Tn5转座酶突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Tn5转座酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

近十几年间，NGS(Next Generation Sequencing)技术高速发展，测序仪器不断更新迭代，形成规模化。在测序模式产业化的大环境下，测序样本制备成为其中很重要的一环。建库周期长、建库流程繁琐等都会限制NGS技术的应用。转座酶(Transposase)技术引入建库中解决了上述问题，拓展了NGS的适用范围。

转座酶(Transposase)是执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子的内端(inside end，lE)、外端(outside end，oE)和嵌合端(mosaic end，ME)的特异序列，能把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点，无同源性要求。其中，含有ME序列的体外转座效率最高，而Tn5转座酶就是其中一种，可以高效地将Tn5转座子插入到目的序列。基于Tn5酶建库的原理具体是指通过Tn5转座体的转座过程，在随机打断DNA的同时，也将测序接头插入片段化的DNA分子两端，最后通过PCR加上测序Index，完成含P5端与P7端完整接头的DNA文库的构建。这极大地缩短了建库的时间，减少了传统建库的复杂流程，因此，目前被广泛的用于二代测序领域。

但是，Tn5转座酶存在酶活不高，宿主污染等问题，很大地制约了在工业生产上的应用。

发明内容

鉴于目前Tn5转座酶的酶活不高，存在宿主污染等问题，本发明通过对Tn5转座酶的402和403氨基酸位点进行定点突变(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，突变后的Tn5转座酶的酶活更高，对基因组DNA具有高的转座插入效率，且突变型Tn5转座酶片段化位点基本无偏好性，无宿主污染，更好地达到了高通量建库要求。

本发明一方面保护Tn5转座酶突变体，所述突变体是对Tn5转座酶的402和403位点的氨基酸进行突变，第402位的半胱氨酸突变为色氨酸，第403位的谷氨酰胺突变为赖氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码权该Tn5转座酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明另一方面保护含有Tn5转座酶突变体编码基因的重组质粒，表达Tn5转座酶突变体的宿主细胞，以及含有Tn5转座酶突变体的试剂盒。

本发明还保护Tn5转座酶突变体在DNA建库中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明基于理性设计的方法，对Tn5转座酶的402和403位点的氨基酸进行突变，得到的突变体酶相较于野生型Tn5转座酶对基因组DNA具有高于2倍的转座插入效率，且无宿主污染，更好地达到了高通建库要求。

附图说明

图1为Tn5转座酶突变体的三级结构中的位置图(以球表示)。

图2为Tn5转座酶突变体蛋白纯化结果图。

图3为野生型和突变型Tn5转座酶应用于切割基因组DNA结果图。

图4为Tn5转座酶突变体应用于建库后的报告图。

图5为Tn5转座酶突变体应用于建库后的数据分析结果。

具体实施方式

实施例1：突变型Tn5转座酶的制备

1.突变体质粒的获取

本发明中经密码子优化的野生型Tn5转座酶的基因委托擎科生物科技有限公司进行全基因合成，基因合成服务中使用PTXB1质粒作为克隆载体。构建的重组质粒PTXB1-Tn5转入E.coli BL21(DE3)，获得重组菌。

2.克隆

采用定点突变PCR方法分别对Tn5转座酶基因位点的C402、Q403进行定点突变，定点突变的引物如表1所示。

表1 Tn5转座酶中定点突变引物的设计

以PTXB-Tn5质粒为模板，进行定点PCR扩增。PCR扩增体系为50μL，包含：PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25μL，1μL上游引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，1μL质粒模板(1ng/μL)，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。

PCR扩增程序为：98℃变性1min后，进入扩增循环，即98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共循环28次，最后再72℃延伸7min。PCR产物经过电泳检测，其条带单一、清晰。

所得定点PCR反应产物用Dpn I在37℃下酶解2h以消除父本模板，酶解产物采用热激法转化入化学感受态细胞E.coli DH 5α，转化液涂布含有氨苄青霉素钠(60μg/mL)的LB固体平板得到定点突变文库，于37℃培养12h。

3.突变酶的表达

从定点突变文库中随机挑取1～3个单菌落，培养并提取质粒，样品送至擎科生物科技有限公司测定核苷酸序列，以确定是否引入预期的突变，测序引物为T7通用引物，编码Tn5转座酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。引入预期突变的质粒转化入E.coliBL21(DE3)中，挑取单菌落接种至加有5mL LB液体培养基的试管中，37℃、200r/min条件下培养过夜。将培养好的菌液以1％比例(体积比)的接种量接种至含60μg/mL氨苄青霉素钠的100mL的LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH 7.0)中，37℃、220r/min培养至OD

4.突变酶的表达和纯化

将收集的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤两次，后用10％发酵液体积的裂解缓冲液(20mM Hepes，0.8M NaCl，1mM EDTA，2mM DTT，0.2％Triton X-100，10％glycerol，NaOH调节pH＝7.2)重悬，超声波破碎细胞，超声破胞工作条件为：功率300W，工作3s，间歇6s，超声8分钟。破胞液于10 000r/min，4℃条件下离心处理30min，收集上清液，加入终浓度0.05％的PEI，4℃磁力搅拌器上迅速混匀，高速离心(10 000r/min，30min)，收集上清并4℃保存，即得到含有的Tn5转座酶粗酶液。

使用

实施例2.Tn5转座酶突变体的应用

将蛋白纯化仪纯化的突变型Tn5转座酶进行如下操作：

(1)制备含有接头的Tn5转座酶突变体

在组装缓冲液中(50mM Hepes，0.1M NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1％Triton X-100，50％glycerol，NaOH调节pH＝7.2)，加入实施例1中所得的突变型Tn5转座酶2μg，10μM的接头引物，反应条件：30℃，60min，得到带有接头的Tn5突变型转座酶。

转座酶识别序列：AGATGTGTATAAGAGACAG；第一接头序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXTCGTCGGCAGCGTC；第二接头序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTCTCGTGGGCTCGG；其中，XXXXXXXX为Index序列。

(2)片段化DNA文库的构建

配制以猪组织基因组DNA为模板的处理体系，反应体系如下：50mM TAPS，25mMMgCl

(3)Tn5转座酶突变体GC偏好性分析及宿主污染

使用华大T7测序仪进行30M数据的读取上述DNA文库。测序结果如图4所示，GC含量与分布结果表明突变型Tn5转座酶片段化位点基本无偏好性；图5中的Mapped reads结果表明，突变型Tn5转座酶无宿主污染。