用于干细胞及其制品的冻存液及冻存方法

技术领域

本发明涉及一种用于干细胞及其制品的冻存液及冻存方法，属于冻存液技术领域。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)来源于中胚层组织，属于多能干细胞，其特点是来源广泛、免疫原性低、一定的分化潜能、具有自我更新能力、具有调节免疫的能力，根据其来源主要分为人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞等。

目前，间充质干细胞的冻存液，主要为含有牛来源血清成分的5％-20％胎牛血清(FBS)+细胞基础培养基(杜尔贝科培养基或α-MEM或F12/DMEM)+10％DMSO。DMSO属于冷冻保护剂，可以保护细胞在降温过程中免受晶体物质的伤害，但其含量越高对细胞的毒性作用越大，而FBS为人源细胞引入了动物源的成分，有一定的安全隐患，如引入支原体、牛源致病菌等，并具有批次不稳定性。如果不添加FBS，细胞复苏后活率则大幅度下降。因此，为保证间充质干细胞的安全性及复苏后的活率，有必要开发一种成分明确、不含血清、活率较高的冻存液。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种用于干细胞及其制品的冻存液及冻存方法，冻存液不含血清，成分明确，同时活率较高。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

用于干细胞及其制品的冻存液，包括以下重量份数的原料：海藻糖10-15份、EDTA10-20份、甲基纤维素5-8份、甘油3-5份、二甲基亚砜3-5份和培养基100-120份。

所述的用于干细胞及其制品的冻存液，所述培养基为DMEM培养基、MEM培养基、IMEM培养基或RPMI1640培养基。

所述的用于干细胞及其制品的冻存液，所述甘油和二甲基亚砜的重量比为1:1。

用于干细胞及其制品的冻存方法，采用所述的冻存液，包括以下步骤：

(1)配制冻存液：在无菌条件下，按上述配比取各原料，将海藻糖加入培养基中，混匀后，再依次加入EDTA和甲基纤维素，混匀后，加入甘油和二甲基亚砜，充分混合后得到冻存液；

(2)干细胞处理：从培养瓶中取出干细胞，加入胰酶进行消化后离心，弃去上清，加入溶液清洗，再进行离心分离，弃去上清液后，加入冻存液重悬后置于冻存管或冻存袋中；

(3)冻存：将步骤(2)中的冻存管或冻存袋先置于-18～-22℃进行预冻存，然后再置于-80～-90℃冻存。

所述的用于干细胞及其制品的冻存方法，所述步骤(1)中，各原料充分混合之后使用过滤器过滤除菌后得到所述冻存液。

所述的用于干细胞及其制品的冻存方法，所述步骤(2)中，加入的溶液为生理盐水。

所述的用于干细胞及其制品的冻存方法，所述步骤(2)中冻存管或冻存袋中干细胞浓度为4～6×10

所述的用于干细胞及其制品的冻存方法，所述预冻存的时间为10-20min；然后直接置于-80～-90℃冻存。

本发明所达到的有益效果：

本发明的冻存液采用海藻糖、EDTA、甲基纤维素、甘油、二甲基亚砜和培养基，其中，海藻糖能够作为冻存液的保护成分，EDTA能够为冻存的细胞提供还原环境；甲基纤维素可以提高冻存液复苏后的抗凋亡、抗氧化的能力；甘油和二甲基亚砜配合使用使得冻存液可渗透成分能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成，同时，减少了二甲基亚砜的使用量，从而减少细胞损伤程度；降低了对细胞潜在的毒性作用；并且，本发明的冻存液不含有FBS，避免了传统冻存液的动物源性安全问题。

本发明的冻存液配制简单，成本较低；本发明的冻存方法步骤简单，通过预冻存，冻存液长时间有效。

附图说明

图1是采用实施例1的冻存液复苏培养1个月后的细胞整体图；

图2是图1的放大图。

图3是采用实施例1和对比例5的冻存液冻存1周后复苏的RTCA增殖图。

图4是采用实施例1和对比例5的冻存液冻存1个月后复苏的RTCA增殖图。

具体实施方式

下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

用于干细胞及其制品的冻存液，包括以下重量份数的原料：海藻糖10份、EDTA 10份、甲基纤维素5份、甘油3份、二甲基亚砜3份和MEM培养基100份。

用于干细胞及其制品的冻存方法，采用所述的冻存液，包括以下步骤：

(1)配制冻存液：在无菌条件下，按上述配比取各原料，将海藻糖加入培养基中，混匀后，再依次加入EDTA和甲基纤维素，混匀后，加入甘油和二甲基亚砜，充分混合后使用过滤器过滤除菌得到冻存液；

(2)干细胞处理：从培养瓶中取出干细胞，加入胰酶进行消化后离心，弃去上清，加入生理盐水清洗，再进行离心分离，弃去上清液后，加入冻存液重悬后置于冻存管或冻存袋中；冻存管或冻存袋中干细胞浓度为4～6×10

(3)冻存：将步骤(2)中的冻存管或冻存袋先置于-18～-22℃进行预冻存10-20min，然后再置于-80～-90℃冻存。

实施例2

用于干细胞及其制品的冻存液，包括以下重量份数的原料：海藻糖15份、EDTA 20份、甲基纤维素8份、甘油5份、二甲基亚砜5份和DMEM培养基120份。

用于干细胞及其制品的冻存方法，采用所述的冻存液，包括以下步骤：

(1)配制冻存液：在无菌条件下，按上述配比取各原料，将海藻糖加入培养基中，混匀后，再依次加入EDTA和甲基纤维素，混匀后，加入甘油和二甲基亚砜，充分混合后使用过滤器过滤除菌得到冻存液；

(2)干细胞处理：从培养瓶中取出干细胞，加入胰酶进行消化后离心，弃去上清，加入生理盐水清洗，再进行离心分离，弃去上清液后，加入冻存液重悬后置于冻存管或冻存袋中；冻存管或冻存袋中干细胞浓度为4～6×10

(3)冻存：将步骤(2)中的冻存管或冻存袋先置于-18～-22℃进行预冻存10-20min，然后再置于-80～-90℃冻存。

实施例3

用于干细胞及其制品的冻存液，包括以下重量份数的原料：海藻糖12份、EDTA 18份、甲基纤维素6份、甘油4份、二甲基亚砜4份和IMEM培养基110份。

用于干细胞及其制品的冻存方法，采用所述的冻存液，包括以下步骤：

(1)配制冻存液：在无菌条件下，按上述配比取各原料，将海藻糖加入培养基中，混匀后，再依次加入EDTA和甲基纤维素，混匀后，加入甘油和二甲基亚砜，充分混合后使用过滤器过滤除菌得到冻存液；

(2)干细胞处理：从培养瓶中取出干细胞，加入胰酶进行消化后离心，弃去上清，加入生理盐水清洗，再进行离心分离，弃去上清液后，加入冻存液重悬后置于冻存管或冻存袋中；冻存管或冻存袋中干细胞浓度为4～6×10

(3)冻存：将步骤(2)中的冻存管或冻存袋先置于-18～-22℃进行预冻存10-20min，然后再置于-80～-90℃冻存。

实施例4

用于干细胞及其制品的冻存液，包括以下重量份数的原料：海藻糖13份、EDTA 15份、甲基纤维素7份、甘油4份、二甲基亚砜4份和RPMI1640培养基108份。

用于干细胞及其制品的冻存方法，采用所述的冻存液，包括以下步骤：

(1)配制冻存液：在无菌条件下，按上述配比取各原料，将海藻糖加入培养基中，混匀后，再依次加入EDTA和甲基纤维素，混匀后，加入甘油和二甲基亚砜，充分混合后使用过滤器过滤除菌得到冻存液；

(2)干细胞处理：从培养瓶中取出干细胞，加入胰酶进行消化后离心，弃去上清，加入生理盐水清洗，再进行离心分离，弃去上清液后，加入冻存液重悬后置于冻存管或冻存袋中；冻存管或冻存袋中干细胞浓度为4～6×10

(3)冻存：将步骤(2)中的冻存管或冻存袋先置于-18～-22℃进行预冻存10-20min，然后再置于-80～-90℃冻存。

对比例1

用于干细胞及其制品的冻存液，包括以下重量份数的原料：海藻糖10份、EDTA 10份、甲基纤维素5份、二甲基亚砜6份和MEM培养基100份。其余与实施例1相同。

对比例2

用于干细胞及其制品的冻存液，包括以下重量份数的原料：海藻糖10份、甲基纤维素5份、甘油3份、二甲基亚砜3份和MEM培养基100份。其余与实施例1相同。

对比例3

用于干细胞及其制品的冻存液，包括以下重量份数的原料：海藻糖10份、EDTA 10份、甘油3份、二甲基亚砜3份和MEM培养基100份。其余与实施例1相同。

对比例4

用于干细胞及其制品的冻存液，包括以下重量份数的原料：海藻糖10份、EDTA 10份、甲基纤维素5份、甘油3份、二甲基亚砜3份和MEM培养基100份。

用于干细胞及其制品的冻存方法，采用所述的冻存液，包括以下步骤：

(1)配制冻存液：在无菌条件下，将海藻糖加入培养基中，混匀后，再依次加入EDTA和甲基纤维素，混匀后，加入甘油和二甲基亚砜，充分混合后使用过滤器过滤除菌得到冻存液；

(2)干细胞处理：从培养瓶中取出干细胞，按上述配比取各原料，加入胰酶进行消化后离心，弃去上清，加入生理盐水清洗，再进行离心分离，弃去上清液后，加入冻存液重悬后置于冻存管或冻存袋中；冻存管或冻存袋中干细胞浓度为4～6×10

(3)冻存：将步骤(2)中的冻存管或冻存袋置于-80～-90℃冻存。

对比例5

用于干细胞及其制品的冻存液，包括以下重量份数的原料：胎牛血清10份、甘油3份、二甲基亚砜3份和MEM培养基100份。其余与实施例1相同。

将人脐带间充质干细胞分成27组，分别使用本发明实施例1～4和对比例1～5提供的冻存液将人脐带间充质干细胞冻存1周、1个月和4个月后再复苏细胞，检测复苏后间充质干细胞的活率，结果如表1所示：

表1各实施例和对比例冻存复苏后细胞的活率

从表1可以看出，与对比例1相比，实施例1加入了甘油替换了部分二甲基亚砜，在冻存1周的细胞存活率是差不多的，甚至在冻存4个月后具有更加良好的存活率，因此，采用甘油替换部分二甲基亚砜是可行的，可以减少对细胞潜在的毒性作用；与对比例2相比，实施例1添加了EDTA，使得本发明提供的冻存液能够进一步提高细胞复苏后的活率；与对比例3相比，实施例1加入了甲基纤维素，使得本发明提供的冻存液能够进一步提高细胞复苏后的活率；与对比例4相比，实施例1进行预冻存，使得本发明提供的冻存液在冻存时间长的条件下具有更好的冻存效果。

同时，取出实施例1的冻存细胞进行培养1个月。培养1个月后细胞整体如图1所示，放大后形态如图2所示。由此可见，使用本发明的冻存液，间充质干细胞具有存活率显著提高，细胞状态好的优点。

脐带间充质干细胞复苏后细胞活力检测：利用RTCA(实时无标记细胞分析系统)检测干细胞冻存不同时间后复苏时细胞的增殖能力。RTCA结果如图所示，图3是采用实施例1和对比例5的冻存液，脐带间充质干细胞冻存1周后复苏的RTCA增殖图；图4是采用实施例1和对比例5的冻存液，脐带间充质干细胞冻存1个月后复苏的RTCA增殖图。从图3和图4可以看出，本发明的冻存液适用于脐带间充质干细胞保存，不会影响其增殖能力。且由于二甲基亚砜的浓度低，直接注射后，对体内其他细胞的毒害小。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。