一种预防和治疗HPV病毒的中药配方及其制备方法

技术领域

本发明涉及HPV防治技术领域，尤其涉及一种预防和治疗HPV 病毒的中药配方及其制备方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)属于乳多空病毒科乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。目前已分离出130多种，不同的型别引起不同的临床表现，根据侵犯的组织部位不同可分为：

皮肤型的HPV人群感染非常普遍，如上述常见的寻常疣、趾疣、扁平疣等，但无法得到具体的感染率。比较引起注意的是高危型的 HPV感染和外生殖器的低危型HPV感染造成的生殖器疣和宫颈癌，据统计在全球的性病中，HPV感染引起的生殖器疣占15-20％。

关于女性生殖道感染HPV的流行情况，据2003-2004年来自美国的国家健康和营养研究课题的一个调查结果，14-59岁的HPV总感染率为26.8％，所以HPV感染对女性造成的负担超出之前的估计。

涉及红花、木贼、香附与蒲公英四味中药的现有技术主要为：

1、申请号201611257249.6的一种预防和治疗HPV病毒的中药配方及其制备方法，公开了配方蒲公英、乌梅、红花、金银花、茯苓、木贼、香附，说明书中仅仅公开了三名患者的使用情况，效果较为一般。

2、申请号202110934622.1的预防及抑制HPV病毒的中药凝胶组合物及其制备方法，公开了含有红花、木贼、香附与蒲公英的配方，其辅助药物过多。

3、申请号CN97108473.4的疣消净，公开了含有红花、木贼、香附与蒲公英的配方，但其组合内药物较多。

4、申请号201510040443.8的一种治疗尖锐湿疣的药物配方及其制备方法，公开了含有红花、木贼、香附与蒲公英的配方，其同样组合内药物较多。

5、申请号200510068289.1的主料人乳头瘤病毒感染的中药，公开了红花、木贼、香附的治疗作用，经试验证的，需要的药量较大，同时该专利公开的实验主要针对游离态的病毒进行消杀。

发明内容

鉴于背景技术存在的不足，本发明提供一种预防和治疗HPV病毒的中药配方及其制备方法，相较于传统红花、木贼与香附的配方，采用50％的剂量即可达到同样的效果。

本发明涉及一种预防和治疗HPV病毒的中药配方，包括以下中药：红花、木贼、香附和蒲公英。

进一步的，所述中药按照重量份配比为：红花6～12份、木贼3～6 份、香附3～6份、蒲公英12～22份。

进一步的，所述红花+木贼+香附：蒲公英为1：1。

进一步的，所述蒲公英取7～15克。

本发明还提供了一种抑制和预防HPV病毒的中药配方的制备方法，具体包括以下步骤：

S1、按重量配比称取蒲公英；

S2、提取：以含水乙醇或含乙醇水进行煎煮、热回流或渗漉提取，充分提取后，离心或静置，得离心液或上清液，浓缩后，记为A液；

S3、A液采用醇沉或者水沉的方法进行处理，分离得到的上清液浓缩后，记为B液；

S4、取B液，稀释后，加入氢氧化钠，充分搅拌，离心或滤过，得透明液，记为C液；取C液，上大孔吸附树脂柱；依次用碱液、水洗涤，用乙醇洗涤，乙醇洗脱，收集过柱液，记为D液；取D液，减压回收乙醇，残液常压浓缩至流浸膏状，干燥，即蒲公英提取物；

S5、按重量配比称取红花、木贼、香附制备提取物；

S6、将红花、木贼、香附及蒲公英提取物混合，获得B组药物。

本发明的主要有益效果：

1、无毒副作用；

2、降低SiHa细胞的活性，下调HPV16致癌基因在SiHa细胞的表达，降低HPV感染所致宫颈癌风险的作用；

3、提高了蒲公英提取有效成分的含量；

4、采用50％的剂量即可达到同样的效果。

附图说明

图1是本发明蒲公英联合宫宜康提物处理宫颈癌SiHa细胞24h (×200)图。

具体实施方式

以下将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述和讨论，显然，这里所描述的仅仅是本发明的一部分实例，并不是全部的实例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

为了便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以具体实施例为例作进一步的解释说明，且各个实施例不构成对本发明实施例的限定。

本发明的实施例1，涉及一种预防和治疗HPV病毒的中药配方及其制备方法的实验：

一、试剂和材料

1.试验样品：A组药品、B组药品，其中A组药品为红花：木贼：香附＝2：1：1配制的药品，B组药品为红花：木贼：香附：蒲公英＝2：1：1：4配制的药品；

2.细胞：SiHa细胞(HPV16阳性的宫颈癌细胞)作为靶细胞；

3.试剂和耗材：胎牛血清(BI，货号04-001-ACS)，DMEM培养液(sigma，货号D6429-500)，PBS磷酸盐缓冲液(GiBCO，货号：10010-023)，胰酶(浙江森瑞生物科技，货号：CR25200)，Trizol (Thermometer Fisher，货号：15596026)，逆转录试剂盒(Thermom eterFisher，货号：K1622)，PCR超混液(10572014(Thermometer Fisher，货号：10572014)。96孔培养板(Corning，货号3516)、25 ml培养瓶(Corning，货号：430639)

4.仪器；细胞培养箱(Thermo scientific，型号：3111)，qPCR仪 (ABI，型号QuantStudio 7)，倒置显微镜(OLYMPUS，型号：C KX41)。

5.引物及序列：

E6：F：CAGCAATACAACAAACCG；R:GCAAGACATACAT CG；

E7：F：CAGAGGAGGAGGATGAAATAG；R：AGGTCTTCC AAAGTACGAATG。

二、方法

B组药品的制备方法为：

S1、按重量配比称取蒲公英；

S2、提取：以含水乙醇或含乙醇水进行煎煮、热回流或渗漉提取，充分提取后，离心或静置，得离心液或上清液，浓缩后，记为A液；

S3、A液采用醇沉或者水沉的方法进行处理，分离得到的上清液浓缩后，记为B液；

S4、取B液，稀释后，加入氢氧化钠，充分搅拌，离心或滤过，得透明液，记为C液；取C液，上大孔吸附树脂柱；依次用碱液、水洗涤，用乙醇洗涤，乙醇洗脱，收集过柱液，记为D液；取D液，减压回收乙醇，残液常压浓缩至流浸膏状，干燥，即蒲公英提取物；

S5、按重量配比称取红花、木贼、香附制备提取物；

S6、将红花、木贼、香附及蒲公英提取物混合，获得B组药物。

1.DMSO溶解A组药品提取物、蒲公英提取物，细胞培养液稀释至恰当浓度，4℃保存、备用。

2.SiHa细胞、HaCaT细胞均采用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养，取对数生长期的细胞接种于培养板或瓶，贴壁后加入含不同浓度A组药品的培养液，以不加药为对照组，每组设置3个复孔。B 组药品终浓度分别为：50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、 400μg/ml、500μg/ml，共6个浓度，A组药品单用作为对照。培养24h、 48h和72h。实验重复3次。

3.显微镜观察细胞生长状态，MTT法检测SiHa和HaCaT细胞的细胞活力；收集细胞，提取RNA，逆转录为cDNA。

4.qPCR检测SiHa细胞中HPV16 E6/E7mRNA表达的变化。采用 2

三、结果：

1.B组药品抑制SiHa细胞增殖

A组药品、B组药品干预SiHa细胞24h、48h和72h。MTT法检测细胞活力，结果显示400、800ug/ml的A组药品干预SiHa细胞72h，细胞的活力有不同程度的下降(表1)；100-800ug/ml蒲公英+A组药品干预SiHa细胞，SiHa细胞的活力均有不同程度的下降，呈时间和剂量依赖关系(表2)。然而，24h的细胞形态无显著变化(图1)。提示：B组药品抑制SiHa细胞的作用大于单用A组药品。

如图1所示蒲公英联合A组药品提物处理宫颈癌SiHa细胞24h (×200)所示：A.空白对照；B.200ug/ml、C.400ug/ml、D.800ug/mlB 组药品提取物；E.A组药品单用800ug/ml。

表1A组药品单用抑制宫颈癌SiHA细胞的时间效应

表2B组药品抑制宫颈癌SiHA细胞的时间效应

*与DMSO组比较，*P<0.05；**P<0.01.

二、B组药品抑制宫颈癌SiHa细胞表达E6、E7mRNA的影响

A组药品、B组药品干预SiHa细胞24h，qPCR法检测SiHa细胞的E6、E7mRNA表达水平，结果显示800μg/mlA组药品能够下调 E6、E7mRNA的表达(表3)；而100-800μg/ml蒲公英+A组药品能够下调E6、E7mRNA的表达，呈剂量依赖关系(表4)。提示：B组药品下调E6、E7mRNA表达的作用强于单用A组药品。

表3.A组药品对SiHa细胞中HPV16 E6、E7mRNA表达的影响 (n＝3)

*与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01.

表4.B组药品对SiHa细胞中HPV16 E6、E7mRNA表达的影响 (n＝3)

*与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01.

B组药品能够降低SiHa细胞(HPV16阳性的宫颈癌细胞)的活性，下调HPV16致癌基因E6、E7mRNA在SiHa细胞的表达，B组药品具有抑制HPV关键蛋白的合成及其活性，降低HPV感染所致宫颈癌风险的作用，同时可以看出B组药品与A组药品在浓度大于 200μg/ml时，下调HPV16致癌基因E6、E7mRNA在SiHa细胞表达的能力高出2倍，同时本实验采用已感染HPV病毒的细胞进行治疗，可以完全治疗感染HPV病毒的细胞，相较于对比文件消灭游离态的 HPV病毒，本发明效果更加显著。

最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。