一种适用于嫁接愈合过程中韧皮部及木质部重连效率定量判断的方法

技术领域

本发明属于嫁接技术领域，公开了一种适用于嫁接愈合过程中韧皮部及木质部重连效率定量判断的方法。

背景技术

嫁接作为一种被广泛运用的农艺措施，能够增强甜瓜、西瓜等瓜类作物的抗病性和抗逆性。嫁接苗的成活率以及出圃质量主要与愈合过程中维管束重新连接及重连后的效果有关。维管束主要由韧皮部、木质部及形成层构成。以往关于嫁接愈合过程中维管束重连的判定方法，主要通过对接穗/砧木进行外源荧光物质的施加，观察能够检测到另一边的砧木/接穗荧光的植株占所有被检测植株的百分比，来作为韧皮部/木质部重连效率的判定。但该方法需要大量的嫁接苗，进行多次重复实验(4次以上)才能得到准确科学的稳定结果，整个实验周期耗时长，需要数月甚至半年才能得到稳定的结果，并且该方法只能对维管束是否连接做出判断，从侧面反应维管束的重连效果，无法对维管束的重连后的连接效率进行直观准确地判定。另外，现有技术CN107907516也存在不足，需要构建转基因材料，对于无稳定成熟的转基因体系的作物不适用，且构建转基因材料需要一年甚至数年以上，相对CN107907516，本专利的方式适用性广，所有作物均能使用，不需要构建任何转基因材料。

本发明开发了一种适用于嫁接愈合过程中韧皮部及木质部重连效率定量判断的方法，能够嫁接愈合过程中对韧皮部及木质部的重连效率进行直观定量地判定，用苗量少，单次实验便可得到科学的实验数据，极大地缩短了实验周期。

发明内容

一种适用于嫁接愈合过程中韧皮部及木质部重连效率定量判断的方法，包括(1)育苗和嫁接、(2)嫁接愈合期管理、(3)溶液配制、(4)韧皮部及木质部重连效率定量判断。

进一步地，步骤(1)中，对接穗与砧木种子浸种催芽后播种于32孔穴盘。当接穗子叶展平，砧木出现第一片真叶时进行嫁接，嫁接采用单子叶贴接。

进一步地，步骤(2)中，嫁接后第1d黑暗，2-7d恒定弱光。嫁接后1-3d用闷养箱保持湿度，4-7d逐渐通风。

进一步地，步骤(3)中，CFDA(5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯)溶液的配制如下：DMSO(二甲亚砜)溶解为10mg/ml的母液，每1ml分装于1.5ml离心管，-20℃下避光保存；工作液现配现用，室温解冻，蒸馏水稀释为0.5mg/ml CFDA，-20℃避光保存。

EDTA·2Na溶液的配制如下：取0.0931g EDTA·2Na溶解于100mL蒸馏水中，常温保存。

进一步地，步骤(4)中，韧皮部重连效率定量判断如下：

接穗预处理：取6-8株嫁接苗，用磨砂纸小心去除接穗子叶的表皮蜡质，切忌磨破子叶。

荧光物质外源施加：先在子叶表面涂抹50μL2.5Mm EDTA·2Na溶液(防止子叶磨伤处愈合而阻挡CFDA进入组织)，再涂抹150μL0.5mg/ml CFDA溶液。26℃避光黑暗处理40min。

荧光物质提取：分别切下接穗(嫁接愈合部上方)及砧木(嫁接愈合部下方)距离愈合部2mm-12mm的茎组织，放进1.5ml离心管并加入1ml蒸馏水。用磨样机粉碎(60Hz,30s,5次)，10000rpm离心五分钟之后，取上清液。

荧光强度测定：剪下1.5ml离心管管盖作为容器，将接穗和砧木提取液，分别取200μL于1.5ml离心管管盖中。

计算韧皮部重连效率用体式荧光显微镜进行观察，在488nm激发光下，分别观察接穗和砧木提取液中的荧光，用imageJ分析提取液荧光强度。

韧皮部重连效率＝砧木提取液荧光强度/接穗提取液荧光强度

木质部重连效率定量判断：

砧木预处理：取6-8株嫁接苗，清洗根部，并保留主根长度为2cm长的根系。

荧光物质外源施加：将洗净的根放入1ml 0.5mg/ml CFDA溶液中，26℃避光黑暗处理40min。

荧光物质提取：分别切下接穗(嫁接愈合部上方)及砧木(嫁接愈合部下方)距离愈合部2mm-12mm的茎组织，放进1.5ml离心管并加入1ml蒸馏水。用磨样机粉碎(60Hz,30s,5次)，10000rpm离心五分钟之后，取上清液。

荧光强度测定：剪下1.5ml离心管管盖作为容器，将接穗和砧木提取液，分别取200μL于1.5ml离心管管盖中。

计算木质部重连效率：用体式荧光显微镜进行观察，在488nm激发光下，分别观察接穗和砧木提取液中的荧光，用imageJ分析提取液荧光强度。

木质部重连效率＝接穗提取液荧光强度/砧木提取液荧光强度

本发明的重连效率定量判断的方法可以用来筛选利于嫁接苗生长的愈合环境参数(例如：光照，温度，湿度等)，本发明的重连效率定量判断的方法可以用来筛选促进嫁接愈合的外源物质筛选，外源物质对嫁接的促进效果越好，相同时间点韧皮部与木质部重连效率就越高。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明提供了一种适用于嫁接愈合过程中韧皮部及木质部重连效率定量判断的方法，能够在嫁接愈合过程中对韧皮部及木质部的重连效率进行直观定量地判定，用苗量少，单次实验便可得到科学的实验数据，极大地缩短了实验周期。

附图说明

图1是韧皮部重连效率操作示意图

图2是木质部重连效率操作示意图

图3A是嫁接苗韧皮部重连效率

图3B是嫁接苗木质部重连效率

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种适用于嫁接愈合过程中韧皮部及木质部运输效率定量判断的方法

(1)育苗和嫁接：用南瓜“青优一号”种子作为砧木，甜瓜“K8-45”种子作为接穗。浸种催芽后播种于32孔穴盘。当接穗子叶展平，砧木出现第一片真叶时进行嫁接，嫁接采用单子叶贴接。

(2)嫁接愈合期管理：嫁接苗放于22℃和26℃的生长室各一盘。嫁接后第1d黑暗，2-7d恒定弱光。嫁接后1-3d用闷养箱保持湿度，4-7d逐渐通风。

(3)溶液配制

CFDA(5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯)溶液的配制：DMSO(二甲亚砜)溶解为10mg/ml的母液，每1ml分装于1.5ml离心管，-20℃下避光保存；工作液现配现用，室温解冻，蒸馏水稀释为0.5mg/ml CFDA，-20℃避光保存。

EDTA·2Na溶液的配制：取0.0931g EDTA·2Na溶解于100mL蒸馏水中，常温保存。

(4)韧皮部及木质部重连效率定量判断

韧皮部重连效率定量判断

接穗预处理：取6-8株嫁接苗，用磨砂纸小心去除接穗子叶的表皮蜡质，切忌磨破子叶。

荧光物质外源施加：先在子叶表面涂抹50μL2.5Mm EDTA·2Na溶液(防止子叶磨伤处愈合而阻挡CFDA进入组织)，再涂抹150μL0.5mg/ml CFDA溶液。26℃避光黑暗处理40min。

荧光物质提取：分别切下接穗(嫁接愈合部上方)及砧木(嫁接愈合部下方)距离愈合部2mm-12mm的茎组织，放进1.5ml离心管并加入1ml蒸馏水。用磨样机粉碎(60Hz,30s,5次)，10000rpm离心五分钟之后，取上清液。

荧光强度测定：剪下1.5ml离心管管盖作为容器，将接穗和砧木提取液，分别取200μL于1.5ml离心管管盖中。

计算韧皮部重连效率用体式荧光显微镜进行观察，在488nm激发光下，分别观察接穗和砧木提取液中的荧光，用imageJ分析提取液荧光强度。

韧皮部重连效率＝砧木提取液荧光强度/接穗提取液荧光强度

木质部重连效率定量判断：

砧木预处理：取6-8株嫁接苗，清洗根部，并保留主根长度为2cm长的根系。

荧光物质外源施加：将洗净的根放入1ml 0.5mg/ml CFDA溶液中，26℃避光黑暗处理40min。

荧光物质提取：分别切下接穗(嫁接愈合部上方)及砧木(嫁接愈合部下方)距离愈合部2mm-12mm的茎组织，放进1.5ml离心管并加入1ml蒸馏水。用磨样机粉碎(60Hz,30s,5次)，10000rpm离心五分钟之后，取上清液。

荧光强度测定：剪下1.5ml离心管管盖作为容器，将接穗和砧木提取液，分别取200μL于1.5ml离心管管盖中。

计算木质部重连效率：用体式荧光显微镜进行观察，在488nm激发光下，分别观察接穗和砧木提取液中的荧光，用imageJ分析提取液荧光强度。

木质部重连效率＝接穗提取液荧光强度/砧木提取液荧光强度

(5)结果分析：

22℃的愈合环境温度下，韧皮部与木质部的重连效果明显低于26℃的愈合环境温度。说明26℃更有利于嫁接苗的生长。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。