一种浓香型大曲酵母菌的检测方法

技术领域

本发明涉及微生物学检测技术领域，具体为一种浓香型大曲酵母菌的检测方法。

背景技术

酵母菌是白酒酿造过程中一类非常重要的微生物，主要进行酒精发酵。其中酿酒酵母是白酒生产过程中的酒精发酵主体菌，其发酵能力直接影响原料的出酒率，酒精发酵的副产物如酸类、酯类、醇类又影响其白酒风味，在白酒生产中具有重要作用，因此，需要对酵母菌进行检测。

现有的专利，如一种活性酵母菌的检测方法(CN202210077127.8)，该方法为不同类型活性酵母菌检测方法，特征在于使用孟加拉红培养基或沙氏氯霉素琼脂培养基并采用浇注法培养活性酵母。其主要缺陷如下：

(1)该方法只适用于纯种酵母菌计数，无法抑制浓香型大曲样品中细菌的生长，从而影响检测结果。

(2)该方法从大曲中分离酵母菌时易受优势丝状真菌(霉菌)的干扰，霉菌常常很快长满培养皿，将酵母菌覆盖，难以对酵母菌进行定量计数、观察和分离纯化。

(3)该方法使用的浇注法只适用于样品数量少且为纯种酵母菌的样品检测，多个样品检测耗时长、难度大。

因此，本发明提供一种浓香型大曲酵母菌的检测方法，用于解决上述所提出的相关技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种浓香型大曲酵母菌的检测方法，在YPD培养基添加体积分数0.2％的乙酸能抑制霉菌的生长，添加0.2％的氯霉素抑制细菌生长，此外，不仅能满足对浓香型大曲酵母菌计数需求，同时也能满足分离纯化的需求，可针对不同香型大曲进行合理设计乙酸的添加量，不限于浓香型大曲。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种浓香型大曲酵母菌的检测方法，包括以下步骤：

Ⅰ、培养基制备：酵母菌培养采用YPD培养基，将YPD培养基灭菌冷却至60～70℃时，加入氯霉素和乙酸，待YPD培养基冷却至50℃左右时倒入平板中，每个平板中含培养基约15～20mL，再待平板凝固后，于无菌操作室中倒置放置2～3天，待平板干燥，无冷凝水、无污染后即可使用；

Ⅱ、样品预处理：按0.1～0.2g/mL的固液比将适量的曲样置于适量的生理盐水中，然后摇床活化后取出，制成1:10的菌悬液；

Ⅲ、培养：将菌悬液进行10倍梯度稀释，取合适浓度的稀释液进行接种混匀，恒温培养；

Ⅳ、菌落计数：用肉眼观察，记录稀释倍数和相应的酵母和霉菌菌落数，计算菌落数。

本发明进一步的设置为：所述步骤Ⅰ中的氯霉素的加入量为YPD培养基质量的0.2％。

本发明进一步的设置为：所述步骤Ⅰ中的乙酸的加入量为YPD培养基体积的0.2％。

本发明进一步的设置为：所述步骤Ⅱ中的摇床活化的温度30℃，转速为180r/min。

本发明进一步的设置为：所述步骤Ⅱ中的摇床活化的时间为30min。

本发明进一步的设置为：所述步骤Ⅲ中的恒温培养的温度为30℃，培养时间为24～48h。

本发明进一步的设置为：所述步骤Ⅳ中，在观察时，还可用放大镜或低倍镜进行观察。

本发明进一步的设置为：所述步骤Ⅳ中，计算菌落数的公式为：菌落总数＝同一稀释度两次重复的菌落平均数×稀释倍数。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所提供的浓香型大曲酵母菌的检测方法，将02.％的氯霉素添加至YPD培养基中，能有效抑制细菌生长，同时在培养基中添加体积分数0.2％的乙酸抑制霉菌的生长，检测结果准确度较高，能满足对浓香型大曲酵母菌进行定量计数、观察和分离纯化的需求；此外，采用稀释涂布平板法检测酵母菌，能同时满足多样品检测，操作简单、耗时短。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中不添加0.2％乙酸的效果图；

图2为本发明中添加0.2％乙酸的效果图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本实施例提供了一种浓香型大曲酵母菌的检测方法，包括以下步骤：

Ⅰ、培养基制备：酵母菌培养使用YPD培养基，YPD培养基灭菌后冷却至60～70℃时加入0.2％的氯霉素(YPD培养基质量的0.2％)，同时添加体积分数0.2％的乙酸抑制霉菌的生长，待培养基冷却至50℃左右时倒入平板中，每个平板中含培养基约15～20mL，待平板凝固后，于无菌操作室中倒置放置2～3天，待平板干燥，无冷凝水、无污染后即可使用。

Ⅱ、样品预处理：称取10g曲样至90mL生理盐水中，于30℃，180r/min摇床活化30min后取出，制成1:10的菌悬液；

Ⅲ、培养：将上述菌悬液进行10倍梯度稀释，取合适浓度的稀释液进行接种混匀，恒温培养，于30℃培养24～48h。

Ⅳ、菌落计数：用肉眼观察，必要时可用放大镜或低倍镜，记录稀释倍数和相应的酵母和霉菌菌落数，以菌落形成单位(colony-forming units，CFU)表示，菌落应采用两个平板(菌落数在10～150CFU之间)的平均数乘以相应稀释倍数，即为每克或每毫升检样中所含酵母菌数，计算公式如下：

菌落总数(大曲以CFU/g表示)＝同一稀释度两次重复的菌落平均数×稀释倍数。

此外，需要说明的是，本实施例中的YPD培养基也可用MEA培养基替代。

对比例：本实施例所提供的浓香型大曲酵母菌的检测方法和实施例大致相同，其主要区别在于：本实施例中不添加0.2％乙酸。

效果测试

通过本发明中实施例得到如图1所示的效果图；通过对比例得到如图2所示的效果图。

由图1和图2可知，将氯霉素(0.2％)添加至YPD培养基中，能有效抑制细菌生长；同时在YPD培养基中添加体积分数0.2％的乙酸抑制霉菌的生长，检测结果准确度较高，能满足对浓香型大曲酵母菌进行定量计数、观察和分离纯化的需求。

本发明所提供的浓香型大曲酵母菌的检测方法，根据酒醅发酵过程中随乙酸和乳酸含量的升高，霉菌含量急剧降低而酵母菌含量逐渐升高的现象，用常规YPD培养基为基础培养基，测试了添加不同量的乙酸和乳酸，以及不同比例的乙酸乳酸组合物，对浓香型大曲中霉菌的抑制效果和对酵母菌生长的影响进行探究，发现在灭菌后的YPD培养基中添加体积分数0.2％的乙酸，30℃培养24～48h之内可有效抑大曲中的霉菌，实现对酵母菌的有效分离、计数和纯化培养。

本发明所提供的浓香型大曲酵母菌的检测方法，将02.％的氯霉素添加至YPD培养基中，能有效抑制细菌生长，同时在培养基中添加体积分数0.2％的乙酸抑制霉菌的生长，检测结果准确度较高，能满足对浓香型大曲酵母菌进行定量计数、观察和分离纯化的需求；此外，采用稀释涂布平板法检测酵母菌，能同时满足多样品检测，操作简单、耗时短，具有更广阔的市场前景，更适宜推广。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。