压实的骨胶原的制备和应用

技术领域

本发明涉及一种压实的凝成胶状的骨胶原，所述骨胶原尤其可以用作用于手术治疗椎间盘突出症的植入物。

背景技术

在动物、特别是哺乳动物和人类中的关节的磨损是广泛流行的问题。该磨损的原因可以是多样化的并且可以归因于增强的负荷或过度劳累、例如由于超重或错误的身体姿态、病理性原因、少的身体运动或者年龄。在多种情况下，通过上述原因引发的(在关节中用作缓冲物的)软骨组织的损伤导致关节磨损提高。此外，关节磨损的后果包括疼痛和活动性受限，疼痛也可能辐射到身体的其他区域。对磨损的关节的治疗的可能方式是手术，这种手术伴随着关节置换(亦即内修补)或软骨移植或者说软骨细胞植入。

软骨组织起决定作用的病症是椎间盘突出症。椎间盘是压力弹性的椎骨间盘，所述椎骨间盘位于颈椎、胸椎和腰椎的椎体之间。椎间盘是能变形的并且具有有限的压缩性和伸展性。由于这些特性，所述椎间盘参与脊柱的运动。椎间盘和椎关节形成一个功能单元，所述功能单元即使在强的机械负荷下也弹性地作出反应。

椎间盘由内部的胶质核(髓核)组成。该缺少细胞的组织由大约80％的水以及成纤维细胞和二型骨胶原组成。纤维软骨组织(纤维环)环绕髓核。玻璃状软骨位于椎间盘与椎体骨的上和下分界面上。

随着年龄增长，由于退化进程在椎间盘中产生裂纹。在随后的压力负荷后(例如通过猛然扭转脊柱)，发生髓核穿透纤维环，这典型地伴随着突然的疼痛。该病理学过程被称为椎间盘突出症。

由于髓核材料排出可能发生神经刺激和/或神经挫伤，其导致疼痛，也特别是导致疼痛辐射到腿部和臂部中，或者也导致感觉紊乱和力量降低。

现今的治疗可能性通常仅消除疼痛，然而不消除成因本身。椎间盘突出症不仅被非手术地治疗，例如通过物理疗法或服用止疼药，而且还被手术地治疗，例如借助于髓核摘除术，在所述髓核摘除术中去除椎间盘的凸出来的部分。紧接于髓核摘除术，例如可以植入替代材料。

在WO2012/004564中尤其描述一种用于制备生物材料的方法，该生物材料通过压实骨胶原来获得。

在专利申请DE10026789A1中公开一种作为软骨替代物的生物基质，所述生物基质包括至少1.5mg/mL的未压实的骨胶原。未压实的骨胶原生物基质由于较低的强度通常不适合作为用于机械强烈负荷的骨胶原(例如髓核)的替代物。

在专利申请DE10241817A1中公开了生物基质的示例，该生物基质尤其可用作用于髓核材料的替代材料。其中描述的生物基质优选使用凝成胶状的骨胶原纤维，所述骨胶原纤维接着被压实，由此直至1000mg/mL的骨胶原最终浓度是可能的。所述压实例如通过一维地施加的压力进行。

如在DE10241817A1中公开的一维压实导致在压实方向上与未压实方向相比更高的强度。然而，该一维压实的材料对于将其用作例如用于髓核的替代物无法保证足够的强度。

因此，本发明的任务在于，提供一种生物基质，所述生物基质包括压实的骨胶原，所述骨胶原具有高的密度和因此高的强度，以便尤其被用作用于髓核的替代物。

发明内容

令人惊奇地发现，至少二维地挤压过的压实的凝成胶状的骨胶原具有比仅一维地挤压或未挤压过的凝成胶状的骨胶原更高的强度。因此，本发明的第一方面涉及一种用于制备压实的骨胶原的方法，所述方法包括如下步骤：

a)沿第一挤压方向挤压凝成胶状的骨胶原，和

b)沿基本上正交于第一挤压方向的第二挤压方向挤压来自步骤a)的凝成胶状的骨胶原，

其中，在步骤a)中的挤压在0.01至0.05bar的范围内的压力实施，而在步骤b)中的挤压在0.5bar至2bar的范围内的压力实施。

在根据本发明的方法中，凝成胶状的骨胶原首先沿一个方向挤压。接着进行第二步骤，在该第二步骤中将来自第一方法步骤的一维地压实的骨胶原沿基本上正交于第一挤压方向的第二挤压方向进一步被挤压。通过该第二步骤可以产生压实的骨胶原基质，所述骨胶原基质具有足够的强度，以便尤其被用作髓核替代物。利用传统方法(参见例如DE10241817A1)无法达到可相比的强度或骨胶原密度。

本发明的另一方面涉及一种含骨胶原的产品，所述含骨胶原的产品包含根据本发明的方法可获得的压实的骨胶原。

可以通过根据本发明的方法制备的压实的骨胶原能够是含骨胶原的产品的一部分，所述含骨胶原的产品用于多种目的。

本发明的又一方面涉及一种植入物，所述植入物包含根据本发明的含骨胶原的产品或根据本发明的方法可获得的压实的骨胶原。

骨胶原、特别是压实的骨胶原尤其可以用作软骨替代物。因为软骨的特征首先在于其强度与柔韧性的结合，因此软骨替代物的关键是具有可与内生的软骨相比的特性、特别是还在其生物兼容性方面。这些特性可以通过至少二维地挤压凝成胶状的骨胶原来实现。因此，包括根据本发明的压实的骨胶原的含骨胶原的产品特别适合于用作植入物。

本发明的另一方面涉及一种用于实施根据本发明的方法的设备，所述设备包括：

·容器，其包括由一个底部和至少一个壁部限定的内腔，其中，所述容器构成为用于在内腔中接纳凝成胶状的含水的骨胶原，以及

·活塞，其封闭容器的内腔，并且能沿朝向底部延伸的第一挤压方向移动，

其特征在于，所述至少一个壁部包括多个区段，其中，这些区段中的至少一个区段能沿基本上正交于第一挤压方向定向的第二挤压方向移动。

本发明的又一方面涉及一种根据本发明的设备在根据本发明的方法中的应用。

附图说明

图1示出在将根据本发明的植入物应用于人类脊柱的区段中时柔韧性的测定的结果。

图2示出在将根据本发明的植入物应用于人类脊柱的区段中时在椎间盘之内的压力的测定的结果。

图3示出在将根据本发明的植入物应用于人类脊柱的区段中时椎间盘高度的测定的结果。

图4示出在将根据本发明的植入物应用于人类脊柱的区段中时防止重新脱出的抵抗性的测定的结果。

图5示出根据本发明的设备的一种实施方式。

具体实施方式

在根据本发明的方法中，凝成胶状的骨胶原首先沿第一挤压方向被挤压并且接着沿第二挤压方向被挤压。沿第一挤压方向和/或第二挤压方向的挤压至少各进行一次。用于该方法的原材料是凝成胶状的骨胶原。

凝成胶状的骨胶原可以通过使溶解的骨胶原凝成胶状来制备。软骨、肌腱、韧带和骨可以用作溶解的骨胶原的来源，其中，软骨是最优选的来源。软骨、肌腱、韧带和骨优选源于哺乳动物、例如牛、猪、羊和鼠，并且在根据现有技术中已知的方法(例如DE10026789)来获取。使用用于获取骨胶原的某些方法(例如DE10026789的方法)具有的优点是，在提取骨胶原后不必对其进行进一步处理，以便被应用于哺乳动物或人类。

除了来自哺乳动物的骨胶原，水母和植物也适合于作为用于骨胶原的其他来源。

如这里使用的“压实的骨胶原”涉及凝成胶状的骨胶原，该凝成胶状的骨胶原通过至少两个挤压过程而具有比未压制的骨胶原更高的密度。经压制的或者说压实的骨胶原优选地相对于原材料具有至少10倍、优选至少20倍、还更优选至少40倍的压缩率(例如6mg/ml到240mg/ml)、还更优选至少80倍压缩率。

如本文使用的“基本上正交于第一挤压方向的第二挤压方向”意味着，在根据本发明的方法中设有至少一个如下的挤压步骤，该挤压步骤具有基本上正交于第一挤压方向6的挤压方向9。

如本文使用的“挤压方向”是如下方向，对凝成胶状的骨胶原沿该方向施加压力。

凝成胶状的骨胶原在步骤a)中沿第一方向的挤压和/或在步骤b)中沿基本上正交于第一挤压方向的第二方向的挤压可以在考虑不同的参数下进行，所述参数选自如下组，所述组包括压力、持续时间、温度和最终尺寸，其中，所述参数压力、持续时间和温度优选可以变化，以便制备根据本发明的压实的骨胶原。

根据一个优选实施方式，在步骤a)中的挤压在0.012至0.03bar的范围内的压力实施、优选在0.015至0.025bar的范围内的压力实施、特别优选在0.01833bar实施；和/或在步骤b)中的挤压在1至1.5bar的范围内的压力实施、优选在1.01551bar实施。在这些压力数据中不包含空气压力。即实际施加到要压实的骨胶原上的压力是上述提到的压力或者压力范围与存在的空气压力(例如在海平面上1.01325bar)的总和。

已证明，在将上述范围内的压力应用到骨胶原上时导致骨胶原的温和且同时均匀的压缩率。施加到骨胶原上的压力优选地基本上均匀分布地施加到整个要压实的骨胶原上。

根据一个优选实施方式，在步骤a)和/或步骤b)中的挤压通过线性或阶段性升高的压力进行。

在挤压时施加到骨胶原上的压力可以是恒定的(即在步骤a)和b)期间限定的压力)，也可以随时间升高。在此，施加到骨胶原上的压力的升高可以线性或阶段性地进行。当然，也可以对要压实的骨胶原首先施加升高的压力，接着施加恒定的压力，反之亦然。在压力升高的情况下，终点(即要达到的最高压力)在上面提到的范围内。

根据一个优选实施方式，步骤a)实施1至48小时、优选实施6至24小时，还更优选实施8小时至18小时，还更优选实施10小时至14小时、特别是实施12小时；和/或步骤b)实施6至96小时、优选实施12至72小时、还更优选实施24至66小时、还更优选实施30至60小时、还更优选实施36至54小时、还更优选实施42小时至52小时、还更优选实施46小时至50小时、特别是实施48小时。

基于在根据本发明的方法中使用的优选的挤压压力，优选在较长的时间段上施加所述压力，特别是以便在压缩的骨胶原体中一方面达到可能的最高压缩，另一方面达到恒定的压缩。

根据一个优选实施方式，步骤a)和/或步骤b)在0℃至20℃、优选0℃至15℃、还更优选0℃至10℃、还更优选1℃至9℃、还更优选2℃至8℃、特别是4℃至6℃的温度进行。

根据本发明的方法制备的经挤压的骨胶原可以根据稍后的应用领域而具有不同的尺寸。根据本发明的另一优选实施方式，对于某些应用(例如，作为椎间盘的替代物)，在根据本发明的方法的步骤a)和/或步骤b)中产生的经挤压的凝成胶状的骨胶原的最终尺寸为1.5至5mm、优选2至4mm、还更优选2.4mm至3.0mm、还更优选2.6mm至2.8mm、特别是2.7mm棱长。

根据一个优选实施方式，二维挤压的凝成胶状的骨胶原所使用的凝成胶状的骨胶原可以通过使含骨胶原的溶液凝成胶状来提供。所述含骨胶原的溶液每mL溶液优选包含1至20mg、还更优选1至10mg、还更优选2mg至8mg、还更优选4mg至6mg、特别是5.5mg至6.5mg的溶解的骨胶原。

根据本发明的另一优选实施方式，所述含骨胶原的溶液通过将骨胶原溶于第一水溶液来制备，所述第一水溶液包含0.01至1％、优选0.05至0.5％、优选0.01至0.2％、特别是0.1％的有机酸，具有优选4.5至5、更优选4.6至4.9、特别是4.7至4.8的pK

如开头已经提到的，软骨、肌腱、韧带和骨可以用作所述溶解的骨胶原的来源。特别优选地，溶解的骨胶原由鼠尾的肌腱分离，其中，优选使用在DE10026789中描述的方法来将其分离。

根据一个更优选的实施方式，所述溶解的骨胶原是一型骨胶原。该骨胶原类型是成纤维的并且存在于皮肤、肌腱、骨、牙质、纤维软骨和角膜中。

根据另一优选实施方式，所述溶解的骨胶原具有大于90％、优选大于95％、还更优选大于99％、特别是大于99、8％的纯度。

根据本发明的一个优选实施方式，使溶解的骨胶原凝成胶状可以通过添加提高pH的制剂进行。凝成胶状过程优选在30分钟至10小时、优选45分钟至5小时、还更优选1至4小时、还更优选2至3小时的时间段进行，最高优选进行约2.5小时。特别有利地，使骨胶原凝成胶状在15℃至50℃、优选20℃至45℃、还更优选25℃至40℃、还更优选30℃至39℃的范围内的温度进行，最高优选在约34℃的温度进行。在凝成胶状过程期间，为了更好地混匀，持续地或无规律地搅拌或混合所述溶液。在该过程中的关键是，以不破坏凝成胶状的骨胶原的结构的方式进行所述混匀。

根据本发明的另一更优选的实施方式，所述提高pH的制剂以相对于在含骨胶原的溶液中的骨胶原为0.1:2(v/v)、优选0.5:1.5(v/v)、更优选0.8:1.2(v/v)、最优选1:1(v/v)的比例添加。

根据又一个更优选实施方式，所述提高pH的制剂以如下量添加给含骨胶原的溶液，使得所产生的含骨胶原的溶液的pH值提高到7.0至9.0、优选提高到7.0至8.0、更优选提高到7.1至7.8、还更优选提高到7.3至7.5。所述提高pH的制剂优选以如下量添加给含骨胶原的溶液，使得骨胶原凝成胶状的溶液具有7.0至7.4的pH值。

根据本发明的另一更优选的实施方式，所述提高pH的制剂是缓冲剂、优选2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)。

所述提高pH的制剂可以溶解在水中，也可以直接(也作为固态物质)掺入溶解的骨胶原。

根据又一优选实施方式，所述提高pH的制剂是含水组分的一部分，所述含水组分优选包括选自如下组的至少一个成分，该组包括Ham F12培养基、碳酸氢钠和D葡萄糖。

在一个优选实施方式中，紧接于步骤a)和b)，将所述压实的骨胶原转移到接纳容器中，所述接纳容器含有第二水溶液。

优选地，所述接纳容器的形状不是有角的，而是基本上椭圆形的、基本上圆的或圆形的。

所述第二水溶液优选是含盐溶液、更优选是PBS

转移到接纳容器中优选用于使压实的骨胶原的外形匹配于接纳容器的横截面，这通过从基本上有角的横截面过渡到基本上没有角的、更优选地基本上椭圆形的、还更优选地基本上圆的、最优选地基本上圆形的横截面进行。这优选通过使骨胶原膨胀、还更优选通过吸收水而发生。

本发明的另一方面涉及一种含骨胶原的产品，所述产品包含根据本发明的压实的骨胶原，并且所述产品可通过根据本发明的方法获得。

根据一个优选实施方式，所述能够利用根据本发明的方法制备的产品具有不透明的直至淡黄色的颜色。

根据一个优选实施方式，所述产品具有三维形状，所述三维形状优选是基本上圆柱形的。该圆柱形的三维形状优选地特征在于，所述三维形状具有基本上没有角的底部、更优选基本上椭圆形的底部、还更优选的基本上圆的底部、最优选基本上圆形的底部，所述底部具有2mm至5mm、优选2.7mm至4.5mm、更优选3.2mm至3.8mm、特别是约3.5mm的直径。

根据本发明的产品优选具有粘弹性的和/或渗透性的特性(优选与天然的髓核材料的特性相当)、是机械稳定的和/或高压缩性的(优选直至或者大于240mg/ml)。

根据本发明制备的压缩的骨胶原还具有水凝胶的特性。

本发明的另一方面涉及一种植入物，所述植入物包含根据本发明的含骨胶原的产品。

根据本发明的植入物可以用于多种目的。根据本发明的植入物可以用作髓核替代物、半月板替代物、韧带替代物和/或肌腱替代物，其中，所述植入物特别良好地适合作为髓核替代物，以用于治疗半月板损伤(例如半月板断裂)和韧带损伤(腕韧带、黄韧带、腹股沟韧带、髌韧带、前交叉韧带、后交叉韧带)。根据应用领域，可以将所述根据本发明的含骨胶原的产品成形为适合的植入物并且将其植入。

根据另一优选实施方式，所述植入物是长效植入物，该长效植入物的特征在于，细胞、优选椎间盘的细胞可以移入。通过细胞移入，根据本发明的植入物(在椎间盘植入物的情况下)可以变为类似于髓核的组织。

根据另一优选实施方式，所述植入物可以借助于手术植入。该手术可以对动物、特别是哺乳动物和人类实施。

在手术过程中，可以借助于辅助装置将根据本发明的植入物从接纳容器移置到目标位置，所述目标位置优选位于纤维环之内。根据本发明的植入物基于其特性优选地适合作为髓核材料的替代物。

根据一个更优选的实施方式，所述手术借助于微创手术技术实施。

所述手术优选作为对椎间盘突出症的治疗来实施，所述椎间盘突出症优选伴随着疼痛、更优选地伴随着背部和/或腿部疼痛。

根据本发明的植入物的量优选根据邻近的椎间盘的高度来确定和/或压入在其目标位置上。

手术优选紧接于髓核摘除术发生并且/或者优选通过封闭纤维环而结束。

根据一个优选实施方式，所述含骨胶原的产品或植入物包括如下压实的骨胶原，其密度大于150mg/mL、更优选地大于200mg/mL、最优选地大于240mg/mL。

优选地，具有上面提到的密度的含骨胶原的产品和/或植入物通过根据本发明的方法制备。

本发明的另一方面涉及一种用于实施根据本发明的方法的设备1，所述设备包括：

·容器2，其包括由一个底部3和至少一个壁部4限定的内腔5，其中，所述容器2构成为用于在内腔5中接纳凝成胶状的含水的骨胶原，以及

·活塞7，其封闭容器2的内腔5，并且能沿朝向底部延伸的第一挤压方向6移动，

其中，所述至少一个壁部4包括多个区段，其中，这些区段中的至少一个区段8能沿基本上正交于第一挤压方向6定向的第二挤压方向9移动。

容器2优选包括可灭菌的适合细胞培养的材料，优选

根据本发明的一个优选实施方式，所述底部3、所述至少一个壁部4和/或所述活塞7具有通入到内腔5中的至少一个开口10，以用于将水从容器2的内腔5去除。

所述至少一个开口10优选这样构造，使得凝成胶状的骨胶原在挤压过程中不会被挤压穿过所述至少一个开口10。因此，所述至少一个开口10优选具有50μm至500μm、优选100至300μm、还更优选120至250μm、还更优选130至200μm、特别是160μm的尺寸。

所述底部3、所述至少一个壁部4和/或所述活塞7也可以包括机械上足够稳定的材料或者由如下材料组成，所述材料可以优选在(在恰当的应用时与骨胶原接触的)整个区域上是多孔的并且可以是渗透水的。多孔的和渗透水的材料的使用是特别有利的，因为该材料在无需加入单独的开口(例如通过钻孔)的情况下便可制造。多孔材料的各孔相当于如这里所定义的开口10。

特别适合的是多孔的塑料，所述多孔的塑料由颗粒材料组成，这些颗粒在烧结过程中相互结合。由此产生空腔(孔)，这些空腔使气体和特别是液体(如水)可以穿流各部分。根据本发明的设备中可使用的多孔的塑料产品可以由各种热塑性材料制造，其中，特别优选使用超高分子量聚乙烯(UHMWPE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)和PE/PP共聚物。孔径尺寸被确定为使得水可以渗透所述材料而不会渗透含骨胶原的材料。

本文使用的术语“水”还可以包括存在于要被压缩的原材料中的其他物质和盐。就这点而言，“水”可以同义于“水溶液”。

根据本发明的另一优选实施方式，用于将水从容器2的内腔5去除的所述至少一个开口10与用于容纳水的至少另一个容器11连接。

为了将在压缩含骨胶原的材料时累积的水导出，根据本发明的设备具有用于容纳水的附加容器11。由此阻止水从设备直接排出到环境中。在压缩方法结束之后可以将水从容器11去除。

根据本发明的另一优选实施方式，所述设备1包括至少一个锁定装置12，所述锁定装置构成为用于将能沿第一挤压方向6移动的活塞7和/或能沿第二挤压方向9移动的区段8在第一挤压方向6和/或第二挤压方向9的端部位置中锁定在容器2上。

锁定装置是特别有利的，因为这能实现将能沿第一挤压方向6移动的活塞7和/或能沿第二挤压方向9移动的区段8固定在一个位置中。如果在压缩过程之后应降低或者完全去除施加到要压缩的骨胶原上的压力，则可以通过锁定装置来保持所压缩的骨胶原的形状。此外，所述锁定装置能实现沿第二方向压缩骨胶原。因此可以在单个设备中而不使用第二设备就能沿两个压缩方向实现骨胶原的压缩。

所述至少一个锁定装置12的锁定优选是可松开的。

所述至少一个锁定装置12优选是螺纹连接(例如螺栓、螺母)、钉子、销或夹子。

本发明的另一方面涉及根据本发明的设备1在根据本发明的方法中的应用。

根据本发明的一个优选实施方式，步骤a)和/或b)在根据本发明的设备1的容器2中实施。

因为水不可压缩，所以在挤压凝成胶状的骨胶原的情况下，在其中挤压凝成胶状的骨胶原的容器2被构造为至少部分可渗透水是有利的。

所述底部3、所述至少一个壁部4和/或所述活塞7优选具有至少一个通入到内腔5中的开口10，以用于将水从容器的2的内腔5去除。所述开口10优选地构造成使得在挤压过程期间凝成胶状的骨胶原不被挤压穿过所述开口10。因此，各壁部或者说限制部具有尺寸为50μm至500μm、优选100至300μm、还更优选120至250μm、还更优选130至200μm、特别是160μm的开口10。

根据本发明的一个优选实施方式，使溶解的骨胶原凝成胶状与挤压所述凝成胶状的骨胶原同样地在容器2中实施。容器2优选包括可灭菌的适合细胞培养的材料，优选

附图的详细说明

在实施例的段落中描述图1至图4。

图5示出根据本发明的设备1的优选实施方式的前视图的剖面(a)和侧视图的与第一剖面无关的剖面(b)，所述设备1包括容器2，所述容器2包括由一个底部3和至少一个壁部4限定的内腔5。容器2被构成为用于在内腔5中容纳凝成胶状的含水的骨胶原。此外，容器2包括封闭容器2的内腔5并能沿朝向底部延伸的第一挤压方向6移动的活塞7。设备1的特征在于，所述至少一个壁部4包括多个区段，其中，这些区段中的至少一个区段8能沿基本上正交于第一挤压方向6定向的第二挤压方向9移动。底部3具有通入到内腔5中的开口10，以用于将水从容器2的内腔5去除。所述用于将水从容器2的内腔5去除的开口10与用于容纳水的另一个容器11连接。所述设备1包括两个锁定装置12，这些锁定装置构成为用于将能沿第一挤压方向6移动的活塞7和能沿第二挤压方向9移动的区段8在第一挤压方向和第二挤压方向的端部位置中锁定在容器2上。

以下描述用于以图表说明本发明的实施例

实施例

实施例1：制备骨胶原GC

实施例1描述由鼠尾的肌腱制备骨胶原并且引用了商业上可获得的一型骨胶原溶液。

由鼠尾的肌腱分离骨胶原可以如在现有技术中(例如在DE10026789中)描述的那样实施。在此情况下，获得由较老的老鼠分离的骨胶原MS作为骨胶原GC。

实施例2：使骨胶原GC凝成胶状

实施例2描述使骨胶原GC凝成胶状。

使骨胶原GC凝成胶状示例性地包括如下步骤：

a.制备胶质中性化溶液，其包括如下在表1中示出的组成部分：

表1:胶质中性化溶液的组成部分

b.将骨胶原GC溶液与胶质中性化溶液按比例1:1(v/v)混合直至均匀，由此中和至生理pH值。

c.将来自前一步骤的均匀溶液浇注到横截面为矩形的浇注腔(长度：20cm、宽度：2.7cm、高度：5cm)。浇注腔位于设备中。

d.使前一步骤的均匀溶液在浇注腔中在34℃持续2.5h凝成胶状。

实施例3：挤压凝成胶状的骨胶原GC

实施例3描述凝成胶状的骨胶原GC的二维挤压。

凝成胶状的骨胶原GC的二维挤压示例性地包括如下步骤：

a.修改实施例2中的设备，其中，用具有冲头的盖罩(罩+冲头的重量1.01kg)来代替塑料盖。

b.用PBS

c.使用垫片。

d.用盖罩封闭设备。

e.在2-6℃第一次挤压持续12h，至2.7mm的最终尺寸。

f.取出一维挤压的凝成胶状的骨胶原GC。

g.在浇注腔侧向开口的情况下，将一维挤压的凝成胶状的骨胶原GC置入设备中。

h.使用垫片

i.在2-6℃第二次挤压至2.7mm的最终尺寸，包括如下步骤:

i.2.5kg持续4h

ii.5kg持续20h

iii.10kg持续24h

实施例4：进一步处理经挤压的骨胶原GC

实施例4描述二维挤压的骨胶原GC的进一步处理。

二维挤压的骨胶原GC的进一步处理示例性地包括如下步骤：

a.从设备取出二维挤压的骨胶原GC，其棱长为2.7mm。

b.将二维挤压的骨胶原GC制成例如5cm长的块。

c.将来自前一步骤的各个块转移到填充有PBS

d.在2-10℃存放来自前一步骤的各个块。

e.在2-37℃以15-20kGy、优选17.5-17.7kGy伽马射线灭菌来自前两个步骤之一的各个块。

实施例5：生物力学测试作为针对椎间盘突出症的植入物的根据本发明的产品

实施例5描述根据本发明的产品的生物力学特性，所述产品在椎间盘突出症的人类脊柱的部分中用作植入物。

基于根据本发明的产品的特性，该产品可以在治疗椎间盘突出症中用作植入物。所述特性例如包括240mg/mL的骨胶原含量，该含量类似于天然的髓核。

实施例5a：制备植入物

按照本发明的方法制备根据本发明的植入物。所述植入物包括98.5％的纯的天然的一型骨胶原，并且具有如下尺寸：50mm×3.5mm(长度×直径)。

实施例5b：脊柱样本的来历和准备

对六个样本实施活体外的试验，这些样本是人类的腰脊柱的功能单元。表2示出样本的概要。

表2

这六个样本来源于四个人类捐献者。每个样本包括一个椎间盘及其两个邻近的椎骨，由此给出椎间盘水平(level)。Pfirmann分级1-3被认为对于椎间盘突出的评价是合适的椎间盘质量。

从样本清除软组织和肌肉纤维。为了将样本适当地安装在测试仪中，这些样本的头端和尾端分别嵌入在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中。

实施例5c：样本处理的步骤

产生后缺损(posterior defect)

使用骨钳对每个样本进行髓核摘除术。在纤维环中产生6×7mm的“箱形切口(Box-cut)”。箱型切口是矩形的开口，该开口可以使用凿子来产生。产生该空腔是为了在稍后的步骤中能够用适当的植入物封闭该纤维环。

产生椎间盘脱出

借助于循环负荷测试，产生椎间盘脱出，即髓核材料穿透纤维环。

在伺服液压加载架(英斯特朗8871，达姆施塔特，德国)中实施该循环加载测试。定制的旋转基座装配在材料测试机的支撑面上。所述样本被法兰连接到旋转基座上，所述旋转基座保持360°/min的旋转速度。然后所述旋转基座侧向移动30mm，以实现样本的偏心的循环加载。液压活塞的负荷线性地提高到350N。然后施加5Hz的100-600N的范围内的正弦曲线形的力，直至最高100000个循环。限定最高100000个循环是为了在12小时内进行实验并且这样避免样本的退化。30mm的侧向移动有效地起到杠杆臂的作用，使得可以施加最高18Nm。当髓核材料泄漏时，停止测试或加载。去除泄漏的髓核材料，包括从箱形切口去除。因此实施了部分髓核摘除术。

植入根据本发明的植入物

微创地进行植入。根据本发明的植入物借助于冲头压入到椎间盘中。髓核材料在完好的椎间盘中被纤维环环绕并且由此获得自然的支撑。为了确定根据本发明的植入物的功能性并且将其与在完好的椎间盘中的髓核材料相比较，通过纤维环封闭装置

实施例5d：实施生物力学测试

测试环境

在室温实施测试。所述样本缠绕在以盐溶液浸湿的纱布中，以避免脱水和分解。

测定柔韧性

该测试在完好的椎间盘中、在“箱形切口”之后、在髓核摘除术之后、在植入根据本发明的植入物之后以及在循环加载测试之后实施。

为了测定柔韧性，首先在尾端固定样本。将纯弯曲力矩以恒定的1.5°/s施加到头端。在此，针对以下方向施用±7.5Nm：向右/向左侧向弯曲(+/-)、弯曲/拉伸(+/-)以及向左/向右轴向旋转(+/-)。

样本经历3.5个加载循环。前2.5个负荷循环用作预循环，以使粘弹性响应的效果最小化。后面的循环被用于结果。

测定在椎间盘内的压力

该测试在完好的椎间盘中、在“箱形切口”之后、在髓核摘除术之后、在植入根据本发明的植入物之后以及在循环加载测试之后实施。

通过位于椎间盘的核内的植入压力传感器记录椎间盘内的压力。

测定椎间盘高度

该测试在完好的椎间盘中、在“箱形切口”之后、在椎间盘突出症之后、在髓核摘除术之后、在植入根据本发明的植入物之后以及在循环加载测试之后实施。

使用Instron材料测试机测定椎间盘的高度。在测量之前对样本施加100N的预负荷持续5s。

循环加载测试

在植入根据本发明的植入物之后实施该测试。

在伺服液压加载架中(英斯特朗8871，达姆施塔特，德国)实施循环负荷测试。将定制的旋转基座按装在材料测试机的支撑面上。所述样本被法兰连接到旋转基座上，所述旋转基座保持360°/min的旋转速度。然后所述旋转基座侧向移动30mm，以实现样本的偏心的循环加载。液压活塞上的负荷线性地提高到350N。然后施加5Hz的100-600N的范围内的正弦曲线形的力，直至最高100000个循环。30mm的侧向移动有效地起到杠杆臂的作用，使得可以施加最高18Nm。在植入之后，测试在100000个加载循环之前在排出核材料时不停止，但是在排出植入物时停止。限定最高100000个循环是为了在12小时内进行实验并且这样避免样本的退化。

测定防止重新脱出的抵抗性

在循环加载测试之后执行该测试。

为了宏观地评价，在椎间盘的中间的横向平面上剖切椎间盘。利用数码相机拍摄照片，用于确定植入物的状态。

实施例5e：生物力学测试的结果

测定柔韧性

图1示出该测试的结果，该测试在完好的椎间盘中(a)、在“箱形切口”之后(b)、在髓核摘除术之后(c)、在植入根据本发明的植入物之后(d)以及在循环的负荷测试之后(e)实施。

可以看出，植入之后运动范围下降到可与完好的椎间盘的活动范围相当的水平。该积极效果被循环加载测试抵消。

测定在椎间盘内的压力

图2示出该测试的结果，所述测试在完好的椎间盘中(a)、在“箱形切口”之后(b)、在髓核摘除术之后(c)、在植入根据本发明的植入物之后(d)以及在循环的负荷测试之后(e)实施。

通过植入可以将椎间盘内的压力提高到甚至超过完好的椎间盘内的压力。在大多数情况下，该压力甚至不能通过循环加载测试来减小。

测定椎间盘高度

图3示出该测试的结果，该测试在完好的椎间盘中(a)、在“箱形切口”之后(b)、在椎间盘突出症之后(c)、在髓核摘除术之后(d)、在植入根据本发明的植入物之后(e)以及在循环的负荷测试之后(f)实施。

通过植入可以将椎间盘的高度降低到完好的椎间盘的高度。该效果再次被循环加载测试抵消。

测定防止重新脱出的抵抗性

图4示出该测试的结果。镊子指向植入物。在所植入的位置处植入物保持在周围的髓核材料内。作为循环加载测试的结果，没有发生新的椎间盘脱出。

结果的总结

使人腰椎的功能性区段遭受椎间盘脱出。根据本发明的植入物不仅可以使柔韧性而且还可以使椎间盘的高度适合于完好的椎间盘的柔韧性和高度。在植入之后，椎间盘内的压力甚至超过完好的椎间盘内的压力。

根据本发明的植入物在人类中应用的可能性

如通过上述实施例示出的那样，根据本发明的植入物适合于在椎间盘突出症之后修复椎间盘的特性。通常可以借助于髓核摘除术治疗与背部和/或腿部疼痛相关联的椎间盘突出症。在髓核摘除术过程中去除髓核材料。根据本发明的产品的植入物可以用作所去除的髓核材料的替代物，并且可以借助于推进器从注射管推入到缺损中。所植入的植入物的量可以根据邻近的椎间盘的高度来确定，例如，如Hong等人(亚洲脊椎期刊，第4卷，第1期，第1-6页，2010)描述的那样。

将根据本发明的植入物用作所去除的髓核材料的替代物可以通过微创手术技术来进行。

在置入植入物之后，应封闭纤维环。适合的封闭系统可从商业上获得，例如