马铃薯块茎调控基因StRAP2.7b及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术和马铃薯育种技术领域，具体涉及一种马铃薯块茎调控基因StRAP2.7b及其应用。

背景技术

块茎是马铃薯主要的食用和经济器官，块茎的形成发育直接影响着马铃薯的产量和品质，研究其形成和发育机制对提高块茎产量意义重大。马铃薯从匍匐茎到块茎的转变是一个重要的发育阶段，除了受自身遗传的影响外，还受许多环境因子、营养条件和内源激素的影响。近些年，研究人员基于不同的影响因子，解析出了结薯的初步调控网络，但对于育种而言，这些基因资源依然很有限。

在已有的结薯调控网络中，韧皮部移动蛋白信号StSP6A(SELF-PRUNING 6A)是调控结薯的下游关键基因，其能显著促进块茎的形成，其他因子可以通过调控StSP6A来影响结薯。LD下，B-box转录因子StCO(CONSTANS)和StSP6A旁系同源蛋白StSP5G(SELF-PRUNING5G)通过抑制StSP6A的表达，进而抑制块茎形成。同时，StCOL1可以与StSP5G启动子区域的TGTGGT元件结合，激活StSP5G基因的表达，进而抑制StSP6A的表达，使马铃薯在LD条件下结薯受阻。而红光受体光敏色素基因StPHYA(Phytochrome A)、StPHYB(Phytochrome B)和StPHYF(Phytochrome F)在LD环境下通过促进StCO蛋白的稳定和StSP5G的表达，进而抑制StSP6A的转录，负调控结薯过程。DOF蛋白家族转录因子StCDF1(CYCLING DOF FACTOR 1)是SD下促进块茎形成的重要分子，它通过抑制StCO来促进StSP6A表达，从而刺激块茎形成。BEL-LIKE转录因子StBEL5(BEL1-LIKE 5)的全长mRNA是一种长距离移动信号，该信号在叶片中转录并转移到根和匍匐茎中，对块茎形成具有正向调节作用。StBEL5/StPOTH1(Knotted1-like)可通过正调控靶标StSP6A和StCDF1来促进结薯过程。也有研究表明，在匍匐茎中，StBEL5/StPOTH1与StGA20ox1和StGA2ox1启动子中的串联TTGAC基序结合，调控GA代谢，从而达到块茎形成所需的低GA水平。此外，糖转运蛋白StSWEET11(Sugar willeventually be exported transporter)和分枝抑制因子StBRC1(Branched 1b)可以与StSP6A相互作用调控库-源平衡，促进地下块茎的形成。除了上述的调控基因外，一些小RNA，如miR172和miR156等，以及表观调控因子StE(z)2等，也参与了块茎的形成和发育。

AP2/ERF家族转录因子在植物生长发育和胁迫应答中发挥着重要的作用。根据AP2/ERF类转录因子结构域的数量及结合序列，可以将AP2/ERF类转录因子分为5个亚家族。其中，AP2亚家族含有两个高度相似且串联重复出现的AP2/ERF结构域，该亚家族的基因主要参与植物的开花、果实发育以及种子萌发和发育等过程。研究表明，开花过程与块茎形成过程密切相关，它们共享很多调控分子，如FT和CO等。马铃薯AP2亚家族基因StRAP2.7b的拟南芥同源基因TOE1/2(Target ofearlyactivation tagged 1/2)作为CRY2(Cryptochrome2)的下游组分，可通过调节CO活性和FT转录介导CRY2对光周期开花的调节。TOE1也可以不依赖于CO，作为miRNA172的靶标，直接结合FT的TA-rich元件调控其表达，进而调控拟南芥开花时间。此外，AP2家族基因在分枝调控中也发挥着重要作用。最近研究表明，圆锥南芥AP2-like基因AaTOE2(Target of EAT2)作为AaSPL5(Quamosapromoter-binding protein-like 15)的上游调控因子，延迟腋生分生组织的起始，抑制腋芽在冷暴露前和冷暴露期间的开花，以保证植物营养生长的维持。在马铃薯中鉴定到了包含miR172结合位点的AP2亚家族基因StRAP1，其在过表达miR172的植株和PHYB沉默的植物中下调，表明StRAP1可能作为miR172的靶标抑制结薯，且具有负调控BEL5的潜能，但关于AP2亚家族基因调控块茎形成的更丰富机制还并未见报道。因此解析马铃薯AP2转录因子将对揭示马铃薯结薯分子机理具有重要意义，为马铃薯提供更多的基因资源。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种马铃薯块茎调控基因StRAP2.7b及其应用。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种马铃薯块茎调控基因StRAP2.7b，其包含9个外显子，序列如SEQIDNo.1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了上述马铃薯块茎调控基因StRAP2.7b在马铃薯块茎改良育种中的应用。

进一步地，所述应用为在马铃薯中过表达StRAP2.7b提高马铃薯块茎的数量和重量。

本发明还提供了上述马铃薯块茎调控基因StRAP2.7b的重组表达载体。

进一步地，所述重组表达载体为StRAP2.7b超表达载体。

进一步地，所述重组表达载体以pRC19-eGFP和pHELLSGATE-8载体为骨架。

本发明还提供了上述马铃薯块茎调控基因StRAP2.7b的重组表达载体在马铃薯块茎改良育种中的应用。

进一步地，所述应用为将马铃薯块茎调控基因StRAP2.7b的超表达重组表达载体采用农杆菌转化法遗传转化到马铃薯E3中获得块茎数量和重量提高的马铃薯转基因株系。

本发明还提供了一种提高马铃薯块茎数量和重量的方法，所述方法为在马铃薯中过表达StRAP2.7b提高块茎的数量和重量。

进一步地，所述方法为以pRC19-eGFP和pHELLSGATE-8载体为骨架，构建StRAP2.7b超表达载体，采用农杆菌转化法遗传转化到马铃薯E3中获得块茎数量和重量提高的StRAP2.7b超表达的转基因株系。

本发明的过程为：发明人从马铃薯块茎发育不同阶段和组织表达两个转录组数据中筛选到马铃薯AP2转录因子StRAP2.7b。该基因在匍匐茎中较高表达，且在匍匐茎膨大早期块茎起始时表达较高，而在块茎形成后的膨大发育阶段表达迅速下降。亚细胞定位结果显示目的基因定位于细胞核，经测序鉴定，其包含9个外显子，序列如SEQ ID No.1所示，编码407个氨基酸，序列如SEQ ID No.2所示。通过农杆菌介导方法进行遗传转化获得超表达转基因株系和干涉转基因株系，盆栽种植实验结果表明，StRAP2.7b过表达植株的匍匐茎和块茎数量显著增加。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种马铃薯块茎调控基因StRAP2.7b，其包含9个外显子，序列如SEQ ID No.1所示，编码407个氨基酸，序列如SEQ ID No.2所示，该基因位于细胞核中，在马铃薯中过表达StRAP2.7b可以提高块茎的数量和鲜重。这对解析马铃薯结薯分子机制和马铃薯改良育种提供了新的遗传材料和理论依据。

附图说明

图1为马铃薯StRAP2.7b信息学分析。A：马铃薯AP2/ERF家族高表达水平差异表达基因在不同组织中的表达情况，Stolons～Stolons2为匍匐茎逐渐膨大的不同时期，Tuber1～Tuber5为块茎形成后进一步膨大的不同时期；B：StRAP2.7b与拟南芥AP2亚家族基因的进化树分析；C：StRAP2.7b基因结构图；D：StRAP2.7b与拟南芥和番茄同源基因的序列比对，红线标识序列为AP2保守结构域。

图2为StRAP2.7b时空表达模式。A：来自“大西洋”不同组织以及匍匐茎和块茎不同发育时期的RNA-Seq数据；B：来自Spud数据库的“DM”不同组织RNA-Seq数据；C：“E3”不同组织部位qRT-PCR；D：“E3”匍匐茎不同弯钩和膨大时期的qRT-PCR 30°～150°为匍匐茎弯钩角度，在匍匐茎形成块茎时顶端弯钩首先会变直；Stolons～Stolons2为匍匐茎逐渐膨大的不同时期；Tuber1～Tuber5为块茎形成后进一步膨大的不同时期；E：亚细胞定位。

图3为StRAP2.7b超量和干涉株系鉴定。A：StRAP2.7b超量株系电泳检测；B：StRAP2.7b干涉株系电泳检测；C：StRAP2.7b超量株系qRT-PCR验证；D：StRAP2.7b干涉株系qRT-PCR验证。

图4为光合指标检测。

图5为盆栽90d植株及块茎的状态。

图6为盆栽植株农艺性状统计。A：单株薯数；B：单株块茎鲜重；C：地上部分鲜重；D地上部分干重；E地上分枝数；F：主匍匐茎数量；G：次级匍匐茎数量；H：植株株高；I：节数；J：平均节间长度；K：块茎鲜重统计热图，颜色的变化表示块茎数量的多少；实验重复2次(n＝10)。误差线为±SEM。

图7为离体培养植株表型统计。A：LD条件下离体培养90d后收获的试管薯；B：块茎的鲜重；C：块茎的形成时间；实验重复3次(n＝27)。误差线为±SEM。**表示p<0.01。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。需要说明的是，本发明实施例中未注明实验材料来源的实验材料均能商业获得，本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验方法或按照实验材料厂商建议方法进行。另外，需要说明的是本发明中所述的马铃薯E3为鄂马铃薯3号，StRAP2.7b表示马铃薯的RAP2.7b基因。

实施例1StRAP2.7b的分子特征和表达模式分析

对马铃薯不同组织的RNA-Seq数据进行分析，结果表明StRAP2.7b在匍匐茎中较高表达，且在块茎膨大早期表达较高，而在块茎形成后的膨大发育阶段表达迅速下降(图1A，2A-B)。且qRT-PCR与RNA-Seq的结果一致，表明StRAP2.7b在匍匐茎和块茎膨大早期表达量较高(图2C，2D)，推测其可能参与匍匐茎的形成和块茎的膨大。多重序列比对发现，StRAP2.7b编码蛋白含有AP2结构域，属于AP2/ERF转录因子家族(图1D)。进化树分析表明，StRAP2.7b与拟南芥开花调控基因RAP2.7(TOE1)、TOE2、SMZ、SNZ和AP2同属一个进化枝，且与RAP2.7的遗传距离最近，因此将这个基因命名为StRAP2.7b(图1B)。对StRAP2.7b的基因序列和蛋白序列进一步克隆分析，结果表明，其包含9个外显子(图1C),序列如SEQ ID No.1所示，编码407个氨基酸，序列如SEQ ID No.2所示，等电点为9.24，为亲水蛋白。亚细胞定位结果表明，StRAP2.7b编码蛋白位于细胞核(图2E)。

实施例2超量表达和干涉转基因的获得和鉴定

为了深入研究StRAP2.7b在马铃薯块茎形成中的功能，以pRC19-eGFP和pHELLSGATE-8载体为骨架分别构建了StRAP2.7b的超量和RNAi干涉载体。以“E3”为受体，采用农杆菌转化法进行遗传转化。经基因组PCR鉴定后分别获得8个超量和16个干涉转基因株系(图3A-B)。利用qRT-PCR进一步鉴定阳性株系StRAP2.7b基因的表达变化，结果显示超量转基因株系的表达量为WT的18倍以上(图3C)，StRAP2.7b的干涉株系表达量降低为WT的0.35-0.8倍(图3D)，表明过表达和干涉效果较好，可以用于后续功能研究。

实施例3超量表达StRAP2.7b转基因株系的表型鉴定

将WT和超量植株的单茎节培养于MS培养基中14d后，洗去培养基，炼苗1周后种植于植物生长室(10h光/14h暗，22℃/18℃)中。生长50d后，测定植株的光合作用相关指标，结果表明，超量株系的净光合速率(Photo)、气孔导度(Cond)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Trmmor)均较WT高，且前三者均显著上升(图4A-D)，这表明StRAP2.7b可提高植株光合作用。

生长90d后，测定植株的农艺性状，结果显示，超量植株的块茎数量(图5，图6A)、单株产量(图5，图6B)、地上部分鲜重(图6C)和地上部分干重(图6D)均增加。株高增高(图5，图6H)，节间数目和节间长度均有增加(图6I-J)，地上分枝增多(图5，图6E)，主匍匐茎和次级匍匐茎数量显著增多(图6F-G)，小薯数目增加(图6K)。这表明StRAP2.7b可以促进地上分支、地下匍匐茎和块茎的形成，增加光合，提高块茎的数量和单株产量。

进一步对StRAP2.7b过表达株系的离体培养植株进行了观察和鉴定。将WT和过表达植株的单茎节培养于MS培养基中，置于长日照(Long day，LD)环境中生长90d，对其块茎形成时间，块茎数量和重量等性状进行统计分析。结果表明，StRAP2.7b过表达植株的块茎形成时间提前(图7C)，最终形成块茎的数目和鲜重均多于WT(图7A、B)。这些结果进一步表明StRAP2.7b对块茎形成有促进作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。