一种水和藻培养基中酮洛芬乙酯的HPLC检测方法
文献发布时间：2023-06-19 18:34:06
技术领域
本发明属于有机化合物分析领域，具体涉及一种水和藻培养基中酮洛芬乙酯的HPLC检测方法。
背景技术
酮洛芬乙酯，化学名称为3-苯甲酰基-α-甲基苯乙酸乙酯，分子式为C
酮洛芬是一种典型非甾体抗炎、解热、镇痛药，被广泛应用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、骨关节炎及痛风等疾病中。
中国专利ZL201110222136.3一种酮洛芬乙酯的制备方法，公开了硫酸存在的条件下，将2-(3-苯甲酰基苯基)丙腈与乙醇反应制备酮洛芬乙酯的方法，但并未公开酮洛芬乙酯质量控制方法。
目前，通常只对酮洛芬乙酯的常规理化指标进行检测，而仅通过常规理化指标难以真实地反映出其质量状况，故建立一种能准确对酮洛芬乙酯进行定性定量检测的方法，对其生产应用具有重大指导意义。
发明内容
本发明的目的在于弥补上述现有技术的不足，提供一种水和藻培养基中酮洛芬乙酯的HPLC检测方法，更准确地实现对酮洛芬乙酯的质量控制。
本发明的目的将通过如下技术方案达到：
一种水和藻培养基中酮洛芬乙酯的HPLC检测方法，采用高效液相色谱仪和PDA检测器，并以ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm色谱柱对酮洛芬乙酯进行检测，所述HPLC检测采用如下色谱条件：流动相A为甲醇，B为水；流速为0.8～1.2mL/min；色谱柱温度为30～40℃；检测波长为254nm，进样量为25～35μL。
所述流动相甲醇和水的体积比为75:25。
优选为，所述流动相流速为1.0mL/min。
优选为，所述色谱柱温度为32～38℃。
进一步优选为，所述色谱柱温度为35℃。
优选为，所述进样量为30μL。
检测方法包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用稀释剂稀释即得供试品溶液，待HPLC测定。(2)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定。(3)测定及计算：设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
优选为，所述稀释剂为曝气水或藻培养基。
本方法的色谱条件下，酮洛芬乙酯的保留时间为7.45min。
本方法对酮洛芬乙酯的LOD为3.97μg/L，LOQ为13.2μg/L。
有益效果
1、本发明建立了水和藻培养基中酮洛芬乙酯的HPLC检测方法，克服了现有技术酮洛芬乙酯质量控制尚处于空白的问题，为酮洛芬乙酯生产应用过程及其相关研究过程中的质量控制提供了参考。本发明的方法经验证学试验表明，其专属性强、重复性好、线性关系良好，稳定性强，能满足酮洛芬乙酯的质量控制要求。
2、本发明的线性试验表明，在0.100mg/L～2.00mg/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为y＝110299x+511.061，该曲线的线性相关系数R＝0.9999。
3、本方法通过比较曝气水和藻培养基空白样品和添加回收率样品的谱图，酮洛芬乙酯在7.45min出峰，且空白样品在该时间点无干扰峰，结果表明该方法对酮洛芬乙酯的专属性好。
4、本方法目标峰的RSDR.T.为0.11％，RSDArea为0.80％，均小于5.00％，结果表明该方法可用于酮洛芬乙酯的定性和定量分析；本方法LOD为3.97μg/L；LOQ为13.2μg/L，能满足检测要求。
5、本发明的回收率试验表明，不同浓度的酮洛芬乙酯在曝气水中的平均添加回收率为95.4％～97.1％，在藻培养基中的平均添加回收率为88.6％～94.4％。
6、本发明的稳定性试验表明，本发明的检测分析方法能分别满足溞类急性活动抑制试验、藻类生长抑制试验及鱼类急性毒性试验的浓度测定要求。
附图说明
图1为酮洛芬乙酯线性拟合曲线图；
图2为酮洛芬乙酯典型图谱；
图3为低浓度酮洛芬乙酯曝气水中回收率加标溶液典型图谱；
图4为高浓度酮洛芬乙酯曝气水中回收率加标溶液典型图谱；
图5为低浓度酮洛芬乙酯藻培养基中回收率加标溶液典型图谱；
图6为低浓度酮洛芬乙酯藻培养基中回收率加标溶液典型图谱；
图7为酮洛芬乙酯鱼试验环境下稳定性图谱(0h)；
图8为酮洛芬乙酯鱼试验环境下稳定性图谱(96h)；
图9为酮洛芬乙酯溞试验环境下稳定性图谱(0h)；
图10为酮洛芬乙酯溞试验环境下稳定性图谱(48h)；
图11为酮洛芬乙酯藻试验环境下稳定性图谱(0h)；
图12为酮洛芬乙酯藻试验环境下稳定性图谱(72h)。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。实施例中所用试剂及仪器未注明生产厂商者，均可以通过市购获得常规产品。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
以下各实施例中涉及的仪器以及试剂包括但不限于：
实施例中使用的仪器与试剂：
1、试剂和溶剂
(1)甲醇：HPLC，上海安谱实验科技股份有限公司；
(2)UP水：电阻率，18.2MΩ×cm；
(3)曝气水：实验室自制；
(4)藻培养基：实验室自制；
(5)酮洛芬乙酯，纯度为99.2％。
2、主要仪器设备
(1)高效液相色谱仪：岛津LC2030C 3D Plus；
(2)SHIMAD LabSolutions数据采集、定性分析、定量分析工作站；
(3)电子天平：梅特勒－托利多(中国)有限公司，XSE205D、UEL204；
(4)生化培养箱，ZXSD-B1430。
实施例1
(1)HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为A：甲醇，B：水；A:B＝75:25(v/v)；流速为1.0mL/min；色谱柱温度为35℃；检测波长为254nm，进样量为30μL。
(2)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用曝气水稀释即得供试品溶液，按HPLC色谱条件测定；
(3)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定；
(4)测定及计算：按HPLC色谱条件设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
实施例2
(1)HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为A：甲醇，B：水；A:B＝75:25(v/v)；流速为0.8mL/min；色谱柱温度为30℃；检测波长为254nm，进样量为25μL。
(2)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用曝气水稀释即得供试品溶液，按HPLC色谱条件测定；
(3)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定；
(4)测定及计算：按HPLC色谱条件设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
实施例3
(1)HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为A：甲醇，B：水；A:B＝75:25(v/v)；流速为0.9mL/min；色谱柱温度为32℃；检测波长为254nm，进样量为28μL。
(2)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用曝气水稀释即得供试品溶液，按HPLC色谱条件测定；
(3)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定；
(4)测定及计算：按HPLC色谱条件设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
实施例4
(1)HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为A：甲醇，B：水；A:B＝75:25(v/v)；流速为1.1mL/min；色谱柱温度为38℃；检测波长为254nm，进样量为32μL。
(2)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用曝气水稀释即得供试品溶液，按HPLC色谱条件测定；
(3)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定；
(4)测定及计算：按HPLC色谱条件设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
实施例5
(1)HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为A：甲醇，B：水；A:B＝75:25(v/v)；流速为1.2mL/min；色谱柱温度为40℃；检测波长为254nm，进样量为35μL。
(2)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用曝气水稀释即得供试品溶液，按HPLC色谱条件测定；
(3)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定；
(4)测定及计算：按HPLC色谱条件设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
实施例6
(1)HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为A：甲醇，B：水；A:B＝75:25(v/v)；流速为1.0mL/min；色谱柱温度为35℃；检测波长为254nm，进样量为30μL。
(2)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用藻培养基稀释即得供试品溶液，按HPLC色谱条件测定；
(3)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定；
(4)测定及计算：按HPLC色谱条件设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
实施例7
(1)HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为A：甲醇，B：水；A:B＝75:25(v/v)；流速为0.8mL/min；色谱柱温度为30℃；检测波长为254nm，进样量为25μL。
(2)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用藻培养基稀释即得供试品溶液，按HPLC色谱条件测定；
(3)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定；
(4)测定及计算：按HPLC色谱条件设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
实施例8
(1)HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为A：甲醇，B：水；A:B＝75:25(v/v)；流速为0.9mL/min；色谱柱温度为32℃；检测波长为254nm，进样量为28μL。
(2)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用藻培养基稀释即得供试品溶液，按HPLC色谱条件测定；
(3)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定；
(4)测定及计算：按HPLC色谱条件设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
实施例9
(1)HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为A：甲醇，B：水；A:B＝75:25(v/v)；流速为1.1mL/min；色谱柱温度为38℃；检测波长为254nm，进样量为32μL。
(2)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用藻培养基稀释即得供试品溶液，按HPLC色谱条件测定；
(3)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定；
(4)测定及计算：按HPLC色谱条件设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
实施例10
(1)HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为A：甲醇，B：水；A:B＝75:25(v/v)；流速为1.2mL/min；色谱柱温度为40℃；检测波长为254nm，进样量为35μL。
(2)供试品溶液的制备：称取0.242g的酮洛芬乙酯试样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液，取适量试样储备液，用藻培养基稀释即得供试品溶液，按HPLC色谱条件测定；
(3)标准品溶液的制备：称取0.10081g酮洛芬乙酯标样于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为1000mg/L的酮洛芬乙酯标准储备液；取吸适量标准储备液，用甲醇稀释成系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，待HPLC测定；
(4)测定及计算：按HPLC色谱条件设定仪器参数，待仪器稳定后，将供试品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，按外标法计算酮洛芬乙酯含量。
为了进一步证实本发明的可行性，发明人通过大量的分析方法试验对本发明的检测方法进行了验证，部分试验内容摘录如下：
1、线性试验
精密吸取1.00mL实施例1中系列浓度为0.100mg/L、0.200mg/L、0.400mg/L、0.600mg/L、0.800mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的标准工作溶液，按本发明的检测方法进行高效液相色谱测定，以酮洛芬乙酯的浓度为横坐标，酮洛芬乙酯的峰面积为纵坐标绘制校正曲线，得到酮洛芬乙酯的方程为y＝110299x+511.061，该曲线的线性相关系数R＝0.9999，结果见表1和图1。
表1：线性试验结果
2、专属性试验
用本发明的检测方法测定曝气水空白样品、曝气水供试品溶液、藻培养基空白样品、藻培养基供试品溶液，比较空白样品和供试品的色谱图。酮洛芬乙酯的保留时间为7.45分钟，且空白样品在该时间点无干扰峰，结果表明该方法对酮洛芬乙酯的专属性好。
3、重复性试验
对实施例1中浓度为0.200mg/L的标准工作溶液进行连续进样6次，测定本发明方法的精密度，RSD
表2：精密度试验结果
结果表明本发明的方法对于同一样品的分析精密度满足要求。
4、检出限和定量限
对实施例1中浓度为0.100mg/L的酮洛芬乙酯标准工作溶液得到的图谱进行分析，在该浓度下，平均信噪比(S/N)＝76.39，根据LOD＝3×分析浓度/(S/N)，LOQ＝10×分析浓度/(S/N)。得本发明的LOD为3.97μg/L，LOQ为13.2μg/L，结果见表3。
表3：检出限和定量限试验结果
5、加样回收率试验
分别吸取1.00mL实施例1中浓度为2.40g/L的酮洛芬乙酯试样储备液于100.0mL容量瓶中，分别用曝气水和培养基定容至刻度，混匀，得到浓度为24.0mg/L高浓度曝气水/培养基回收率试验样品。分别向100.0mL容量瓶中添加1.00mL的高浓度曝气水/培养基回收率试验样品，用曝气水/培养基定容至刻度，混匀，得到浓度为0.240mg/L的曝气水/培养基低浓度回收率试验样品；每个浓度样品均平行制作5份。高浓度回收率实验样品用甲醇稀释50倍，低浓度回收率样品直接取样，用液相色谱仪测定，分析溶液中的被试物浓度并计算回收率。
按实施例1的仪器操作条件进行测试，按公式(1)计算回收率，按公式(2)和公式(3)计算回收率相对标准偏差(RSD)，分析结果见表4、表5、图3、图4、图5和图6，2种不同浓度的酮洛芬乙酯在曝气水中的平均添加回收率分别为97.1％和95.4％，回收率相对标准偏差分别为0.45％和1.03％；2种不同浓度的酮洛芬乙酯在藻培养基中的平均添加回收率分别为88.6％和94.4％，回收率相对标准偏差分别为0.31％、1.35％。
式中：
R——回收率，％；
C
式中：
S——标准偏差；
Xi——第i次测量得到的回收率，％；
N——参与计算的回收率个数。
式中：
RSD——相对标准偏差，％。
表4：曝气水中回收率试验结果
表5：藻培养基中的回收率
6、稳定性试验
分别准确称取0.1000g和0.1001g酮洛芬乙酯于100.0mL容量瓶中，分别加入曝气水和藻培养基定容至刻度，于25℃恒温培养箱中磁力搅拌24h，过0.45μm滤膜，得酮洛芬乙酯饱和溞类急性活动抑制试验稳定性储备液和藻类生长抑制稳定性储备液备用。称取1.08g酮洛芬乙酯于1L玻璃瓶中，加入1L曝气水，于25℃恒温培养箱中磁力搅拌24h，过滤，得酮洛芬乙酯饱和鱼类急性毒性试验稳定性储备液备用。
取储备液用甲醇稀释25倍，用本发明的检测方法进行测定，分析溶液中的被试物浓度，每个饱和溶液平行测定3次。
取3次测定结果平均值作为饱和储备液浓度，经测定，酮洛芬乙酯饱和溞类急性活动抑制试验稳定性储备液浓度为21.1mg/L，酮洛芬乙酯饱和藻类生长抑制稳定性储备液浓度为26.6mg/L，酮洛芬乙酯饱和鱼类急性毒性试验稳定性储备液浓度为20.9mg/L。
6.1溞类急性活动抑制试验稳定性
取30.00mL饱和溞类急性活动抑制试验稳定性储备液加入100.0mL容量瓶，用曝气水定容至刻度，混合均匀，得到溞类急性活动抑制试验稳定性样品。将其置于溞类试验条件下放置，间隔时间取样，用甲醇稀释10倍；按本发明的色谱条件进行浓度测定。按照公式(4)计算该样品溶液中目标物在曝气水中的稳定性。稳定性结果显示，酮洛芬乙酯在溞类急性活动抑制试验条件下，在48h内能维持在初始浓度的80％以上，结果见表6、图7、图8。
稳定性，％＝(Cnh/C0h)×100％..............(4)
式中：
C0h：是目标物在0小时的实测浓度；
Cnh：是目标物在n小时的实测浓度。
表6：溞类急性活动抑制试验稳定性结果
6.2鱼类急性毒性试验稳定性
取900mL饱和鱼类急性毒性试验稳定性储备液于5L烧杯中，加入2100mL曝气水，混合均匀得到鱼类急性毒性试验稳定性样品。于其置于鱼类试验条件下，间隔时间取样，用甲醇稀释10倍；按本发明的色谱条件进行浓度测定。按照公式(4)计算该样品溶液中目标物在曝气水中的稳定性。稳定性结果显示，酮洛芬乙酯在鱼类急性毒性试验条件下，在96h内能维持在初始浓度的80％以上，结果见表7、图9、图10。
表7：鱼类急性毒性试验稳定性结果
6.3藻类生长抑制试验稳定性
取30.00mL饱和藻类生长抑制试验稳定性储备液加入100.0mL容量瓶中，用培养基定容至刻度，混合均匀，得到藻类生长抑制试验稳定性样品。将其置于藻类试验条件下，隔时间取样，用甲醇稀释10倍；按本发明的色谱条件进行浓度测定。按照公式(4)计算该样品溶液中目标物在曝气水中的稳定性。稳定性结果显示，酮洛芬乙酯在藻类生长抑制试验条件下，在72h内能维持在初始浓度的80％以上，结果见表8、图11、图12。
表8：藻类生产抑制试验稳定性平行的设计
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。