基于纯天然中草药、蚕丝提取的抗氧化抗皱效果的纳米微针化妆品及其制备工艺

技术领域

本发明属于美妆领域，具体涉及一种护肤品，特别是一种基于纯天然中草药、蚕丝提取的抗氧化抗皱效果的化妆品及其制备工艺。

背景技术

大量天然中草药能够用于化妆品领域，充分利用天然中草药的药效，达到除去皱纹、改善皮肤质量、保持皮肤亮泽的功效，达到中医所说的“驻颜”、“美颜”、“留颜”、“益容”之目的。

然而中草药在化妆品中应用的不是很广泛，研究不够深入，例如，积雪草是伞形科、积雪草属多年生草本植物，分布于中国陕西、江苏、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、福建、台湾、广东、广西、四川、云南等省区。积雪草是一种综合性能优良的草坪植物。积雪草以全草入药。性寒、味苦、辛，具清热利湿、解毒消肿的功效，临床上用于湿热黄疸、痈疮肿毒、跌打损伤、解砒霜中毒、覃中毒、解暑、传染性肝炎、流行性脑脊髓膜炎等。

积雪草提取物中含有大量的黄酮类物质以及多种三萜类，可以用于湿热黄疸，中暑腹泻，砂淋血淋，痈肿疮毒，跌扑损伤。积雪草提取物可以紧致表皮与真皮连接部分，能使皮肤变柔软，有助于解决皮肤松弛现象，使皮肤光滑有弹性；帮助促进真皮层中胶原蛋白形成，使纤维蛋白再生，重新连接起来，从根本上消除妈妈纹，使肌肤达到紧致光滑的效果。还可帮助受损的组织愈合及紧实肌肤。既能促进表皮与真皮之间的密切连接，又能抑制脂肪细胞的增加，防止皮肤水肿、出现肥胖。然而积雪草中活性成分单一，且活性成分不稳定，容易分解，不能很好的用于化妆品领域。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是制备一种化妆品，具有抗氧化、除皱纹、保持皮肤亮泽等特点。为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

S1、制备当归提取物：称取当归粉末10-30g，加入甲醇20-50ml，称定重量超声处理20-50min，用甲醇补足重量，摇匀后过滤，取滤液，干燥后获得当归提取物。

S2、积雪草提取物的制备：取干燥充分的积雪草药材，使用粉碎机进行粉碎，过60目筛，得到积雪草粉末，备用，取5-15g的积雪草粉末于三角瓶中，按照料液比加入一定体积分数的乙醇提取液，置于超声波清洗仪中超声提取。

S3、丝素蛋白的制备：电子天平称取60-80g家蚕蚕茧壳，配置4000ml质量分数为0.01M，PH＝9的碳酸氢钠/碳酸钠水溶液(碳酸氢钠3g，碳酸钠1g)，倒入不锈钢锅中，用电磁炉加热至沸腾后加入茧壳，调节溶液状态为微沸，每隔10min用玻璃棒搅拌一次，30min后取出用去离子水清洗干净，重复上述实验步骤3次，之后取出置于60℃的烘箱中烘干得到纯丝素纤维，在水浴锅中以一定的浴比溶解丝素纤维，在溴化锂溶液中溶解，置于恒温磁力搅拌器中65℃溶解约1-3h，冷却后装入透析袋中，在低温冰箱中(4℃)用去离子水透析3-4天，取出用脱脂棉过滤并离心得到纯净的丝素溶液，再进行冷冻干燥，得到丝素蛋白。

S4、制备天然中草药混合物溶液：将1-5ml溶解在乙醇中的当归提取物(1-5mg/ml)、积雪草溶液(1-5mg/ml)添加到质量浓度为3％-15％的丝素蛋白溶液中。

S5、丝素蛋白微针的制备：将得到的丝素蛋白溶液经过超声波震荡处理后，浇筑在激光打孔得到的聚二甲基硅基氧烷膜针孔模具阵列上，将模具经真空干燥，得到丝素蛋白凝胶微针。

优选的：步骤S2采取的料液比为1:20。

优选的：步骤S2采取的乙醇浓度为70％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明中的微针无激素，无色素，无合成香料，无防腐剂等有害的化学添加剂。

2、本发明中的积雪草、当归具有抑制络氨酸酶的作用，达到淡化斑痕，祛斑的效果。

3、本发明中的改性组合物将积雪草、当归包裹在丝素蛋白微针内，可达到协同作用，该纳米微球具有的抗氧化、祛斑性能高于单一组分的当归或白术，对皮肤具有良好的修复效果。

4、本发明操作简单，生产的成本较低，有利于批量生产。

5、本发明制备的纳米微球还具有一定的活化毛细血管的作用，有一定的抗疲劳效果。

6.本发明制备的微针注射在皮肤内，可达到长时间的作用效果。

附图说明

图1为本发明制备的丝素蛋白纳米微针扫描图。

图2为本发明制备的丝素蛋白纳米微针扫描图。

图3为本发明制备实施例1-5和对比例1-3的DPPH清除率柱状图。

图4为本发明制备实施例1-5和对比例1-3的自氧化速率柱状图。

图5为本发明制备实施例1和对比例4-5的积雪草提取物含量图。

图6为本发明制备实施例1-5和对比例1-3黑色素含量检测柱状图。

图7为本发明制备实施例1-5和对比例1-3细胞存活率柱状图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备

一、材料与方法

1.搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备

一个具体的实施例1的搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备过程如下：

S1、制备当归提取物：称取当归粉末10g，加入甲醇20ml，称定重量超声处理20min，用甲醇补足重量，摇匀后过滤，取滤液，干燥后获得当归提取物。

S2、积雪草提取物的制备：取干燥充分的积雪草药材，使用粉碎机进行粉碎，过60目筛，得到积雪草粉末，备用，取5g的积雪草粉末于三角瓶中，按照料液比1:20加入70％的乙醇提取液，置于超声波清洗仪中超声提取。

S3、丝素蛋白的制备：电子天平称取60g家蚕蚕茧壳，配置4000ml质量分数为0.01M，PH＝9的碳酸氢钠/碳酸钠水溶液(碳酸氢钠3g，碳酸钠1g)，倒入不锈钢锅中，用电磁炉加热至沸腾后加入茧壳，调节溶液状态为微沸，每隔10min用玻璃棒搅拌一次，30min后取出用去离子水清洗干净，重复上述实验步骤3次，之后取出置于60℃的烘箱中烘干得到纯丝素纤维，在水浴锅中以一定的浴比溶解丝素纤维，在溴化锂溶液中溶解，置于恒温磁力搅拌器中65℃溶解约1h，冷却后装入透析袋中，在低温冰箱中(4℃)用去离子水透析3d，取出用脱脂棉过滤并离心得到纯净的丝素溶液，再进行冷冻干燥，得到丝素蛋白。

S4、制备天然中草药混合物溶液：将1ml溶解在乙醇中的当归提取物(1mg/ml)、积雪草溶液(1mg/ml)添加到质量浓度为3％的丝素蛋白溶液中。

S5、丝素蛋白微针的制备：将得到的丝素蛋白溶液经过超声波震荡处理后，浇筑在激光打孔得到的聚二甲基硅基氧烷膜针孔模具阵列上，将模具经真空干燥，得到丝素蛋白凝胶微针。

一个具体的实施例2的搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤S5中积雪草提取物浓度为3mg/ml、当归浓度为1mg/ml。

一个具体的实施例3的搭载积雪草、当归丝素蛋白微针制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤S5中积雪草提取物浓度为1mg/ml、当归浓度为3mg/ml。

一个具体的实施例4的搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤S5中积雪草提取物浓度为3mg/ml、当归浓度为3mg/ml。

一个具体的实施例5的搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤S5中积雪草提取物浓度为5mg/ml、当归浓度为5mg/ml。

一个具体的对比例1的搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤S5中不加入当归提取物和白术粉。

一个具体的对比例2的搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤S5中只加入当归，不加入白术粉。

一个具体的对比例3的搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤S5中只加入白术粉，不加入当归。

一个具体的对比例4的搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备过程如下：

S1、制备当归提取物：称取当归粉末10g，加入甲醇20ml，称定重量超声处理20min，用甲醇补足重量，摇匀后过滤，取滤液，干燥后获得当归提取物。

S2、积雪草提取物的制备：取干燥充分的积雪草药材，使用粉碎机进行粉碎，过60目筛，得到积雪草粉末，备用，取5g的积雪草粉末于三角瓶中，按照料液比1:30加入70％的乙醇提取液，置于超声波清洗仪中超声提取。

S3、丝素蛋白的制备：电子天平称取60g家蚕蚕茧壳，配置4000ml质量分数为0.01M，PH＝9的碳酸氢钠/碳酸钠水溶液(碳酸氢钠3g，碳酸钠1g)，倒入不锈钢锅中，用电磁炉加热至沸腾后加入茧壳，调节溶液状态为微沸，每隔10min用玻璃棒搅拌一次，30min后取出用去离子水清洗干净，重复上述实验步骤3次，之后取出置于60℃的烘箱中烘干得到纯丝素纤维，在水浴锅中以一定的浴比溶解丝素纤维，在溴化锂溶液中溶解，置于恒温磁力搅拌器中65℃溶解约1h，冷却后装入透析袋中，在低温冰箱中(4℃)用去离子水透析3d，取出用脱脂棉过滤并离心得到纯净的丝素溶液，再进行冷冻干燥，得到丝素蛋白。

S4、制备天然中草药混合物溶液：将1ml溶解在乙醇中的当归提取物(1mg/ml)、积雪草溶液(1mg/ml)添加到质量浓度为3％的丝素蛋白溶液中。

S5、丝素蛋白微针的制备：将得到的丝素蛋白溶液经过超声波震荡处理后，浇筑在激光打孔得到的聚二甲基硅基氧烷膜针孔模具阵列上，将模具经真空干燥，得到丝素蛋白凝胶微针。

一个具体的对比例5的搭载积雪草、当归丝素蛋白微针的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤S2中料液比为1:40。

2.体外抗氧化性能测定

(1)DPPH自由基清除能力测定

用1000mL甲醇溶解40mgDPPH得到0.04mg/mL的DPPH甲醇溶液，配制浓度为1mg/mL的样品溶液。取0.2mL各样品溶液中加入7.8mLDPPH甲醇溶液，避光反应30min，在517nm处测定吸光值，以蒸馏水代替样品做空白对照，以甲醇代替DPPH甲醇溶液做样品空白，以维生素C做阳性对照。

DPPH自由基的清除能力/％＝(A

(2)O

邻苯三酚在酸性条件下稳定，在碱性条件下能迅速自氧化产生O

配制50mLpH＝8.2的Tris-HCl溶液(0.1mol/L的Tris溶液50mL 0.1mol/L的HCl溶液22.8mL，定容至100mL)、3mmol/L的邻苯三酚溶液。

邻苯三酚自氧化速率的测定：取5mLTris-HCl缓冲液，加入4.7mL超纯水，25℃保温20min，加入25℃的邻苯三酚溶液0.3mL，迅速倒入比色皿，每隔一段时间测定一次319.5nm处的吸光值，以吸光值为纵坐标，时间为横坐标绘制曲线，斜率即为邻苯三酚的自氧化速率。

样品的测定：以4.7mL样品溶液代替超纯水进行测定，以吸光值为纵坐标，时间为横坐标绘制曲线。

3.料液比对积雪草提取物提取率的影响

采用薄层层析法(TLC)对积雪草中的羟基积雪草苷与积雪草苷进行定性分析，参照文献，并经过预实验验证，最终确定展开剂种类及比例为三氯甲烷:醇:水＝7:3:0.5，将点样后的硅胶板置于展开剂中，当展开剂离硅胶板的上缘1cm时，取出硅胶板，喷洒10％硫酸乙醇的显色剂，105℃条件下，烘箱烘干显色。

4.酪氨酸酶抑制活性检测

在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶多用于多巴，形成多巴醌，多巴醌经过一系列自发反应后形成黑色素。

采用Elson-Morgan改良法测定透明质酸酶活性的抑制率。实验过程中，透明质酸酶能够不加选择地水解透明质酸中的β-N-乙酰葡糖胺与D-葡糖醛酸盐之间的1，4-键，得到β-N-乙酰葡糖胺，β-N-乙酰葡糖胺在碱性条件下可以与乙酰丙酮缩合生成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，生色原与对-二甲氨基苯甲醛在浓盐酸乙醇中生色。

配制浓度为1mg/mL的样品溶液，待用。取0.1mL浓度为0.25mmol/L的CaCl

酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(C-D)/(A-B)]×100％

其中，A：对照溶液吸光值(用醋酸缓冲液代替样品溶液)；B：对照空白溶液吸光值(用醋酸缓冲液代替样品溶液及酶液)；C：样品溶液吸光值；D：样品空白溶液吸光值(用醋酸缓冲液代替酶液)。

先在450nm-700nm范围内扫描A液，以确定最大吸收波长。

二、结果

1.微针表征

图1、图2为丝素蛋白微针的扫描图，从图中可以看出，微针阵列规整，长短一致，排列均匀，长度在500μm左右。从图中还可以看出冷冻干燥后仍能保持原有的形状，并未出现断裂弯曲，排列均匀，能够正常刺入皮肤。

2.体外抗氧化实验

表1

分别配制浓度为1mg/mL的各样品溶液，以维生素C作为阳性对照。各样品对DPPH的清除结果如图3所示。

图3为DPPH自由基清除性能的柱状图，从图中可以看出，随着实施例中积雪草和当归的不断加入，实施例的DPPH清除能力也在增加。和市面上的VC抗氧化剂相比，实施例1-5的DPPH清除性能要更好。通过实施例1和对比例1-3的比较，可以看出积雪草和当归同时加入时，样品的抗氧化性能要好于单一组分的抗氧化性能，说明二者具有协同作用。

图4为空白对照、实施例1-5和对比例1-3的自氧化性能柱状图，实施例1-5的自氧化速率要明显低于空白对照和对比例1-3，说明本发明制备的微针具有良好的抗氧化性能。

3.料液比对样品中积雪草含量实验

表2

图5为实施例1和对比例4、对比例5中不同的料液比对积雪草提取物影响的柱状图。实施例1和对比例4、对比例5中的料液比分别为1:20、1:30、1:40，随着料液比的不断减小，单位质量原料提取到的羟基积雪草苷与积雪草苷质量均呈现升高降低再升高降低的趋势，考虑提取积雪草提取物的提取效率及消耗成本等因素，选择1:20作为实验最佳料液比。

细胞实验

一、材料与方法

1.材料

B16-F10细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)；南DMEM培养基(美国Gibco公司)；0.25％胰蛋白酶－EDTA(美国Gibco公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)；PBS缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)；噻唑蓝试剂盒(MTT，江苏凯基公司)。

2.黑色素抑制实验

采用NaOH裂解法测定细胞内的黑色素含量。将处于对数生长期的B16细胞消化，接种于6孔板中，浓度为2×105个/孔，并置于37℃、5％CO

黑色素相对含量＝(OD

每个样品重复3次进行测定。

3.细胞毒性检测

收集对数生长期细胞，铺板使待测细胞密度至5000个/孔，于37℃、5％CO

细胞存活率＝(测定孔吸光度－空白对照组吸光度)/(对照组吸光度－空白对照组吸光度)×100％。

二、结果

表3

1.黑色素含量实验

图6为本发明空白对照、实施例1-5、对比例1-3进行细胞实验所得到的细胞内黑色素含量柱状图。从图中可以看出实施例5中细胞内黑色素含量最低，原因是实施例5中积雪草提取物和当归提取物要多于实施例1-4当中的含量。此外，通过实施例1-5和对比例1-3的比较，可以看出，积雪草和当归的同时加入要好于单一含量的加入，这也从另一方面说明，当归和积雪草在抑制黑色素方面具有协同作用。

2.细胞毒性检测

图7为本发明空白对照、实施例1-5、对比例1-3进行细胞实验所得到的细胞活性柱状图，从图中可以看出，实施例1-5和对比例1-3相比于空白对照来说，细胞的存活率都要高于空白对照，也就是说样品对细胞是不具有毒性的。同时，实施例1-5中的细胞存活率还要好于对比例1-3，这也说明积雪草和当归具有协同作用。

综上，本发明制备的除皱、抗氧化组合物以积雪草提取物和当归提取物作为原料，将两者加入在丝素蛋白溶液中，制备成纳米微针。纳米微针穿透皮肤，将本化妆品注射入皮肤中，使本发明在皮肤内更好的发生作用。当该方法为除皱、抗氧化化妆品提供了新的思路，也为除皱抗氧化组合物的制备提供了一种新的方法。

最后应说明的是：以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。