任一序列所示的核苷酸序列；

(ii)如(i)所示的任一核苷酸序列的突变体序列，所述突变体序列在对应根据(i)所示的任一核苷酸序列的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，且所述突变体序列具有起始环状核酸分子的翻译活性；

(iii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列的杂交序列反向互补，且具有起始环状核酸分子的翻译活性的核苷酸序列；

(iv)与(i)或(ii)任一项所示的核苷酸序列具有至少70％，可选至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％的序列同一性，且具有起始环状核酸分子的翻译活性的核苷酸序列；

优选地，所述多核苷酸包含如下任一序列所示的核苷酸序列：。

在一些实施方式中，根据本公开所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是根据权利要求1-9任一项所述的方法筛选的包含IRES的多核苷酸。

在一些实施方式中，根据本公开所述的多核苷酸在如下(a

第三方面，本公开提供了一种环状核酸分子，其中，所述环状核酸分子包含如第二方面所述的多核苷酸；

优选地，所述环状核酸分子还包含编码目标多肽的编码区，所述编码区与所述多核苷酸可操作地连接；

可选地，所述环状核酸分子还包含如下的一种或多种元件：5’间隔区、3’间隔区、第二外显子、第一外显子。

在一些实施方式中，本公开提供的环状核酸分子，所述5’间隔区包含如下(b

在一些实施方式中，本公开提供的环状核酸分子，所述3’间隔区包含如下(c

在一些实施方式中，本公开提供的环状核酸分子，所述第二外显子包含如下(d

在一些实施方式中，本公开提供的环状核酸分子，所述第一外显子包含如下(e

第四方面，本公开提供了一种环化前体核酸分子，其中，所述环化前体核酸分子环化形成如第三方面所述的环状核酸分子；

可选地，所述环化前体核酸分子还包含如下的一种或多种元件：

5’同源臂、3’内含子、第二外显子、5’间隔区、编码区、3’间隔区、第一外显子、5’内含子和3’同源臂。

在一些实施方式中，本公开提供的环化前体核酸分子，所述5’同源臂包含如下(g

在一些实施方式中，本公开提供的环化前体核酸分子，所述3’同源臂包含如下(h

在一些实施方式中，本公开提供的环化前体核酸分子，所述5’内含子包含如下(j

在一些实施方式中，本公开提供的环化前体核酸分子，所述3’内含子包含如下(k

第五方面，本公开提供了一种重组核酸分子，其中，所述重组核酸分子选自如下(f

第六方面，本公开提供了一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含如第五方面所述的重组核酸分子。

第七方面，本公开提供了一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含如第二方面所述的多核苷酸，如第三方面所述的环状核酸分子，如第四方面所述的环化前体核酸分子，如第五方面所述的重组核酸分子，或如第六方面所述的重组表达载体。

第八方面，本公开提供了一种制备具有提高的蛋白表达水平的环状核酸分子的方法，其中，所述方法包括将如第二方面所述的多核苷酸与所述环状核酸分子的编码区可操作地连接的步骤。

第九方面，本公开提供了如第三方面所述的环状核酸分子，如第四方面所述的环化前体核酸分子，如第五方面所述的重组核酸分子，或如第六方面所述的重组表达载体在如下(g

可选地，所述蛋白或多肽选自如下的一种或多种：抗原、抗体、抗原结合片段、通道蛋白、受体、细胞因子、免疫检查点抑制剂。

发明的效果

在一些实施方式中，本公开提供的基于莱文斯坦距离的筛选IRES的方法可高效准确地判断待预测序列中IRES是否存在，如果存在，还可以进一步通过预测待预测序列的二级结构并结合其与样本序列的最长公共子串来进一步预测和定位IRES的位置，筛选出序列中可能的IRES核心序列，为高活性的IRES筛选提供技术支持，有利于新的IRES序列的发现，以及有利于研究人员可以有选择性地对具有较高概率存在IRES序列的RNA序列进行实验验证，提高实验验证效率，节省无效的时间和成本。

在一些实施方式中，通过本公开提供的方法筛选得到如SEQ ID NO:1～548任一序列所示的多核苷酸。本公开通过实验验证发现，如SEQ ID NO:1～548任一序列所示的多核苷酸均具有起始环状核酸分子翻译的活性，说明本公开中提供的筛选方法具有准确性高的优势。

在一些实施方式中，本公开通过对比发现，依据本公开的方法筛选得到包含如(i)任一序列所述核苷酸序列的多核苷酸，多核苷酸的IRES活性超过目前已发现的具有高翻译起始活性的CVB3 IRES元件，可显著提高环状核酸分子的蛋白表达水平，为环状核酸分子在制备蛋白、作为疫苗、生产治疗性蛋白或作为基因治疗手段等方面的应用提供了丰富的翻译起始元件。

在一些实施方式中，本公开提供了环状核酸分子，其包含如(i)所示核苷酸序列的多核苷酸，可以实现目标多肽、蛋白的高水平表达，进一步拓展其在蛋白生产、临床疾病的预防或治疗等领域中的应用效果。

在一些实施方式中，本公开将如(i)任一序列所示的多核苷酸与环状核酸分子的编码区可操作地连接，为环状核酸分子高效表达目标蛋白提供良好基础。

附图说明

图1示出了实施例2中制备的部分线状mRNA分子以及环状mRNA分子的琼脂糖凝胶电泳图，其中，图中Linear IRES 1～30所示的条带依次表示包含SEQ ID NO:1～30所示序列的多核苷酸的线状mRNA分子的电泳条带，图中Circle IRES 1～30所示的条带依次表示包含SEQ ID NO:1～30所示序列的多核苷酸的环状mRNA分子的电泳条带。

图2示出了实施例2中制备的部分线状mRNA分子以及环状mRNA分子的琼脂糖凝胶电泳图，其中，图中Linear IRES 31～62所示的条带依次表示包含SEQ ID NO:31～62所示序列的多核苷酸的线状mRNA分子的电泳条带，图中Circle IRES 31～62所示的条带依次表示包含SEQ ID NO:31～62所示序列的多核苷酸的环状mRNA分子的电泳条带。

图3示出了实施例2中制备的部分线状mRNA分子以及环状mRNA分子的琼脂糖凝胶电泳图，其中，图中Linear IRES 63～94所示的条带依次表示包含SEQ ID NO:63～94所示序列的多核苷酸的线状mRNA分子的电泳条带，图中Circle IRES 63～94所示的条带依次表示包含SEQ ID NO:63～94所示序列的多核苷酸的环状mRNA分子的电泳条带。

图4示出了利用本公开中筛选IRES的方法得到的多核苷酸构建的环状mRNA分子表达荧光蛋白的检测结果，其中，图中柱形图由左向右依次为对照1、对照2、包含SEQ ID NO:1、2、3、4、9、10、11、13、14、15、17、18、19、20、25、26、27、28、41、42、45、46、51、56、59、72、79、91所示核苷酸序列的环状mRNA分子。

图5示出了利用本公开中筛选IRES的方法得到的多核苷酸构建的环状mRNA分子表达荧光蛋白的检测结果，其中，图中柱形图由左向右依次为对照1、对照2、包含SEQ ID NO:98、101、104、106、107、110、115、116、117、118、119、122、123、125、127、129、130、135、139、165、179、180、183、186、188、198、200、215所示核苷酸序列的环状mRNA分子。

图6示出了利用本公开中筛选IRES的方法得到的多核苷酸构建的环状mRNA分子表达荧光蛋白的检测结果，其中，图中柱形图由左向右依次为对照1、对照2、包含SEQ ID NO:216、217、218、219、220、221、222、223、225、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、239、240、242、243、244、245、246、247、248所示核苷酸序列的环状mRNA分子。

图7示出了利用本公开中筛选IRES的方法得到的多核苷酸构建的环状mRNA分子表达荧光蛋白的检测结果，其中，图中柱形图由左向右依次为对照1、对照2、包含SEQ ID NO:249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、272、273、274、275、276、278、279、280所示核苷酸序列的环状mRNA分子。

图8示出了利用本公开中筛选IRES的方法得到的多核苷酸构建的环状mRNA分子表达荧光蛋白的检测结果，其中，图中柱形图由左向右依次为对照1、对照2、包含SEQ ID NO:281、282、283、284、285、286、287、289、291、293、294、296、298、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、314、315、317所示核苷酸序列的环状mRNA分子。

图9示出了利用本公开中筛选IRES的方法得到的多核苷酸构建的环状mRNA分子表达荧光蛋白的检测结果，其中，图中柱形图由左向右依次为对照1、对照2、包含SEQ ID NO:318、319、321、322、323、324、326、329、331、332、333、334、335、336、348、385、387、389、392、393、394、395、406、436、438、439、441、445、457、460、496、504、507、509、511、514、534所示核苷酸序列的环状mRNA分子。

图10示出了本公开中预测的Human poliovirus 1strain Mahoney_CDC 5’UTR序列的二级结构图以及IRES存在的位置；

图11示出了Human poliovirus 1strain Mahoney_CDC 5’UTR组、HumanEchovirus29strain JV-10组与Human Coxsackievirus B3组luciferase蛋白表达检测结果图。

具体实施方式

定义

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。

虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

术语“One-Hot编码”，又称为一位有效编码，主要是采用N位状态寄存器来对N个状态进行编码，每个状态都由他独立的寄存器位，并且在任意时候只有一位有效。One-Hot编码是分类变量作为二进制向量的表示。这首先要求将分类值映射到整数值。然后，每个整数值被表示为二进制向量，除了整数的索引之外，它都是零值，它被标记为1。

术语“遍历样本序列”样本序列是被排成一列的对象(或元素)，每个元素不是在其他元素之前，就是在其他元素之后。元素之间的顺序非常重要。遍历样本序列是沿着某条搜索路线，依次对样本序列中每个元素均做一次且仅做一次访问。访问元素所做的操作依赖于具体的应用问题。遍历序列在数据结构的树和图搜索中经常用到。

术语“莱文斯坦距离是”是一种两个字符串序列的距离度量。形式化地说，两个字符串的莱文斯坦距离是一个字符串变成另一个字符串要求的最少单个字符编辑数量(如：删除、插入和替换)。莱文斯坦距离也被称做编辑距离，尽管它只是编辑距离的一种，与成对字符串比对紧密相关。数学上，两个字符串a、b之间的莱文斯坦距离，levab(i,j)＝max(i,j)；如果min(i,j)＝0；levab(i,j)＝min(levab(i-1,j)+1,levab(i,j-1)+1，levab(i-1,j-1)+1)(ai！＝bj)，其中ai！＝bj是指示函数，当ai！＝bj是为1，否则为0。注意在最小项：第一部分对应删除操作(从a到b)、第二部分对应插入操作、第三部分对应替换操作。

术语“最长公共子串”是寻找两个或多个已知字符串最长的子串。最长公共子串与最长公共子序列的区别在于子序列不必是连续的，而子串却必须是。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。

术语“多核苷酸”或“核酸分子”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

术语“环状核酸分子”是指呈封闭环形的核酸分子。在一些具体的实施方式中，环状核酸分子为环状RNA分子。更具体地，环状核酸分子为环状mRNA分子。

在一些实施方式中，本公开中的环状RNA分子由线状RNA分子的上游的5’端与下游的3’端连接形成环状。本公开中的环状RNA分子由环化前体RNA分子通过剪切和环化反应形成环状。

术语“线状RNA”是指能够环化形成环状RNA的RNA 前体，其一般由线状的DNA分子转录形成。

术语“线性RNA”是指包括5’帽子结构(5’Cap)，3’多聚腺苷尾巴(PolyA tail)，5’非翻译序列(5’untranslational region，5’UTR)，3’非翻译序列(3’untranslationalregion，3’UTR)以及开放阅读框(Open reading frame，ORF)等结构的具有翻译功能的RNA。

术语“翻译起始元件”是指能够招募核糖体，起始RNA分子的翻译过程的任意的序列元件。示例性的，翻译起始元件为IRES元件、m

术语“IRES”(Internal ribosome entry site，IRES)又称内部核糖体进入位点，“内部核糖体进入位点”(IRES)属于翻译控制序列，通常位于所关注基因的5’端，并使得以帽非依赖性方式翻译RNA。经转录的IRES可直接结合核糖体亚单位，以使得mRNA起始密码子在核糖体中适当地取向以进行翻译。IRES序列通常位于mRNA的5’UTR中(起始密码子的正上游)。IRES在功能上取代对各种与真核生物翻译机制相互作用的蛋白因子的需求。

术语“编码区”(Coding Region)是指能够转录信使RNA，并最终翻译为目标多肽、蛋白的基因序列。

术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。

示例性的，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。在某些实施方式中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(例如，多核苷酸)的整个长度上基本相同。

术语“重组核酸分子”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中，且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”“重组蛋白”“融合蛋白”等。

术语“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如病毒质粒、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如慢病毒、逆转录病毒、牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。

术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。术语“重组宿主细胞”涵盖导入环状核酸分子、环化前体核酸分子、重组核酸分子或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够导入本公开的环状核酸分子、环化前体核酸分子、重组核酸分子或重组表达载体的细胞即可。

术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

如本公开所使用的，术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

技术方案

在本公开的技术方案中，说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示：

SEQ ID NO:1～548、562～564所示的序列为具有起始环状核酸分子的翻译活性的多核苷酸序列；

SEQ ID NO:549所示的序列为5’间隔区序列1的核苷酸序列；

SEQ ID NO:550所示的序列为5’间隔区序列2的核苷酸序列；

SEQ ID NO:551所示的序列为3’间隔区序列1的核苷酸序列；

SEQ ID NO:552所示的序列为3’间隔区序列2的核苷酸序列；

SEQ ID NO:553所示的序列为3’间隔区序列3的核苷酸序列；

SEQ ID NO:554所示的序列为I类PIE系统的外显子原件1(E1)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:555所示的序列为I类PIE系统的外显子元件2(E2)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:556所示的序列为I类PIE系统的5’内含子的核苷酸序列；

SEQ ID NO:557所示的序列为I类PIE系统的3’内含子的核苷酸序列；

SEQ ID NO:558所示的序列为5’同源臂序列1(H1)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:559所示的序列为5’同源臂序列2(H2)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:560所示的序列为3’同源臂序列1的核苷酸序列；

SEQ ID NO:561所示的序列为3’同源臂序列2的核苷酸序列。

基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法

本公开基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法，其包括如下步骤：

(1)选取n条含有IRES的序列作为样本序列；其中，n≥1且n为自然数；

(2)将样本序列和待预测序列分别进行One-Hot编码，分类变量为A、T、C、G；

(3)遍历样本序列，计算每条样本序列与待预测序列的莱文斯坦距离；

(4)计算所有样本序列与待预测序列的莱文斯坦距离的均值；

(5)基于所述均值判断待预测序列是否包含IRES。

本公开提供的筛选方法首次利用莱文斯坦距离实现了针对大批量待预测序列样本的IRES筛选与判断，利于研究人员可以有选择性地对具有较高概率存在IRES的待预测序列进行实验验证，有效节省了IRES序列筛选的时间和成本。与现有的IRES预测方法相比，本公开中的筛选方法具有结果准确、效率高的优势。

在一些实施方式中，所述步骤(5)中，如果均值不小于设置的预测阈值，则判断待预测序列包含IRES，否则判断待预测序列为不包含IRES。

在一些具体的实施方式中，所述预测阈值不小于0.5。当预测阈值不小于0.5时，待预测序列中有较高概率包含IRES。在一些优选的实施方式中，所述预测阈值为0.75。当预测阈值0.75时，待预测序列中普遍包含IRES。

在一些具体的实施方式中，莱文斯坦距离的计算方法为：两个字符串a、b之间的莱文斯坦距离，levab(i,j)＝max(i,j)如果min(i,j)＝0；levab(i,j)＝min(levab(i-1,j)+1,levab(i,j-1)+1，levab(i-1,j-1)+1)(ai！＝bj)，其中ai！＝bj是指示函数，当ai！＝bj是为1，否则为0。注意在最小项：第一部分对应删除操作(从a到b)、第二部分对应插入操作、第三部分对应替换操作。

在一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：预测判断为包含IRES的待预测序列的二级结构，并结合最长公共子串，判断IRES在待预测序列中存在的位置。

进一步地，所述预测判断为包含IRES的待预测序列的二级结构包括：使用RNAfold、Mfold、RNAfoldweerver、Vienna RNA软件中的至少一种预测判断为包含IRES的待预测序列的二级结构。

结合RNAfold等IRES分析软件，可进一步对包含IRES的待预测序列中IRES的位置进行分析与定位，有利于新的IRES序列的发现。

在一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：对判断为包含IRES的待预测序列进行实验验证，判断所述待预测序列的IRES活性。

在一些实施方式中，所述实验验证的步骤包括：使用判断为包含IRES的待预测序列构建环状核酸分子，所述环状核酸分子中，所述待预测序列与编码荧光蛋白的核苷酸序列可操作地连接；

获取所述环状核酸分子释放的荧光信号，根据所述荧光信号判断所述待预测序列的IRES活性。

在一些具体的实施方式中，本公开以已公开的具有IRES活性的Human poliovirus1strain Mahoney_CDC 5’UTR(SEQ ID NO:564所示序列)为待预测序列进行示例，利用本公开中的方法判断SEQ ID NO:564所示的序列是否包含IRES的过程如下：

(1)样本序列的选取：选取已经过实验验证的具有高活性的HumanCoxsackievirus B3(CVB3)病毒IRES序列(SEQ ID NO:562)以及Human Echovirus29strain JV-10(E29)病毒IRES序列(SEQ ID NO:563)作为样本序列；

(2)One-Hot编码：如下Table1-3所示，确定要编码的对象为样本序列和待预测序列，分类变量为A、T、C、G；每个样本有4个特征，并将其转化为二进制向量表示，从而将序列字母信息转化为数字信息；

表1(SEQ ID NO:562)

表2(SEQ ID NO:563)

表3(SEQ ID NO:564)

(3)遍历样本序列，计算每条样本序列与待预测序列的莱文斯坦距离：其中，a代指样本序列，b代指待预测序列，i和j分别代表表1-3中的行和列，根据莱文斯坦距离的计算公式，分别计算得到Human poliovirus 1strain Mahoney_CDC 5’UTR序列与HumanCoxsackievirus B3(CVB3)病毒IRES序列的莱文斯坦距离为0.79028，Humanpoliovirus1strain Mahoney_CDC 5’UTR序列与Human Echovirus 29strain JV-10(E29)病毒IRES序列的莱文斯坦距离为0.79380；

(4)预测阈值设置为0.75；计算可得2条样本序列与待预测序列的莱文斯坦距离的均值为0.79204，大于预测阈值0.75，因此可以将待预测序列Human poliovirus 1strainMahoney_CDC 5’UTR序列判断为包含IRES序列；

(5)遍历样本序列，分别查找每条样本序列与待预测序列的最长公共子串，其中，待预测序列Human poliovirus 1strain Mahoney_CDC 5’UTR序列与样本序列HumanCoxsackievirus B3(CVB3)病毒IRES序列的最长公共子串为GCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC，待预测序列Human poliovirus 1strain Mahoney_CDC 5’UTR序列与样本序列Human Echovirus 29strain JV-10(E29)病毒IRES序列的最长公共子串为TCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCCAAC；

(6)使用RNAfold软件预测Human poliovirus 1strain Mahoney_CDC 5’UTR序列的二级结构如图10所示，结合最长公共子串，可以预估计Human poliovirus 1strainMahoney_CDC 5’UTR序列中的IRES结构在椭圆圈标记的区域内。

如图11所示，luciferase蛋白表达结果显示Human poliovirus 1strainMahoney_CDC 5’UTR组mRNA蛋白表达显著高于对照组Human Echovirus 29strain JV-10组与Human Coxsackievirus B3组。由此可知，通过本公开提供的基于莱文斯坦距离的筛选IRES的方法判断为包含IRES待预测序列Human poliovirus 1strain Mahoney_CDC 5’UTR序列，经实验验证，其确实含有IRES，可应用于环状RNA的表达，且Human poliovirus1strain Mahoney_CDC 5’UTR序列IRES活性显著高于样本序列Human Coxsackievirus B3(CVB3)病毒IRES序列和Human Echovirus 29strain JV-10(E29)病毒IRES序列。由此，证明了本发明提供的基于莱文斯坦距离的IRES预测方法的预测准确度高，可以高效准确地预测待预测序列中是否存在IRES，且通过本发明提供的IRES预测方法筛选到的IRES活性高，能够应用于环状RNA的表达。

进一步地，通过上述方法，本公开中筛选发现了548条包含IRES的核苷酸序列，在进一步的实验验证中，本公开发现SEQ ID NO:1～548任一项所述的核苷酸序列均具有IRES活性，能够起始环状核酸分子中目标蛋白的表达，说明本公开提供的筛选方法具有准确性高、效率高的优势。

需要说明的是，CVB3 IRES是目前已发现的具有高IRES活性，可高水平起始环状核酸分子的蛋白表达的IRES元件(Wesselhoeft RA,Kowalski PS,Anderson DG.Engineeringcircular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells.NatCommun.2018Jul 6；9(1):2629.doi:10.1038/s41467-018-05096-6.)。在一些具体的实施方式中，本公开以目前已发现的具有高IRES活性的CVB3 IRES进行对照，发现本公开中如下所示序列的多核苷酸(SEQ ID NO:1、2、3、4、9、10、11、13、14、15、17、18、19、20、25、26、27、28、41、42、45、46、51、56、59、72、79、91、98、101、104、106、107、110、115、116、117、118、119、122、123、125、127、129、130、135、139、165、179、180、183、186、188、198、200、215、216、217、218、219、220、221、222、223、225、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、239、240、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、272、273、274、275、276、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、289、291、293、294、296、298、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、314、315、317、318、319、321、322、323、324、326、329、331、332、333、334、335、336、348、385、387、389、392、393、394、395、406、436、438、439、441、445、457、460、496、504、507、509、511、514、534)起始环状mRNA分子表达蛋白的水平高于CVB3 IRES，说明以本公开方法能够筛选到大量具有极高IRES活性的目标核苷酸序列，为提高环状核酸分子表达目标蛋白的水平奠定了基础。

具有起始环状核酸分子的翻译活性的多核苷酸

目前，虽然已经在一些物种(例如病毒)中发现了具有起始蛋白翻译过程的IRES元件，但是不同种属的病毒IRES序列的同源性低，且目前缺少明确的判断IRES序列的标准。因此，对于具有起始环状核酸分子翻译活性的IRES序列，还需要进一步研究、鉴定。

为解决上述问题，本公开提供了来源于如下所示的不同种类病毒的多核苷酸：

Echovirus E1(strain Farouk/ATCC VR-1038)、Echovirus E2(strain USA/2013-19511)、Echovirus E3(isolate JSev001)、Echovirus E3(strain 61246-70294)、Echovirus E3(strain61247-622)、Echovirus E3(strain 61245-2710)、Echovirus E3(strain 63038-1131)、Echovirus E3(strain 63040-70881)、Echovirus E3(isolateHNWY-01)、Echovirus E3(isolate ECHO3_INMI1)、Echovirus E3(isolate Env_2016_Sep_E-3)、Echovirus E3(strain Sakhalin-11.293)、Echovirus E3(strain HAI/2016-23067A)、Echovirus E3(strain HAI/2016-23066)、Echovirus E3(strain HAI/2016-23065A)、Echovirus E3(strain HAI/2016-23061)、Echovirus E3(strain HAI/2016-23056)、Echovirus E3(strain HAI/2016-23051A)、Echovirus E3(strain HAI/2016-23050)、Echovirus E3(isolate 123-R2)、Echovirus E3(strain Sakhalin/10_DU145)、Echovirus E3(strain Sakhalin/10_RD)、Echovirus E3(isolate E3/TO/BR/018)、Echovirus E4(strain 2F5)、Echovirus 4(strain AUS250G)、Echovirus E4(strainPesacek)、Echovirus E5、Echovirus E6、Echovirus 9(strain Barty)、Echovirus 9(strain Hill)、Echovirus E11、Echovirus E12、Echovirus E13(strain HAI/2017-23078B)、Echovirus E13(strain HAI/2016-23072)、Echovirus E13(strain HAI/2016-23073)、Echovirus E13(strain HAI/2016-23075)、Echovirus E13(strain HAI/2017-23082B)、Echovirus E14(strain RO-81-1-79)、Echovirus E14(isolate ETH_P19/E14_2016)、Echovirus E14(isolate NSW-V04-2012-ECHO14)、Echovirus E14(isolate E14/P843/2013/China)、Echovirus E14(isolate E14/P968/2013/China)、Echovirus E15(strain CH 96-51)、Echovirus E16(isolate ETH_P4/E16_2016)、Echovirus E16(isolate E16/P85/2013/China)、Echovirus E16(strain Harrington)、Echovirus 17(strain CHHE-29)、Echovirus E18(isolate PC06/JS/CHN/2019)、Echovirus E18(strainE18/JXY2-2/2019)、Echovirus E18(isolate QD9/SD/CHN/2019)、Echovirus E18(isolateLJ/0530/2019)、Echovirus E18(strain 12J3)、Echovirus E18(strain USA/2015/CA-RGDS-1049)、Echovirus E18(isolate E18-221/HeB/CHN/2015)、Echovirus E18(strain12G5)、Echovirus E18(isolate E18-393/HeB/CHN/2015)、Echovirus E18(isolate E18-398/HeB/CHN/2015)、Echovirus E18(isolate E18-HeB15-54462/HeB/CHN/2015)、Echovirus E18(isolate E18-HeB15-54498/HeB/CHN/2015)、Echovirus E18(isolateETH_P12/E18_2016)、Echovirus E18(isolate NSW-V13A-2008-ECHO18)、Echovirus E18(strain A83/YN/CHN/2016)、Echovirus E18(strain A86/YN/CHN/2016)、Echovirus E18(isolate Jena/ST9524/10)、Echovirus E18(isolate Jena/VI10227/10)、Echovirus E18(isolate Kor05-ECV18-054cn)、Echovirus E19(strain HAI/2016-23039B)、EchovirusE19(strain HAI/2016-23036D)、Echovirus E19(strain HAI/2016-23037D)、EchovirusE19(strain HAI/2016-23037E)、Echovirus E19(strain HAI/2016-23042B)、EchovirusE19(strain HAI/2016-23046B)、Echovirus E19(strain HAI/2016-23047)、EchovirusE19(strain HAI/2016-23054)、Echovirus E19(strain HAI/2016-23052)、Echovirus E19(strain HAI/2016-23053)、Echovirus E19(train HAI/2016-23062D)、Echovirus E19(train HAI/2016-23063B)、Echovirus E19(train HAI/2016-23064B)、Echovirus E19(strain HAI/2016-23067B)、Echovirus E19(strain HAI/2016-23070B)、Echovirus E19(strain HAI/2017-23079)、Echovirus E19(strain HAI/2017-23081A)、Echovirus E19(isolate ETH_P3/E19_2016)、Echovirus E19(strain NGR_2014)、Echovirus E19(isolate PDV_BLR_IN)、Echovirus E19(strain Burke)、Echovirus E19(strain K/542/81)、Echovirus E20(isolate E20/TO/BR/016)、Echovirus E20(strain HAI/2016-23038B)、Echovirus E20(strain HAI/2016-23041B)、Echovirus E20(strain HAI/2016-23085B)、Echovirus E20(strain HAI/2016-23065C)、Echovirus E20(strain HAI/2016-23068B)、Echovirus E20(strain HAI/2016-23069)、Echovirus E20(strain HAI/2017-23080B)、Echovirus E20(strain HAI/2017-23081B)、Echovirus E20(HAI/2016-23077B)、Echovirus E20(strain HAI/2017-23083C)、Echovirus E20(strain KM-EV20-2010)、Echovirus E20(strain JV-1)、Echovirus E21(strain 553/YN/CHN/2013)、EchovirusE21(strain Farina)、Echovirus E24(strain VEN/2018-23086)、Echovirus E24(isolatePZ18G/JS/20120703)、Echovirus E24(strain DeCamp)、Echovirus E25(strain USA/2016-19521)、Echovirus E25(strain USA/2018-23126)、Echovirus E25(strain 10-4339-2)、Echovirus E25(strain USA/CA/RGDS-2017-1010)、Echovirus E25(isolateNSW-V07-2007-ECHO25)、Echovirus E25(isolate NSW-V08-2008-ECHO25)、Echovirus E25(isolate NSW-V09-2008-ECHO25)、Echovirus E25(isolate NSW-V58-2010-ECHO25)、Echovirus E25(strain 61241-70868)、Echovirus E25(strain E25/ZE-wly/Zhejiang/CHN/2005)、Echovirus E25(isolate Jena/AN1380/10)、Echovirus E25(strain XM0297)、Echovirus E25(strain E25/2010/CHN/BJ)、Echovirus E25(isolate E25SD2010CHN)、Echovirus E25(strain HN-2)、Echovirus E25(strain JV-4)、Echovirus E26(strainCoronel)、Echovirus E27(isolate ETH_P8/E27_2016)、Echovirus E27(strain Bacon)、Echovirus E29(strain HAI/2016-23048B)、Echovirus E29(strain JV-10)、EchovirusE30(isolate E30/TO/BR/032)、Echovirus E30(isolate TL12C/NM/CHN/2016)、EchovirusE30(isolate TL7C/NM/CHN/2016)、Echovirus E30(strain USA/2018-23125)、EchovirusE30(Echo30/Hokkaido.JPN/21208/2017)、Echovirus E30(strain USA/2015/CA-RGDS-1046)、Echovirus E30(strain USA/2017/CA-RGDS-1048)、Echovirus E30(isolate B001/USA/2016)、Echovirus E30(strain 16-I10)、Echovirus E30(strain 1-B4-TW)、Echovirus E30(strain 2002-59)、Echovirus E30(strain KM/A363/09)、Echovirus E30(isolate 1-MRS2013)、Echovirus E30(isolate 3-MRS2013)、Echovirus E30(isolate 4-MRS2013)、Echovirus E30(isolate 2012EM161)、Echovirus E30(isolateE30SD2010CHN)、Echovirus E30(isolate ECV30/GX10/05)、Echovirus E30(strainKor08-ECV30)、Echovirus E30(isolate FDJS03_84)、Echovirus 30(strain Bastianni)、Echovirus 31(strain Caldwell)、Echovirus 32(strain PR-10)、Echovirus E33(strainYNK35/CHN/2013)、Echovirus E33(strain YNA12/CHN/2013)、Human poliovirus 1(isolate CHN-Hainan/93-2)、Human poliovirus 1(isolate RUS39223)、Humanpoliovirus 1(isolate Pak-1)、Human poliovirus 1(isolate TJK35363 clone 6)、Human poliovirus 1(strain 3788ALB96)、Human poliovirus 1(isolate CHN15115/Xinjiang/CHN/2011)、Human poliovirus 1(isolate 29690_c1)、Human poliovirus 1(strain NIE1018316)、Human poliovirus 1(isolate EGY1218587)、Human poliovirus 1(isolate 558/BRA-PE/88)、Human poliovirus 2(isolate Env2008_E2450)、Humanpoliovirus 2(strain CHA1218985)、Human poliovirus 2(isolate Env2008_E3218)、Human poliovirus 2(strain MAD-2593-11)、Human poliovirus 3(strain PAK1019536)、Human poliovirus 3(isolate Env08_E2886)、Human poliovirus 3(strain SWI10947)、Human poliovirus 3(strain FIN84-2493)、Human poliovirus 3(strain USOL-D-bac)、Enterovirus A71(isolate 2019-EV-A71-R398)、Enterovirus A71(strain USA/2018-23296)、Enterovirus A71(strain 16L)、Enterovirus A76(strain 10-3291-2)、Humanenterovirus A76(AY697458)、Enterovirus A89(strain KSYPH-TRMH22F/XJ/CHN/2011)、Human enterovirus A89(AY697459.1)、Enterovirus A90(strain 10-2879-1)、Enterovirus A90(isolate SCH05F/XJ/CHN/2011)、Human enterovirus A90(isolate01336/SD/CHN/EV90)、Human enterovirus A90(AB192877.1)、Human enterovirus A90(isolate F950027)、Human enterovirus 91(AY697461.1)、Human enterovirus A92(strain RJG7)、Simian enterovirus SV19(strain NOLA-2)、Simian enterovirus SV19(isolate cg4006)、Simian enterovirus SV19(strain M19s(P2))、Simian enterovirusSV43(strain OM112t(P12))、Simian enterovirus SV46(isolate cg5400)、Simianenterovirus SV46(strain RNM5)、Enterovirus B69(strain Toluca-1)、EnterovirusB69(isolate 15_491)、Enterovirus B73(isolate 088/SD/CHN/04)、Human enterovirusB73(isolate 2776-82)、Human enterovirus 74(strain Rikaze-136/XZ/CHN/2010)、Enterovirus B75(isolateY16/XZ/CHN/2007)、Enterovirus B75(isolate 102/SD/CHN/97)、Enterovirus B75(strain USA/OK85-10362)、Human enterovirus B77(strain USA/TX97-10394)、Human enterovirus B77(strain CF496-99)、Human enterovirus B79(strain 17-2255-1_E79)、Human enterovirus B79(AB426610.1)、Human enterovirusB79(strain USA/CA79-10384)、Enterovirus B80(isolate HT-LYKH203F/XJ/CHN/2011)、Human enterovirus B80(isolate HZ01/SD/CHN/2004)、Enterovirus B81(isolate99279/XZ/CHN/1999)、Human enterovirus B81(strain USA/CA68-10389)、Humanenterovirus B82(strain USA/CA64-10390)、Human enterovirus B83(strain USA/CA76-10392)、Enterovirus B83(isolate 99245/XZ/CHN/1999)、Enterovirus B83(isolateAFP341-GD-CHN-2001)、Enterovirus B83(isolate 246/YN/CHN/08)、Enterovirus B84(strain GHA:BAR:TES/2017)、Enterovirus B84(isolate AFP452/GD/CHN/2004)、Humanenterovirus 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C117(strain JX-C117-40-2017)、Human enterovirus C118(isolate CQ5185)、Human enterovirus D68(strain Fermon)、Enterovirus D68(TBp-13-Ph209)、Enterovirus D70(strain JPN/1989-23292)、Enterovirus D94(strain ANG/2010-23293)、Human enterovirus D94(isolate 19/04)、Enterovirus D111(strain ANG/2010-23294)、Enterovirus D111(isolate D111-NGR-KAT-1263)、Simian enterovirus J103(isolate cg8227)、Coxsackievirus A2(isolate HN202009)、Coxsackievirus A2(isolate 16027)、Coxsackievirus A2(isolate CVA2-1388-M14/XY/CHN/2017)、Coxsackievirus A2(isolate CVA2/Shenzhen50/CHN/2012)、Coxsackievirus A2(strain 2260165)、Coxsackievirus A4(strain CA4/JX2204/2014)、Coxsackievirus A4(isolate HK458564/2016)、Coxsackievirus A5(isolate CV-A5-3487-M14-XY-CHN-2017)、Coxsackievirus A5(strain CVA5/13164/HUN/2015)、Coxsackievirus A6(isolate DN1501)、CoxsackievirusA6(strain RYN-A1205)、Coxsackievirus A7(strain MAD-3101-11)、Coxsackievirus A8(isolate 13-467/GS/CHN/2013)、Coxsackievirus A8(isolate C177/CHW/AUS/2017)、Coxsackievirus A8(isolate 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A9(isolate F02)、Human rhinovirus A9(strain ATCC VR-489)、Humanrhinovirus A10(strain ATCC VR-1120)、Human rhinovirus A11(strain RvA11/USA/2021/XHZLKL)、Human rhinovirus A11(strain SCH-107)、Human rhinovirus A11(EF173414)、Human rhinovirus A12(isolate p211)、Human rhinovirus A12(EF173415)、Human rhinovirus A13(strain ATCC VR-1123)、Human rhinovirus A13(isolate F03)、Human rhinovirus A15(isolate 7002)、Human rhinovirus A15(DQ473493)、Humanrhinovirus A16(isolate KC939)、Human rhinovirus A16(HRVPP)、Human rhinovirusA18(strain HRVA18/03/ZJ/CHN/2017)、Human rhinovirus 18(strain ATCC VR-1128)、Human rhinovirus 19(strain ATCC VR-1129)、Human rhinovirus A20(strain RvA20/USA/2021/B4Q4QT)、Human rhinovirus A22(strain RvA22/USA/2021/WBLGNP)、HumanRhinovirus A23(strain RvA23/USA/2021/JZHYZ6)、Human rhinovirus A24(strainRvA24/USA/2021/QZ8RX3)、Human Rhinovirus A25(strain RvA25/USA/2021/A8F6KW)、Human Rhinovirus A28(strain RvA28/USA/2021/ADMJHA)、Human Rhinovirus A29(strain RvA29/USA/2021/273658-4)、Human rhinovirus 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ATCC VR-1299)、Human rhinovirus C2(isolate 470389)、Humanrhinovirus C6(strain RvC6/USA/2021/LCP8K8)、Human rhinovirus C8(strain RvC8/USA/2021/7N6PM0)、Human rhinovirus C9(strain RvC9/USA/2021/96D92H)、Humanrhinovirus C10(strain QCE)、Human rhinovirus C11(strain SC9849)、Humanrhinovirus C12(strain RvC12/USA/2021/044858)、Human rhinovirus C15(strainRvC15/USA/2021/SUSM75)、Human rhinovirus C17(strain RvC17/USA/2021/T3RVH2)、Human rhinovirus C23(strain RvC23/USA/2021/ULVLFU)、Human rhinovirus C30(strain USA/2015/CA-RGDS-1045)、Human rhinovirus C31(strain RvC31/USA/2021/B8JUE1)、Human rhinovirus C32(strain USA/CA/RGDS-2016-1008)、Human rhinovirusC34(strain RvC34/USA/2021/BYRST7)、Human rhinovirus C35(strain RvC35/USA/2021/70881)、Human rhinovirus C36(strain RvC36/USA/2021/PEXCU4)、Human rhinovirusC39(strain RvC39/USA/2021/71206)、Human rhinovirus C40(strain RvC40/USA/2021/70389)、Human rhinovirus C41(strain USA/CA/2016-RGDS-1006)、Human rhinovirusC42(strain RvC42/USA/2021/278730)、Human rhinovirus C43(strain SC174)、Humanrhinovirus C47(isolate CA-RGDS-1001)、Human rhinovirus C50(strain human/Australia/SG1/2008)、Human rhinovirus C51(isolate LZ508)、Human rhinovirus C54(isolate D3490)、Human rhinovirus C56(strain RvC56/USA/2021/466615)、Enterovirus E(isolate HeN-A2)、Enterovirus F(isolate HeN-B62)、Enterovirus G(EV-G/Pig/JPN/Kana-Uchi13/2019/G1_PL-CP)、Enterovirus I Dromedary camelenterovirus(strain 19CC)、Bovine enterovirus GX20-1、Goat enterovirus(isolateNMG-F37)、Aimelvirus 1(strain gpai001)、Ampivirus A1(strain NEWT/2013/HUN)、Equine rhinitis A virus(strain PERV-1)、Foot-and-mouth disease virus-type A(isolate A/BR19-16_08dpi_CB-RF)、Foot-and-mouth disease virus-type Asia 1(isolate Mazbi/QOL-UVAS-Pak/2006)、Foot-and-mouth disease virus-type C(isolateKEN/1/2004)、Foot-and-mouth disease virus O(isolate o6pirbright iso58)、Foot-and-mouth disease virus-type SAT 1(isolate TAN/3/80)、Duck hepatitis A virus 1(strain R85952)、Turkey avisivirus(isolate USA-IN1)、Bopivirus sp(strainbovine/TV-9682/2019-HUN)、Encephalomyocarditis virus(ZM12/14)、Human TMEV-likecardiovirus(NC_010810)、Saffold virus 3(NGT07-987)、Human cosavirus A(strainAM326/BRA-AM/2017)、Cosavirus F(strain NGR_2017_NHP_CV)、Caninepicodicistrovirus(strain 209)、Equine rhinitis B virus 1、Simian hepatitis Avirus、Hepatovirus D2(isolate KS111230Crimig2011)、Rodent hepatovirus(KEF121Sigmas2012)、Hepatovirus G2(isolate FO1AF48Rhilan2010)、Loch Leven virus(isolate MW12_1o)、Hunnivirus 05VZ(isolate 05VZ-75-RAT099)、Melegrivirus A(NC_023858)、Canine picornavirus、Turdivirus 3、Pasivirus A3(strain swine/Zsana1/2013/HUN)、Passerivirus(sp.strain waxbill/DB01/HUN/2014)、Wenling sharpspineskate picornavirus(strain DHBYCGS18742)、Picornaviridae(sp.rodent/RL/PicoV/FJ2015)、Avian sapelovirus、Marmot sapelovirus 2(strain HT6)、Bat picornavirus(isolate BtPV/13585-58/M.dau/DK/2014)、Bat picornavirus LMA6(isolate DesRot/Peru/LMA6_F_DrPicoV)、Sicinivirus A1(isolate JSY)、Sicinivirus A5(strain RS/BR/2015/1)、Sicinivirus(sp.isolate Environment/NLD/2019/VE_7_picorna_3)、Porcineteschovirus 10(strain Vir 460/88)、Tremovirus A(isolate GDs29)、Yiliteratoscincus roborowskii picornavirus 1(strain LPWC175499)、Canine kobuvirus(US-PC0082)、Feline kobuvirus(strain FK-13)、Feline kobuvirus(strain WHJ-1)、Kobuvirus(dog/AN211D/USA/2009)、Murine kobuvirus 1(isolate MKV1/NYC/2014/M014/0146)、Kobuvirus sewage Kathmandu(isolate KoV-SewKTM)、Bovine kobuvirus(strainIL35164)、Kobuvirus cattle/Kagoshima-1-22-KoV/2014/JPN(Kagoshima-1-22-KoV/2014/JPN)、Caprine kobuvirus(isolate MN1/2018)、Ferret kobuvirus(isolateMpKoV38)、Grey squirrel kobuvirus(isolate UK 2010)、Marmot kobuvirus(strainHT9)、Ovine kobuvirus(isolate SKoV-China/SWUN/AB18/2019)、Human parechovirustype 1(PicoBank/HPeV1/a virus p123)、Human parechovirus 3(strain CAU14/2015/KR)、Human parechovirus 4(isolate K251176-02)、Human parechovirus 5(strainCT86-6760)、Human parechovirus 5(4112/SapporoC/July/2018)、Human parechovirus 6(strain:NII561-2000)、Human parechovirus 6(isolate AFW)、Human parechovirus 7、Human parechovirus 14(clone V3C)、Human parechovirus 17(isolate 157Chzj058)、Human parechovirus 18(isolate 11Chzj207)、Human parechovirus 19(isolate67Chzj11)、Ljungan virus strain 145SL(isolate 145SLG)、Ljungan virus M1146、Ljungan virus 64-7855、Rattus tanezumi parechovirus(strain Wencheng-Rt386-3)、Parechovirus(sp.strain Parchzj-6)、Baskerville virus、Bemisia tabaci picorna-like virus 1(isolate CAU-Q1)、British Admiral virus(isolate MW13_1o)、Carfaxvirus、Chicken picornavirus 4(isolate 5C)、Chicken picornavirus 5(isolate 27C)、Chicken proventriculitis virus(isolate CPV/Korea/03)、Zebrafish picornavirus-1(strain NCSZCF/ZfPV/2015/North Carolina/USA)、Duck picornavirus(duck/FC22/China/2017)、Eotetranychus kankitus picorna-like virus(strain EKPLV.abc9)、Falcon picornavirus、Feline picornavirus(strain 661F)、French Guianapicornavirus(isolate French_Guiana_Picornavirus)、Leveillula tauricaassociated picorna-like virus 1(isolate PM-A_DN31116)、Moran virus、Musmusculus picornavirus(strain Wencheng-Mm283)、Ovine picornavirus、Pigeonmesivirus 2(strain pigeon/GALII5-PiMeV/2011/HUN)、Red-necked stintPicornavirus B-like、Sphenigellan virus、Sphenimaju virus、Washington batpicornavirus、Waterwitch virus(isolate MW03_1o)、Aphid lethal paralysis virus、Cricket paralysis virus、Drosophila C virus(strain EB)、Homalodisca coagulatavirus-1、Antheraea pernyi iflavirus(isolate LnApIV-02)、Isla virus(strain Cx1773-5)、Chaetoceros socialis f.radians RNA virus、Apple latent sphericalvirus。

本公开提供的多核苷酸具有起始环状核酸分子的翻译活性，能够介导环状核酸分子内蛋白的表达过程，实现蛋白高效的翻译、表达，为环状核酸分子的应用提供了良好的应用基础。

在一些实施方式中，本公开提供了具有起始环状核酸分子的翻译活性的多核苷酸(i)，其包含如SEQ ID NO:1～548任一序列所示的核苷酸序列。优选地包含如下任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、9、10、11、13、14、15、17、18、19、20、25、26、27、28、41、42、45、46、51、56、59、72、79、91、98、101、104、106、107、110、115、116、117、118、119、122、123、125、127、129、130、135、139、165、179、180、183、186、188、198、200、215、216、217、218、219、220、221、222、223、225、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、239、240、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、272、273、274、275、276、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、289、291、293、294、296、298、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、314、315、317、318、319、321、322、323、324、326、329、331、332、333、334、335、336、348、385、387、389、392、393、394、395、406、436、438、439、441、445、457、460、496、504、507、509、511、514、534。

本公开通过筛选得到的SEQ ID NO:1～548任一序列所示的多核苷酸在环状核酸分子中可以招募核糖体，起始环状核酸分子的翻译。其中优选序列所示的多核苷酸介导环状核酸分子表达蛋白的水平显著高于CVB3 IRES，能够提高目标多肽、蛋白的表达水平，为使用环状核酸分子制备蛋白、作为疫苗、生产治疗性蛋白或作为基因治疗手段等提供了丰富的翻译起始元件。

环状核酸分子虽然在蛋白表达、临床疾病的预防或治疗方面表现出极高的应用前景，但目前可用于起始环状核酸分子翻译的序列未大量发现。本公开提供的筛选方法，为环状核酸分子提供了丰富的翻译起始序列，对于拓宽环状核酸分子在工业、临床中的应用具有重要价值。

在一些实施方式中，多核苷酸还包括如(i)任一序列所示的核苷酸序列的突变体序列(ii)，所述突变体序列在对应如(i)任一所示序列的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且突变体序列具有起始环状核酸分子的翻译活性。

在本公开中，突变体序列是指相对于“野生型的”或者“相比较的”核苷酸序列，在一个或在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。

在一些具体的实施方式中，突变体序列包含对应于如(i)任一序列所示的核苷酸序列的5’端缺失或添加的一个或多个核苷酸。在一些具体的实施方式中，突变体序列包含对应于如(i)任一序列所示的核苷酸序列的3’端缺失或添加的一个或多个核苷酸。在一些具体的实施方式中，突变体序列包含对应于如(i)任一序列所示的核苷酸序列的内部缺失、添加和/或取代的一个或多个核苷酸。

在本公开中，突变体序列与未突变的核苷酸序列相比，可以具有提高的起始环状核酸分子的翻译活性、保留的或至少部分保留的起始环状核酸分子的翻译活性。具体而言，只要突变的核苷酸不会导致突变体序列的起始环状核酸分子的翻译活性的丧失，均在本公开的范围内。

在一些实施方式中，具有起始环状核酸分子的翻译活性的多核苷酸，还包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列的杂交序列反向互补，且具有起始环状核酸分子翻译的活性的核苷酸序列。

在一些实施方式中，具有起始环状核酸分子的翻译活性的多核苷酸，还包括与(i)或(ii)任一项所示的核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性(包括这些数值之间所有范围和百分数)，且具有起始环状核酸分子的翻译活性的核苷酸序列。

在一些实施方式中，本公开提供了多核苷酸在如下(a

本公开提供的多核苷酸用于起始环状核酸分子的蛋白翻译，具有高的翻译活性，能够实现目标蛋白的稳定、高效表达。

环状核酸分子

本公开提供的环状核酸分子，包含如如(i)任一序列所示的多核苷酸。环状核酸分子具有高的蛋白表达效率，在工业蛋白生产、核酸疫苗、表达治疗性蛋白、基因治疗等领域极具应用前景。

在一些实施方式中，环状核酸分子为环状RNA分子。更具体地，环状核酸分子为包含编码目标多肽的编码区的环状mRNA分子。环状mRNA分子的编码区与具有起始环状核酸分子的翻译活性的多核苷酸可操作地连接，可起始环状mRNA分子的蛋白翻译过程。

在一些实施方式中，环状mRNA分子还包含如下的一种或多种元件：5’间隔区、3’间隔区、第二外显子、第一外显子。

在一些优选的实施方式中，环状mRNA分子包含顺次连接的如下所示元件：第二外显子E2、5’间隔区、具有起始环状核酸分子的翻译活性的多核苷酸、编码区、3’间隔区和第一外显子E1。本公开发现，具有该结构的环状mRNA分子，在插入本公开提供的多核苷酸后，具有提高的蛋白表达水平。

在本公开中，编码区可以包含编码任意的核苷酸序列。本公开对编码区序列不进行具体限定，其依据所需表达的目标蛋白的种类进行设置。

在一些具体的实施方式中，5’间隔区包含如SEQ ID NO:549-550任一项所示的核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO:549-550任一项所示的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些具体的实施方式中，3’间隔区包含如SEQ ID NO:551-553所示的核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO:551-553任一项所示的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些具体的实施方式中，第一外显子E1包含如SEQ ID NO:554所示的核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO:554所示的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些具体的实施方式中，第二外显子E2包含如SEQ ID NO:555所示的核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO:555所示的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

本公开发现，上述各元件的核苷酸序列可进一步促进由多核苷酸介导的环状mRNA分子的蛋白翻译过程，提高多核苷酸起始蛋白翻译的活性。

在另外一些实施方式中，环状核酸分子也可以包含其他种类的元件、或元件序列，本公开对此不进行具体限定，只要本公开中SEQ ID NO:1～548所示序列的多核苷酸能够起始环状核酸分子的蛋白翻译，实现蛋白的高水平表达即可。

在一些实施方式中，本公开提供了环化前体核酸分子，可以环化形成上述的环状核酸分子。进一步的，环化前体核酸分子为环化前体mRNA分子。

在一些具体的实施方式中，环化前体mRNA分子还包含如下的一种或多种元件：5’同源臂、3’内含子、第二外显子、5’间隔区、编码区、3’间隔区、第一外显子、5’内含子和3’同源臂。

在一些具体的实施方式中，环化前体mRNA分子包含顺次连接的如下所示元件：

5’同源臂、3’内含子、第二外显子、5’间隔区、具有起始环状核酸分子的翻译活性的多核苷酸、编码区、3’间隔区、第一外显子、5’内含子和3’同源臂。

环化前体mRNA分子通过如下过程成环：利用内含子的核酶特性，在GTP的引发下，5’内含子与第一外显子的连接处发生断裂；第一外显子的核酶裂口进一步攻击3’内含子与第二外显子的连接处，使该处发生断裂，3’内含子解离，第一外显子和第二外显子连接形成环状mRNA分子。

在一些具体的实施方式中，5’同源臂包含与SEQ ID NO:558-559任一项所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些具体的实施方式中，3’同源臂包含与SEQ ID NO:560-561任一项所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些具体的实施方式中，5’内含子包含与SEQ ID NO:556所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些具体的实施方式中，3’内含子包含与SEQ ID NO:557所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些实施方式中，本公开提供了一种重组核酸分子，能够转录形成上述的环化前体mRNA分子。为使重组核酸分子能够进一步转录形成mRNA分子，在重组核酸分子中还可以包含调控序列。示例性的，调控序列为连接于5’同源臂上游的T7启动子。

在一些实施方案中，本公开提供了一种重组表达载体，包含上述的重组核酸分子。其中，连接重组核酸分子的载体可以是本领域常用的各类载体，例如pUC57质粒等。进一步的重组核酸分子中包含限制性酶切位点，使重组表达载体经酶切后得到适于转录的线性化载体。

在一些实施方案中，本公开提供了一种重组宿主细胞，包含环状mRNA分子、环化前体mRNA分子、重组核酸分子和重组表达载体中的至少一种。

实施例

本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例1：筛选具有起始环状核酸分子的翻译活性的序列

(1)获取来源于不同种类的病毒的核苷酸序列，作为的待预测序列集合。

(2)从iresite数据库(http://www.iresite.org)下载583个经过实验验证具有活性的样本IRES序列集合。

(3)one-hot编码，确定要编码的对象为(1)得到的待预测序列集合与(2)选取的IRES序列集合，分类变量为A、T、C、G；每个样本有4个特征，并将其转化为二进制向量表示。以SEQ ID：1序列为例，如下表4：

表4

(4)计算莱文斯坦距离，分别计算每条待预测序列与选取的583个样本IRES序列之间的莱文斯坦距离，并取其均值。计算数学上，两个字符串a、b之间的莱文斯坦距离，levab(i，j)＝max(i，j)如果min(i，j)＝0；levab(i，j)＝min(levab(i–1，j)+1，levab(i，j-1)+1，levab(i–1，j-1)+1)(ai！＝bj)，其中ai！＝bj是指示函数，当ai！＝bj是为1，否则为0。注意在最小项：第一部分对应删除操作(从a到b)、第二部分对应插入操作、第三部分对应替换操作。计算待预测序列与583个样本IRES序列的莱文斯坦距离均值，其均值最高为1.0，如果均值大于0.5，可初步判断待预测序列可能含有IRES，如果均值大于0.75，则判断极有可能含有IRES，莱文斯坦距离均值下表5。

表5

实施例2：验证待预测序列的IRES活性

2.1质粒构建

构建含有不同IRES元件以及编码基因eGFP的质粒，该步骤委托南京金斯瑞生物科技公司进行基因合成与克隆。构建的环状RNA的DNA载体，包含T7启动子，5’同源臂(SEQ IDNO:558)，3’内含子(SEQ ID NO:557)，第二外显子E2(SEQ ID NO:555)，5’间隔区(SEQ IDNO:549)，IRES元件，eGFP蛋白编码区序列，3’间隔区(SEQ ID NO:551)，第一外显子E1(SEQID NO:554)，5’内含子(SEQ ID NO:556)，3’同源臂(SEQ ID NO:560)，以及可用于质粒线性化的酶切位点XbaI。所得基因片段连接到pUC57载体。

2.2线性质粒模板制备

2.2.1质粒抽提

①将外部合成的穿刺菌活化，条件37℃/220rpm/3～4h。

②取活化菌液扩大培养，培养条件：37℃/220rpm/过夜。

③质粒抽提(天根无内毒素小量中提试剂盒)，测定OD值。

2.2.2质粒酶切

采取XbaI单酶切的方法酶切上述2.2.1制备质粒

酶切体系如下：

表6

37℃酶切过夜。采用通用型DNA胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收酶切产物，测定OD值并采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。纯化的线性质粒模板用于体外转录。

2.2.3体外转录制备mRNA

2.2.3.1一步转录环化制备环状mRNA

1)进行体外转录反应，体系如下：

表7

37℃孵育2-4h，加入2μl DNaseI于37℃消化15min。

2)转录产物mRNA纯化

将上述所得转录产物，使用硅膜离心柱法纯化(Thermo，GeneJET RNAPurification Kit)，测定OD值及1％变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA大小(图1-图3)。图1-图3所示的变性琼脂糖凝胶电泳图显示以成功合成线性mRNA和环化RNA，且环化处理组mRNA较线性mRNA在胶上的迁移速度更快，条带环化完全。

2.2.4编码EGFP的环状mRNA转染293T细胞及荧光强度测定

2.2.4.1细胞培养：293T接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的DMEM高糖培养基中，于37℃，5％CO

2.2.4.2细胞转染：转染前将293T细胞以1×10

1)稀释Messenger MAX

表8

稀释混合后，室温静置孵育10min。

2)稀释mRNA

表9

3)取混合稀释后的Messenger MAX

表10

稀释混合后，室温静置孵育5min。

2)吸取上述混合液50μl贴壁缓缓加入24孔板中，37℃、5％CO

2.2.4.2蛋白表达检测

1)细胞荧光观察：将转染24h后293T细胞于荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。

2)流式细胞术检测细胞平均荧光强度：将转染24h后293T细胞用流式细胞仪检测细胞平均荧光强度。

2.2.5实验结果分析

对照1的环状mRNA分子中未添加活性IRES序列，对照2的环状mRNA分子中添加具有高IRES活性的Coxsackievirus B3(CVB3)序列(SEQ ID NO:562)。实验结果如下表，如果EGFP的表达量大于0小于等于10000，表明待预测序列介导了环状RNA的表达，其含有IRES序列，如果EGFP的表达量大于10000，表明该待预测序列含有的IRES活性极好。

表11

由上表11可知，本公开中SEQ ID NO:1～548所示序列的多核苷酸均具有起始环状mRNA分子的蛋白翻译活性，可作为IRES元件用于构建具有蛋白、多肽翻译活性的环状mRNA分子。在一些优选的实施方式中，使用本公开中多核苷酸构建的环状mRNA分子表达EGFP的表达量超过使用Coxsackievirus B3(CVB3)(SEQ ID NO:562所示序列)构建的环状核酸分子，说明本公开提供的多核苷酸的IRES活性较目前高活性的IRES序列有进一步的提升，对于提高环状核酸分子表达目标蛋白、多肽的水平具有重要意义。

本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。

此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本发明中很容易清楚本发明的关键特征，在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州科锐迈德生物医药科技有限公司

<120> 基于莱文斯坦距离筛选IRES的方法及其筛选的多核苷酸

<130> 6A23-2103333I-SU

<150> CN202111185073.9

<151> 2021-10-12

<160> 564

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 743

<212> DNA

<213> Echovirus E1 (strain Farouk / ATCC VR-1038)

<400> 1

ttaaaacagc ctgtgggttg ttcccaccca cagggcccac tgggcgttag cacactggta 60

tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttatac tcccccccct aaggaaactt tagaagcaaa 120

gcaattgtga tcaatagtgg gtatggcaca ccagtcatat cttgatcaag cacttctgtt 180

cccccggact tagtaccaat agactgctca agcggttgaa ggggaaaacg ttcgttatcc 240

ggccaactac ttcgagaaac ctagtagcac catgaaagtt gcggagtgtt tcgctcagca 300

cttcccccgt gtagatcagg ctgatgagtc accgtattcc ccacgggcga ccgtgacggt 360

ggctgcgttg gcggcctgcc catggggtaa cccatgggac gctctaaaac agacacggtg 420

cgaagagtct attgagctag ttggtagtcc tccggcccct gaatgcggcc aatcctaact 480

gcggagcaca tactcccaat ccagggagca gtgtgtcgta atgggtaact ctgcagcgga 540

accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt ttattctcac attgactgct tatggtgaca 600

attgaaagat tgttaccata tagctattgg attggtcatc cggtgagcaa tagagctatt 660

gtttatcaat ttgttggatt tgtaccactc aacttttctg ttttgagaac actcaactac 720

atcttactgc taaacacatc aaa 743

<210> 2

<211> 697

<212> DNA

<213> Echovirus E2 (strain USA/2013-19511)

<400> 2

ctagcactcc ggtattgcgg tacccttgtg cgcctgtttt atcctccctc cccctaacgt 60

aatttagaag caagacttta acggtcatta ggtggctcag cacaccagcc gagtcaagac 120

caagcacttc tgttaccccg gactgagtat caataagctg ctcacgtggc tgaaagagaa 180

aacgttcgtt acccggccaa ttacttcgag aaacctagta ccaccatgga ggttgcgcag 240

cgtttcgctc cgcactaccc cagtgtagat caggtcgatg agtcaccgca ttccccacgg 300

gcgaccgtgg cggtggctgc gttggcggcc tgcccatggg gaaacctatg ggacgcttca 360

atactgacat ggtgtgaaga gtctattgag ctaattggta atcctccggc ccctgaatgc 420

ggctaatcct aactgcggag cagacaccca caagccagtg agcagtctgt cgtaacgggc 480

aactctgcag cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt ccttttattc cattactggc 540

tgcttatggt gacaattgag agattgttac catatagcta ttggattggc catccggtga 600

gcaacagagc acttatatat ctctttgttg gattcatacc actagacacc aggagtttta 660

cgtctttggt ttatatttta aggttgaaca cagcaaa 697

<210> 3

<211> 743

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (isolate JSev001)

<400> 3

ttaaaacagc ctgtgggttg tacccaccca cagggcccac tgggcgccag cactctggta 60

ttacggtacc cttgtgcgcc tgttttatat cccttcccca aggtaaacgt tagaagcaat 120

gcactcccga tcaatagaag gtgcgacgcg ccagtcgtat ctcgatcaag cacttctgtt 180

tccccggacc gagtatcaat agactgctag cgcggttgaa ggagaaaacg ttcgttaccc 240

gactaactac ttcgagaagc ccagtagcgc catgaaagtt gcagagtgtt tcgctcagca 300

cttcccccgt gtagatcagg ccgatgagtc accgcaatcc ccacgggcga ccgtggcggt 360

ggctgcgttg gcggcctgcc tatggggaaa cccataggac gctcaaatac agacatggtg 420

cgaagagtct attgagctag ttagtactcc tccggcccct gaatgcggct aatcctaact 480

gcggagcaag tactcacaat ccagtgggca gcttgtcgta acgggtaact ctgcagcgga 540

accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt ttattcctac attggctgct tatggtgaca 600

atcaaagagt tgttaccata tagctattgg attggccatc cggtgactaa taaagcaatt 660

atatttcttt ttgttgggtt tgtacccctt aatacaacca gcttcaccac cttgtgttac 720

atcattagac tgaacaaggc aaa 743

<210> 4

<211> 740

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain 61246-70294)

<400> 4

aaacagcctg tgggttgttc ccacccacag ggcccactgg gcgctagcac tctggtatca 60

tggtaccttt gtgcgcctgt tttatccacc ctccccaaaa tgcaacttag aagcataatc 120

caaacggtca ttaggtagct cagtacacca actgagccca gaccaagcac ttctgtcacc 180

ccggaccgag tatcaatagg ctgctcgcgc ggctgaagga gaaaacgttc gttatccggc 240

caattacttc gagaaaccca gtaccactat gaaagttgcg cagcgtttcg ttccgcacaa 300

ccccagtgta gatcaggtcg atgagtcacc gcgttcccca cgggcgaccg tggcggtggc 360

tgcgttggcg gcctgcccat ggggcaacct atgggacgct tcaatactga catggtgtga 420

agagtctatt gagctaattg gtagtcctcc ggcccctgaa tgcggctaat cctaactgcg 480

gagcagatgc tcacaaacca gtgggcagtc tgtcgtaatg ggtaactctg cagcggaacc 540

gactactttg ggtgtccgtg tttcctttca tttttacact ggctgcttat ggtgacaatt 600

gagagattgt taccatatag ctattggatt ggccatccgg tgactaacag agcaattgtt 660

tacctattta ttggttttgt accgttagat tacaaagttc taaagactct gaatcttatt 720

atagcactca atacagtaaa 740

<210> 5

<211> 723

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain 61247-622)

<400> 5

ttcccaccca cagggcccac tgggcgctag cactctggta tcatggtacc tttgtgcgcc 60

tgttttatcc accctcccca aaatgcaact tagaagcata atccaagcgg tcattaggta 120

gctcagtaca ccaactgagc ccagaccaag cacttctgtc accccggacc gagtatcaat 180

aggctgctcg cgcggctgaa ggagaaaacg ttcgttatcc ggccaattac ttcgagaaac 240

ccagtaccac tatgaaagtt gcgcagcgtt tcgttccgca caaccccagt gtagatcagg 300

tcgatgagtc accgcgttcc ccacgggcga ccgtggcggt ggctgcgttg gcggcctgcc 360

catggggcaa cctatgggac gcttcaatac tgacatggtg tgaagagtct attgagctaa 420

ttggtagtcc tccggcccct gaatgcggct aatcctaact gcggagcaga tgctcacaaa 480

ccagtgggca gtctgtcgta atgggtaact ctgcagcgga accgactact ttgggtgtcc 540

gtgtttcctt ttatttttac actggctgct tatggtgaca attgagagat tgttaccata 600

tagctattgg attggccatc cggtgactaa cagagcaatt gtttacctat ttattggttt 660

tgtaccgtta gattacaaag ttctaaagac tctgaatctt attatagcac tcaatacagt 720

aaa 723

<210> 6

<211> 730

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain 61245-2710)

<400> 6

tgggttgttc ccacccacag ggcccactgg gcgctagcac tctggtatca tggtaccttt 60

gtgcgcctgt tttatccacc ctccccaaaa tgcaacttag aagcataatc caaacggtca 120

ttaggtagct cagtacacca actgagccca gaccaagcac ttctgtcacc ccggaccgag 180

tatcaatagg ctgctcgcgc ggctgaagga gaaaacgttc gttatccggc caattacttc 240

gagaaaccca gtaccactat gaaagttgcg cagcgtttcg ttccgcacaa ccccagtgta 300

gatcaggtcg atgagtcacc gcgttcccca cgggcgaccg tggcggtggc tgcgttggcg 360

gcctgcccat ggggcaaccc atgggacgct tcaatactga catggtgtga agagtctatt 420

gagctaattg gtagtcctcc ggcccctgaa tgcggctaat cctaactgcg gagcagatgc 480

tcacaaacca gtgggcagtc tgtcgtaatg ggtaactctg cagcggaacc gactactttg 540

ggtgtccgtg tttcctttca tttttacact ggctgcttat ggtgacaatt gagagattgt 600

taccatatag ctattggatt ggccatccgg tgactaacag agcaattgtt tacctattta 660

ttggttttgt accgttagat tacaaagttc taaagactct gaatcttatt atagcactca 720

atacagtaaa 730

<210> 7

<211> 722

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain 63038-1131)

<400> 7

tcccacccac agggcccact gggcgctagc actctggtat catggtacct ttgtgcgcct 60

gttttatcca ccctccccaa aatgcaactt agaagcataa tccaaacggt cattaggtag 120

ctcagtacac caactgagcc cagaccaagc acttctgtca ccccggaccg agtatcaata 180

ggctgctcgc gcggctgaag gagaaaacgt tcgttatccg gccaattact tcgagaaacc 240

cagtaccact atgaaagttg cgcagcgttt cgttccgcac aaccccagtg tagatcaggt 300

cgatgagtca ccgcgttccc cacgggcgac cgtggcggtg gctgcgttgg cggcctgccc 360

atggggcaac ccatgggacg cttcaatact gacatggtgt gaagagtcta ttgagctaat 420

tggtagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg cggagcagat gctcacaaac 480

cagtgggcag tctgtcgtaa tgggtaactc tgcagcggaa ccgactactt tgggtgtccg 540

tgtttccttt catttttaca ctggctgctt atggtgacaa ttgagagatt gttaccatat 600

agctattgga ttggccatcc ggtgactaac agagcaattg tttacctatt tattggtttt 660

gtaccgttag attacaaagt tctaaagact ctgaatctta ttatagcact caatacagta 720

aa 722

<210> 8

<211> 714

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain 63040-70881)

<400> 8

acagggccca ctgggcgcta gcactctggt atcatggtac ctttgtgcgc ctgttttatc 60

caccctcccc aaaatgcaac ttagaagcat aatccaaacg gtcattaggt agctcagtac 120

accaactgag cccagaccaa gcacttctgt caccccggac cgagtatcaa taggctgctc 180

gcgcggctga aggagaaaac gttcgttatc cggccaatta cttcgagaaa cccagtacca 240

ctatgaaagt tgcgcagcgt ttcgttccgc acaaccccag tgtagatcag gtcgatgagt 300

caccgcgttc cccacgggcg accgtggcgg tggctgcgtt ggcggcctgc ccatggggca 360

acccatggga cgcttcaata ctgacatggt gtgaagagtc tattgagcta attggtagtc 420

ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac tgcggagcag atgctcacaa accagtgggc 480

agtctgtcgt aatgggtaac tctgcagcgg aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttcct 540

ttcattttta cactggctgc ttatggtgac aattgagaga ttgttaccat atagctattg 600

gattggccat ccggtgacta acagagcaat tgtttaccta tttattggtt ttgtaccgtt 660

agattacaaa gttctaaaga ctctgaatct tattatagca ctcaatacag taaa 714

<210> 9

<211> 682

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (isolate HNWY-01)

<400> 9

atcacggtac ctttgtgcgc ctgttttata accctttccc caacgcaaca tagaagctat 60

acacactgat caacagcagg cacagcgcac cagttgtgtc tcgatcaagc acttctgtct 120

ccccggaccg agtatcaata gactgcttac gcggttgaag gagaaaacgt tcgttacccg 180

gctgactact tcgaaaagcc tagtagtgcc atgaaagttg cggagcgttt tgttcagcac 240

ttcccccgtg tagatcaggt cgatgagtca ctgcgttccc cacgggtgac cgtggcagtg 300

gctgcgttgg cggcctgccc gtggggcaac ccatgggacg cttcaataca aacatggtgc 360

gaagagtcta ttgagctagt cagtagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcccaactg 420

cggagcatgc gccttcgacc cagagggtag catgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa 480

ccgactactt tgggtgtccg tgtttccttt tattcttata ctggctgctt atggtgacaa 540

ttgagagatt gttaccatat agctattgga ttggccatcc ggtgagtaat agagctatta 600

tatactcctt tgtgggtttt gtgccactgg atcacaaggt cttgaaaact ctcactttta 660

tcacaacact taacactgca aa 682

<210> 10

<211> 744

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (isolate ECHO3_INMI1)

<400> 10

ttaaaacaag gctgtgggtt gtacccgccc acagggccca ctgggcgcca gcactctggt 60

attacggtac ccttgtgcgc ctgttttata tcccttcccc aaggtaaacg ttagaagcaa 120

tgcactcccg atcaatagaa ggtgcgacgc gccagtcgta tctcgatcaa gcacttctgt 180

ttccccggac cgagtatcaa tagactgcta gcgcggttga aggagaaaac gttcgttacc 240

cgactaacta cttcgagaag cccagtagcg ccatgaaagt tgcagagtgt ttcgctcagc 300

acttcccccg tgtagatcag gccgatgagt caccgcaatc cccacgggcg accgtggcgg 360

tggctgcgtt ggcggcctgc ctatggggaa acccatagga cgctcaaata cagacatggt 420

gcgaagagtc tattgagcta gttagtactc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac 480

tgcggagcaa gtactcacaa tccagtgggc agcttgtcgt aacgggtaac tctgcagcgg 540

aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttcct tttattccta cattggctgc ttatggtgac 600

aatcaaagag ttgttaccat atagctattg gattggccat ccggtgacta ataaagcaat 660

tatatttctt tttgttgggt ttgtacccct taatacaacc agcttcacca cattgtgtta 720

catcattaga ctgaacaagg caaa 744

<210> 11

<211> 657

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (isolate Env_2016_Sep_E-3)

<400> 11

cacaccctcc ccaaagatgt aacttagaag cactttccaa gtggtcatta ggcagctcag 60

cacaccagct gagtccagac caagcacttc tgttaccccg gaccgagtat caataggctg 120

cttgcgcggc tgaaagagaa aacgttcgtt acccggccaa ttacttcgag aaacctagta 180

ccaccatgaa agttgcgcgg cgtttcgttc cgcacaaccc cagtgtagat caggtcgatg 240

agtcaccgcg ttcctcacgg gcgaccgtgg cggtggctgc gctggcggcc tgcccatggg 300

acaacccatg ggacgcttca atgctgacat ggtgtgaaga gtctattgag ctaattggta 360

gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct aactgcggag cagataccca caaaccagtg 420

ggcagtctgt cgtaacgggt aactctgcag cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt 480

ccttttattc atacattggc tgcttatggt gacaattgag agattgttac catatagcta 540

ttggattggc catccggtgt ctaacagagc aattgtatac ctatttatag gttttatacc 600

attgaattac aaagtcttag agactctgaa tcttattata acacttaaca cagcaaa 657

<210> 12

<211> 742

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain Sakhalin-11.293)

<400> 12

ttaaaacagc tctggggttg tacccactca cagggcccac tgggcgctag cacactggta 60

tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttataa cccctttccc aaacgcaacg tagaagccac 120

acacactgat cagtagtagg cacagcgcac cagttgtgtc tcgatcaagc acttctgtct 180

ccccggaccg agtatcaata gactgctcac gcggttgaag gagaaaacgt tcgttaaccg 240

gctgactact tcgagaaacc tagtagtact atgaaagttg cgaagcgttt cactcagcac 300

ttcccccgtg tagatcaggc cgatgagtca ctgcgttccc cacgggtgac cgtggcagtg 360

gctgcgttgg cggcctgccc atggggtaac ccatgggacg cttcaatacg gacatggtgc 420

gaagagtcta ttgagctagc cagtagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg 480

cggagcatgt gccctcgatc cagagggtag catgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa 540

ccgactactt tgggtgtccg tgtttctttt tattcttata ctggctgctt atggtgacaa 600

ttgggagatt gttaccatat agctattgga ttggccaccc ggtgactaat agagctatta 660

tctactcctt tataggtttt gtgccattga actacaaggt cttaaagact ctcaacttta 720

tcatcatact taatactgca aa 742

<210> 13

<211> 687

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain HAI/2016-23067A)

<400> 13

ggtatcacgg tacctttgtg cgcctgtttt ataacccctc ccccgaatgt aacgtagaag 60

ctgaacctaa gtggtcaata ggcggctcag aacaccatct gggtcttgac caagcacttc 120

tgttaccccg gactgagtat caataagctg ctcacgcggc tgaaggagaa aacgtccgtt 180

acccggccaa ttacttcaag aaacccagta ccaccatgaa ggttgcgcag cgtttcgctc 240

cgcacaaccc cagtgtagat caggtcgatg agtcaccgca ttcctcacgg gcgaccgtgg 300

cggtggctgc gctggcggcc tgcccatggg gcaacccatg ggacgcttca atactgacat 360

ggtgcgaaga gtcaattgag ctaattggta gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct 420

aactgcggag cagacgccca agctccagtg ggtagtctgt cgtaacgggt aactctgcag 480

cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt ccttttattc ttacattggc tgcttatggt 540

gacaattgag agattgttac catatagcta ttggattggc catccggtga caaatagagc 600

aattgtatat ctttttgttg gattcatacc actcggcaaa acaaatttca gaaccttgtg 660

ttatattatt agattaaata cagcaaa 687

<210> 14

<211> 725

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain HAI/2016-23066)

<400> 14

tgttcccacc cacggggcct actgggcgcc agcacactgg tatcacggta cctttgtgcg 60

cctgttttat aacccctccc ccgaatgtaa cgtagaagct gaacctaagt ggtcaatagg 120

cggctcagaa caccatctgg gtcttgacca agcacttctg ttaccccgga ctgagtatca 180

ataagctgct cacgcggctg aaggagaaaa cgtccgttac ccggccaatt acttcaagaa 240

acccagtacc accatgaagg ttgcgcagcg tttcgctccg cacaacccca gtgtagatca 300

ggtcgatgag tcaccgcatt cctcacgggc gaccgtggcg gtggctgcgc tggcggcctg 360

cccatggggc aacccatggg acgcttcaat actgacatgg tgcgaagagt caattgagct 420

aattggtagt cctccggccc ctgaatgcgg ctaatcctaa ctgcggagca gacgcccaag 480

ctccagtggg tagtctgtcg taacgggtaa ctctgcagcg gaaccgacta ctttgggtgt 540

ccgtgtttcc ttttattctt acattggctg cttatggtga caattgagag attgttacca 600

tatagctatt ggattggcca tccggtgaca aatagagcaa ttgtatatct ttttgttgga 660

ttcataccac tcggcaaaac aaatttcaga accttgtgtt atattattag attaaataca 720

gcaaa 725

<210> 15

<211> 721

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain HAI/2016-23065A)

<400> 15

cccacccacg gggcctactg ggcgccagca cactggtatc acggtacctt tgtgcgcctg 60

ttttataacc cctcccccga tcgtaacgta gaagctgaac ctaagcggtc aataggcggc 120

tcagaacacc atctgggtct tgaccaagca cttctgttac cccggactga gtatcaataa 180

gctgcttacg cggctgaagg agaaaacgtc cgttacccgg ccaattactt caagaaaccc 240

agtaccacca tgaaggttgc gcagcgtttc gctccgcaca accccagtgt agatcaggtc 300

gatgagtcac cgcattcctc acgggcgacc gtggcggtgg ctgcgttggc ggcctgccca 360

tggggtaacc catgggacgc ttcaatactg acatggtgcg aagagtctat tgagctaagt 420

ggtagtcctc cggcccctga atgcggctaa tcctaactgc ggagcagacg cccaagctcc 480

agtgggtagt ctgtcgtaac gggtaactct gcagcggaac cgactacttt gggtgtccgt 540

gtttcctttt attcttacat tggctgctta tggtgacaat tgagagattg ttaccatata 600

gctattggat tggccatccg gtgacaaata gagcaattat atatcttttt gttggattca 660

taccactcga caaaacaaat ttcagaacct tgtgttatat tattagatta aatacagcaa 720

a 721

<210> 16

<211> 721

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain HAI/2016-23061)

<400> 16

tcccacccac agggcccata gggcgctagc actctggtat tgcggtacct ttgtgcgcct 60

gttttatatt cccaccccca atcgcaactt agaagcagta cttcacgacc aacagtgggc 120

gtgacacacc agccacgtct cggtcaagca cctctgtctc cccggactga gtatcaataa 180

gctgctcacg cggctgaggg agaaaacgtc cgttacccgg ccaattactt cgagaaacct 240

agtaccacca cgaaagttgc gcagcgtttc gatccgcaca accccagtgt agatcaggtc 300

gatgagtcac cgcattcccc acgggcgacc gtggcggtgg ctgcgttggc ggcctgccca 360

tgggagaacc cgtgggacgc ttcaatactg acatggtgtg aagagtctat tgagctaatt 420

ggtagtcctc cggcccctga atgcggctaa tcctaactgt ggagcagatt cccgcatgcc 480

agcgggtggt ctgtcgtaac gggcaactct gcagcggaac cgactacttt gggtgtccgt 540

gtttcctttt attcctatat tggctgctta tggtgacaat tgagagattg ttaccatata 600

gctattggat tggccatccg gtgacaaaca gagcaattat ctaccaattt gttggttttg 660

taccattgaa tttcaacgca ttcaaaactc ttaactttat tttgactctt aatacagcaa 720

a 721

<210> 17

<211> 733

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain HAI/2016-23056)

<400> 17

ctgtgggttg ttcccaccca cggggcctac tgggcgccag cacactggta tcacggtacc 60

tttgtgcgcc tgttttacaa cccctccccc gaacgtaacg tagaagctga acctaagcgg 120

tcaataggcg gctcagaaca ccatctgggt cttgaccaag cacttctgtt gccccggact 180

gagtatcaat aagctgctca cgcggctgaa ggagaaaacg tccgttaccc ggccaattac 240

ttcaagaaac ccagtaccac catgaaggtt gcgcagcgtt tcgctccgca caaccccagt 300

gtagatcagg tcgatgagtc accgcattcc tcacgggcga ccgtggcggt ggctgcgctg 360

gcggcctgcc catggggtaa cccatgggac gcttcaatac tgacatggtg cgaagagtca 420

attgagctaa ttggtagtcc tccggcccct gaatgcggct aatcctaact gcggagcaga 480

cgcccaagct ccagtgggta gtctgtcgta acgggtaact ctgcagcgga accgactact 540

ttgggtgtcc gtgtttcctt ttattcttac attggctgct tatggtgaca attgagaggt 600

tgttaccata tagctattgg attggccatc cggtgacaaa tagagcaatt gtatatcttt 660

ttgttggatt cataccactc gacaaaacaa atttcagaac cttgtgttat atcattagat 720

taaacacagc aaa 733

<210> 18

<211> 708

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain HAI/2016-23051A)

<400> 18

cccactgggc gctagcacac tggtatcccg gtacctttgt gcgcctgttt tataccccct 60

cctccaaccg taacctagaa gcagcaccat atggccaata gtagacgtgg cgcaccagcc 120

acgttttggt caagcacttc tgtttccccg ggccgagtat caataggctg ctcacgcggc 180

tgaaggagaa agcgtccgtt acccggccaa ttacttcgag aaacctagta ccaccatgga 240

agttgcgcgg cgtttcgctc cacacaaccc cagtgtagat cgggtcgatg agtcaccgca 300

tttccccacg ggtgaccgtg gcggtggctg cgttggcggc ctgcccatga ggaaactcat 360

gggacgcttc aatactgaca tggtgtgaag agtctattga gctaattggt agtcctccgg 420

cccctgaatg cggctaatcc taactgcgga gcagatgctc acaaaccagt gggtggtctg 480

tcgtaatggg caactctgca gcggaaccga ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatt 540

ttcacactgg ctgcttatgg tgacaattga aggattgtta ccatatagct attggattgg 600

ccatccggtg acaaacagag cgattgtcta tctatttgtt ggttttgtac cattagattt 660

caaagtcctg aaaaccctca atttcgtctt aacactcaat tcggcaag 708

<210> 19

<211> 723

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain HAI/2016-23050)

<400> 19

ttcccactca cagggcccac tgggcgctag cacactggta tcccggtacc tttgtgcgcc 60

tgttttatac cccctcctcc aaccgtaacc tagaagcagc accatatggc caatagtaga 120

cgtggcgcac cagccacgtt ttggtcaagc acttctgttt ccccgggccg agtatcaata 180

ggctgctcac gcggctgaag gagaaagcgt ccgttacccg gccaattact tcgagaaacc 240

tagtaccacc atggaagttg cgcggcgttt cgctccacac aaccccagtg tagatcgggt 300

cgatgagtca ccgcatttcc ccacgggtga ccgtggcggt ggctgcgttg gcggcctgcc 360

catgaggaaa ctcatgggac gcttcaatac tgacatggtg tgaagagtct attgagctaa 420

ttggtagtcc tccggcccct gaatgcggct aatcctaact gcggagcaga tgctcacaaa 480

ccagtgggtg gtctgtcgta atgggcaact ctgcagcgga accgactact ttgggtgtcc 540

gtgtttcctt ttattttcac actggctgct tatggtgaca attgaaggat tgttaccata 600

tagctattgg attggccatc cggtgacaaa cagagcgatt gtctatctat ttgttggttt 660

tgtaccatta gatttcaaag tcctgaaaac cctcaatttc gtcttaacac tcaattcggc 720

aag 723

<210> 20

<211> 741

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (isolate 123-R2)

<400> 20

ttaaaacagc ctgtgggttg tacccactca cagggcccac tgggcgctag cacactggta 60

tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttataa tcccttcccc accgtaacat agaagctaca 120

cacactgatc aacagcaggc acagcacacc agttgtgtct cgatcaagca cttctgtctc 180

cccggaccga gtatcaatag actgcttacg cggttgaagg agaaaacgtt cgtcacccgg 240

ctgactactt cgaaaagcct agtagtacca tgaatgttgc ggagtgtttc gctcagcact 300

tcccccgtgt agatcaggct gatgagtcac tgcattcccc acgggtgacc gtggcagtgg 360

ctgcgttggc ggcctgccca tggggcaacc catgggacgc ttcaatacag acatggtgcg 420

aagagtctat tgagctagtc agtagtcctc cggcccctga atgcggctaa tcctaactgc 480

ggagcatgcg cctccgaccc agggggtagc atgtcgtaat gggcaactct gcagcggaac 540

cgactacttt gggtgtccgt gtttcctttt attcttatat tggctgctta tggtgacaat 600

tgagagattg ttgccatata gctattggat tggccatccg gtgagtaata gagctattat 660

atactccttt gtgggttttg tgccactgga tcacaaggtc ttgaaaactc tcacttttgt 720

cataatacta aacactgcaa a 741

<210> 21

<211> 747

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain Sakhalin/10_DU145)

<400> 21

tgaccttaaa acagctctgg ggttgtaccc actcacaggg cccactgggc gctagcacac 60

tggtatcacg gtacctttgc gcgcctgctt tataacccct tccccaaacg taacgtagaa 120

gctacacaca ctgatcaata gcaggcacag cgcaccagtt gtgtcccgat cgagcacttc 180

tgtctccccg gaccgagtat caatagactg ctcacgcggt tgaaggagaa aacgttcgtt 240

aaccggctga ctacttcgag aaacctagta gtactatgaa agttgcgaag cgtttcactc 300

agcacttccc ccgtgtaggt caggccgatg agtcactgcg ttccccacgg gtgatcgtgg 360

cagtggctgc gttggcggcc tgcccatggg gtaacccatg ggacgcttca atacggacat 420

ggtgcgaaga gtctattgag ctagccagta gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct 480

aactgcggag catgtgccct cgatccagag ggtagcatgt cgtaacgggc aactctgcag 540

cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt ctttttattc ttatactggc tgcttatggt 600

gacaattggg agattgttac catatagcta ttggattggc cacccggtga ctaatagagc 660

tattatctac tcctttatag gttttgtgcc attgaactac aaggtcttaa agactctcaa 720

ctttatcatc atacttaata ctgcaaa 747

<210> 22

<211> 742

<212> DNA

<213> Echovirus E3 (strain Sakhalin/10_RD)

<400> 22

ttaaaacagc tctggggttg tacccactca cagggcccac tgggcgctag cacactggta 60

tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttataa ccccttcccc aaacgtaacg tagaagctac 120

acacactgat caatagcagg cacagcgcac cagttgtgtc ccgatcgagc acttctgtct 180