治疗中风的影响的方法

相关申请

本申请是中国专利申请201280033263.1号的分案申请。本申请 要求于2012年6月3日提交的名称为“治疗中风的影响的方法”的美 国专利申请号61/493,057的优先权。所述申请的全部内容通过引用并 入本文。

序列表

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领域

本发明涉及治疗受试者的中风的影响的方法。

背景

在澳大利亚，中风是继心脏病之后的第二大死亡原因和残疾的主 要原因。在美国，它是死亡的第三大主要原因，每年有超过140,000 的人死于中风。在美国，它还是严重的长期残疾的主要原因。在美国， 从2005年至2050年期间，中风的计划花费为2.2万亿美元。

残疾影响了75％的中风后存活者，而足以降低他们的就业能力。 中风可以在身体上、精神上、情绪上或以这三种的组合形式来影响受 试者。

中风所可能导致的一些肢体残疾包括肌无力、麻木、褥疮、肺炎、 尿失禁、失用(不能进行学习到的运动)、开展日常活动困难、食欲丧 失、失语、视力丧失以及疼痛。如果中风足够严重，或在某个部位如 脑干部分，那么可能导致昏迷或死亡。

由中风引起的情绪问题可能是由对脑部的情绪中枢的直接损伤 或由适应新的限制的挫折或困难所造成。中风后的情感障碍包括抑 郁、焦虑、恐慌发作、情感贫乏(不能表达情感)、躁狂症、情感淡漠 以及精神病。

由中风引起的认知缺陷包括感知障碍、语言障碍、痴呆以及注意 力和记忆力的问题。中风患者可能不知道他或她自己的残疾，一种名 为疾病感缺失的病状。在一种名为偏侧空间忽视症的病状中，病人无 法参加与受损半球空间相反的一侧上的任何事。

所有中风患者中高达10％发展成癫痫发作，最常见的是在事件后 的星期内。中风的严重性增加了癫痫的可能性。

中风是由于脑供血的干扰而引起的快速发展的脑功能的丧失。这 可以是由于堵塞(血栓形成、动脉栓塞)或出血(血液渗漏)引起的缺血 (血流量不足)。因此，脑部受影响的区域不能起作用，这可能导致受 试者不能移动躯体一侧的一个或多个肢体，不能理解或表述语言，或 不能看见视野的一侧。中风经常造成神经元细胞死亡或可能导致死 亡。

有两种常见类型的中风：(i)缺血性中风，这是由供给脑部的血流 的暂时或永久性闭塞引起的，并且占中风病例的85％，以及(ii)出血 性中风，这是由破裂的血管引起的，并且占大多数其余病例。缺血性 中风最常见的原因是大脑中动脉(颈内动脉下游的颅内动脉)的闭塞， 这损害了大脑(例如，大脑皮层)，例如脑部的运动和感觉皮层。所述 损害导致偏瘫、偏侧感觉缺失以及取决于所损害的大脑半球的语言或 者视觉空间缺陷。

目前对缺血性中风的治疗已集中于对缺血半暗带的救治，即，保 持结构完整性但是失去电功能的脑部的适度低灌注区。目前，只有四 种临床上证明的治疗来改善中风后的预后：

·阿司匹林，以预防进一步中风，

·用组织型纤溶酶原激活剂的急性血栓溶栓，以逆转闭塞，

·中风单元的管理，以及

·偏侧颅骨切除术，以降低颅内压。

然而，所述治疗仅试图减轻持续的神经损伤，并且不恢复丢失的 神经元或脑功能。

已测试了一些神经保护剂治疗中风的功效，并且已经失败，包括 N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂、纳美芬、芦贝鲁唑、氯美噻唑、钙 通道阻滞剂(包括a-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸拮抗剂、血清素 受体激动剂(例如，瑞比诺坦)以及跨膜钾通道调节剂)、替拉扎特、抗 ICAM-I抗体、人抗白细胞抗体(Hu23F2G)、抗血小板抗体(例如，阿 昔单抗)、胞磷胆碱(胞苷-5'-二磷酸胆碱的外源性形式)以及碱性成纤 维细胞生长因子。

从上述内容可明显看出，在本领域中需要用于中风的治疗。一种 所希望的治疗将修复由中风引起的至少一些神经损伤和/或恢复中风 所致的至少一些脑功能丧失。

概述

本发明是基于发明人对对于治疗中风的影响有用的细胞群的鉴 定。如本文所例示，发明人已示出了STRO-1

例如，发明人示出了它们可以在中风后恢复大脑功能和/或治疗 运动障碍。发明人还示出了STRO-1

发明人还示出了STRO-1

本文中呈现的这些研究结论提供了用于治疗中风的一种或多种 影响的方法的基础。例如，所述方法包括对患有中风的受试者施用富 含STRO-1

本发明提供了在患有中风的受试者中改善大脑功能或预防大脑 功能丧失的方法，所述方法包括对所述受试者施用富含STRO-1

在一个实施例中，改善受试者的大脑功能改善了受试者的运动障 碍。在一个实施例中，大脑功能是大脑皮层功能，如运动皮层功能和 /或感觉皮层功能。

本发明额外或可选地提供了一种治疗或预防患有中风的受试者 的运动障碍的方法，所述方法包括对所述受试者施用富含STRO-1

在本文描述的方法的一个实施例中，运动障碍是麻痹、部分麻痹、 言语不清、动作不协调、肌无力、张力减退、张力亢进或不自主的异 常运动。

本发明额外地提供了一种使患有中风的受试者的大脑神经元再 生的方法，所述方法包括对所述受试者施用富含STRO-1

本发明额外地提供了一种治疗、减轻或预防患有中风的受试者的 脑萎缩的方法，所述方法包括对所述受试者施用富含STRO-1

在一个实施例中，通过执行本发明的方法而再生的大脑神经元是 在大脑皮层中，例如，在运动皮层和/或感觉皮层中。

一个实施例中，所述中风是缺血性中风。

本发明所涵盖的示例性中风是由受试者的大脑中动脉闭塞引起 的缺血性中风。

在一个实施例中，本发明的方法包括在中风后1小时与1个月之 间，例如在1小时与2周之间，如在1小时与1周之间对所述受试者 施用富含STRO-1

在另一个实施例中，所述方法包括在中风后24小时内对所述受 试者施用富含STRO-1

在一个实施例中，所述方法包括施用富含STRO-1

示例性细胞和/或子代额外地表达组织非特异性碱性磷酸酶 (TNAP)和/或热休克蛋白90β(HSP90β)和/或CD146。

在一个实施例中，细胞群来源于骨髓或牙髓。

在一个实施例中，富含STRO-1

在一个可选的实施例中，富含STRO-1

在一个实施例中，富含STRO-1

本文中根据任何实施例描述的示例性方法包括施用足以改善大 脑功能和/或使大脑神经元再生的剂量的所述群和/或所述子代和/或 所述可溶性因子。

在一个实施例中，所述方法包括施用有效剂量或治疗有效剂量的 所述群和/或子代和/或可溶性因子。

在一个实施例中，所述方法包括施用每公斤0.1×10

在一个实施例中，本文中根据任何实施例描述的方法包括施用低 剂量的STRO-1

在一个实施例中，所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子施 用多次。例如，所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子是每四周 或更多周施用一次。

在一个实施例中，在施用后28天少于25％的STRO-1

在一个实施例中，富含STRO-1

在本文中根据任何实施例描述的方法的实施例中，富含STRO-1

在一个实施例中，所述群和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶 性因子以包含所述STRO-1

在一个实施例中，本文中根据任何实施例描述的方法额外地包括 测试治疗后受试者的大脑功能。例如，所述方法额外地包括测试受试 者的运动和/或力量和/或语言和/或力量。在一个实施例中，如果受试 者的大脑功能与施用所述群和/或子代和/或可溶性因子之前相比没有 显著提高，那么所述方法包括施用另一个剂量的所述群和/或子代和/ 或可溶性因子。

在一个实施例中，被治疗的受试者是哺乳动物，如灵长类，例如 人。

本发明还提供了富含STRO-1

本发明额外地提供了富含STRO-1

本发明还提供了一种包含富含STRO-1

例如，本发明提供了一种包含含有所述群和/或子代和/或可溶性 因子的组合物的试剂盒，其与指示在本文中根据任何实施例描述的方 法中使用组合物的产品信息一同包装。

本发明还提供了一种用于分离或培养STRO-1

本发明还提供了一种方法，包括用在本文中根据任何实施例描述 的方法的使用说明书提供富含STRO-1

本发明还提供了一种方法，包括分离或提供来分离或储存或提供 来储存富含STRO-1

本文描述的方法应在作了必要修改的情况下适用于降低进一步 中风的风险的方法。

作为非限制性实例，本申请提供了以下实施方案：

1.一种在患有中风的受试者中改善大脑功能或预防大脑功能丧 失的方法，所述方法包括对所述受试者施用富含STRO-1

2.如实施方案1所述的方法，其中改善所述受试者的大脑功能 改善了所述受试者的运动障碍。

3.一种治疗或预防患有中风的受试者的运动障碍的方法，所述 方法包括对所述受试者施用富含STRO-1

4.如实施方案2或3所述的方法，其中所述运动障碍是麻痹、 部分麻痹、言语不清、动作不协调、肌无力、张力减退、张力亢进或 不自主的异常运动。

5.一种使患有中风的受试者的大脑神经元再生的方法，所述方 法包括对所述受试者施用富含STRO-1

6.如实施方案5所述的方法，其中所述大脑神经元是在大脑皮 层中。

7.如实施方案6所述的方法，其中所述大脑神经元是在运动皮 层和/或感觉皮层中。

8.如实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述中风是缺 血性中风。

9.如实施方案8所述的方法，其中所述缺血性中风是由受试者 的大脑中动脉闭塞造成的。

10.如实施方案1至9中任一项所述的方法，其包括在中风后1 小时与2周之间对所述受试者施用富含STRO-1

11.如实施方案10所述的方法，其包括在中风后24小时内对所 述受试者施用富含STRO-1

12.如实施方案1至11中任一项所述的方法，其包括施用富含 STRO-1

13.如实施方案12所述的方法，其中所述细胞额外地表达组织 非特异性碱性磷酸酶(TNAP)和/或热休克蛋白90β(HSP90P)和/或 CD146。

14.如实施方案1至13中任一项所述的方法，其中所述细胞群 是获自骨髓或牙髓。

15.如实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述富含 STRO-1

16.如实施方案1至14中任一项所述的方法，其中所述富含 STRO-1

17.如实施方案16所述的方法，其中所述富含STRO-1

18.如实施方案1至17中任一项所述的方法，其包括施用足以 改善大脑功能和/或使大脑神经元再生的剂量的所述群和/或所述子代 和/或所述可溶性因子。

19.如实施方案1至17中任一项所述的方法，其中所述群和/或 所述子代和/或所述可溶性因子施用多次。

20.如实施方案19所述的方法，其中所述群和/或所述子代和/ 或所述可溶性因子是每四周或更多周施用一次。

21.如实施方案1至20中任一项所述的方法，其包括施用每公 斤0.1×10

22.如实施方案1至20中任一项所述的方法，其包括施用每公 斤0.3×10

23.如实施方案1至20中任一项所述的方法，其包括施用低剂 量的STRO-1

24.如实施方案23所述的方法，其中所述低剂量的STRO-1

25.如实施方案1至24中任一项所述的方法，其中所述富含 STRO-1

26.如实施方案1至25中任一项所述的方法，其中所述富含 STRO-1

27.如实施方案1至26中任一项所述的方法，其中所述STRO-1

28.一种富含STRO-1

23.富含STRO-1

附图简述

图1.TNAP(STRO-3)和间充质前体细胞标志物STRO-1

图2.培养的和扩增的STRO-1

图3.培养的和扩增的STRO-1

图4.人DPSC分化成神经元样细胞。(A)显微照片的复本示出了 人包皮成纤维细胞(HFF)在体外对神经元诱导培养基无反应。(B)显微 照片的复本示出了hDPSC在体外在神经元诱导培养基中分化成神经 元表型。(C)图形表示示出了响应于持续30ms、跨度范围为-44mV 至36mV、步幅10mV，在分化的DPSC中记录的Na

图5.一系列表示描绘了用于治疗中风模型的过程。图A示出使 用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色的代表性大鼠脑部冠状切片来使大脑 中动脉闭塞(MCAo)后1天的梗塞(白色)组织可视化。图B示出了使 用抗人线粒体抗原抗体和苏木精染色的代表性大鼠脑部冠状切片。图 A和B中的黑点表示位于相对于前囟的前侧-后侧-0.40mm、内侧-外 侧-4.00mm，距离硬脑膜背侧-腹侧-5.50mm的第一纹状体注射部位， 和位于距离硬脑膜背侧-腹侧-1.75mm的第二皮层注射部位。图C示 出了治疗方案的图解表示，其中动物在MCAo前训练3天(表示为第 0天)，并且第三段用作术前基线(第-1天)。在MCAo后24小时将动 物随机分配以接受人DPSC或单独的培养基。在MCAo后第1天、 第7天、第14天、第21天、第28天由不知道治疗分组的研究者来 执行行为评估。在实验期间，所有动物都接受每天皮下注射10mg/kg 的环孢菌素A。将动物处死，并且在神经行为学研究结束时对它们的 脑部进行免疫组织化学处理。比例尺＝2mm(A，B)。缩写：Cx，大脑 皮层；DPSC，牙髓干细胞；MCAo，大脑中动脉闭塞；Str，纹状体。

图6.一系列图形表示示出了人DPSC治疗对MCAo后神经行为 结果的效果。在MCAo之后，所有动物在所有的行为测试(第1天或 第7天对第-1天)中都表现出功能缺陷。图A示出了在移植后4周时， 与媒介物治疗的动物相比DPSC治疗的动物显示了总神经评分的明显改善(p＜0.018组×天相互作用，重复测量的方差分析[ANOVA]；在 第21天和第28天在治疗组之间分别为p＜0.05和p＜0.01；事后费 雪保护的最小显著差异)。如图B中示出的，如通过在步进测试中用 侧前肢进行的明显更大数量的步进所证明的，DPSC-移植组还示出了明显改善的前肢感觉运动能力(p＝0.045总治疗效果)。图C还示出， 与媒介物治疗组相比，DPSC移植组还显示了在胶带去除测试中试图 从对侧前爪去除标签的明显更小的时间比例(p＝0.049总治疗效果)。 治疗组之间的行为表现的差异在转棒(图D)和锥形/壁架平衡木行走 (图E)测试中不能达到统计显著性(p＞0.05，重复测量的ANOVA)。 由于盘旋行为，中风动物在MCAo后1天时不能完成平衡木行走任 务。已将数据标绘为箱线图来使值的分布可视化。箱中的中央星号表 示中值，并且箱表示值的中间50％(即，它的范围为第25百分位至第 75百分位)。触线(whisker)示出了数据的范围，极端观测值由外围圆 圈呈现。缩写：DPSC，牙髓干细胞；MCAo，大脑中动脉闭塞。

图7.摄影表示的复本示出了在缺血后的脑中存活的DPSC的分 布。代表性大鼠脑部冠状切片示出了移植后4周时移植的DPSC(单个 细胞指示为黑点)的存活和迁移模式。针对人线粒体抗原染色切片以 检测来自大鼠脑组织中的人细胞。注意到，DPSC的靶标迁移朝向中 风损伤并且最终围绕闭塞积累。比例尺＝2mm。缩写：B，前囱；CC， 胼胝体；Cx，大脑皮层；DG，背侧海马齿状回；LV，侧脑室；Str， 纹状体。

图8.摄影表示的复本示出了在中风后28天时植入的人DPSC的 形态。在大脑中动脉闭塞后4周的啮齿动物脑中的人DPSC的高倍放 大图(人线粒体抗原阳性细胞染深灰色，图的右手边)描绘了在紧邻梗 塞核心内的积累(图A)和明显的沿CC的迁移(图B)。注意到，DPSC 在注射和中风部位对侧的大脑半球内的稀疏分布。圆点指示单个的人 DPSC。图C示出了一些获自DPSC的细胞似乎植入大脑血管壁内， 形态外观与内皮细胞(箭状物)、周皮细胞或平滑肌细胞(箭头)一致。 图D示出了获自DPSC的细胞的形态提示星形胶质细胞(箭状物)和神 经元(箭头)。比例尺＝2mm(图A、图B)和25μm(图C、图D以及图 A、图B中的＝40倍放大插图)。缩写：B，前囱；CC，胼胝体。

图9.一系列表示示出了DPSC治疗对健侧CC萎缩的效果。图 A示出了在前囱水平处的代表性大鼠脑切片，其中指示了在同侧和对 侧两个半球中用于测量在脑中线处(LI)和在侧脑室侧缘处(L2)的CC 厚度的两个部位。图B示出了在移植后4周时，与媒介物治疗的动物相比，DPSC治疗的动物的健侧半球中有胼胝体萎缩减少的趋势。 L2(同侧)针对LI(中线)CC测量的正常化不能达到统计显著性(P＞ 0.05)。在治疗组之间的对侧CC厚度测量值不存在差异。数据显示为 平均值±SEM。比例尺＝100μm。缩写：CC，胼胝体；Contra，对侧； Cx，大脑皮层；DPSC，牙髓干细胞；Ipsi，同侧；LV，侧脑室。

图10.图形表示示出了使用利用山羊抗鼠类IgM或IgG缀合的 FITC二次抗体检测时相对于同种型(IgM、IgG2a以及IgG1)阴性对照 (虚线)具有间充质干细胞标志物STRO-1、STRO-4以及CD146(实线) 阳性细胞表面表达的培养扩增骨髓来源的食蟹猕猴MPC的单细胞悬 浮液所产生的代表性流式细胞术直方图。代表性直方图还示出了食蟹 猕猴MPC缺乏单核细胞/巨噬细胞(CD14)、造血干/祖细胞(CD34)以 及成熟白细胞(CD45)的细胞表面标志物表达。与同种型对照相比大于 1％的荧光水平表示为阳性。

序列表注释

SEQ ID NO:1--用于扩增编码GAPDH的核酸的寡核苷酸。

SEQ ID NO:2--用于扩增编码GAPDH的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:3--用于扩增编码SDF-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:4--用于扩增编码SDF-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:5--用于扩增编码IL-1β的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:6--用于扩增编码IL-1β的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:7--用于扩增编码FLT-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:8--用于扩增编码FLT-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:9--用于扩增编码TNF-a的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:10--用于扩增编码TNF-a的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:11--用于扩增编码KDR的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:12--用于扩增编码KDR的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:13--用于扩增编码RANKL的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:14--用于扩增编码RANKL的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:15--用于扩增编码瘦蛋白的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:16--用于扩增编码瘦蛋白的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:17--用于扩增编码CBFA-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:18--用于扩增编码CBFA-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:19--用于扩增编码PPARγ2的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:20--用于扩增编码PPARγ2的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:21--用于扩增编码OCN的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:22--用于扩增编码OCN的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:23--用于扩增编码MyoD的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:24--用于扩增编码MyoD的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:25--用于扩增编码SMMHC的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:26--用于扩增编码SMMHC的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:27--用于扩增编码GFAP的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:28--用于扩增编码GFAP的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:29--用于扩增编码巢蛋白的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:30--用于扩增编码巢蛋白的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:31--用于扩增编码SOX9的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:32--用于扩增编码SOX9的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:33--用于扩增编码X型胶原的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:34--用于扩增编码X型胶原的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:35--用于扩增编码聚集蛋白聚糖的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:36--用于扩增编码聚集蛋白聚糖的核酸的寡核苷酸

详细描述

在本说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，否则提及 单个步骤、物质的组合物、步骤的组或物质组合物的组应视为包括那 些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组中的一个或多个 (即，一个或多个)。

除非特别声明，否则本发明的每个实施例在作必要的修改的情况 下适用于各个和每个其它实施例。

本领域的技术人员应了解，本发明容许具体描述的内容以外的变 化和修改。应理解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括 在本说明书中个别地或共同地提及或指示的所有的步骤、特征、组合 物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或其任何两者或 更多者。

本发明的范围不受本文描述的具体实施例限制，所述实施例意图 只是用于示例的目的。功能上等同的产物、组合物和方法清楚地在本 发明的范围内。

除非另有指示，否则在不进行过度实验的情况下使用分子生物 学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液相肽合成、固相肽合 成以及免疫学的常规技术来执行本发明。所述程序描述于以下文献 中，例如Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第 二版(1989)，卷I、II以及III全部；DNA Cloning:A Practical Approach， 卷I和II(D.N.Glover编著,1985),IRL Press，Oxford，全文； Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(M.J.Gait编著,1984) IRL Press，Oxford，全文，以及尤其是其中Gait的论文，第1-22页；Atkinson等，第35-81页；Sproat等，第83-115页；以及Wu等，第 135-151页；4.Nucleic AcidHybridization:A Practical Approach(B.D. Hames和S.J.Higgins编著,1985)IRLPress，Oxford，全文； Immobilized Cells and Enzymes:A Practical Approach(1986)IRLPress， Oxford，全文；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编著, Academic Press,Inc.)，全系列；J.F.Ramalho Ortigao,"The Chemistry of Peptide Synthesis"见：Knowledgedatabase of Access to Virtual Laboratory website(Interactiva,Germany)；Sakakibara,D.,Teichman,J., Lien,E.Land Fenichel,R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun. 73 336-342；Merrifield,R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154； Barany,G.和Merrifield,R.B.(1979)见The Peptides(Gross,E.和 Meienhofer,J.编著),卷.2,第1-284页,Academic Press,New York 12. Wünsch,E.编著(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden derOrganischen Chemie(Müler,E.编著),卷15,第4版,第1 和2部分,Thieme,Stuttgart；Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.和Bodanszky,A. (1984)The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg； Bodanszky,M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25,449-474；Handbook of Experimental Immunology,卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell 编著,1986,Blackwell Scientific Publications)；以及Animal Cell Culture: PracticalApproach,第3版(John R.W.Masters编著,2000),ISBN 0199637970,全文。

在本说明书中，除非全文另有要求，否则词语“包括(comprise)”， 或变化形式如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，将被理解为意 指包括所述步骤或要素或整数或者步骤或要素或整体的组，但是不排 除任何其它的步骤或要素或整数或者要素或整数的组。

如本文中所用的，术语“来源于”应意味指示指定的整数可从特定 的来源来获得，即使不一定直接来自该来源。在由STRO-1

本文中所用的术语“中风”应意味着脑功能的丧失，通常快速进 展，这是由于对通向脑部或脑干的血流的干扰。这种干扰可以是由例 如血栓形成或栓塞引起的缺血(缺少血)，或可以是由于出血。在一个 实施例中，脑功能丧失伴随着神经元细胞死亡。在一个实施例中，中 风是由来自(至)大脑或其一个区域的血液的干扰或损失所造成。在一 个实施例中，中风是持续超过24小时或在24小时内因死亡而中断的 脑血管原因的神经功能缺失(如世界卫生组织所定义)。症状持续超过 24小时将中风与短暂性脑缺血发作(TIA)区分开，在TIA中症状持续 少于24小时。中风的症状包括偏瘫(身体一侧麻痹)；轻偏瘫(身体一侧虚弱)；面部肌无力；麻木；感觉减退；嗅觉、味觉、听觉或视觉 改变；嗅觉、味觉、听觉或视觉丧失；眼睑下垂(上睑下垂)；可检测 的眼部肌无力；咽反射减少；吞咽能力降低；瞳孔对光反应性下降； 面部感觉减退；平衡下降；眼球震颤；呼吸频率改变；心率改变；胸 锁乳突肌无力伴随头部偏向一侧的能力下降或无能；舌头无力；失语 症(不能说话或理解语言)；失用症(随意运动改变)；视野缺损；记忆 缺失；半侧忽视或半侧空间忽视(对损害对侧的视野空间的注意力的 缺失)；思维瓦解；混乱；性欲过度姿势的发展；疾病失认症(持续否 认缺失的存在)；行走困难；运动协调改变；眩晕；平衡失调；意识 丧失；头痛；和/或呕吐。

技术人员将知道“大脑”包括大脑皮层(或大脑半球皮层)、基底神 经节(或基底核)以及边缘系统。

术语“大脑功能”包括：

·推理、计划，言语、动作、情绪以及解决问题的部分(与额叶相 关)；

·刺激的移动、定位、识别、感知(与顶叶相关)；

·视觉处理(与枕叶相关)；以及

·感知和识别听觉刺激、记忆以及语言(与颞叶相关)。

本文所用的术语“运动障碍”应意指与中风之前相比，受试者运动 能力的任何改变。示例性运动障碍包括麻痹、部分麻痹、言语不清、 动作不协调、肌无力、张力减退、张力亢进或不自主的异常运动。

本文所用的使神经元“再生”应意指受试者的内源性神经元被诱 导生长(例如，生长轴突)和/或分裂和/或内源性神经干细胞被诱导生 长和/或分裂和/或分化来产生新的神经元。这与施用的分化产生神经 元的细胞不同。这个术语不意指使神经元再生的方法不能额外地包括 施用的细胞分化成神经元或其它细胞类型。

本文所用的术语“有效量”应意指足以诱导患有中风的受试者的 大脑神经元再生和/或分化成受试者的神经元的富含STRO-1

本文所用的术语“治疗有效量”应意指足以在患有中风的受试者 中改善大脑功能和/或治疗运动障碍和/或使大脑神经元再生的富含 STRO-1

本文所用的术语“低剂量”应理解为意指STRO-1

本文所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“治疗 (treating)”应理解为意指施用一定量的可溶性因子和/或细胞并且降低 运动障碍的严重性。

本文所用的术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”或“预防(prevention)”应理解为意指施用一定量的可溶性因子和/或细胞并且停 止或阻止或延迟中风后运动障碍的发展或进展和/或大脑功能的丧 失。因此，本发明的方法应意味着在作了必要修改的情况下适用于预 防患有中风的受试者的运动障碍或大脑功能丧失的方法。

本文所用的术语“可溶性因子”应理解为指可溶于水的由 STRO-1

本文所用的术语“上清液”指的是在合适的培养基(如，液体培养 基)中体外培养STRO-1+细胞和/或其子代后产生的非细胞物质。通 常，上清液由在适宜的条件和时间下在培养基中培养细胞，随后通过 如离心等过程去除细胞物质后所产生。在施用之前，上清液可能会或 可能不会经受进一步的纯化步骤。在一个实施例中，上清液包含少于 10

本文所用的术语“正常或健康个体”应意指不患有中风的受试者。

在本说明书中，术语“中风的影响”将被理解为包括并且为以下一 项或多项提供文字支持：改善大脑功能、治疗或预防运动障碍和/或 使大脑神经元再生。

STRO-1

在一个实施例中，STRO-1

在一个实施例中，STRO-1

在一个实施例中，STRO-1

在一个实施例中，STRO-1

在一个实施例中，细胞群是富含包含处于可选择的形式的 STRO-r细胞的细胞制剂。在这方面，术语“可选择的形式”将被理解 为意指细胞表达允许选择STRO-1

提及选择细胞或其群不需要从特定的组织来源进行选择。如本文 描述的，STRO-1

在一个实施例中，细胞表达一种或多种个别地或全体选自由以下 组成的组的标志物：TNAP

在一个实施例中，细胞表达或细胞群富含表达STRO-1

“个别地”指本发明独立地涵盖所述标志物或标志物组，以及虽然 个别标志物或标志物组可能未独立地在本文中列出，但随附权利要求 书仍可彼此独立地和分开地定义所述标志物或标志物组。

“全体”指本发明涵盖任何数量的所述标志物或肽组或其组合，以 及虽然所述数量的标志物或标志物组或其组合可能未在本文中具体 列出，但随附权利要求书仍可将所述组合或子组合与标志物或标志物 组的任何其它组合独立地和分开地定义。

在一个实施例中，STRO-1

例如，STRO-1

在一个实施例中，间充质前体细胞是WO 2004/85630中所定义 的血管周围间充质前体细胞。例如，间充质前体细胞表达血管周围细 胞的标志物，例如，细胞是STRO-1

对于指定标志物称为“阳性”的细胞，其可能根据标志物存在于细 胞表面上的程度而表达低(lo或暗)或高(亮、亮)水平的所述标志物， 其中所述术语涉及细胞分选过程中所用的荧光或其它标志物的强度。 lo(或暗或深)和亮的区别应放在所分选特定细胞群体上所用的标志物 的情形中加以理解。对于指定标志物称为“阴性”的细胞不一定完全不 存在于所述细胞。所述术语指细胞表达所述标志物的水平相对极低， 并且当在可检测标记时产生极低信号或者在背景水平以上不可检测， 例如使用同种型对照抗体检测到的水平。

当在本文中使用时，术语“亮”是指细胞表面上的标志物在可检测 标记时产生相对较高的信号。虽然不希望受理论限制，但提出“亮” 细胞所表达的靶标志物蛋白(例如由STRO-1识别的抗原)比样本中的 其它细胞多。例如，当用缀合FITC的STRO-1抗体标记时，如通过 荧光活化细胞分选(FACS)分析所测定的STRO-1

本文所用的术语“TNAP”意图涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所 有亚型。例如，所述术语涵盖肝亚型(LAP)、骨亚型(BAP)和肾亚型 (KAP)。在一个实施例中，TNAP是BAP。在一个实施例中，如本文 所用的TNAP是指可以结合由2005年12月19日根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定以保藏编号PTA-7282保藏于ATCC的杂交瘤 细胞系产生的STRO-3抗体的分子。

此外，在本发明的一个实施例中，STRO-1

在一个实施例中，大比例的STRO-1

在另一个实施例中，STRO-1

在一个实施例中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在 体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以自体或同 种异体组合物形式施用至受试者。在可选实施例中，使用一种或多种 已建立的人细胞系的细胞。在另一适用实施例中，使用非人动物的细 胞(或者如果患者不是人，而来自于另一物种)。

本发明还涵盖使用由自体外培养物产生的STRO-1

子代细胞可以通过在任何适合培养基中培养而获得。如本文在提 及细胞培养时使用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基 可以是固体、液体、气态或相和材料的混合物。培养基包括液体生长 培养基以及不供养细胞生长的液体培养基。培养基也包括胶状培养 基，诸如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态培养基包 括在皮氏培养皿(petri dish)或其它固体或半固体支持物上生长的细胞 所暴露的气相。术语“培养基”也指意欲用于细胞培养中的材料，即使 其尚未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富营养液体是培 养基。当与水或其它液体混合时变得适于细胞培养的粉末混合物可称 为“粉状培养基”。

在一个实施例中，适用于本发明方法的子代细胞是通过使用经过 STRO-3抗体标记的磁性珠粒从骨髓分离或富集TNAP

在一个实施例中，所述扩增细胞(子代)(例如至少在5次传代后) 可以是TNAP

在一个实施例中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩 增细胞群体包含其中至少25％(如至少50％的细胞)的细胞是CC9

在另一实施例中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩 增细胞群体包含其中至少40％(如至少45％的细胞)的细胞是 STRO-1

在另一实施例中，扩增细胞可表达一种或多种全体或个别地选自 由以下组成的组的标志物：LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、 PECAM-1、P-选择蛋白、L-选择蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD 90、CD29、CD18、CD61、整联蛋 白β6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、 IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦蛋白-R(STRO-2＝瘦蛋白-R)、RANKL、 STRO-4(HSP-90P)、STRO-1

在一个实施例中，子代细胞是如WO 2006/032092中所定义和/ 或所述的多能扩增STRO-1

例如，子代可获自大致上纯化的STRO-1

MEMPS与新鲜采集的STRO-1

STRO-1

应理解，在进行本发明中所述的方法时，带有任何指定细胞表面 标志物的细胞的分离可以通过多种不同方法来实现，然而，示例性方 法依赖于结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)与所关注标志物的结 合，随后分离显示结合(为高水平结合或低水平结合)或不结合的那些 细胞。最适宜结合剂为抗体或基于抗体的分子，例如单克隆抗体或基 于单克隆抗体的分子(例如包含其抗原结合片段的蛋白质)，因为后面 所说的这些结合剂具有特异性。抗体在两个步骤中都可使用，然而也 可以使用其它试剂，因此这些标志物的配体也可以用于富集带有所述 标志物或缺乏所述标志物的细胞。

抗体或配体可连接至固体支持物以允许粗分离。在一个实施例 中，分离技术最大程度地保持欲收集的部分的活力。具有不同功效的 各种技术可用于获得相对较粗的分离。所用特定技术将取决于分离效 率、相关细胞毒性、执行的容易性和速度，以及复杂设备和/或技术 技能的必要性。分离程序可包括但不限于使用涂有抗体的磁性珠粒的 磁性分离、亲和色谱和利用连接至固体基质的抗体的“淘选”。提供精 确分离的技术包括但不限于FACS。执行FACS的方法对于本领域的 技术人员来说是显而易见的。

针对本文所述的各标志物的抗体可商购获得(例如抗STRO-1的 单克隆抗体可从R&D Systems,USA商购获得)、从ATCC或其它保 藏组织获得和/或可使用业内公认的技术产生。

在一个实施例中，分离STRO-1

获得STRO-1

一旦获得了适合的STRO-1

在一个实施例中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在 体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以自体或同 种异体组合物形式施用至受试者。在可选实施例中，使用一种或多种 已建立的人细胞系的细胞来获得上清液或可溶性因子。在另一适用实 施例中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，则来自另一物 种)来获得上清液或可溶性因子。

本发明可以使用来自任何非人动物物种的细胞加以实施，包括但 不限于非人灵长类动物细胞、有蹄类动物、犬科动物、猫科动物、兔 类动物、啮齿动物、鸟类动物和鱼类动物细胞。可用于实施本发明的 灵长类动物细胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猕猴和任何其它新 世界或旧世界猴类的细胞。可用于实施本发明方法的有蹄类动物细胞 包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。可用于 实施本发明方法的啮齿动物细胞包括但不限于小鼠、大鼠、天竺鼠、 仓鼠和沙鼠细胞。可用于实施本发明方法的兔类动物物种的实施例包 括家兔、长腿大野兔、野兔、棉尾兔、雪地兔和鼠兔。鸡(原鸡(Gallus gallus))为可用于实施本发明的方法的鸟类物种的一个实例。

在一个实施例中，细胞是人细胞。

适用于本发明方法的细胞在使用前或获得上清液或可溶性因子 前可储存。保藏和储存真核细胞和尤其哺乳动物细胞的方法和方案在 本领域中是已知的(参见例如Pollard,J.W.和Walker,J.M.(1997) Basic Cell Culture Protocols,第二版,HumanaPress,Totowa,N.J.； Freshney,R.I.(2000)Culture of Animal Cells,第四版,Wiley-Liss, Hoboken,N.J.)。维持所分离的干细胞(诸如间充质干细胞/祖细胞)或其 子代的生物活性的任何方法都可以结合本发明来使用。在一个实施例 中，通过使用低温保藏来维持和储存细胞。

在一个实施例中，对STRO-1

遗传修饰细胞的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。 例如，使欲在细胞中表达的核酸可操作地连接至用于在细胞中诱导表 达的启动子。例如，将核酸连接至可在受试者的多种细胞中可操作的 启动子，诸如病毒启动子，例如CMV启动子(例如CMV-IE启动子) 或SV-40启动子。其它适合启动子在本领域中是已知的并且应理解为 在作了必要修改的情况下适用于本发明的实施例。

在一个实施例中，核酸以表达构建体的形式提供。如本文所用， 术语“表达构建体”是指具有在细胞中将表达赋予到可操作地连接的 核酸(例如报道基因和/或可反选择的报道基因)的能力的核酸。在本发 明的上下文中，应了解，表达构建体可包含或为质粒、噬菌体、噬菌 粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或能够以可表达格式维持和/ 或复制异源DNA的其它核酸。

构建适用于实施本发明的表达构建体的方法对于本领域的技术 人员来说将是显而易见的并且描述于以下文献中：例如Ausubel等 (见：Current Protocols in MolecularBiology.Wiley Interscience,ISBN 047 150338,1987)或Sambrook等(见：MolecularCloning:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratories,New York,第三版2001)。例如，使用例如PCR从适合模板核酸扩增表达 构建体的各组分并随后克隆至适合的表达构建体(诸如质粒或噬菌粒) 中。

适于所述表达构建体的载体在本领域中是已知的和/或在本文中 描述。例如，适于哺乳动物细胞中的本发明方法中使用的表达载体为 例如由Invitrogen供应的pcDNA载体套装的载体、pCI载体套装的载 体(Promega)、pCMV载体套装的载体(Clontech)、pM载体(Clontech)、 pSI载体(Promega)、VP 16载体(Clontech)或pcDNA载体套装的载体(Invitrogen)。

本领域的技术人员将认识到其它载体和所述载体的来源，诸如 LifeTechnologies公司、Clontech或Promega。

用于将分离的核酸分子或包含所述核酸的基因构建体引入细胞 中用于表达的方式对于本领域的技术人员来说是已知的。用于指定生 物体的技术取决于已知的成功技术。用于将重组DNA引入细胞中的 方式包括显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体(诸如使用 lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA))介导 的转染、PEG介导的DNA吸收、电穿孔和微粒轰击(诸如使用涂有 DNA的钨粒子或金粒子(AgracetusInc.,WI,USA))以及其它方式。

或者，本发明的表达构建体是病毒载体。适合病毒在本领域中是 已知的并且可商购获得。用于递送核酸和使所述核酸整合至宿主细胞 基因组中的常规基于病毒的系统包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载 体或腺相关病毒载体。或者，腺病毒载体适用于将保持游离形式的核 酸引入宿主细胞中。病毒载体为靶细胞和组织中基因转移的有效且通 用的方法。另外，已在多种不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效 率。

例如，逆转录病毒通常包含包装能力高达6-10kb外来序列的顺 式作用长末端重复(LTR)。最小顺式作用LTR就足以用于载体的复制 和包装，其接着用于将表达构建体整合至靶细胞中以提供长期表达。 广泛使用的逆转录病毒载体包括基于以下病毒的载体：鼠类白血病病 毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人 免疫缺陷病毒(HIV)和其组合(参见例如Buchscher等,J Virol. 56:2731-2739(1992)；Johann等,J.Virol.65:1635-1640(1992)； Sommerfelt等,Virol.76:58-59(1990)；Wilson等,J.Virol.63:274-2318 (1989)；Miller等,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700； Miller和Rosman BioTechniques 7:980-990,1989；Miller,A.D.Human GeneTherapy 7:5-14,1990；Scarpa等Virology 75:849-852,1991；Burns 等Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:8033-8037,1993)。

已开发各种腺相关病毒(AAV)载体系统用于核酸递送。AAV载 体可以使用本领域中已知的技术容易地构建。参见例如美国专利号 5,173,414和5,139,941；国际公布号WO92/01070和WO 93/03769； Lebkowski等Molec.Cell.Biol.5:3988-3996,1988；Vincent等(1990) Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter CurrentOpinion in Biotechnology 5:533-539,1992；Muzyczka.Current Topics in Microbiol,and Immunol.755:97-129,1992；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801,1994；Shelling和Smith Gene Therapy 7:165-169,1994；和 Zhou等J Exp.Med.779:1867-1875,1994。

适用于递送本发明的表达构建体的其它病毒载体包括例如来源 于痘病毒家族的载体，诸如牛痘病毒和禽痘病毒或α病毒或缀合病毒 载体(例如Fisher-Hoch等,Proc.NatlAcad.Sci.USA 56:317-321,1989 中所述的载体)。

用于确定细胞或可溶性因子改善大脑功能和/或治疗运动障碍和/ 或使大脑神经元再生的能力的方法对于本领域的技术人员来说是显 而易见的。

例如，将细胞或可溶性因子与神经元一起培养，并且评估细胞或 可溶性因子诱导轴突生长的能力，例如，显微技术。类似的测定可以 在体内通过注射细胞和/或可溶性因子至鸡胚的脑中并且评估轴突的 生长来进行，例如，如本文所例举的。

在一个实施例中，在与细胞和/或可溶性因子一起培养时或之前 将神经元暴露在氧和/或葡萄糖剥夺下。氧和葡萄糖剥夺是一种缺血 模型。

在另一个实施例中，细胞在诱导神经元分化的条件下生长，例如 包含叔丁基羟基茴香醚和丙戊酸或5-氮杂胞苷或吲哚美辛和异丁基 甲基黄嘌呤和胰岛素。分化成神经元的细胞被认为适用于治疗。

在又一个实施例中，将细胞或可溶性因子(例如，(例如通过亲和 纯化或色谱得到的)因子或单个因子或因子片段的混合物)施用于中 风模型，并且对大脑功能、大脑神经元再生和/或运动障碍的影响进 行评估。

存在各种已知的技术用于诱导非人动物受试者的缺血性中风， 如，主动脉/腔静脉闭塞、外颈部止血带或箍、出血或低血压、颅内 高压或颈总动脉闭塞、两-血管闭塞和低血压、四-血管闭塞、单侧颈 总动脉闭塞(仅在某些物种中)、内皮素-1诱导的动脉和静脉收缩、大 脑中动脉闭塞、自发脑梗塞(自发性高血压大鼠)、巨球栓塞、血液凝 块栓塞或微球栓塞。出血性中风可以通过向脑部输注胶原酶而建模。

在一个实施例中，中风模型包括大脑中动脉闭塞来产生缺血性中 风。

为了测试群和/或子代和/或分泌因子治疗中风的影响的能力，将 群和/或子代和/或分泌因子在诱导中风之后施用，例如，在中风的1 小时至1天内。在施用后对大脑功能和/或运动障碍进行几次评估。

评估大脑功能和/或运动障碍的方法对于本领域的技术人员来说 将是显而易见的并且包括，例如转棒、高架十字迷宫、开场实验、 Morris水迷宫、T-迷宫、八臂迷宫、运动评估(例如，在一定时间内覆 盖的面积)、甩尾或De Ryck’s行为测试(De Ryck等.,Stroke.20:1383-1390,1989)。额外的测试对于本领域的技术人员将是显而易 见的和/或是本文所描述的。

在另一个实施例中，群和/或子代和/或分泌因子对大脑的效果通 过成像来评估。例如，细胞凋亡、自噬和神经血管单元可以通过体内 光学成像来检测(Liu等.,BrainRes.2011年4月27日)，并且可以使 用PET、MRI或CT来评估各种因素，如梗塞的大小、半暗带尺寸和 /或脑损伤的程度。

还评估了群和/或子代和/或分泌因子对大脑神经元的效果。例如， 将脑或其大脑的一个区域移除，并且评估或估计神经元的数目或神经 元的子型。根据所使用的模型，这个数目可以与对照动物中的数目相 比较，或者如果仅诱导了局灶性缺血，那么与同一动物的脑部对照区 域相比较。

在本发明的一个实施例中，STRO-1

术语“载体”和“赋形剂”是指在本领域中常规用于促进活性化合 物的储存、施用和/或生物活性的物质的组合物(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mac Publishing Company(1980)。载 体还可减少活性化合物的任何不当副作用。适合载体例如是稳定的， 例如不能与载体中的其它成分反应。在一个实施例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下在接受者体内不产生明显的局部或全身性不良作 用。

适用于本发明的载体包括那些常规使用的载体，例如水、盐水、 右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer's solution)、缓冲溶液、透 明质酸和二醇是示例性液体载体，特别是(当等渗时)对于溶液来说。 适合药用载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明 胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单 硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

在另一实施例中，载体是介质组合物，例如细胞在其中生长或悬 浮的介质组合物。在一个实施例中，所述介质组合物不在其所施用的 受试者中诱发任何不良作用。

示例性介质和赋形剂不会不利地影响细胞活力和/或细胞减少、 预防或延迟中风的影响的能力。

在一个实施例中，载体或赋形剂提供缓冲活性以使细胞和/或可 溶性因子维持在适合pH下，由此发挥生物活性，例如载体或赋形剂 是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表一种有吸引力的载体或赋形剂， 因为其与细胞和因子相互作用的程度最低并且允许快速释放细胞和 因子，在这种情况下，可将本发明的组合物制造为用于例如通过注射 直接施加至血流或组织或围绕组织或与组织相邻的区域中的液体。

STRO-1

多种不同的骨架可成功用于实施本发明。示例性骨架包括但不限 于生物可降解的骨架。天然生物可降解骨架包括胶原蛋白、纤连蛋白 和层连蛋白骨架。适用于细胞移植骨架的合成材料应能够支持广泛细 胞生长和细胞功能。所述骨架也可被吸收。适合骨架包括聚乙醇酸骨 架，例如如Vacanti等,J.Ped.Surg.23:3-9 1988；Cima等,Biotechnol.Bioeng.35:145 1991；Vacanti等,Plast.Reconstr.Surg.88:153-9 1991 所述，或合成聚合物，诸如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。

在另一实施例中，细胞可在凝胶骨架(诸如来自Upjohn公司的 Gelfoam)中施用。

适用于本文所述方法的细胞组合物可以单独施用或作为与其它 细胞的混合物施用。可结合本发明组合物施用的细胞包括但不限于其 它多效或多能细胞或干细胞，或骨髓细胞。不同类型的细胞可在临施 用前或施用前不久与本发明组合物混合，或者其可以在施用前一起共 培养一段时间。

在一个实施例中，组合物包含有效量或治疗或预防有效量的细 胞。例如，组合物包含约1×1O

在一个实施例中，将低剂量细胞施用至受试者。示例性剂量包括 每公斤约0.1×10

在一些实施例中，细胞是含于不允许细胞离开进入受试者循环 中，然而允许由细胞分泌的因子进入循环中的腔室中。以此方式，可 通过允许细胞分泌因子进入受试者循环中来向受试者施用可溶性因 子。所述腔室同样可植入受试者的某一部位以增加可溶性因子的局部 水平，例如在胰腺中或其附近植入

在本发明的一些实施例中，可不必或不需要在起始细胞组合物疗 法前对患者进行免疫抑制。因此，移植同种异体或者甚至异种的 STRO-1

然而，在其它情况下，在起始细胞疗法前以药理学方式对患者进 行免疫抑制和/或针对细胞组合物减少受试者的免疫反应可能是需要 或适当的。这可以通过使用全身性或局部免疫抑制剂来实现，或者这 可以通过在囊封装置中递送细胞来实现。细胞可以囊封在细胞所需要 的营养物和氧以及治疗因子可透过，而细胞不可透过的胶囊中来免疫 体液因子和细胞。在一个实施例中，囊封剂具有低变应原性，容易地 且稳定地位于靶组织中，并且对所植入的结构提供附加保护。降低或 消除对移植细胞的免疫反应的这些和其它方式在本领域中是已知的。 作为替代，可对细胞进行遗传修饰以降低其免疫原性。

在本发明的一个实施例中，由STRO-1

在一个实施例中，组合物包含稳定可溶性因子或上清液组分(例 如蛋白酶抑制剂)的物质的组合物。在一个实施例中，所包括的蛋白 酶抑制剂的量不足以对受试者产生不良影响。

包含由STRO-1

可以通过在具有上述成分之一或其组合的适当溶剂中并入所需 量的上清液或可溶性因子，需要时随后过滤灭菌来制备无菌注射溶 液。

一般来说，通过将上清液或可溶性因子并入含有基本分散介质或 来自以上列出成分的其它所需成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用 于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，示例性制备方法是真空干 燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何 其它所需成分的粉末。根据本发明的替代方面，上清液或可溶性因子 可以与一种或多种增强它的溶解度的其它化合物一起配制。

其它示例性载体或赋形剂描述于以下文献中：例如Hardman等, (2001)Goodman和Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams以及Wilkins, New York,N.Y.；Avis等,(编著)(1993)Pharmaceutical DosageForms: Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等,(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman 等,(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems, Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.。

治疗组合物通常应无菌且在制造和储存条件下稳定。组合物可配 制成溶液、微乳液、脂质体或其它有序结构。载体可为含有例如水、 乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物 的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散液的 情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。 在许多情况下，希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如 甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在 组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬酯酸盐和明胶)来达成。此 外，可溶性因子可以于时间释放制剂中施用，例如于包括缓慢释放聚 合物的组合物中施用。活性化合物可用保护化合物免于快速释放的载 体制备，诸如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使 用生物可降解的、生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、 聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。多种用于制备所述制剂的方法已获得专利或通常为本领域的 技术人员所已知。

上清液或可溶性因子可与例如提供可溶性因子的缓慢释放的适 当基质组合施用。

STRO-1

在一个实施例中，如本文根据任何实施例描述的组合物包含用于 改善大脑功能和/或使大脑神经元再生和/或治疗运动障碍的附加因 子，例如，神经生长因子。

或者或另外，如本文根据任何实施例描述的细胞、分泌因子和/ 或组合物与中风影响的已知治疗组合，例如，物理疗法和/或语言疗 法。

在一个实施例中，如本文根据任何实施例描述的药物组合物包含 用于治疗中风的影响的化合物。或者，如本文根据本发明的任何实施 例描述的治疗/预防的方法另外包括施用用于治疗中风的影响的化合 物。示例性化合物在本文描述并且应理解为在作了必要的修改的情况 下适用于本发明的这些实施例。

在另一个实施例中，如本文根据任何实施例描述的组合物另外包 含诱导或增强祖细胞分化为血管内皮细胞的因子。示例性因子包括血 管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF，例如PDGF-BB) 以及FGF。

在另一个实施例中，如本文根据任何实施例描述的组合物另外包 含组织特异性定向细胞(TSCC)。在这方面，国际专利申请号 PCT/AU2005/001445示范了施用TSCC和STRO-1

本发明还提供了用于使用或当在如本文根据任何实施例描述的 方法中使用时的医疗装置。例如，本发明提供包含如本文根据任何实 施例描述的STRO-1

在另一个实施例中，本发明提供包含如本文根据任何实施例描述 的STRO-1

由STRO-1

在一个实施例中，由STRO-1

在细胞递送至心脏的心房或心室的情况下，可以将细胞施用至左 心房或左心室以避免可能由细胞快速递送至肺而引起的并发症。

在一个实施例中，群和/或子代和/或可溶性因子是施用至颈动脉 内。

在一个实施例中，群和/或子代和/或可溶性因子是施用至受试者 的脑中，例如，颅内。例如，将群和/或细胞和/或可溶性因子施用至 大脑和/或任选至纹状体。

在一个实施例中，将群和/或细胞和/或可溶性因子施用至缺血部 位和/或缺血部位的周边。所述部位可以使用本领域已知的方法来确 定，例如磁共振成像和/或计算机断层扫描和/或超声。

用于治疗性制剂的施用方案的选择取决于若干因素，包括实体的 血清或组织周转率、症状水平和实体的免疫原性。

在一个实施例中，由STRO-1

本发明包括以下非限制性实施例。

实施例

骨髓(BM)是从健康正常的成人志愿者(20-35岁)中采集。简单地 说，从髂后嵴抽吸40ml BM至含肝素锂抗凝剂的试管中。

如先前所述(Zannettino,A.C.等(1998)Blood 92:2613-2628)使用 Lymphoprep

随后如先前所述(Gronthos等(2003)Journal of Cell Science 116: 1827-1835；Gronthos,S.和Simmons,P.J.(1995)Blood 85:929-940)通 过磁性活化细胞分选法分离STRO-3

将100μl抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach, Germany)加入细胞悬浮液中且在冰上孵育15分钟。将细胞悬浮液洗 涤两次并重悬于0.5ml MACS缓冲液中且随后上样至微型MACS管 柱(MS Columns,Miltenyi Biotec)上，并用0.5ml MACS缓冲液洗涤三 次以回收未结合STRO-3mAb的细胞(于2005年12月19日保藏于美 国典型培养物中心(American Type Culture Collection；ATCC)，保藏 编号PTA-7282-参见国际公布号WO 2006/108229)。再加入1ml MACS缓冲液后，由磁体移除管柱并通过正压力分离TNAP

设计实验以证实使用STRO-3mAb作为用于分离细胞STRO-1

鉴于STRO-3(IgG1)的同种型与STRO-1(IgM)的同种型不同，因 此通过双色FACS分析基于与使用MACS程序分离的STRO-1

表1：通过双色FACS分析基于细胞表面标志物STRO-1和TNAP 的共表达富集人骨髓细胞(参考图1)。将FACS分选的细胞在标准克 隆条件下在补充有20％FCS的αMEM中培养。数据表示铺板的每 10

在第一系列实验中，采用半定量RT-PCR分析来检验由通过荧光 活化细胞分选法分离的STRO-1

总细胞RNA从2×10

使用ImageQant软件参考持家基因GAPDH的表达来评定各细胞 标志物的相对基因表达(图2B、图2C)。另外，与STRO-1抗体组合 基于多种多样的细胞谱系相关标志物的表达使用双色流式细胞分析 来检验离体扩增的MPC的蛋白质表达谱。基于STRO-1

还进行消减杂交研究以鉴别由STRO-1

为了鉴别由STRO-1

表2.用于特异性扩增人mRNA的RT-PCR引物和条件

表3.STRO-1

为使蛋白质表面表达与STRO-1表达的密度相关联，通过胰蛋白 酶/EDTA分离制备离体扩增的由骨髓MPC得到的细胞的单细胞悬浮 液并且随后与STRO-1抗体与鉴别多种多样细胞谱系相关标志物的抗 体的组合一起孵育。使用山羊抗鼠类IgM-异硫氰酸荧光素鉴别 STRO-1，同时使用山羊抗小鼠或抗兔IgG-藻红蛋白鉴别所有其它标 志物。对于鉴别细胞内抗原的那些抗体，首先用STRO-1抗体标记细 胞制备物，用70％冷乙醇固定以使细胞膜渗透并且接着与细胞内抗原 特异性抗体一起孵育。在相同条件下使用同种型匹配对照抗体。使用 COULTER EPICS流式细胞仪进行双色流式细胞分析并且收集列表 模式数据。点阵图表示指示各谱系细胞标志物(y轴)和STRO-1(x轴) 的荧光强度水平的5,000个列表模式事件。参考同种型匹配阴性对照 抗体建立垂直和水平象限。

表4.STRO-1

分离DPSC和人包皮成纤维细胞

将DPSC和人脱落的乳牙(SHED)如Gronthos等,Proc Natl Acad Sci U.S.A 97:13625-13630,2000所述基本上分离。简单地说，从成人 (19-35岁)收集丢弃的正常人的第三阻生磨牙或脱落的牙齿(7-8岁)， 在阿德莱德大学牙科诊所(Dental Clinic of theUniversity of Adelaide) 在由阿德莱德大学以及医学和兽医科学人受试者研究委员会(Insititute of Medical and Veterinary Science Human Subjects ResearchCommittees)(H-73-2003)制定的所批准的指导方针下对知情同意的患 者进行常规提取。对牙齿表面进行清洁并且使用虎钳使其裂开以露出 髓腔。轻轻地将牙髓组织与牙冠和牙根分离，然后在37℃下在3mg/ml 的I型胶原酶和4mg/ml的分散酶溶液中消化1小时。通过使细胞经 过70-μM的滤器来获得单细胞悬浮液。通过以下操作来建立培养： 将牙髓的单细胞悬浮液(1-2×10

在父母的知情同意下，通过胶原酶/分散酶消化来自男性新生儿 供体的包皮活检组织外植体来分离人包皮成纤维细胞(HFF)。

神经诱导测定

在室温下用多鸟氨酸(最终浓度10μg/ml)涂布组织培养烧瓶或孔 过夜。将烧瓶和孔用水洗涤两次，然后在潮湿的孵化器内在37℃下 用层粘连蛋白(最终浓度5μg/ml)涂布过夜。用磷酸盐缓冲盐水(PBS) 洗涤烧瓶和孔，然后在添加细胞前用生长培养基洗涤。解冻细胞，并 且在T25-涂布的烧瓶中生长直到80％汇合。将细胞以1.5×105个/ 孔的密度在2ml/孔的生长培养基中重新接种，在6-孔涂布的板中持 续3天，或以2×103个细胞在8-孔涂布的腔室培养玻片上。然后将 细胞在培养基A或培养基B中培养3周。培养基A由Neurobasal A 培养基(10888-022；Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、100U/ml青霉素、 1×B27补充物、100μg/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子(EGF， 100-15；PeproTech,RockyHill,NJ,USA)以及40ng/ml碱性成纤维细 胞生长因子(FGF，编号104FGFB01；Prospec TanyTechnoGene, Rehovot,Israel)组成。培养基B包含三种单独的培养基条件持续3周 的时间：第一孵育是培养基A持续7天，接着是在由50:50比率的杜 氏改良的伊格尔培养基(DMEM，12100-046；Invitrogen)与F12培养 基(21700-075；Invitrogen)、以及胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠补充剂 (ITTS，11074547001；Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)、100U/ml 青霉素、100μg/ml链霉素和40ng/ml的FGF组成的培养基中的改变 持续7天。最终7天的孵育由包含50:50比率的DMEM与F12培养 基、ITTS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、40ng/ml的FGF以 及0.5μM维甲酸(RA，R2625；Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)的培养 基组成。对照样品维持在生长培养基中持续神经元诱导测定的持续时 间。所有条件的培养基均每周更换两次。

电生理学

在3周的神经元分化测定结束时，用胰蛋白酶释放细胞并且在神 经元分化培养基或生长培养基中以2×10

禽类胚胎注射

将鸡蛋(白色来亨鸡；HICHICK Breeding Company,Bethal, Australis)纵长地放置在蛋盒内并且在37℃下在潮湿的孵化器中孵育 大约40小时以达到注射前的10-12阶段。将绿色荧光蛋白(GFP)-转 导的成年人DPSC或HFF(5×10

培养的细胞制剂的免疫细胞化学法

在室温下用4％的PFA将腔室培养玻片固定30分钟，然后用PBS 和0.1％的吐温20(Sigma-Aldrich)(PBS-T)洗涤。在室温下将培养物阻 断(PBS-T中的10％马血清)30分钟并且然后与一次抗体(1:100的巢蛋 白(611658；BD Biosciences,San Diego,USA)；1:500的多唾液酸-神经 细胞粘附分子(PSA-NCAM)(由T.Seki博士惠赠)，1:500的β-III微管 蛋白克隆，TUJ1(MMS-435P，1mg/ml；Covance,Princeton,NJ,USA)； 1:200的NF-M(13-0700，0.5mg/ml；Zymed,South San Francisco,CA)； 1:500的NF-H(AB1991；Chemicon,Temecula,CA,USA)一起在阻断 溶液中在4℃孵育过夜。在相同的条件下处理小鼠、山羊以及兔(Ig)对照物。洗涤之后，在室温下在黑暗中将二次抗体(1:200山羊抗小鼠 Alexa 488[A11029，1.5mg/ml；Jackson免疫研究实验室,West Grove, PA,USA]；1:200山羊抗兔Alexa 488[A11034，2mg/ml[Molecular Probes Inc.,Eugene,OR,USA])加入阻断溶液中并持续2小时。最后， 将玻片洗涤并且用具有4’,6-双脒基-2-苯基吲哚二氢氯化物(DAPI， P36931；Invitrogen)的Prolong gold抗淬灭剂来盖住盖玻片。

结果

如图4中所示出，当hDPSC在神经元诱导培养基中生长时，它 们分化成具有引导钠电流的生物物理特性的多进程神经元样细胞。此 外，当hDPSC移植至鸡胚胎的脑中时，它们分化成表达神经丝的神 经元样细胞。

在导致缺血性中风的大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠模型中评估 hDPSC的治疗功效。MCAO是人缺血性中风的最常见的表现，并且 MCAO的这种临床前啮齿动物模型重现了人类条件。在这个模型中， 通过以下操作来制造MCAO：向颈内动脉中插入尼龙丝线，将所述 丝线向前推进以使位于颈内脉的远端的大脑中动脉闭塞。

方法

人DPSC培养和制备

通过消化牙髓组织和用荧光标志物绿色荧光蛋白(GFP)逆转录转 导来从成人阻生(未能完全萌出至它的预期位置)第三磨牙分离人 DPSC。将传代3-5次的DPSC冷冻保存在含10％二甲亚砜的胎牛血 清中。将细胞解冻并且在用于大脑内移植之前传代至少一次。将DPSC 在37℃下5％的CO2中，在补充有20％胎牛血清、100DM的L-抗坏 血酸2-磷酸盐(Wako,Richmond,VA)、2mM的L-谷氨酰胺、100U/ml 青霉素和100μg/ml链霉素的改良的伊格尔培养基(Sigma-Aldrich,St. Louis,http://www.sigmaaldrich,com)中培养。用胰蛋白酶将细胞离解并 且在没有补充物的改良的伊格尔培养基中以1.5×10

啮齿动物大脑中动脉闭塞和大脑内移植

将54只体重为300±20g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠维持在 12-小时光/暗循环中，随意获取食物和水。

用异氟烷麻醉大鼠并且通过腔内近端大脑中动脉闭塞(MCAo)使 其经受暂时的局灶性脑缺血[如Aspey等.,Neuropathol Appl Neurobiol., 26:232-242,2000和Spratt等,J Neurosci Methods,155:285-290,2006 所基本上描述的]。通过加热垫将直肠温度维持在37±1℃，并且使用 脉搏血氧仪(型号8500AV；Nonin Medical,Plymouth,MN)监测血氧饱和度和脉率且将其维持在生理参数内。简要地说，将右颈总动脉、颈 外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)以及翼腭动脉通过钝性分离暴露，接着 将ECA烧灼和结扎。将4-0单丝尼龙线(Dynek,Hendon,SA,Australia) 和硅氧烷涂覆的尖头(直径0.35mm、长度5mm)从ECA残干前进， 穿过ICA，并且上行至右大脑中动脉(MCA)。将线程固定到位，并且 闭合切口。在闭塞2个小时后，将大鼠再次麻醉，且撤走线程以允许 再灌注。允许大鼠从手术中恢复，并且在2小时时通过以尾巴使动物 短暂悬置评估对侧前肢屈曲并且评估在地板上的盘旋行为以验证 MCAo。在MCAo后24小时，随机选取动物来接受人DPSC(n＝31) 或媒介物(n＝23)治疗(参见描述治疗方案的图5)。将总体积为4μl的 细胞混悬液(6×10

2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色

进行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色来证实缺血。将新鲜的脑 切为2-mm的薄片，并且在37℃下在2％的TTC(Sigma-Aldrich)中在 黑暗中孵育10分钟。使用LiDE210平板扫描仪(Canon,Tokyo)将脑切 片彩色成像。

功能评估

在MCAo之前将动物连续训练3天，并且第三段(第-1天)被用作 术前基线。在第1天(DPSC移植之前)、MCAo后的第7、14、21、 28天(每个测试有三个试验)的光循环期间进行行为的盲法评估(图 5C)。将MCAo前神经行为训练失败(在于每个测试中动物没有达到基 线分数)的动物和在MCAo后至少1周表现出几乎没有至没有或非常 严重的功能缺陷的动物排除。实验是在随机处理分配和盲结果评估下 进行的，其符合中风治疗学术产业圆桌会议(STAIR)和类似的指导方 针。

神经评分

使用从先前研究[Barry等.,Brain Res,1389:143-151,2011； Bederson Stroke,17:472-476,1986；以及Thai等.,J.Neurol.Sci,286: 150-159,2008]改良的评分系统评价MCAo后每只动物的总神经功能 障碍。更高分数指示了更严重的神经功能缺损。

胶带去除测试

将粘性标签(15mm2)贴在大鼠前爪的内侧面[Bouet等,Nat Protoc 4:1560-1564,2009]。不干胶标签放置到对侧或同侧前爪的顺序 是随机化的。在返回到测试笼中时，记录每个爪子试图去除粘性标签 所花费的时间和去除标签所用的总时间(分配的最大值为2分钟)。去 除(或试图去除)胶带所花费的持续时间表达为总花费时间的百分比。

步进测试

使用一只手轻轻地抬起大鼠的躯干和后肢且另一只手控制一只 前爪以使体重负载在没有受限的另一只前爪上，从而牢固地抓住每只 大鼠[Schallert等,Exp Neurol,64:33-43,1979]。然后将大鼠向侧面移 动(30cm)，由此负重前爪向反手方向迈步以调整身体运动。前爪测试 的顺序是随机化的。记录每个前肢执行的步子数目。

转棒

将大鼠放置在由18×1-mm的棒[28]的电动旋转集合组成的转棒 装置上。随着旋转速度在2分钟内从0rpm加速至24rpm，动物需要 在所述装置上行走。记录动物完成试验、从装置上跌下、或夹住横档 以及旋转连续两个旋转而不是试图在横档上行走的时间。

锥形/壁架平衡木行走

动物需要横穿沿其长度变细的高平衡木且最后至一个暗盒中 [Schallert T,Woodlee MT.Orienting and placing.In:Whishaw IQ,Kolb B编著.The Behavior of theLaboratory Rat:A Handbook with Tests. Oxford,U.K.:Oxford University Press2005；129–140]，并且将它们的 表现录影。将在下悬壁架(上部平衡木表面以下2cm)上每个后肢产生 的脚滑数目计算为横穿平衡木花费的总步子数目的百分比。由于中风 动物的盘旋行为，MCAo后1天时不能完成平衡木行走。

免疫组织化学和成像

在神经行为评估结束时，将大鼠深度麻醉，直接注射1,000U的 肝素至心脏中，并且用冰冷的盐水、随后是含4％(wt/vol)多聚甲醛的 磷酸盐缓冲盐水(PBS)经心灌注。将脑去除并且在相同的固定剂中在 4℃下后固定过夜。将脑包埋在石蜡中并且切成连续的5-μm冠状切片 用于比色法检测存活的人DPSC。在与小鼠抗人线粒体(1:1,500； Millipore,Billerica)、接着是生物素化的抗小鼠IgG(1:250；Vector Laboratories,Burlingame,CA)以及链霉亲和素辣根过氧化物酶缀合的 抗体(1:1,000；Thermo Scientific,Rockford,IL)孵育之前，使用含有3％ 正常马血清的PBS阻断切片并且在PBS中洗涤两次。在阻断溶液中 稀释抗体。用3,3-二氨基联苯胺(Sigma-Aldrich)使抗体染色视觉化。 使用NanoZoomer数字病理系统(Hamamatsu Photonics，Shizuoka， Japan)获取并分析明视场图像。在每个第二5μm冠状切片中计数移 植后4周在啮齿动物脑(n＝3)中剩余的移植细胞数目，并且分析移植 细胞的分布。

对于双重免疫荧光研究，在使用山羊抗-GFP(1:250；Rockland, Gilbertsville,PA)鉴定人DPSC、使用小鼠抗神经元核鉴定成熟神经元 (NeuN；1:500；Millipore)或使用兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP；1:250； DAKO,Glostrup,Denmark)鉴定星形胶质细胞之前，将1OOμm自由 浮动的切片用含有0.3％Triton X-100含10％正常马血清的PBS阻断。 所用的其它一次抗体是小鼠抗-β-III微管蛋白(1:500；Millipore)、小鼠 抗巢蛋白(1:100；Abcam,Cambridge,U.K.)、小鼠抗多唾液酸-神经细 胞粘附分子(PSA-NCAM；1:200；Millipore)以及小鼠抗-04(1:500； Sigma-Aldrich)。二次抗体是Cy2缀合抗山羊IgG、Cy3缀合抗兔IgG 或Cy3缀合抗小鼠IgG(1:300；Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PA)。在阻断溶液中稀释抗体。所有的切片用ProLong Gold 抗淬灭剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)封固。为了估计共表达NeuN或 GFAP的GFP阳性细胞的百分比，在5个场(由在DPSC移植水平下 同侧半球中的2个皮层和3个纹状体区域组成)中以D40的放大率拍 摄z-堆叠图像(n＝3只动物)。使用TCS SP5共聚焦显微镜顺次获取共 聚焦图像并且使用它的LAS AF软件(Leica Microsystems,Wetzlar)进 行处理。使用ImageJ(NIH)进行正交投影。

胼胝体厚度测量

使用0.1％的甲酚紫将在前囟和前囟±0.1mm的水平下的石蜡切 片染色(n＝6DPSC-处理的,n＝2媒介物-处理的)。在脑的两个半球 的脑室的中线(在两个半球之间的中点)和侧缘进行胼胝体厚度测量。 测量值表达为相应的中线测量值的百分比并且使用Axio Vision成像 软件(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)来完成。

统计分析

使用GenStat(第13版；VSN International,Hemel Hempstead,U.K.) 进行分析。使用重复测量的方差分析(ANOVA)来分析治疗对行为测试 评分的影响，使用Greenhouse-Geisser校正来说明单个大鼠的连续测 量值之间的关联，并且调整中风前数据作为协变量以允许大鼠初始能 力中可能的差异。如果初始ANOVA是显著的，则进行事后费雪保护 的最小显著差异(LSD)检验。在p＜0.05下，差异被认为具有统计学 显著性。使用R(版本2.10.1；R Development Core Team,Vienna, Austria)将数据呈现为箱线图或使用Prism(版本5.02，GraphPad Software,Inc.,San Diego)使其呈现为条形图。报告值是平均值±SEM。

结果

移植的人DPSC增强了中风后前肢感觉运动恢复

探讨了人DPSC治疗在局灶性脑缺血后改善随着时间推移的神 经行为功能的能力。关于发病率或死亡率，与对照相比，没有观察到 DPSC治疗后的有害影响。大脑内移植后获得的死亡率在两个治疗组 中是相当的(大约9％)。

单侧MCAo的临床相关啮齿动物模型引起对啮齿动物脑同侧半 球的背外侧纹状体和上覆的额/顶叶皮层的实质性缺血性损伤。因此， 通过在中风后第1天11.7±0.4分的神经评分增加来证明动物已发展了 神经行为缺陷(图6A)。此外，标记的前肢躯体感觉和运动不对称在步 进测试(图6B，在MCAo后第1天对侧前肢收集的步子数目的降低为 82.2±6.6％)，以及胶带去除测试(图6C；在MCAo后第1天试图从对 侧前爪去除外部刺激的时间减少为93.7±2.8％)中展示。

在实验性中风中，在转棒测试(图6D；MCAo后第1天花费在转 棒上的时间减少为53.0±2.0％)中也观察到运动平衡和协调的丧失。

受中风影响的动物表现出MCAo后第1周时平衡木行走期间对 侧后肢的脚滑中的后肢不对称(图6E；增加为21.7±6.2％)。同侧肢体 具有正常的中风后神经行为功能。

所有动物在中风后4周中展现出逐步恢复的神经行为功能(图6)。 与媒介物治疗组相比，DPSC治疗的动物表现出明显提高的总体神经 行为功能(图6A；p＜0.018组×天相互作用，重复测量的ANOVA) 和显著下降的神经评分，特别是中风后第21天(p<0.05，事后费雪保 护的LSD)和第28天(pO.01)。在肢体特定的神经行为研究中，在步进 测试(图6B；p＜0.045总体组效果)和胶带去除测试(图2C；p＜0.049 总体组效果)中，与媒介物对照相比，DPSC治疗的动物表现出明显增 加的同侧(受中风影响)前肢感觉运动恢复。总体来说，DPSC治疗的 动物在所有测量的天数中在使用对侧前肢时显示出降低的中风后缺 陷。

在治疗组之间在同侧肢体功能上无显著差异。在治疗组之间在转 棒中(图6D)和锥形/壁架平衡木行走(图6E)测试中的表现没有统计学 显著差异(p＜0.05)。肢体之间增加的功能改善的差异的一种可能解 释是：由于对这个区域的优先血管供应，这种啮齿动物MCAo模型 对啮齿动物脑中代表前肢功能的感觉运动皮层产生了更大的破坏 [Salo等,SocNeurosc Abstr 13:1268,1987]。为了支持这点，如通过步 进和胶带去除测试所测量在本研究的动物中存在严重的前肢功能丧 失，但如在MCAo后立即通过锥形/壁架平衡木行走测试所评价后肢 功能的损害不那么明显。转棒跑和平衡木行走分别评估运动协调和后 肢功能[Hicks等,Cell stem Cell,5:139-140,2009]，并且这些测试可能 对检测中风后缺陷的敏感性不足。与媒介物治疗的动物相比，DPSC 治疗后增加的功能改善在4周的前肢分析中变得明显而后肢功能则 不是。

另一个解释可能涉及到动物的学习到的代偿运动行为。在转棒跑 和锥形/壁架平衡木行走测试中，通过重复的测试，啮齿动物可能已 学会以下新颖的方式：可以使用未受中风影响的肢体或尾偏斜来补偿 受中风影响的肢体的功能丧失[Schaar等,Exp TranslStroke Med,2:13, 2010]。如通过步进和胶带去除测试所测量，前肢-特定的任务允许最少使用补偿行为来克服中风后感觉运动功能的丧失。

前述的数据指示了hDPSC移植影响了中风后宿主神经系统的正 常功能并且与对照动物相比产生了改善的神经功能。不受理论或作用 模式约束，这种改善可能在中风后的脑内通过神经可塑性改变产生。 例如，如上所示，STRO-1

移植后4周时缺血性脑中DPSC的存活

DPSC移植后的神经行为研究中的发现指示了在神经评分和前肢 感觉运动功能中位于稍后的时间点的峰值效益。随后的研究探讨了解 释这些发现的底层细胞机制是否是由于DPSC在中风脑内的移植后 的神经细胞替代。例如，测定当观察到峰值效益时在研究终点时存活 的捐献者细胞的数目。使用不与大鼠组织发生交叉反应的对抗人线粒 体抗原的特异性抗体来可视化啮齿动物脑内的单个DPSC。在每个第 二脑冠状切片中，即，在10-μm的间隔下，手动计数标记的细胞的数 目。在移植后4周时每个动物的脑中检测到的人线粒体阳性细胞的总 数目的范围在9,458至22,394个细胞之间(表5)。这给出了 13,807-4,293个剩余的人DPSC的平均数目以及最初移植的6×10

不受理论或作用模式约束，由于只有平均2.3％的初始移植的 hDPSC存活到中风后28天，所以神经元替代不大可能是hDPSC改 善神经功能的主要作用机制。然而，所述神经元替代可以提供一些治 疗益处。可能造成这种改善的替代或额外的机制包括神经保护作用、 血管生成、免疫调节和神经可塑性。

表5：4周时所移植的人DPSC的存活

DPSC向中风损害的靶标迁移

还分析了移植至缺血性大鼠脑之后的人DPSC的空间分布。在移 植后24小时，发现DPSC聚集在注射部位周围。4周后，发现人线 粒体标记的细胞主要在环绕梗塞核心周围的区域内(图7、图8A、图 8B)，表明移植的细胞从移植部位优先地向缺血梗塞迁移并且定位在缺血边界区(IBZ)。在细胞移植部位对侧的半球内(图7、图8A、图8B) 和胼胝体中(图8B)观察到少量DPSC。在4周期间，细胞已迁移至对 侧半球内至少4mm。与健侧半球相比，源于DPSC的细胞广泛地以 低数目分布在对侧半球中，并且DPSC无明显迁移至对侧半球的特定 靶标区域中。在极少的情况下，源于DPSC的细胞并入且围绕具有与 内皮细胞(图4C，箭状物)、周皮细胞或平滑肌细胞(图4C，箭头)一 致的形态外观的大脑微血管壁。

移植的人DPSC在体内分化成神经元和星形胶质细胞

然后检查缺血后4周的脑中人线粒体抗原阳性细胞的形态。表现 出具有与星形胶质细胞一致形态的细胞显示了恒星样外观(图8D，箭 状物)，而假定的神经元细胞表现出长突起(图8D，箭头)。为了验证 这些表型，使用了双重免疫荧光分析和共聚焦成像。移植的人DPSC 之前已被逆转录转导来表达GFP，这允许用NeuN或GFAP共标记来 分别鉴定成熟神经元或星形胶质细胞。GFAP与胶质瘢痕内的细胞中 GFP表达共区域化确证了源于DPSC的细胞已分化成星形胶质细胞。 在同侧梗塞周围皮层区域内，NeuN和GFP双阳性细胞指示了移植的 DPSC分化成神经元。星形胶质细胞和神经元在缺血后同侧大脑半球 中的分布不均匀。在纹状体区域中的IBZ处，源于DPSC的星形胶质 细胞占主要(51.0±8.6％GFAP/GFPD双阳性细胞，表达为GFP单标记 细胞的百分比)，而相比之下，源于DPSC的神经元占更小的比例(8.7±6.1％NeuN/GFPD细胞)。在梗塞周围的皮层区域内，星形胶质 细胞和神经元的比例似乎类似(分别是38±0.6％GFAP/GFP细胞和 32.1±1.8％NeuN/GFPD细胞)。发现移植的DPSC沿纹状体中的IBZ 主要地分化成星形胶质细胞，其似乎并入胶质瘢痕内。与纹状体相比， 在皮层梗塞周围区域内有更多的源于DPSC的神经元存在。令人感兴 趣的是，在梗塞周围皮层区域内大约1/3的GFP细胞也用早期/中间 神经元标志物β-III微管蛋白标记。然而，在沿着IBZ的胶质瘢痕内， 许多GFP细胞还共表达神经祖细胞标志物巢蛋白。皮层中巢蛋白/GFPD细胞的证据几乎没有。在梗塞周围皮层中，一些GFP细胞还 对迁移的成神经细胞标志物PSA-NCAM呈阳性。在极少情况下，在 移植后4周时在啮齿动物脑中观察到源于DPSC的少突胶质细胞 (04/GFPD细胞)。

DPSC治疗减少中风后胼胝体萎缩

还探讨了DPSC治疗对中风损害后穿过胼胝体的两半球间的连 通性的丧失的影响。在中风后4周，与媒介物治疗组相比，DPSC治 疗的动物中同侧胼胝体萎缩有不明显的减少(DPSC治疗的， 67.6±12.5％，L2测量值表达为相应的中线L1测量值的百分比；媒介 物治疗的，56.6±3.0％；p＞.05)(图9)。在DPSC治疗的脑中，同侧 半球中的胼胝体的厚度示出了朝向更好的保护的趋势并且在对侧(未 受中风影响的)半球取得类似的胼胝体厚度。在治疗组之间对侧半球 中的胼胝体厚度没有差异(DPSC治疗的，66.1±14.0％；媒介物治疗的， 66.5±1.6％)。

将猿猴骨髓祖细胞(来自食蟹猕猴；cyno-MPC)从自雌性食蟹猕猴 (macacafascicularis)收集的约15ml的骨髓抽吸液中分离。使用聚蔗 糖梯度(Ficoll gradient)将骨髓抽吸物悬浮液分离并且洗涤以移除无核 细胞(红血球)。将有核细胞计数然后通过连接CA12抗体(抗STRO-3) 和Dynalbeads进行分离。将连接有抗体和珠粒的细胞通过MPC-1磁 体的磁场进行阳性选择。将阳性选择的细胞计数，并且接种至T形瓶 中的生长培养基中作为传代(p.)0。在集落形成测定(CFU-F)中使用预 选、阳性和阴性细胞。

使用生长培养基喂养cyno-MPC细胞。每2至4天喂养所有培养 物(p.O–p.5)直到它们达到所需的汇合度。接着使用HBSS洗涤，以 及随后相继使用胶原酶和胰蛋白酶/维尔烯(Versene)来对细胞进行传 代或收获细胞。将p.1细胞计数并且接种至T形瓶中。当p.1cyno-MPC 细胞达到所需汇合度时，收获细胞并且使用速率受控的冷冻机进行低 温保存。

将传代1低温保存cyno-MPC解冻并且接种至T形瓶中(p.2)。将 p.2细胞在细胞工厂中传代至p.3。收获p.3细胞并在细胞工厂内传代 至p.4。将额外的p.3细胞低温保存。将p.4细胞在6×细胞工厂传代 至p.5。当p.5cyno-MPC细胞达到所需的汇合度时，收获细胞并且使 用速率受控的冷冻机低温保存。将细胞在50％的αMEM、42.5％的 Profreeze，以及7.5％的DMSO中低温保存。样品是针对CFU-F测定、 FACS、无菌性、支原体以及内毒素进行测试。

培养的cyno-MPC的免疫表型的代表性流式细胞仪分析结果在图 10中示出。如所示出的，这些细胞是STRO-1

使用磁珠分选允许从纤维状牙髓组织纯化出稀少的DPSC。收获 牙髓组织并且酶消化之后，可以从一个成人的第三磨牙回收大约1-2 ×10

评定STRO-1、STRO-4或CD146抗体作为单一试剂纯化 nhpDPSC的效率。一式三份，将未分级分离的以及STRO-1、STRO-4 或CD146阳性和阴性选择的细胞部分以0.3、1.0以及3.0×10

流式细胞分析是用来表征离体扩增的DPSC的免疫表型。如前所 描述对处于不同细胞代数的间充质和非间充质干细胞相关表面标志 物的表达进行评定。当使用异体nhpDPSC来治疗缺血性中风时，评 定了这些细胞抑制在混合淋巴细胞反应中或与有丝分裂原刺激的淋 巴细胞在体外共培养时活化的免疫细胞的免疫调节能力(例如，如 Wada等，Jcell Physiol,219:667-676,2009中描述的)。

DPSC产生中胚层和外胚层组织(包括类似于由其得到的那些)的 能力是这些细胞的一个标志性特征。通过在诱导条件下培养来探讨 DPSC在体外分化成不同细胞谱系的能力。使用离体扩增的nhpDPSC 来评定多谱系分化成为成骨细胞(矿藏的茜素红染色)、脂肪细胞(脂滴 的油红O染色)以及软骨细胞(硫酸蛋白多糖和II型胶原表达的甲苯胺 蓝染色)的能力，例如，如Grontos等,J Cell Scl.,116:1827-2835,2003 中所描述。

将离体扩增的预先标记了GFP的nhpDPSC单细胞悬浮液与作为 载体媒介物的陶瓷羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)颗粒组合额外地皮 下移植至严重受损免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠(n＝3)的背侧面中，保持 一段约8周的时期。在移植后8周之后，将受体动物处死以取回移植 物用于组织学分析。

有关nhpDPSC体外分化成神经细胞的评定是在如前描述的神经 诱导培养条件下在用多鸟氨酸涂布的腔室培养玻片上进行。

使用实时PCR和免疫组织化学来评定早期(NeuroD、巢蛋白、 NeuN、b-III微管蛋白)和晚期(GFAP、神经丝中链和重链)的基因和蛋 白质表达。

执行膜片钳技术来确定分化的nhpDPSC在体外发起动作电位的 能力。

此外，通过将GFP标记的nhpDPSC胚蛋注射至鸡胚中(例如， 如前描述的)来确定这些细胞的神经原性和神经可塑性电位。

通过在植入后第7天和第14天测量电压依赖性钠和钾通道在300 mm脑组织切片上的存在来评定所植入的GFP标记的DPSC的电生理 特性。

这些研究共同地定义了用于在非人灵长类动物临床前研究中治 疗中风的异体nhpDPSC群。

人与非人灵长类动物之间在复杂的认知能力、显著的社会复杂性 以及大脑组织的精细复杂性方面的相似之处使其成为了研究神经系 统疾病和障碍的很好的模型。

使用经由颈内动脉的尼龙丝线阻塞通过MCAO方法来产生非人 灵长类动物缺血性中风模型(例如，如Freret等,J Cereb Blood Flow Metab.,28:786-796,2008中描述的)。以食蟹猴(一种旧大陆猴类(食蟹 猕猴))产生非人灵长类动物模型。以下是有关缺血性中风研究的实验 设计程序：

(i)在中风前对所有动物进行基线神经行为测试。

(ii)诱导MCAO缺血性中风模型。

简要地说，对猴子进行麻醉、气管插管并且机械通气，同时集中 监测血氧水平、中心体温、血压、ECG以及颅内血流量的激光多普 勒血流测定。详细的手术是由经验丰富的神经科学家暴露在颈外和颈 内动脉分叉处的右颈总动脉来执行。对颈外动脉和其它分支动脉进行 烧灼以确保丝线沿着颈内动脉顺利通过，到达大脑中动脉的起端。将 0.54mm直径×3mm长度的经过硅橡胶涂覆的尼龙丝线插入至颈内 动脉中并且前进直到感觉到阻力，此指示丝线已经使大脑中动脉闭 塞。通过结扎线将丝线固定到位。MCAO后3小时，将硅橡胶涂覆 的尼龙丝线撤走以引起再灌注，这一过程近似于人的大脑中动脉缺血 性中风。

(iii)在MCAO后第7天进行MRI以确定是否引起了合适大小 和位置的缺血性中风。

(iv)细胞疗法设计包括在中风后一周对三个组进行5×10

(iv)在为期6周的研究期间，每周一次进行神经行为测试。为 了充分探讨MCA缺血性中风之后感觉-运动缺陷的程度，使用了以下 测试：猴

(vi)研究在中风之后第6周完成。

10.1缺血半暗带的救治：

在缺血性中风的周围有一个处于死亡风险但可以被救治的缺血 半暗带组织区域。STRO-1

将猴子麻醉并且俯卧定位于.0T的Siemens Trio扫描仪上，并且 以一定视场(180×180mm)和平面分辨率为0.5×0.5的图像采集矩阵 来采集T2-W涡轮自旋回波图像(T2WI,TR/TE＝4800/86ms)。采集十 二张间隔0.2mm的切片厚度为2mm的T2WI冠状图像。将使用Siemens MRI软件对每只猴子在T2WI上的梗塞体积进行描绘。

10.2NHP中风脑中的神经元取代和连接性

梗塞导致一个大脑半球约2/3的神经元和神经胶质缺失。这一系 列探讨的目标在于确定：(1)存活的nhpDPSC的数目、(2)分化成神 经元或神经胶质的nhpDPSC的数目、以及(3)nhpDPSC来源的神经 元是否产生功能连接。为了做到这一点，用逆转录病毒转导nhpDPSC 以使其表达GFP并且在移植之前在BrdU(大约20μM，保持24小时) 中培养以用于核标记。这两种标记方法提供了对于宿主脑内植入的 nhpDPSC的正式鉴别。

通过确定规定体积中nhpDPSC的密度以体视学估计分化成神经 表型的nhpDPSC的数目。从啮齿动物研究中我们发现了在4周时， hDPSC迁移至中风部位中在前-后方向上距注射部位大约1mm处(这 从脑表面上的伤痕来看是显而易见的)。因此，前-后轴线到注射部位 的厚度为8mm的猴脑包括了到中风后6周时大部分的移植的人细 胞。沿这个轴取得100mm的连续冠状切片(在100mm下约4×103 mm组织宽度＝每只治疗动物40个冠状切片)。构建随机抽样方案(使 用Image J)来对标准化组织体积中BrdU阳性细胞的数目进行计数。使用Bio-Rad MRC-1000UV共聚焦显微镜(Adelaide Microscopy)来进 行阳性染色的人细胞的直接3维计数。共聚焦显微术鉴别出与分化的 细胞(例如使用针对神经丝中链(NF-M)或β-III微管蛋白的抗体的神经 元、表达胶质纤维酸性蛋白GFAP或酪氨酸羟化酶的星形胶质细胞) 所表达的胞浆抗原共定位的GFP阳性或BrdU阳性nhpDPSC。

还评定了植入至猴子中风中的获自nhpDPSC的神经元的电生理 学特性。首先，评定从啮齿动物中风脑中分离的单个获自nhpDPSC 的神经元的生物物理学特性。简要地说，将动物断头并且取出脑，并 放置于冰冷的含氧盐水中。使用振动组织切片机将脑切为300-500 mm厚度的切片，洗涤并且然后通过胰蛋白酶和胶原酶的混合物进行 酶消化。通过小心地抽吸组织来获得单个神经元，洗涤并且接种于胶 原处理过的玻璃盖玻片上。24小时的恢复之后，将细胞用于全细胞 膜片钳技术。获自nhpDPSC的神经元被鉴别为GFP阳性细胞。使用 适当电压方案和通道抑制剂来鉴别这些细胞所表达的电压门控通道 的类型。

通过脑切片中细胞的膜片钳技术和成像来探讨获自nhpDPSC的 神经元产生动作电位(AP)和与其它神经元形成连接的能力。在振动切 片机上将靠近注射部位的脑切为250-400mm厚度的切片。在室温和 恒定充氧下恢复1小时的时间之后，将单个切片转移至安装在直立的 具有荧光附件IR和DIC光学的BX51WI Olympus显微镜上的记录室 中。首先使用GFP荧光鉴别nhpDPSC，并且然后使用IR滤光器 (720-850nm)和Rolera-XR IR感光摄影机(Rolera-XR IR-sensitive camera)来进行观测。使用EPC-10计算机控制的放大器和相关仪器来 进行脑切片中神经元的全细胞膜片钳技术。通过注射去极化电流来引 起Ap并且以电流钳模式记录。

为了探讨由nhpDPSC产生的AP是否能通过紧密连接或突触连 接传播至周围神经元，使用Fura-2荧光联合膜片钳技术来观测胞内 Ca

10.3非人灵长类动物中风脑的功能MRI(fMRI)和弥散张量成像 (DTI)以便探讨神经可塑性：

这些技术允许进行如与对照猴子相比在nhpDPSC治疗之后的神 经可塑性的无创探讨。在缺血性中风模型中，使用了fJVIRI来评定 前肢运动控制并且确定在nhpDPSC治疗之后运动皮层是否有更强的 活化。fJVIRI研究是在治疗之后3周和6周进行的。

序列表

<110> 麦瑟布莱斯特公司

中央阿德莱德当地卫生网络公司

<120> 治疗中风的影响的方法

<130> 512140

<150> 61/493057

<151> 2011-06-03

<160> 36

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 用于扩增GAPDH的寡核苷酸

<400> 1

cactgacacg ttggcagtgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<222>

<223> 用于扩增GAPDH的寡核苷酸

<400> 2

catggagaag gctggggctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<221>

<222>

<223> 用于扩增SDF-1的寡核苷酸

<400> 3

gagacccgcg ctcgtccgcc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增SDF-1的寡核苷酸

<400> 4

gctggactcc tactgtaagg g 21

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增IL-1β的寡核苷酸

<400> 5

aggaagatgc tggttccctc tc 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增IL-1β的寡核苷酸

<400> 6

cagttcagtg atcgtacagg tgc 23

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增FLT-1的寡核苷酸

<400> 7

tcactatgga agatctgatt tcttacagt 29

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增FLT-1的寡核苷酸

<400> 8

ggtataaata cacatgtgct tctag 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增TNFα的寡核苷酸

<400> 9

tcagatcatc ttctcgaacc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增TNFα的寡核苷酸

<400> 10

cagatagatg ggctcatacc 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增KDR的寡核苷酸

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tatagatggt gtaacccgga 20

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<212> DNA

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<223> 用于扩增KDR的寡核苷酸

<400> 12

tttgtcactg agacagcttg g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增RANK-配体的寡核苷酸

<400> 13

aacaggcctt tcaaggagct g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增RANK-配体的寡核苷酸

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taaggagggg ttggagacct cg 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增瘦蛋白的寡核苷酸

<400> 15

atgcattggg aaccctgtgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增瘦蛋白的寡核苷酸

<400> 16

gcacccaggg ctgaggtcca 20

<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增CBFA-1的寡核苷酸

<400> 17

gtggacgagg caagagtttc a 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增CBFA-1的寡核苷酸

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tggcaggtag gtgtggtagt g 21

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增PPARγ2的寡核苷酸

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aactgcgggg aaacttggga gattctcc 28

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增PPARγ2的寡核苷酸

<400> 20

aataataagg tggagatgca ggctcc 26

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增OCN的寡核苷酸

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atgagagccc tcacactcct c 21

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增OCN的寡核苷酸

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cgtagaagcg ccgataggc 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增MyoD的寡核苷酸

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aagcgccatc tcttgaggta 20

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<223> 用于扩增MyoD的寡核苷酸

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gcgagaaacg tgaacctagc 20

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<212> DNA

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<223> 用于扩增SMMHC的寡核苷酸

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ctgggcaacg tagtaaaacc 20

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<212> DNA

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<223> 用于扩增SMMHC的寡核苷酸

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tatagctcat tgcagcctcg 20

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<223> 用于扩增GFAP的寡核苷酸

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ctgttgccag agatggaggt t 21

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<212> DNA

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<223> 用于扩增GFAP的寡核苷酸

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tcatcgctca ggaggtcctt 20

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<212> DNA

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<223> 用于扩增巢蛋白的寡核苷酸

<400> 29

ggcagcgttg gaacagaggt tgga 24

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<223> 用于扩增巢蛋白的寡核苷酸

<400> 30

ctctaaactg gagtggtcag ggct 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增SOX9的寡核苷酸

<400> 31

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<223> 用于扩增SOX9的寡核苷酸

<400> 32

cctttgcttg ccttttacct c 21

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<212> DNA

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<223> 用于扩增X型胶原的寡核苷酸

<400> 33

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 用于扩增X型胶原的寡核苷酸

<400> 34

ttttcccact ccaggagggc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 用于扩增聚集蛋白聚糖的寡核苷酸

<400> 35

cactgttacc gccacttccc 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 用于扩增聚集蛋白聚糖的寡核苷酸

<400> 36

accagcggaa gtccccttcg 20