右旋龙脑脱氢酶基因在制备右旋龙脑中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及右旋龙脑脱氢酶或其相关的生物材料在制备右旋龙脑中的应用。

背景技术

天然冰片有右旋龙脑(D-龙脑)和左旋龙脑(L-龙脑)之分。其中由龙脑香科植物中提取的天然冰片，又被称为“梅片”，主要由右旋龙脑((+)-Borneol)组成。右旋龙脑作为一味名贵的中药材，清香宣散，具有开窍醒神，清热散毒，明目退翳的功效。临床上主要用于治疗烧烫伤、眼疾以及中风等疾病，同时具有止痛消炎、抑菌、保护心脑血管、抗衰老等作用，因此右旋龙脑在医药、化妆品和农药等领域的应用广泛。

由于右旋龙脑主要从龙脑樟树(Cirmamonun Camphora)等植物中提取，资源紧缺、成本昂贵。因而大多药物中所使用的是由松节油经一系列化学方法合成的人工冰片，但其疗效远不及右旋龙脑。虽然目前也有报道其他化学合成右旋龙脑的方法，但由于此类化学合成法的得率低、过程环境不友好导致并未被实际应用。而专利(201810147374.4)以右旋樟脑为底物，利用各种来源的酮还原酶制备右旋龙脑，但是这种酶催化的方式需要加入价格昂贵的辅酶NADP+，还需要加入葡萄糖、异丙醇或甲酸铵，导致转化成本高，实用性较差。

因此，本发明希望提出一种可用于制备右旋龙脑且成本低、转化率好的方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出右旋龙脑脱氢酶基因在制备右旋龙脑中的应用。本发明通过构建可外源表达右旋龙脑脱氢酶的工程菌，能够将右旋樟脑一步转化为右旋龙脑，并具有成本低和转化率好的特点。

本发明提供了右旋龙脑脱氢酶基因在制备右旋龙脑中的应用，其特征在于，所述右旋龙脑脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种重组载体，包含有右旋龙脑脱氢酶基因。

优选地，所述重组载体为重组质粒载体。

更优选地，所述重组质粒载体中质粒为pTrc99A质粒。

本发明还提供了上述重组载体在制备右旋龙脑中的应用。

本发明还提供了一种重组菌，包含上述重组载体。

优选地，所述重组菌选自重组大肠杆菌、重组酵母菌或重组芽孢杆菌。

更优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌。

进一步优选地，所述重组大肠杆菌中所用菌株选自E.coli MG1655或E.coliBW25113。

本发明还提供了上述重组菌在制备右旋龙脑中的应用。

本发明还提供了一种右旋龙脑的制备方法，包括以下步骤：

以右旋樟脑((+)-camphor)为原料，加入上述重组菌进行转化，得到右旋龙脑((+)-Borneol)。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明通过在模式微生物菌株中表达右旋龙脑脱氢酶基因，所构建的工程菌能够右旋樟脑为原料一步转化为目的产物右旋龙脑，具有转化率高且成本低的特点。

附图说明

图1为重组大肠杆菌将右旋樟脑一步转化为右旋龙脑的示意图。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1

1.构建重组大肠杆菌

根据恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的右旋龙脑脱氢酶((+)-borneoldehydrogenase，PP-BDH)基因序列(如SEQ ID NO:1所示)，设计相应的上下游引物PBDH-F和PBDH-R(如SEQ ID NO：2-3所示)。

5’-ATGCAATACGCAAGAGCGGCTGTGATGGTTGAGCAAAATCGGGTCGAGACCTGGGAGGTTCCGATTTTCGATCCTGCACCAGGTGGGGCACTGGTACGCGTGGTGCTAGGCGGCGTGTGCGGAAGCGACGTGCACATCGTATCAGGGGAGGCAGGCGCCATGCCCTTCCCTATCATTCTTGGCCACGAAGGCATTGGCCGCATCGAAAAGCTCGGCACTGGCGTTACCACGGATTATGCCGGCGTTCCGGTCAAACAGGGCGACATGGTCTACTGGGCGCGTGCAAGGCGCAGGCCCGGTCGGACTCGCGGCCGTACTGGTTGCCGCAGCATCCGGCGCCAAGGACATCATCGCCATAGACCACTCCCCGATTCGCCTGGATATGGCCCGCAGCCTCGGCGCGACCGAAACCATCTCCCTGGCAGACACCACGCCGGAAGAGCGCCAGCGGATCGTCCAAGAACGTTTCGGCAAACGTGGCGCCAGCCTGGTCGTGGAAGCGGCCGGCGCGCTACCAGCCTTCCCGGAAGGCGTGAATCTGACCGGCAACCACGGCCGCTACGTCATTCTCGGGCTGTGGGGTGCAATTGGCACCCAGCCCATCTCGCCCCGGGACTTGACCATCAAGAACATGAGTATTGCCGGAGCAACCTTCCCGAAGCCCAAGCATTACTACCAGGCCATGCAGCTTGCAGCTCGACTGCAGGATCGTTATCCGCTGGCCGATCTGATCACCCAGCGTTTTTCCATCGACGAGGCCAGCAAGGCACTTGAACTGGTCAAGGCAGGAGCACTGATCAAACCCGTGATCGACCCCACTCTTTAG-3’(SEQ ID NO：1)。

PBDH-F：5’-ACACAGGAAACAGACCATGGATGCAATACGCAAGAGC-3’(SEQ ID NO：2)；

PBDH-R：5’-CCGGGTACCGAGCTCGAATTCTAAAGAGTGGGGTCGAT-3’(SEQ ID NO：3)。

以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因组DNA序列为模板，用引物PBDH-F/PBDH-R经PCR扩增得到PP-BDH基因。PCR的扩增条件为：98℃预变性5min；98C变性28s，56℃退火40s，72℃延伸2min，共28个循环。

以pTrc99A质粒为模板，设计引物ptrcA-F和ptrcA-R(SEQ ID NO：4-5)，PCR扩增得到pTrc99A载体片段。PCR的扩增条件为：98℃预变性5min；98℃变性28s，56℃退火60s，72℃延伸3min，共25个循环。

ptrcA-F：5’-AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGA-3’(SEQ ID NO：4)；

ptrcA-R：5’-CCATGGTCTGTTTCCTGTGT-3’(SEQ ID NO：5)。

将扩增得到的PP-BDH基因和pTrc99A载体片段按照3:1的浓度比混合，然后利用Gibson无缝连接技术将两个片段依次连接以构建重组质粒，即50℃水浴孵育30分钟后冰上冷却。然后采用42℃热激法转化大肠杆菌感受态细胞(E.coli MG1655)，过夜培养，挑取在含氨苄青霉素抗生素平板上生长的克隆菌株接种在3mL试管中，于30℃，220rpm过夜，提取质粒测序验证。

待测序验证无误后，将重组大肠杆菌的单个菌落接种在5mL含氨苄抗生素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm转速下过夜培养，然后转移到50mL的LB培养基中，培养基中含有10g/L葡萄糖和氨苄抗生素。当OD600≈0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)1mM，25℃、220rpm继续培养；培养至当OD600≈4时，收集重组大肠杆菌菌体。

2.催化合成右旋龙脑

用100mL Tris缓冲液(50mM，pH＝6.5)将重组大肠杆菌重悬，倒入250mL的三角瓶中。将2g右旋樟脑((+)-camphor)加入至pH＝6.5，浓度为0.1M，体积为10mL的Tris缓冲液(50mM，pH＝6.5)中，震荡1min待右旋樟脑完全溶解，再加入上述含有重组大肠杆菌的100mLTris缓冲液，在30℃、220rpm摇床中进行充分转化，得到含右旋龙脑的样品。图1所示为重组大肠杆菌将右旋樟脑一步转化为右旋龙脑的示意图。

3.右旋龙脑产量检测

取5mL上述样品与2mL乙酸乙酯混合，混合1小时后完成萃取，以8000rpm离心10分钟，收集上层有机相用于进一步分析，然后用无水硫酸钠脱水处理30min后作为待检测样品。

检测仪器型号为安捷伦6890N-5975C，色谱柱型号规格HP-INNOWAX(30m×0.25mm,0.25μm)；使用FID检测器；载气为氦气，流量为1.0mL/min且为恒定流量；分流比10:1；进样量1μL；进样口温度250℃；检测器温度250℃；进样体积为1μL，分流比为10:1，喷射器温度为250℃。第一阶段从初始温度60℃以10℃/min的升温速率提升至160℃，保持2min；第二阶段从160℃以1℃/min升温速率升至190℃，保持2min；第三阶段从190℃以30℃/min升温速率升至250℃，保持5min，后运行1min。

配制浓度分别为1mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L和40mg/L的右旋龙脑标准溶液，经过0.22μm有机滤膜过滤注入气相瓶中。采用外标绝对定量法，通过GC-MS分析获得各浓度标准液对应的峰面积，并建立右旋龙脑浓度与峰面积之间的关系曲线，再由GC-MS结果可以得到本实施例中右旋龙脑的产量为1.78g，摩尔转化率为88.1％。

实施例2

1.构建重组大肠杆菌

根据蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)的右旋龙脑脱氢酶基因(nerylneryl diphosphate synthase，PM-BDH)基因序列(如SEQ ID NO：6所示)，设计相应的上下游引物MBDH-F和MBDH-R(如SEQ ID NO：7-8所示)。

5’-ATGGGCAGAGTTAACGGGAAAGTCGCCATCGTAACGGGTGCAGGGGGTGGGCAAGGCGAAGCTGAAGCTCGCCTGCTCGCTGCTGAAGGAGCGAAAGTGGTTGCTACAGATATTAATCTGGACCGTGTCACACGGGTGGTGGCGGAAATCAACGAGCAATACCCGGGCAGTGCGATGGCCCTCTGGCATGATGTATCGTCGCAATCGGACTGGCAGGACGTGGTGGAACAGACGGTTGCTGCGTTCGGTCCGATCACTATTTTGGTTAACAACGCAGGGATTTTGGCGCCTGCTGCCTATGACAAGGTGACATTCGAGCACTGGCAAAAAACCATGAATGTCAATGCCTGGAGCCAATTCGTAGGCATGCAGACTGTTATTCCGCACATGCGCGCGGCAGGTGGTGGTTCAATCATCAACCAACAGGCCATGGATGAAGTCATTGCCGCCCAGCCGTTGCGTCGCATGGGGCGACCCATCGATGTGGCTTATCTGGTCCTGTACTTGGCCAGTGACGAATCGTGGTTCACCACCGGCACCTCTCAAACGATCGACGGCGGTATGTCTGTAATGGGCGGCGTTTCACCGCACATTGATCGT-3’(SEQ ID NO：6)。

MBDH-F：5’-ACACAGGAAACAGACCATGGGCAGAGTTAACGGGAA-3’(SEQ ID NO：7)；

MBDH-R：5’-CCGGGTACCGAGCTCGAATTACGATCAATGTGCGGTGA-3’(SEQ ID NO：8)。

以蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)的基因组DNA序列为模板，用引物MBDH-F/MBDH-R经过PCR扩增得到PM-BDH基因。PCR的扩增条件为：98℃预变性5min；98C变性28s，56℃退火40s，72℃延伸2min，共28个循环。

以pTrc99A质粒为模板，采用引物ptrcA-F和ptrcA-R(SEQ ID NO：4-5)进行PCR扩增，得到pTrc99A载体片段。PCR的扩增条件为：98℃预变性5min；98℃变性28s，56℃退火60s，72℃延伸3min，共25个循环。

将扩增得到的PM-BDH基因和pTrc99A载体片段按照3:1的浓度比混合，然后利用Gibson无缝连接技术将两个片段依次连接以构建重组质粒，即50℃水浴孵育30分钟后冰上冷却。然后采用42℃热激法转化大肠杆菌感受态细胞(E.coli MG1655)，过夜培养，挑取在含氨苄青霉素抗生素平板上生长的克隆菌株接种在3mL试管中，于30℃，220rpm过夜，提取质粒测序验证。

待测序验证无误后，将重组大肠杆菌的单个菌落接种在5mL含氨苄抗生素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm转速下过夜培养，然后转移到50mL的LB培养基中，培养基中含有10g/L葡萄糖和氨苄抗生素。当OD600≈0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)1mM，25℃、220rpm继续培养；培养至当OD600≈4时，收集重组大肠杆菌菌落。

2.催化合成右旋龙脑

用100mL Tris缓冲液(50mM，pH＝6.5)将重组大肠杆菌重悬，倒入250mL的三角瓶中。将2g右旋樟脑加入pH＝6.5，浓度为0.1M，体积为10mL的Tris缓冲液(50mM，pH6.5)，震荡1min待右旋樟脑完全溶解，再加入上述含有重组大肠杆菌的100mL Tris缓冲液中，30℃、220rpm摇床中进行充分转化，得到含右旋龙脑的样品。

3.右旋龙脑产量检测

取5mL上述样品与2mL乙酸乙酯混合，混合1小时后完成萃取，以8000rpm离心10分钟，收集上层有机相用于进一步分析，然后用无水硫酸钠脱水处理30min后作为待检测样品。

检测仪器型号为安捷伦6890N-5975C，色谱柱型号规格HP-INNOWAX(30m×0.25mm,0.25μm)；使用FID检测器；载气为氦气，流量为1.0mL/min且为恒定流量；分流比10:1；进样量1μL；进样口温度250℃；检测器温度250℃；进样体积为1μL，分流比为10:1，喷射器温度为250℃。第一阶段从初始温度60℃以10℃/min的升温速率提升至160℃，保持2min；第二阶段从160℃以1℃/min升温速率升至190℃，保持2min；第三阶段从190℃以30℃/min升温速率升至250℃，保持5min，后运行1min。

配制浓度分别为1mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L和40mg/L的右旋龙脑标准溶液，经过0.22μm有机滤膜过滤注入气相瓶中。采用外标绝对定量法，通过GC-MS分析获得各浓度标准液对应的峰面积，并建立右旋龙脑浓度与峰面积之间的关系曲线，再由GC-MS结果可以得到本实施例中右旋龙脑的产量为1.45g，摩尔转化率为72.8％。

上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。