一种基于GelMA和PLMA混合水凝胶涂覆树脂的白内障术后后囊膜混浊3D生物打印模型和打印方法

技术领域

本发明设计一种基于眼部晶状体结构的白内障术后后囊膜混浊(posteriorcapsule opacification，简称PCO)的3D打印模型，并提出基于GelMA和PLMA的复合水凝胶作为树脂模型涂层来满足细胞培养的条件，进而研究白内障手术后PCO的发病机制和药物干预的方法。

背景技术

白内障是世界首位的致盲性眼病，是由于晶状体混浊导致的视觉障碍性疾病，需要通过超声乳化手术作为主要治疗方法[1,2]。PCO是白内障术后首位并发症，尽管激光后囊切开术被视为标准治疗方法，但也存在一些风险，例如人工晶状体(IOL)损伤或脱位、炎症增加和视网膜脱落。PCO发生的机制未明，已经提出了几个因素可能导致其发生，包括炎症反应、囊袋收缩、年龄和IOL设计和材料性质，这些因素可以触发人晶状体上皮细胞(HLECs)的增殖、迁移和转分化[3-5]。因此进一步研究以充分阐明参与PCO发展的复杂机制，可以帮助制定预防策略和干预措施，改善白内障手术后的视觉效果。

为了研究PCO的潜在机制，可以采用多种模型，包括体外细胞或组织培养，体外囊袋模型和动物模型[3-5]，每种模型都有其优点和弱点。晶状体囊袋是一种极其精细和可塑性的结构，为HLECs增殖提供了一个框架。然而，晶状体囊袋，脆弱性在构建提供足够支持的模型方面存在挑战。因此，已经开发了几种支撑方法来克服这个障碍，包括针插、囊袋张力环、硅胶管和3D打印支撑结构等[6-8]。此外，已经建立了包含培养基中各种生长因子的前房模型，以复制PCO微环境[6]。然而，这些支撑方法有时可能导致畸变或晶状体囊袋塌陷等。因此，现有的PCO模型尚不能完全模拟PCO发病的微环境，存在着支撑不足、三维培养系统缺失、无法模拟体内微环境动态变化、缺乏仿生曲率变化以及在体内模型中的干预方法不足等限制。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于GelMA和PLMA混合水凝胶涂覆树脂的白内障术后后囊膜混浊3D生物打印模型和打印方法。

第一方面，本发明提供了一种基于GelMA和PLMA混合水凝胶涂覆树脂的白内障术后后囊膜混浊3D生物打印模型，所述的3D生物打印模型是通过以下方法打印得到的:

(a)模型设计:模型是根据人晶状体的解剖参数设计的，所述的模型采用外部圆柱形基座的中空结构，所述的模型设有上部分和下部分，模型的上部分和下部分通过螺纹连接，模型的上部分前表面设有直径为5.4-5.6mm圆形开口，在模型的赤道区域设有底座周边一圈的弧形向下凹槽；

(b)水凝胶的制备

所述的GelMA和PLMA水凝胶含有5％-15％浓度的GelMA和2％浓度的PLMA，所述的GelMA的氨基置换度为60％-90％，水凝胶溶液被旋涂到模型上，通过紫外光(UV,波长范围365-405nm)照射样品30-60秒来诱导凝胶化；

(c)模型的3D打印

将设计参数输入打印机，使用透明环氧树脂作为打印材料，打印完成后，将模型进行超声波清洗，并经过UV固化。

作为一个优选例，还包括步骤(d)，经过紫外线交联和酒精消毒处理。

作为另一优选例，所述的步骤(a)模型的上部分前表面设有直径为5.5mm圆形开口，在模型的赤道区域设有底座周边一圈，宽为1mm的弧形向下凹槽；所述的步骤(b)所述的GelMA和PLMA水凝胶含有5％浓度的GelMA和2％浓度的PLMA，所述的GelMA的氨基置换度为60％，所述的步骤(c)将模型固定在载玻片上，并放置在旋涂仪中，将按步骤(b)水凝胶加热，然后注入模型的中央区域，旋涂参数设置为2000转/分钟，进行两次旋涂，然后UV固化。

第二方面，本发明提供了一种基于GelMA和PLMA混合水凝胶涂覆树脂的白内障术后后囊膜混浊3D生物打印方法，所述的打印方法包括以下步骤：

(a)PCO模型设计:模型是根据人晶状体的解剖参数设计的，所述的模型采用外部圆柱形基座的中空结构，所述的模型设有上部分和下部分，模型的上部分和下部分通过螺纹连接，模型的上部分前表面设有直径为5.4-5.6mm圆形开口，在模型的赤道区域设有底座周边一圈的弧形向下凹槽；

(b)水凝胶的制备

所述的GelMA和PLMA水凝胶含有5％-15％浓度的GelMA和2％浓度的PLMA，所述的GelMA的氨基置换度为60％-90％，水凝胶溶液被旋涂到模型上，通过紫外光(UV,波长范围365-405nm)照射样品30-60秒来诱导凝胶化；

(c)PCO模型的3D打印

将设计参数输入打印机，使用透明树脂作为打印材料，打印完成后，将模型进行超声波清洗，并经过UV固化。

作为一个优选例，所述的打印方法还包括步骤(d)，经过紫外线交联和酒精消毒处理。

作为另一优选例，所述的步骤(a)模型的上部分前表面设有直径为5.5mm圆形开口，在模型的赤道区域设有底座周边一圈，宽为1mm的弧形向下凹槽；所述的步骤(b)所述的GelMA和PLMA水凝胶含有5％浓度的GelMA和2％浓度的PLMA，所述的GelMA的氨基置换度为60％，所述的步骤(c)将模型固定在载玻片上，并放置在旋涂仪中，将按步骤(b)水凝胶加热，然后注入模型的中央区域，旋涂参数设置为2000转/分钟，进行两次旋涂，然后UV固化。

第三方面，本发明提供了AICAR、4-OI在制备基于眼部晶状体结构的白内障术后后囊膜混浊疾病药物中应用。

本发明优点在于：

(1)使用GelMA和PLMA水凝胶包覆树脂作为材料，能够提供稳定的支撑和仿生的晶状体囊袋结构，为细胞提供了合适的生长微环境；

(2)通过3D生物打印技术，可以精确控制PCO模型的形状和结构；

(3)设计开闭结构，便于定位、干预和染色观察；

(4)模型稳定可靠，可重复使用。

附图说明：

图1PCO模型图

图2PCO制备和药物干预流程

图3PCO模型制备及功能示意图

图4PCO模型生物相容性和表面涂层方法比较

图5PCO模型用于药物干预分析

图6PCO模型的共聚焦显微镜活细胞成像

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.实验材料

人晶状体上皮细胞系(HLECs SRA01/04)来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。DAPI、calcein-AM和碘化丙啶(PI)由上海碧云天生物技术有限公司提供(中国上海)。CCK-8试剂盒由Dojindo Laboratories提供(日本熊本)。磷酸盐缓冲液(PBS)由HyClone提供。青霉素-链霉素、胎牛血清(FBS)和培养基(DMEM)由Gibco提供(美国)。3D打印机型号为Formlabs Form3+(美国Formlab)，透明环氧树脂型号为RS-F2-GPCLCN-04(美国Formlab)。甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和甲基丙烯酰化聚赖氨酸(PLMA)水凝胶由EFL股份有限公司提供(中国苏州)。CellTrackerTMBlue CMAC荧光探针和BODIPY 581/591C11试剂盒(D3861)由Thermo Fisher Scientific提供(美国)。EdU细胞增殖Apollo567试剂盒由RiboBio提供(中国广州)。药物制剂，

包括5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamideribonucleotide,AICAR)、CDK7选择性共价抑制剂THZ1、索比尼尔(sorbinil)、4-辛基衣康酸(4-Octyl itaconate,4-OI)和黄腐酚(xanthohumol)由MedChemExpress(MCE，美国)提供。斑蝥素(Zebularine，一种甲基化转移酶DNMT1抑制剂)、雷帕霉素(Rapamycin)和咖啡酸苯乙酯(CAPE)由Aladdin Biochemical Technology Co.，Ltd.提供(中国上海)。

2.实验方法

(1)PCO模型设计

PCO模型是根据人晶状体的解剖参数设计的，水平直径为11.665mm，垂直直径为4.023mm，后表面曲率半径为10mm。前表面模拟了在白内障手术过程中通过连续环形撕囊制作的直径为5.4-5.6mm(优选为5.5mm)的圆形开口。在PCO模型的赤道处赤道区域预留底座周边一圈，宽为1mm的弧形向下凹槽，以容纳接种的细胞。

为了准确复制白内障手术后的形状，整个模型采用外部圆柱形基座的中空结构。为了便于观察和干预，PCO模型设计成可以打开的结构。模型的上下部分通过螺纹连接，并特别加入了槽口以容纳细胞接种。在上下部分打开并接种细胞后，它们可以沿模型的曲线牢固固定。然后，整个模型被填充满培养基以支持细胞生长。完成所需的干预后，可以打开模型进行染色和观察。模型的外底部使用树脂材料(透明环氧树脂)进行3D打印，然后该中空的表面通过不同参数的旋涂法涂覆上超薄层水凝胶。这种水凝胶复制了晶状体囊的结构，为细胞培养提供了支架(图1)。

请参看图1，图1左图为基于GelMA和PLMA混合水凝胶涂覆树脂的白内障术后后囊膜混浊3D生物打印模型整体图，图1右边上图为模型上部分，图1右边下图为模型下部分，图1左图中的标号1为模型的上部分前表面圆形开口，图1右边上图标号1为模型的上部分前表面圆形开口，图1左图中的标号2为在模型的赤道区域设有底座周边一圈的弧形向下凹槽，图1右边下图标号2为在模型的赤道区域设有底座周边一圈的弧形向下凹槽。

(2)水凝胶的制备

为了制备0.25％(w/v)的引发剂标准溶液，将20毫升PBS加入含有0.05克LAP的棕色瓶中。混合物在40-50℃的水浴中轻轻搅拌并加热15分钟，期间间歇性搅拌。GM30、GM60和GM90均可应用于细胞培养，三种型号分别表示氨基取代度为30％、60％和90％，同等条件下，取代度越高，固化后的水凝胶强度越强。PLMA是一种改性的聚赖氨酸，具有广谱抗菌和抗真菌活性。通过在紫外或可见光作用下由光引发剂交联来实现PLMA的凝胶化。为了制备水凝胶溶液，将所需量的GelMA或PLMA称重并放入离心管(2％浓度对应于20mg/ml，5％-50mg/ml，10％-100mg/ml，15％-150mg/ml)。通过在室温下使用引发剂标准溶液彻底溶解PLMA，然后加入GelMA来制备混合水凝胶溶液。将混合物或纯GelMA水凝胶溶液在有光屏蔽的水浴中加热至60-70℃20-30分钟，定期搅拌。最后，使用0.22微米的无菌注射器过滤器立即对GelMA溶液进行灭菌处理，以防止低温下凝胶化(图2中的C)。之后，水凝胶溶液被旋涂到PCO模型上。通过紫外光(UV,波长范围365-405nm)照射样品30-60秒来诱导凝胶化。

(3)PCO模型的3D打印

将设计参数输入Form 3+SLA 3D打印机，使用透明树脂(透明环氧树脂)作为打印材料，该材料具有光学透明度、表面光滑度和高分辨率。打印过程大约需要2小时18分钟。打印完成后，将模型进行3分钟超声波清洗，并经过UV固化15分钟。

将模型牢固固定在玻璃载玻片上，并放置在Laurell旋涂仪中。将按照前述方法制备的GelMA水凝胶加热至60℃，然后注入PCO模型的中央区域，体积为200μl。旋涂参数设置为2000转/分钟，进行2轮旋涂，然后UV固化1分钟。涂有水凝胶的模型随后浸泡在75％酒精中1小时，消毒后用于细胞培养(图2)。

(4)细胞培养

HLEC-SRA01/04细胞在含有10％胎牛血清(Gibco,美国)、100mg/ml链霉素和100units/ml青霉素的高葡萄糖DMEM培养基(Gibco,美国)中培养。细胞在37℃、5％ CO

(5)细胞功能评估

为了评估晶状体上皮细胞的功能，应用Calcein-AM和PI双染色进行活死细胞染色，将1μl PI和1μl Calcein-AM加入1ml DMEM中制备PI和Calcein-AM稀释液(最终浓度为10μM)。然后，每个孔加入200μl PI和Calcein-AM稀释液，在37℃下孵育30分钟。洗涤后490nm激发滤光片(绿色)观察活细胞，使用545nm激发滤光片(红色)观察死细胞。

使用阳离子荧光染料Rhodamine 123来评估线粒体膜电位。通过稀释制备2μM的最终浓度的Rhodamine 123，并加入到每个孔中，在37℃下孵育30分钟。洗涤后用DAPI染核，490nm的激发波长观察绿色荧光强度，表示线粒体膜电位的强度。细胞核染色使用450nm的激发波长观察。

使用BODIPY 581/591C11试剂盒进行脂质过氧化水平的评估。将细胞在5μM的最终浓度的BODIPY-C11探针中，在37℃下培养1小时。洗涤后将24孔板放置在倒置荧光显微镜下观察。在氧化还原反应中，发射波长从591nm(还原形式，橙色荧光)向510nm(氧化形式，绿色荧光)移动。

(6)药物干预

为了探索PCO模型对药物筛选的影响，我们选择了8种具有抗凋亡、抗炎和抗氧化特性的药物。这些化合物被用于干预HLECs功能，旨在观察它们对细胞增殖、迁移和凋亡的影响。

Zebularine是一种DNA甲基转移酶抑制剂，通过下调PI3K/Akt和MAPK信号通路来剂量依赖地抑制HLEC增殖[9,10]。AICAR是一种AMP激活蛋白激酶(AMPK)激活剂，起到渗透性腺苷酸单磷酸类似物的作用。它在调节能量代谢、调节葡萄糖和脂质代谢、抑制促炎细胞因子和iNOS产生方面发挥重要作用。此外，AICAR还作为自噬、YAP和线粒体自噬抑制剂[11]。THZ1是一种选择性共价结合CDK7抑制剂，通过抑制Notch和TGFβ/Smad信号通路，在HLEC中抑制TGFβ2介导的上皮-间质转化(EMT)，显示出作为PCO的新型治疗药物的潜力[12]。雷帕霉素(Sirolimus)是一种特异性mTOR抑制剂，通过针对某些生长因子介导的AKT/mTOR信号通路有效抑制HLEC的增殖和迁移[13]。Sorbinil是一种醛糖还原酶抑制剂，通过阻断MAPK信号通路，从而抑制LEC的增殖和EMT，有助于预防PCO[14,15]。4-OI是一种内源性水杨酸盐衍生物，具有细胞膜渗透性，通过上调NRF2和下调p38信号通路发挥其抗炎作用[16]。Xathohumol是一种黄酮类化合物，表现出显著的抗氧化、抗炎、抗菌、抗真菌和抗肿瘤特性[17]。CAPE是蜂胶的主要活性成分，是一种黄酮类化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌和抗真菌等多种药理作用，能有效保护多个器官[18]。这些药物干预浓度如下：Zebularine(10μM)、THZ1(400nM)、Rapamycin(200nM)、Sorbinil(100nM)、Xathohumol(20μM)、4-OI(100μM)、CAPE(20μM)和AICAR(50μM)。

(7)共聚焦显微镜观察

用于活细胞成像的HLEC以1×10

随后，使用ZEISS LSM 900共聚焦显微镜对倒置的PCO模型在共聚焦皿中进行成像，使用490nm激发滤光片(绿色)和5倍放大倍率。应用多维采集模式，获取1900μm高度范围和50μm间隔的Z-stack图像。使用14×14(总面积：16228.1μm

3.实验结果

(1)3D打印和PCO模型构建

本研究探索了体外PCO模型的构建方法。首先，模型的外部设计基于晶状体的解剖结构和白内障手术后的晶状体囊膜结构(图2中的A，B)。然后使用树脂(透明环氧树脂)材料进行3D打印，创建一个稳定的外层结构。整个模型通过中央螺丝设计分为上下两个开口结构。这个设计不仅可以在中央赤道区域精确定位HLEC细胞，还可为药物干预提供PCO微环境的培养和模拟。此外，模型的上下底座可以分开进行染色和摄影。为了模拟超薄的晶状体囊袋结构，比较了不同水凝胶配方的组合，选择GelMA 60 5％+PLMA 2％进行表面涂层，因为它表现出最佳的生物相容性。PCO模型的最佳表面涂覆是通过两次旋涂法，在2000rpm的转速下施加超薄凝胶层，使细胞均匀附着，改善生长状态，并减少脂质过氧化。模型构建完成后，进行紫外交联，然后在75％酒精中进行1小时的灭菌处理以供细胞培养使用(图2中C-H)。

在本研究中，采用了三种不同的方法来模拟PCO模型。首先，在赤道沟中接种HLEC细胞，模拟赤道区域的细胞迁移。其次，使用中央支柱将中央HLEC细胞限制在PCO模型的外围区域，模拟整体细胞迁移。最后，在整个PCO模型底部接种HLEC细胞，观察整体细胞生长。这三种方法可以根据研究需求和干预策略应用于PCO模型。在模型的上下部分旋紧组合后，模拟了PCO的微环境，并可以对HLEC细胞进行药物干预。一旦干预结束，上下盖子可以再次分开进行染色和更好的观察。由于各种荧光显微镜(特别是共聚焦显微镜)的成像范围有限，打开后基座高度的减小使得在显微镜范围内可以获得更好的成像效果(图2中的I)。该模型非常稳定且可多次重复使用。染色后，可以将其放入酒精中1小时以恢复其无菌状态，而不会影响凝胶和模型基座的形态和功能，极大地增强了便利性和可用性。

在本研究中，我们构建的PCO模型基于人类晶状体囊袋结构的仿生外观。利用基于树脂(透明环氧树脂)的3D打印技术创建了一个外部基座，提供有效而稳定的支撑。此外，还在表面上涂覆了一层超薄水凝胶，模拟了晶状体囊的结构，为细胞提供了最佳的生长微环境。开合式结构的设计有助于精确定位、干预和染色观察。这个模型旨在更好地模拟PCO发生和发展的关键因素，以进行有效的干预(图3)。

(2)最佳表面涂覆策略比较

为了研究不同浓度和强度条件下GelMA水凝胶中HLEC细胞的存活能力和生物相容性，本研究使用了30％、60％和90％氨基置换度的GelMA(GM30、GM60和GM90)，浓度分别为5％、10％和15％。将水凝胶倒入24孔板的孔中，并进行HLEC细胞培养。使用Calcein-AM/PI染色观察活细胞和死细胞的数量。结果表明，与对照组相比，所有三个浓度的GM30水凝胶显示出凝胶支架坍塌，经Calcein-AM染色的活细胞数量显著减少，而经PI染色的死细胞数量明显增加，与GM60和GM90水凝胶相比。这表明在GM30水凝胶中HLEC细胞的生长条件较差，无法为细胞提供足够的支持。相反，在三个浓度下，GM60和GM90水凝胶中活细胞的数量相似，且没有统计学上的显著差异。然而，在三个浓度下，GM90水凝胶中死细胞的数量显著高于GM60水凝胶。值得注意的是，GelMA 605％+PLMA 2％复合凝胶在所有浓度和强度中均有最低的死亡细胞数量和死亡细胞与活细胞比率(图2中的D，E)。

Rhodamine染色评估线粒体膜电位(ΔΨm)，与对照组相比，GelMA30和GelMA90组的ΔΨm水平显著降低。此外，随着浓度的增加，ΔΨm水平进一步下降。值得注意的是，GelMA30 5％+PLMA 2％复合凝胶的ΔΨm水平与纯GelMA305％凝胶相当，而GelMA90 5％+PLMA 2％复合凝胶显示了与纯GelMA90 5％凝胶类似的ΔΨm水平。相反，GelMA 60 5％、GelMA 60 10％和GelMA 60 5％+PLMA 2％组的ΔΨm水平与对照组没有显着差异。随着GelMA 60浓度的增加，ΔΨm水平下降。GelMA 60 5％+PLMA 2％组在所有研究组中显示出最高的ΔΨm水平(图2中的D，E)。关于核染色，不同凝胶组之间没有观察到显著变化，表明无论凝胶组合和浓度如何，核结构保持完整。此外，将HLEC细胞接种在涂有GelMA 60 5％+PLMA 2％的96孔板上进行细胞追踪。细胞的荧光强度在第三天达到峰值，并在第六天和第七天显著降低(图4中的E)。

随后比较了不同涂层方法在模拟晶状体囊的超薄结构和为HLEC培养创造最佳条件方面的效果。在不进行任何表面涂层的情况下，只有很少数量的活细胞附着在凝胶模型表面，并伴随有大量凋亡细胞的存在。相反，当使用GelMA 605％、GelMA 60 5％+PLMA 2％、GelMA 90 5％或GelMA 90 5％+PLMA 2％进行3D打印时，HLEC在凝胶模型表面显示出不均匀分布、融合、变形以及凋亡细胞明显增多，表明生长条件不佳。将整个PCO模型直接使用水凝胶制作会导致由于其软性材料特性而崩溃，使得在特定位置(如赤道区域)精确定位细胞成为一项挑战。此外，水凝胶寿命较短，打印的模型在一周内溶解，不适用于保持原始PCO模型结构。

为了解决这些挑战，我们改进了水凝胶涂覆方法，通过直接在树脂(透明环氧树脂)基础上施加薄薄的涂层来改善。最初，使用棉签进行手动涂覆水凝胶在厚度和均匀性方面难以控制。结果与未涂层的PCO模型相比，细胞在模型表面的生长数量没有显著增加，并且凋亡细胞仍然存在。我们进一步改进了方法，采用旋涂法确保在表面形成均匀和超薄的水凝胶涂层。我们测试了不同的旋涂参数，发现速度越高，凝胶涂层越薄。当旋转速度从1500rpm增加到2500rpm时，附着在PCO模型表面的活细胞数量逐渐增加。在2000rpm和2500rpm下，细胞分布变得更加均匀；然而，在2500rpm下，凋亡细胞数量明显增加。在测试的不同涂层方法中，以2000rpm旋涂两层水凝胶涂层可以得到最佳的生长状态和最小的脂质过氧化(图2中的F,G)。因此，这种方法被选为制备PCO模型的首选方法。

(3)对PCO模型中的生物材料相容性和脂质过氧化进行评估

与含有或不含有手动涂覆水凝胶的细胞培养皿以及完整模型的3D打印相比，在PCO模型的中央和外围区域观察到最高的细胞数量，并且凋亡细胞数量没有显著增加(图4中的A，B)。ROT诱导氧化损伤后24小时，使用C11 BODIPY染色评估HLEC细胞在不同表面涂层方法下的脂质过氧化程度。与手动涂覆水凝胶或没有任何涂层的细胞培养皿相比，以及使用GelMA 60 5％、GelMA 605％+PLMA 2％、GelMA 90 5％或GelMA 90 5％+PLMA 2％进行完整3D打印的PCO模型，HLEC细胞在凝胶3D打印培养中显示出较高水平的脂质过氧化。与手动涂覆水凝胶的细胞培养皿或没有任何涂层的细胞培养皿相比，PCO模型表现出更加均匀的细胞附着，并显示出较低的脂质过氧化水平(图4)。

结果表明，直接使用GelMA或GelMA和PLMA的复合水凝胶进行整个模型的3D打印会导致由于力学强度不足而坍塌。此外，它无法准确复制晶状体囊的超薄结构，从而阻碍了实现理想生物相容性和促进细胞附着、增殖和迁移所必需的适当生物力学特性。因此，采用树脂(透明环氧树脂)为基底进行3D打印，并进行表面水凝胶涂覆以模拟晶状体囊的超薄结构变得至关重要。这种方法可以在机械支持、形态稳定性和生物相容性特性之间取得平衡。在本研究中，展示了旋涂技术用于水凝胶涂层PCO模型表面的成功实施，为HLEC培养提供了最佳环境，同时保持了模型结构的完整性。因此，采用树脂(透明环氧树脂)3D打印基底和盖子，表面用2000rpm旋涂两层超薄水凝胶，为制备PCO模型的首选方法(图4)。

(4)PCO模型用于药物评估

应用PCO模型探讨药物干预的潜在价值。选择了八种具有抗凋亡、抗氧化应激和抗炎特性的药物进行研究：Zebularine、AICAR、THZ1、Rapamycin、Sorbinil、4-OI、Xanthohumol和CAPE。评估对HLEC的影响，为PCO药物筛选和机制研究提供理论支持。在HLEC附着到PCO模型后，添加不同的药物进行48小时干预，使用EdU染色评估细胞增殖。与对照组相比，AICAR、Rapamycin和4-OI的干预明显抑制了细胞增殖，表明它们对PCO具有抑制作用(图5中的A、B)。在TGF-β1诱导增殖后，对HLEC进行不同的药物干预。经过1、3和7天的干预后，将HLEC从PCO模型中消化并接种到Transwell孔板中观察细胞迁移。与对照组相比，在TGF-β1诱导增殖下，Rapamycin、4-OI和CAPE对增殖具有最显著的抑制作用(图5中的C、D)。使用共聚焦显微镜观察细胞向中心生长情况，Calcein-AM染色活细胞显示Rapamycin和4-OI对增殖具有最显著的抑制作用，其次是AICAR(图5中的E)。这些结果表明，PCO模型可以通过不同的干预和观察方法评估药物对细胞功能的影响。其中，AICAR、Rapamycin和4-OI有望成为PCO治疗的治疗药物。

(5)共聚焦显微镜成像

为了获得PCO模型的最佳全景活细胞成像并观察细胞的分布，使用共聚焦显微镜扫描和捕捉了整个PCO模型的图像。本研究设计的PCO模型基底的高度落在共聚焦显微镜5倍物镜的焦距范围内，可以进行全景成像，以更好地观察PCO模型中HLECs的生长。在成像过程中，使用14x 14的视场来捕捉PCO模型的总体范围，并进行三维重建(图6中A，B)。此外，使用8x 8的视场来捕捉基底中央区域的图像(图6中的C)，使用3x 3的视场来捕捉基底核心区域的详细图像(图6中的E)，随后进行了三维重建(图6中的F)。此外，使用8x 8的视场对PCO模型盖子进行成像，以捕捉周围HLECs的分布，并进行三维成像(图6中的D，G)。结果显示，HLECs在整个PCO模型中生长良好，分布均匀，细胞完整性保持良好，没有聚集、变形或塌陷现象。三维成像揭示了HLECs在PCO模型中的空间分布与晶状体囊壁的结构相符，为HLECs提供稳定的支架。

本发明成功开发了一个精确模拟人晶状体解剖结构的新型PCO模型。该模型根据人晶状体的参数模拟了晶状体囊袋在白内障手术后的状态，而3D打印的中空基底提供了稳定支撑。利用GelMA和PLMA复合水凝胶的超薄涂层，创建了HLEC生长的最佳微环境，模拟了晶状体囊壁的组成和结构。上下开合的螺纹结构使得操作和观察更容易，有助于细胞的精确定植和药物干预。通过对水凝胶的生物相容性和抗菌活性评估，确定GelMA 60 5％+PLMA2％复合水凝胶为最佳选择。经过药物干预研究，发现Rapamycin、4-OI和AICAR等药物对HLECs具有较强的抗增殖效果。此外，共聚焦显微镜可以对模型进行全景成像，具有良好的可重复使用性。总之，该发明涉及的PCO模型综合应用了GelMA和PLMA水凝胶、3D打印技术和药物干预方法，可准确模拟晶状体囊袋的解剖结构和病理过程，为研究PCO相关问题提供了有力的研究工具和实验基础。本发明通过3D打印技术利用树脂材料构建外部基座结构，以提供有效且稳定的支撑；选择GelMA和PLMA水凝胶组合涂层，并将其薄膜状地涂覆在模型表面上，模拟晶状体囊袋的结构，为细胞生长提供最佳微环境；设计开闭结构，便于精确定位、干预和染色观察；经过紫外线交联和酒精消毒处理，确保模型无菌状态。

参考文献

1.Lee CM,Afshari NA.The global state of cataract blindness.Curr OpinOphthalmol 2017；28:98-103.2.Rao GN,Khanna R,Payal A.The global burden ofcataract.Curr Opin Ophthalmol 2011；22:4-9.

3.Sugiyama Y,Nakazawa Y,Sakagami T,Kawata S,Nagai N,Yamamoto N,Funakoshi-Tago M,Tamura H.Capsaicin attenuates TGFβ2-induced epithelial-mesenchymal-transition in lens epithelial cells in vivo and invitro.Experimental Eye Research 2021；213:108840.

4.Ursell PG,Dhariwal M,Majirska K,Ender F,Kalson-Ray S,Venerus A,Miglio C,Bouchet C.Three-year incidence of Nd:YAG capsulotomy and posteriorcapsule opacification and its relationship to monofocal acrylic IOLbiomaterial:a UK Real World Evidence study.Eye 2018；32:1579-89.

5.Wormstone IM,Wormstone YM,Smith AJO,Eldred JA.Posterior capsuleopacification:What's in the bag？Progress in retinal and eye research 2021；82:100905.

6.Dawes LJ,Illingworth CD,Wormstone IM.A fully human in vitrocapsular bag model to permit intraocular lens evaluation.Investigativeophthalmology&visual science 2012；53:23-9.

7.Jaitli A,Roy J,Mcmahan S,Liao J,Tang L.An in vitro system toinvestigate IOL:Lens capsule interaction.Experimental Eye Research 2021；203:108430.

8.Wormstone IM,Damm NB,Kelp M,Eldred JA.Assessment of intraocularlens/capsular bag biomechanical interactions following cataract surgery in ahuman in vitro graded culture capsular bag model.Experimental Eye Research2021；205:108487.

9.Zhou P,Lu Y,Sun XH.Effects of a novel DNA methyltransferaseinhibitor Zebularine on human lens epithelial cells.Mol Vis 2012；18:22-8.

10.Zhou P,Luo Y,Liu X,Fan L,Lu Y.Down-regulation and CpG islandhypermethylation of CRYAA in age-related nuclear cataract.The FASEB Journal2012；26:4897-902.

11.Steinberg GR,Hardie DG.New insights into activation and functionof the AMPK.Nature Reviews Molecular Cell Biology 2022.

12.Ning J,Ma X,Long C,Mao Y,Kuang X,Huang Z,Fan Y,Zhang H,Xia Q,WangR,Liang Y,Lin S,Zhang Q,Shen H.Antitumor Drug THZ1 Suppresses TGFβ2-mediatedEMT in Lens Epithelial Cells via Notch and TGFβ/Smad SignalingPathway.Journal of Cancer 2019；10:3778-88.

13.Ye Z,Huang Y,Li J,Ma T,Gao L,Hu H,He Q,Jin H,Li Z.Two-dimensionalultrathin Ti(3)C(2)MXene nanosheets coated intraocular lens for synergisticphotothermal and NIR-controllable rapamycin releasing therapy againstposterior capsule opacification.Front Bioeng Biotechnol 2022；10:989099.

14.Chang K,Shieh B,Petrash JM.Influence of aldose reductase onepithelial-to-mesenchymal transition signaling in lens epithelialcells.Chemico-Biological Interactions 2017；276:149-54.

15.Zukin LM,Pedler MG,Groman-Lupa S,Pantcheva M,Ammar DA,PetrashJM.Aldose Reductase Inhibition Prevents Development of Posterior CapsularOpacification in an In Vivo Model of Cataract Surgery.Investigativeophthalmology&visual science 2018；59:3591-8.

16.Maassen S,Coenen B,Ioannidis M,Harber K,Grijpstra P,Van denBossche J,van den Bogaart G.Itaconate promotes a wound resolving phenotype inpro-inflammatory macrophages.Redox Biology 2023；59:102591.17.Fernández J,Silván B,Entrialgo-Cadierno R,Villar CJ,Capasso R,Uranga JA,LombóF,AbaloR.Antiproliferative and palliative activity of flavonoids in colorectalcancer.Biomedicine&Pharmacotherapy 2021；143:112241.

18.Taysi S,Algburi FS,Taysi ME,Caglayan C.Caffeic acid phenethylester:A review on its pharmacological importance,and its association withfree radicals,COVID-19,and radiotherapy.Phytotherapy Research 2023；37:1115-35.

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。