一种缺失MnmE基因的弓形虫弱毒活疫苗及构建方法

技术领域

本发明属于生物及基因工程领域，具体涉及一种缺失MnmE基因的弓形虫弱毒活疫苗及构建方法。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专一性的胞内寄生虫，属于顶复门球虫亚纲肉孢子虫科，它是世界上分布最广泛的寄生虫之一，可以感染几乎所有温血动物和部分冷血动物，全球有三分之一的人口受到这种寄生虫的威胁。弓形虫的传播可以通过粪口途径、食用受感染的肉以及通过胎盘从母亲转移到胎儿。成人的原发性感染大多呈现无症状，但当感染某些分离株时，免疫功能正常的个体也可能会发生严重的急性弓形虫病。免疫功能低下个体的潜伏感染被重新激活可导致致命的弓形虫脑炎、心肌炎和肺炎。怀孕期间获得的感染会对胎儿造成严重损害，例如长期致残后遗症、死产或胎儿死亡。而家畜等动物感染后，易流产、死胎，给畜牧业造成严重的经济损失。此外，一些新的研究结果表明，弓形虫的感染和一些精神性疾病，例如精神分裂症、抑郁症和自杀倾向等也存在着一定的关系。

而人和动物感染了这种寄生虫后，因弓形虫具有各种免疫逃避机制，完全治愈的难度非常大，并且目前所有的治疗药物都存在一定的局限性和药物毒性。值得注意的是，在发现弓形虫病一百多年后，它仍然是一种被忽视的寄生虫感染，目前没有安全有效的药物或疫苗可以预防弓形虫感染，关于抗弓形虫药物与预防疫苗的研究迫在眉睫，因此构建具有良好免疫原性和免疫保护力的弓形虫疫苗对于人类生活健康和畜牧业的良性发展具有非常重要的价值。

发明内容

本发明的目的是为针对以上提到的现有技术的不足，提供一种缺失MnmE基因的弓形虫弱毒活疫苗，所述弓形虫基础虫株RHΔku80，该弓形虫基础虫株RHΔku80含有tRNA修饰GTP酶基因：MnmE基因，所述MnmE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述弓形虫基因缺失虫株具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，该序列替代了MnmE基因。

所述的缺失MnmE基因的弓形虫弱毒活疫苗，其中，弓形虫疫苗虫株以注射稀释液作为溶剂制成疫苗虫株的速殖子混悬液。

本发明还提供了上述缺失MnmE基因的弓形虫虫株的构建方法，通过以下步骤实现：

(1)出发虫株RHΔku80：选用弓形虫基础虫株RHΔku80，所述虫株为真球虫目弓形虫科弓形科属的I型虫株，该弓形虫基础虫株RHΔku80含有tRNA修饰GTP酶基因：MnmE基因，所述MnmE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgMnmE质粒的构建：以pSAG1-Cas9-TgU6-sgBbs I质粒为模板，经Bbs I酶切线性化，将上下游引物经梯度降温合成双链，使用Solution I连接、转化E.coli TOP10得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgMnmE质粒，其中，上、下游引物序列(5’至3’方向)分别为：

gRNA-MnmE-F：ACAGGGAGCCGGTTCTCATG

gRNA-MnmE-R：CATGAGAACCGGCTCCCTGT；

(3)MnmE-5UTR::DHFR::MnmE-3UTR同源模板的制备：以pBlue-DHFR质粒为模板，设计分别包含MnmE-5UTR和MnmE-3UTR同源臂的上下游引物，利用KOD高保真酶扩增获得带有MnmE-5UTR和MnmE-3UTR同源臂的模板序列，其中扩增MnmE-5UTR::DHFR::MnmE-3UTR同源模板的引物序列(5’至3’方向)为：

MnmE-5UTR-F：

AAGCTACGCGGGTTATTCGTACGCAACCTGAGAACCCGCCTGTCATTCGATTTTCAC CCC

MnmE-3UTR-R：

AAATGCCTCGCGTAGCGGCGAAAACGCGACGCGTGTGTCTGGATCGATCCCCCCGG GCTG

(4)弓形虫基因缺失虫株ΔMnmE的获得：将步骤(2)中用于定点打靶的pSAG1-Cas9-TgU6-sgMnmE质粒和步骤(3)中用于同源替换MnmE基因的MnmE-5UTR::DHFR::MnmE-3UTR同源模板混匀后共同电转至出发虫株RHΔku80中，经3μM乙胺嘧啶筛选、PCR鉴定和单克隆筛选，获得上述MnmE基因缺失的弓形虫虫株，所述ΔMnmE缺失虫株缺失SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

本发明提供的上述缺失MnmE基因的弓形虫弱毒活疫苗，是一种缺失tRNA修饰GTP酶MnmE基因的弓形虫弱毒活疫苗。本发明发现缺失该基因后，弓形虫缺失突变虫株具有毒力减小，小鼠体内繁殖少，能为小鼠提供良好的免疫保护效果等特点，有成为抗动物弓形虫病弱毒活疫苗的潜力。在对动物接种时，将所述弓形虫弱毒疫苗的速殖子用稀释注射液制成混悬液即可进行接种。

本发明的有益效果在于：本发明提供的是一种可用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗，与出发虫株相比，MnmE基因缺失疫苗虫株在小鼠体内几乎没有致病性，也不会在体内形成包囊，对宿主的安全性高；MnmE基因缺失虫株具有良好的免疫原性和免疫保护力，能提高动物对弓形虫的免疫能力，尤其是对主要流行的II型虫株，有制备预防动物弓形虫病的弱毒活疫苗的潜力。

附图说明

图1为本发明具体实施例中敲除弓形虫MnmE基因的策略示意图。

图2为本发明具体实施例中ΔMnmE单克隆虫株的PCR鉴定结果。

图3为本发明具体实施例中ΔMnmE虫株对小鼠的毒力试验结果。

图4为本发明具体实施例中不同剂量ΔMnmE虫株对小鼠的毒力试验结果。

图5为本发明具体实施例中ΔMnmE虫株感染小鼠的荷虫量试验结果。

图6为本发明具体实施例中ΔMnmE虫株对小鼠的免疫保护力试验结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。所描述的实施例仅仅是本发明一部分而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有进行创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：弓形虫ΔMnmE虫株的构建

(1)出发虫株RHΔku80

RHΔku80虫株是具有tRNA修饰GTP酶MnmE的弓形虫虫株，可在HFF细胞上连续传代。弓形虫RHΔku80虫株公开在(Huynh,M.H.and Carruthers,V.B.2009.Tagging ofendogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80.Eukaryot Cell 8,530-539.)中。

(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgMnmE质粒的构建

①利用网站EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)设计靶向目的基因的sgRNA序列，并根据设计的序列设计gRNA引物：

上游引物gRNA-MnmE-F：5'-ACAGGGAGCCGGTTCTCATG-3'

下游引物gRNA-MnmE-R：5'-CATGAGAACCGGCTCCCTGT-3'；

②在灭菌PCR管中配制如下反应体系：

将上述液体混匀后，置于PCR仪中反应，反应程序如下：

③将实验室保存的pSAG1-Cas9-TgU6-sgBbs I质粒与Bbs I内切酶按照如下体系预混：

pSAG1-Cas9-TgU6-sgBbs I质粒    8μL

Bbs I                          1μL

Bbs I Enzyme Buffer            1μL

置于37℃水浴锅酶切2h，通过1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并割胶回收酶切后的质粒产物。

④取新的灭菌PCR管，配制以下反应体系：

pSAG1-Cas9-TgU6-sgBbs I酶切产物     3μL

sgRNA退火产物                       2μL

Solution I                          2μL

置于16℃连接仪连接3h。

⑤将连接产物转化入E.coli TOP10(100μL)感受态细胞中，取适量均匀涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB板上，37℃倒置培养过夜，挑取生长良好的单菌落扩大培养并取500μL菌液测序，若序列比对完全正确，则表明目标质粒pSAG1-Cas9-TgU6-sgMnmE构建成功。利用浙江易思得生物科技有限公司的去内毒素质粒提取试剂盒进行pSAG1-Cas9-TgU6-sgMnmE质粒的抽提，测定浓度后备用。

(3)MnmE-5UTR::DHFR::MnmE-3UTR同源模板的制备

①根据拟敲除基因的Gene ID在ToxoDB上确定该基因所在位置，确定5'同源臂(MnmE-5UTR)和3'同源臂(MnmE-3UTR)；

②根据图一所示的MnmE基因敲除策略进行带有TgMnmE基因5'同源臂和3'同源臂扩增引物的设计：

MnmE-5UTR-F：5'-AAGCTACGCGGGTTATTCGTACGCAACCTGAGAACCCGCCTGTCATTCGATTTTCACCCC-3'

MnmE-3UTR-R：5'-AAATGCCTCGCGTAGCGGCGAAAACGCGACGCGTGTGTCTGGATCGATCCCCCCGGGCTG-3'；

利用高保真酶对PBlue-DHFR质粒进行PCR扩增，扩增体系如下：

将上述液体混匀后，置于PCR仪中反应，反应程序如下：

对含有SEQ ID NO：2所示序列的目的片段MnmE-5UTR::DHFR::MnmE-3UTR进行切胶回收并测定浓度、备用。

(4)弓形虫基因缺失虫株ΔMnmE的获得

①将步骤(1)的出发虫株RHΔku80培养至50％虫体逸出，无菌细胞刮刀刮下细胞后用无菌注射器抽吸悬液3-5次，将细胞内弓形虫完全破出，利用无菌的5μm滤器过滤纯化虫体，室温800g离心5min后弃上清，用5mL HBSS重悬洗涤虫体后，加入1mL的电转液CytomixBuffer(120mM KCl,0.15mM CaCl

②根据计数结果，取含有1×10

③吸出悬液接入HFF细胞中，放置于37℃、5％ CO

④每天观察虫体状态，待电转后的虫体大部分逸出HFF细胞后，将细胞破裂使弓形虫完全逸出。取适量虫体悬液接至新的HFF细胞中，用含有3μM乙胺嘧啶的培养基进行筛选；

⑤在药物筛选2-3代后，收集速殖子，计数后接至铺满HFF细胞的96孔板中进行单克隆筛选(接2块96孔板)，每孔接种1-2个(计算量)速殖子；

⑥10天左右后在显微镜下观察是否存在单一虫斑，用移液枪将虫斑吹起，扩繁至24孔板继续培养，待70％虫体逸出后，吸取适量速殖子利用DNA提取试剂进行DNA的提取，以鉴定单克隆虫株；

⑦对上一步提取的单克隆虫株DNA进行PCR1、PCR2、PCR3鉴定，MnmE的基因敲除示意图及PCR鉴定引物设计原理见图1，若单克隆虫株PCR1、PCR3有特异性条带而PCR2无目的条带则说明该单克隆虫株为基因缺失虫株ΔMnmE。PCR的上下游引物分别为：

上游引物PCR1-F：5'-ACAGGAGGGGTTAAAGCACC-3'

下游引物PCR1-R：5'-GCATGAAAAGCGTCCTACCAC-3'

上游引物PCR2-F：5'-TGAAGGGTTTGCACCTCACAG-3'

下游引物PCR2-R：5'-CGATCGTCCATCTCCACATCTT-3'

上游引物PCR3-F：5'-TCACCGCCGAGGATTTTGAG-3'

下游引物PCR3-R：5'-TCCCCGAACGACCCTATCAA-3'

反应体系如下：

反应条件如下：

⑧PCR产物鉴定：扩增完成后，取8μL PCR产物与2μL的10×Loading Buffer混匀，用1％琼脂糖凝胶核酸电泳实验验证扩增片段大小，凝胶成像系统观察并拍照，鉴定结果如图2所示，表明成功获得ΔMnmE的单克隆虫株。

⑨将鉴定为ΔMnmE的虫株接至T25培养瓶扩大培养，并冻存到液氮中长期保存。

实施例2：含弓形虫ΔMnmE虫株的弱毒活疫苗的用途

2.1基因缺失虫株ΔMnmE稀释注射液

(1)稀释注射液配方

称取NaCl 2g、KCl 0.0493g、KH

(2)稀释注射液制作方法

①磁力搅拌器混匀；

②0.22μm滤器过滤除菌。

2.2ΔMnmE缺失株对小鼠的毒力实验

(1)在HFF细胞中培养弓形虫速殖子，待有40-50％虫体逸出时，弃去培养瓶中的培养基，加入PBS洗涤，去除残留的培养基和已经逸出的虫体，加入稀释注射液。

(2)用细胞刮将细胞刮下，用5mL无菌注射器抽吸悬液3-5次，将细胞破裂使弓形虫完全逸出，用无菌的5μm孔径滤器过滤去除宿主细胞碎片，用血球计数板对虫体悬液进行计数、稀释。

(3)对7周龄雌性ICR小鼠进行腹腔接种ΔMnmE虫株，接种剂量为100速殖子/只，同时按100速殖子/只接种RHΔku80作为对照组，每组6只小鼠。将2组小鼠在相同的环境中饲养，每天记录小鼠的存活情况，观察30天。结果如图3所示，接种ΔMnmE虫株的小鼠在30天内全部存活，存活率为100％；接种RHΔku80虫株的小鼠在8天内全部死亡，存活率为0。

2.3不同剂量ΔMnmE缺失株对小鼠的毒力实验

按2.2的方法收集ΔMnmE虫株，对7周龄雌性ICR小鼠进行腹腔接种，接种剂量分别为1×10

2.4小鼠腹水中ΔMnmE虫株荷虫量实验

(1)分别向不同组7周龄雌性ICR小鼠，按照1×10

(2)将5mL生理盐水注入空白ICR小鼠，然后取出，形成阴性对照液，将10

(3)进行荷虫量qPCR实验，所用引物序列如下：

RT-tubulin-F：5'-CACTGGTACACGGGTGAAGGT-3'

RT-tubulin-R：5'-ATTCTCCCTCTTCCTCTGCG-3'

反应体系如下：

反应程序如下：

(4)qPCR结果如图5所示，接种ΔMnmE敲除虫株小鼠的腹水荷虫量显著低于对照组RHΔku80的小鼠腹水荷虫量，说明弓形虫ΔMnmE在小鼠体内繁殖能力显著降低，可以被宿主有效清除。

2.5ΔMnmE缺失株对小鼠的保护力实验

(1)分别向不同组7周龄雌性ICR小鼠，按照1×10

(2)免疫30天后，对各组免疫或未免疫的小鼠分别攻毒不同型的弓形虫虫株，攻毒情况如下表1.

表1

(3)免疫30天后进行小鼠攻毒实验的检测结果如图6所示。结果显示，对照组小鼠接种1×10

本发明提供一种用于预防动物弓形虫病的减毒活疫苗，通过动物实验确立了其免疫剂型、免疫接种程序及接种量，发现其对于弓形虫感染具有较好的免疫保护效果，具有制备抗弓形虫减毒活疫苗的潜力。