一种用于防治类风湿关节炎的口服多肽制剂

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于防治类风湿关节炎的口服多肽制剂。

背景技术

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介导细胞反应的重要信号系统，其参与了细胞的生长、分化以及细胞间相互作用，普遍存在于多种生物，包括酵母和哺乳动物细胞。自从1991年Sturgill及其同事在哺乳动物细胞鉴定出细胞外信号调节激酶(ERK)， MAPK信号转导通路的研究取得了迅猛发展。MAPK不同成员具有明显的序列同源性，都是通过“T-X-Y”双位点磷酸化达到最大激活。如今，已经有五种p38MAPK异构体分离出来，p38家族根据对刺激的反应性分为两类：p38α/β/β2和p38γ/δ。p38 家族成员的合成和活化不是普遍存在的，但是在不同的细胞系和组织中的p38MAPK 可被不同的介质活化，产生不同的生物学效应，同时也受不同炎症介质的调节。已有的研究表明，p38激酶作为真核细胞的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的一员，可将各种胞外刺激信号传递至胞核、从而调控基因表达，是多种免疫相关疾病中重要的信号中枢。p38 MARK参与了炎症、应急、发育、细胞生长与凋亡、细胞周期调控、缺血/再灌损伤及心肌肥厚等生理、病理过程中的信号传导。抑制p38 MARK活性，可有效阻断其介导的病理信号转导，从而减轻、甚至消除病理现象。

聚糖是指以葡萄糖为单糖组成的同型多糖，葡萄糖单元之间以糖苷键连接。其中根据糖苷键的类型又可分为alpha-葡聚糖和beta-葡聚糖。葡聚糖以β-葡聚糖最具生理活性。β-葡聚糖活性结构是由葡萄糖单位组成的多聚糖，它们大多数是通过β-1,3结合，这是葡萄糖链连接方式。它能够活化巨噬细胞与嗜中性白血球等，因此能提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体含量，全面刺激机体免疫系统。那么，机体就有更多准备去抵抗微生物引起的疾病。β-葡聚糖能使受伤机体淋巴细胞产生细胞因子(IL-1) 的能力迅速恢复正常，有效调节机体免疫机能。大量实验表明，β-葡聚糖可促进体内 IgM抗体产生，以提高体液免疫能力。这种葡聚糖活化细胞会激发宿主非专一性防御机制，故应用在肿瘤、感染病与治疗创伤方面深受瞩目。经特殊步骤萃取且不含内毒素β-1,3葡聚糖在美国FDA已认定是种安全的物质，可添加于一般食品，许多报导显示小鼠口服酵母β-1,3葡聚糖，可增加强腹膜细胞抗菌吞噬作用。

酵母葡聚糖是存在于酵母细胞壁中一种具有增强免疫力活性的多糖-β-葡聚糖。β-葡聚糖广泛存在于各种真菌与植物，如香菇和灵芝、燕麦中，是它们发挥保健作用主要功效物质。而酵母葡聚糖免疫增强活性更强，并具有改善血脂和抗辐射、改善肠道功能的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于防治类风湿关节炎的口服多肽制剂。

第一方面，本发明要求保护一种用于治疗或预防类风湿关节炎的口服多肽制剂。

本发明要求保护的用于治疗或预防类风湿关节炎的口服多肽制剂的活性成分为SEQ ID No.1所示多肽。

进一步地，所述口服多肽制剂为将SEQ ID No.1所示多肽装载于葡聚糖颗粒中后形成。

更进一步地，所述口服多肽制剂中，每0.5mg所述葡聚糖颗粒中装载有10-250μg(如50μg)的SEQ ID No.1所示多肽。

更加具体地，所述口服多肽制剂可按照包括如下步骤的方法制备得到：

P1、采用酸碱处理法从对数生长期的活的酵母细胞中提取葡聚糖颗粒，得到葡聚糖颗粒干粉；

P2、将SEQ ID No.1所示多肽溶于体积百分含量为20％的乙醇水溶液中，得到多肽溶液；然后将步骤P1所得的葡聚糖颗粒干粉加入所述多肽溶液中进行溶胀、冻干；冻干后再加入超纯水进行溶胀、冻干，并反复“溶胀-冻干”过程(指用超纯水进行溶胀、冻干的步骤)，直至所有的所述多肽都被装载入所述葡聚糖颗粒。存于-20℃备用。

其中，所述P1可按照包括如下步骤完成：将所述对数生长期的活的酵母细胞分散于80℃的1M NaOH溶液中，保持80℃搅拌1h，然后离心(如8000g离心5min) 收集不溶组分；用超纯水清洗3次去除NaOH以及被热碱液分解的物质，用HCl调pH 为5，保持55℃继续搅拌1h，然后离心(如8000g离心5min)收集不溶组分；依次用超纯水洗涤2次、异丙醇洗涤4次、丙酮洗涤2次；最后真空抽干所有溶剂，得到所述葡聚糖颗粒干粉。存于-20℃。

在所述P2中，所述多肽溶液中多肽浓度可为1-10μg/μL(如1μg/μL)。进行第一次所述溶胀时，所述葡聚糖颗粒干粉与所述多肽溶液的配比可为0.5mg：10-250μL(如 0.5mg：50μL)。进行所述溶胀的条件为室温溶胀1h。

在本发明的具体实施方式中，所述酵母为酿酒酵母。

第二方面，本发明要求保护前文第一方面所述口服多肽制剂的制备方法。

本发明所要求保护的所述口服多肽制剂的制备方法，包括前文所述P1和所述P2。

第三方面，本发明要求保护SEQ ID No.1所示多肽和葡聚糖颗粒在如下任一中的应用：

Q1、制备用于治疗类风湿关节炎或改善类风湿关节炎症状的口服药物；

Q2、制备用于预防类风湿关节炎的口服药物。

第四方面，本发明要求保护前文第一方面所述口服多肽制剂在如下任一中的应用：

Q1、制备用于治疗类风湿关节炎或改善类风湿关节炎症状的口服药物；

Q2、制备用于预防类风湿关节炎的口服药物。

在本发明的具体实施方式中，以类风湿性关节炎小鼠模型进行实验。所述口服多肽制剂的给药频次为隔天给药，单次给药剂量为50μg多肽/0.5mg GPs，治疗周期为5 天。

实验证明，利用本发明所提供的口服多肽制剂能够有效抑制类风湿关节炎局部的炎性细胞因子分泌，延缓或阻止病情进展。本发明所提供的口服多肽制剂在治疗类风湿性关节炎方面具有重要应用前景。

附图说明

图1为装载多肽的GPs能保护多肽不被降解，同时显著抑制由LPS诱导的以及 CIA模型的TNF-α表达水平。(a)GPS可装入多肽，并保护装入其中的多肽不被胃肠道消化酶降解(图中的Q11多肽序列为QQEFQFQFKQQ；图中是以Q11多肽为例说明GPS可以保护装载的多肽不被降解，引用自文章J.Mater.Chem.B,2014,2,5882)； (b)多肽可以载入GPS并被巨噬细胞有效吞噬；(c)装入GPS的多肽可以抑制LPS 诱导巨噬细胞的TNF-α分泌水平，其效果与多肽单用类似；(d)各组小鼠的类风湿性关节炎(RA)炎症指数；(e)CIA模型小鼠50d后受累关节中TNF-α的含量，可以看到装有多肽的GPs的效果明显强于多肽本身。可以看到多肽口服单用在短时间内有效，长时间后被降解导致无效。而GPS包裹的多肽具有靶向与缓释的作用，可以长时间显著降低TNF-α的血清浓度。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、葡聚糖颗粒(Glucan Particles,GPs)制备方法

GPs是一种FDA批准的食物添加剂，目前已经有商业化的产品上市，比如Biothera公司出品的营养补充品Welmune，而商业化用于实验的GPs也可以买到，例如Invivogen 公司的WGP。这里本发明用的是自己提纯的产品，通过购买活酵母(Saccharomycescerevisiae,Baker’s Yeast)，需要将其培养至对数生长期之后，再进行提取。根据我们的经验，这样取得的GPs均一度与原有的生物活性均能得到比较好的保持。

提取方法采用酸碱处理法。首先，将对数生长期的500mL活酵母(OD600值在 0.6-0.8)通过8000g离心20min从培养基中分离出来，弃去上清；新鲜配制1M NaOH 水溶液，并加热到80℃。之后将离心取得的活酵母分散于100mL的热NaOH溶液中，保持80℃搅拌1h。处理完之后，8000g离心5min，收集不溶组分，并在100mL Milli-Q水(属于超纯水)中清洗3次，除去NaOH以及被热碱液分解的物质。之后，将100mL溶液pH值用HCl调节为5，保持55℃继续搅拌1h。之后，8000g离心收集不溶物，用Milli-Q水洗涤2次，50mL异丙醇洗涤4次，丙酮洗涤2次，真空抽干所有溶剂，遂得到GPs，存于-20℃。

实施例2、多肽装载入GPs

将事先制备好的SEQ ID No.1所示多肽(简称MKK3b)溶于20％(v/v)乙醇/水溶液中，配成1μg/μL的浓度，体积约为20-50μL，然后按照预定的多肽/GPs装载量比例(1mg GPs装载100μg多肽)将实施例1制备得到的GPs干粉置于多肽溶液中，室温溶胀1h，之后彻底冻干。冻干后，加入10μL Milli-Q水继续溶胀1h，再行冻干。整个溶胀-冻干过程需要反复3-5次左右，直到所有的多肽都被装入(多肽没有被完全装入的时候，冻干后葡聚糖颗粒外面会有纤毛状的多肽冻干纤维存在。当没有纤毛状的多肽冻干纤维存在时，即可认为多肽都已经被装入)。最后将装有MKK3b多肽的 GPs冻干存于-20℃备用。

将Q11多肽(Q11多肽序列为QQEFQFQFKQQ)经Cy5标记，GPs经DTAF标记，然后按照上述方法将Q11多肽装载入GPs。然后用含有或不含有酶的模拟胃液和模拟小肠液(模拟胃液与模拟肠液的配方和配制方法在欧洲药典可以公开查询， European Pharmacopoeia(07/2010:51701Recommendations on Dissolution Testing。文章 J.Mater.Chem.B,2014,2,5882的方法部分第2.12小节详细说明了配方和配制方法)对装载有Q11多肽的GPs进行消化处理。消化前后分别取样进行荧光成像。消化后，一方面测量内含多肽的Cy5荧光强度和DTAF标记的GPs的荧光强度比值，另一方面取消化后的上清液，测量Cy5的紫外吸收。结果如图1(a)所示，第一个荧光图说明 MKK3b多肽装载入GPs内；第二个小图说明经过模拟胃液和模拟小肠液消化之后，离心下来的装有荧光多肽的GPs，分别测量内含多肽的Cy5荧光强度和DTAF标记的 GPs的荧光强度，两者的比值，在消化前后没有差别，由此推断GPs对装载入的多肽具有保护不被酶消化的作用；第三个小图，取消化后的上清液，测量Cy5的紫外吸收。如果多肽被消化，则上清液中Cy5的紫外吸收会很高，反之则很低。通过对比，可以进一步验证GPs可以保护装入其中的多肽不被消化酶所降解。

实施例3、巨噬细胞吞噬装有多肽的GPs可有效抑制TNF-α的分泌

供试多肽为MKK3b多肽；供试装有MKK3b多肽的GPs为实施例2制备产品；供试GPs为实施例1制备产品。

小鼠巨噬细胞系为RAW264.7，复苏后稳定传代3次之后，以20000个每孔的密度接种于6孔板过夜，第二天加入10倍细胞数量的装有经Cy5标记的MKK3b多肽的 GPs(对多肽进行Cy5标记这是本领域公知的常规操作)，37℃孵育8小时，用PBS 洗去未被吞噬的GPs并在显微镜下成像，可观察到Cy5标记的MKK3b多肽的GPs被 RAW264.7细胞大量摄取。结果见图1中(b)。

与此同时，以5000个每孔的密度将RAW264.7细胞接种于96孔板过夜，第二天按照对照组(只加溶剂，即磷酸盐缓冲液PBS)，MKK3b多肽组(10μg)，GPs组(0.1 mg)，LPS刺激组(0.1μg/mL)，LPS+GPs组(0.1μg/mL的LPS+0.1mg GPs)， LPS+MKK3b多肽组(0.1μg/mL的LPS+10μg MKK3b)，装有多肽的GPs(10μg多肽 /0.1mgGPs)，以及LPS+装多肽的GPs组(0.1μg/mL的LPS+10μg多肽/0.1mgGPs)。8 小时后取细胞培养上清液测量其中的TNF-α浓度。结果见图1中(c)。

实施例4、CIA小鼠模型建立

采用6-8周龄DBA/1雄性小鼠(参见网址：https://www.jax.org/strain/000670)。DBA/1小鼠对鸡，牛，猪的二型胶原蛋白比较敏感。将牛二型胶原蛋白 (CollagenTypeII，Chondrex)按照2mg/mL混合完全溶解于0.1M的冰醋酸溶液中，4℃过夜。随后，与等体积的完全弗氏佐剂(Sigma)混合，超声充分乳化，可得1mg/mL 的胶原乳液。在DBA/1小鼠距尾根部2-3cm处皮内注射(注意是皮内，不是皮下) 胶原乳液(100μL/只)，进行第一次注射，注射部位7-10天左右一般会有破溃，属于正常现象；第21天时进行第二针注射，注射乳液体积相同。从注射前1d开始隔天记录类风湿性关节炎(RA)炎症指数，到50d停止。一般在28d左右可见显著RA病情进展。以第一次注射胶原乳液为0d。RA炎症指数评分：0分：无红肿；1分：踝或足趾轻度红肿；2分：关节或足趾严重红肿；3分：关节僵硬或强直。对每只小鼠的四肢分别观察，记录其累积分数。

实施例5、CIA小鼠分组以及关节TNF-alpha测定

供试多肽为MKK3b多肽；供试装有MKK3b多肽的GPs为实施例2制备产品；供试GPs为实施例1制备产品。

将实施例4建立的CIA模型的小鼠分组，每组5只。在24d，26d，28d(以CIA 模型建模时第一次注射胶原乳液为0d)分别口服灌胃生理盐水(100μL)(即CIA模型组)，GPs(0.5mgGPs)，MKK3b多肽(50μg)，装有MKK3b多肽的GPs(50μg 多肽/0.5mg GPs)，以及尾静脉注射地塞米松(0.5mg/Kg体重)。口服灌胃前，断水食 4h。灌胃或注射治疗后，恢复水和食物。同时设置正常小鼠作为对照。

一方面，按照实施例4中的方法测定各组小鼠的类风湿性关节炎(RA)炎症指数，如图1中(d)所示。

另一方面，各组小鼠在50d(以CIA模型建模时第一次注射胶原乳液为0d)断颈处死，取受累关节，称重后在0.5mL HBSS中冰上研磨粉碎，离心取上清，用TNF-alpha 的ELISA试剂盒(ebioscience)测定浓度。结果见图1中(e)。

各实施例的结果如图1所示。图1展示了装载多肽的GPs能保护多肽不被降解，同时显著抑制由LPS诱导的以及CIA模型的TNF-α表达水平。(a)GPS可装入多肽，并保护装入其中的多肽不被胃肠道消化酶降解；(b)多肽可以载入GPS并被巨噬细胞有效吞噬；(c)装入GPS的多肽可以抑制LPS诱导巨噬细胞的TNF-α分泌水平，其效果与多肽单用类似；(d)单纯MKK3b多肽能够短期有效延缓类风湿关节炎，停药后再次进展；而口服多肽制剂长效阻止了小鼠CIA模型的类风湿关节炎病情进展，效果类似地塞米松；(e)CIA模型小鼠50d后受累关节中TNF-α的含量，可以看到装有多肽的GPs的效果明显强于多肽本身。可以看到多肽口服单用在短时间内有效，长时间后被降解导致无效。而GPS包裹的多肽具有靶向与缓释的作用，可以长时间显著降低TNF-α的血清浓度。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>  北京大学

<120>  一种用于防治类风湿关节炎的口服多肽制剂

<130>  GNCLN212376

<160>  1

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  24

<212>  PRT

<213>  Artificial sequence

<400>  1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Lys Gly Lys Ser

1               5                   10                  15

Lys Arg Lys Lys Asp Leu Arg Ile

            20