一株产气克雷伯氏菌及其在提高植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明涉及生物农业领域，具体涉及一株产气克雷伯氏菌及其在提高植物抗逆性中的应用。

背景技术

目前全球盐碱化土地面积有8亿多公顷，我国盐碱地面积位列全球第三。土壤盐碱化是限制作物生长及产量的主要因素之一,严重制约农作物产量。土地盐碱化是目前制约我国农业发展和生态治理的重要瓶颈，人为活动加上迅速的气候变化是导致土壤盐碱化的主要因素。过高的盐浓度会导致土壤退化，改变土壤渗透和基质潜力，这是由于过量的可交换Na+和土壤高pH值会导致粘土膨胀和分散，以及由于土壤渗透性、可用水容量和渗透率的下降而导致土壤团聚体减少，从而使土壤不适宜作物生长。盐胁迫应激会对植物的生理生化产生各种有害影响，并降低农作物产量。植物在盐胁迫下的生长不良是营养动员减少、激素不平衡、活性氧种类(ROS)的形成、离子毒性和渗透应力所致。此外，盐度导致的土壤理化性质将影响土壤微生物的活性，导致土壤微生物多样性被破坏，从而影响土壤的健康状况。

植物根际促生细菌是指自由生活在土壤或附生于植物根际的一类可促进植物生长、防治病害、增加作物产量的有益菌类。接种植物根际促生菌，可使土壤中无效营养有效化，预防和控制农作物病害，减少农药和化肥的使用，是解决土壤、水源和食品污染的根本途经，被普遍认为是一种环境友好、经济有效的提高作物产量的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何改善植物在盐碱地的生长状况，使植物的产量和生物量提高，提高植物的抗逆性。

第一方面，本发明要求保护一株产气克雷伯氏菌。

本发明提供的产气克雷伯氏菌为产气克雷伯氏菌(klebsiella aerogenes)CGMCCNo.25755，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.25755。

第二方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明提供的菌剂含有上述产气克雷伯氏菌和/或所述产气克雷伯氏菌的代谢物(如分泌物)。

上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。

上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

在本发明的具体实施方式中，所述菌剂为2×10

进一步地，所述细菌培养基为LB液体培养基。

在所述菌剂的制备方法中，所述培养的条件可为：25～35℃(如25～30℃、30～35℃、25℃、30℃或35℃)、100-150r/min(如100-130r/min、130-150r/min、100r/min、130r/min或150r/min)培养30～60h(如30～48h、48～60h、30h、48h或60h)。

术语“代谢物”是指微生物新陈代谢过程中产生的初级代谢产物和/或次级代谢产物。初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢的产物即为初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次级代谢的产物即为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型。

上文中，所述代谢物可从所述产气克雷伯氏菌的发酵液中获得。所述代谢物可为所述产气克雷伯氏菌的无菌代谢物或所述产气克雷伯氏菌的含菌代谢物。所述产气克雷伯氏菌的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述产气克雷伯氏菌，过滤除去液体培养物(发酵液)中的所述产气克雷伯氏菌即得到所述产气克雷伯氏菌的无菌代谢物。所述产气克雷伯氏菌的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养所述产气克雷伯氏菌，收集发酵液，该发酵液即为所述产气克雷伯氏菌的含菌代谢物。

本发明还提供了上述产气克雷伯氏菌的培养物，是将上述产气克雷伯氏菌在细菌培养基中培养得到的物质。

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。

第三方面，上述产气克雷伯氏菌，产气克雷伯氏菌菌剂或产气克雷伯氏菌培养物在如下至少一种中的应用也属于本发明要求保护的范围。

上述应用具体可为如下任一种：

(a1)增强植物的抗盐碱性；

(a2)制备增强植物的抗盐碱性的产品；

(a3)促进植物生长；

(a4)制备促进植物生长的产品；

(a5)产IAA；

(a6)制备产IAA的产品；

(a7)产ACC脱氨酶；

(a8)制备产ACC脱氨酶的产品；

(a9)溶磷；

(a10)制备溶磷的产品；

(a11)固氮；

(a12)制备固氮的产品。

上述应用中，所述促进植物生长体现为如下中的全部或部分：

(b1)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物根伸长；

(b2)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物干重增加；

(b3)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物鲜重增加；

(b4)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物叶片长度增加；

(b5)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物叶片宽度增加；

(b6)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物叶片数量增加

(b7)在盐碱胁迫条件下减少植物叶片枯萎。

本发明还提供了上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将上述产气克雷伯氏菌作为活性成分，得到所述菌剂。

本发明还提供了一种生物有机肥，所述生物有机肥含有上述产气克雷伯氏菌或菌剂或上述培养物。

第四方面，本发明要求保护一种促进植物生长的方法。

本发明还提供的促进植物生长的方法，可包括如下步骤：在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下，对受试植物施用上述产气克雷伯氏菌YJ-DY2或上述菌剂或上述培养物，从而促进植物生长。

其中，所述施用可为滴加。

所述非盐碱胁迫条件可如正常生长条件(无任何胁迫)下。在本发明的具体实施方式中，以水处理作为非盐碱胁迫条件。

上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

上述应用或方法中，所述单子叶植物可为禾本科植物；所述双子叶植物可为十字花科植物。

进一步地，所述禾本科植物可为玉米或水稻；所述十字花科植物可为拟南芥。

在本发明的一个具体实施方式中，所述植物具体为野生型拟南芥Columbia-0亚型。在本发明的另一个具体实施方式中，所述植物具体为玉米自交系B73。在本发明的再一个具体实施方式中，所述植物具体为水稻品种日本晴。

实验证明，本发明提供的产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes.)YJ-DY2可以提高水稻、玉米和拟南芥的对盐碱胁迫抗性，具体表现为干重、鲜重和总根长显著增加，地上部分高度增加(即株高增加)，叶片长度增加。通过检测YJ-DY2作为促生菌的生化实验，YJ-DY2具备溶磷、固氮、分泌H+，分泌铁载体，分泌IAA和分泌ACC脱氨酶的能力，这些指标是YJ-DY2具备促生菌潜力的重要佐证，以上实验表明，产气克雷伯氏菌YJ-DY2具有重要的应用价值。

保藏说明

菌种名称：产气克雷伯氏菌

拉丁名：Klebsiella aerogenes

菌株编号：YJ-DY2

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年9月19日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25755

附图说明

图1为YJ-DY2分泌H

图2为YJ-DY2耐NaCl、NaHCO

图3为盐碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂对拟南芥幼苗根系生长的影响。其中：左图为碱固体培养基，右图为碱+产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌剂固体培养基。

图4为碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂对玉米幼苗全苗和地上部分的影响。其中：1为水对照组；2为水菌剂组；3为碱液对照组；4为碱液菌剂组。

图5为碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂对玉米幼苗的根部形态的影响。其中：1为水对照组，2为水菌剂组，3为碱液对照组，4为碱液菌剂组。

图6为碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂对水稻幼苗全苗和地上部分的影响。其中1为水对照组；2为水菌剂组；3为碱液对照组；4为碱液菌剂组。

图7为碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂对水稻幼苗的根部形态的影响。其中：1为水对照组，2为水菌剂组，3为碱液对照组，4为碱液菌剂组。

图8为碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂分泌IAA能力检测。A为定性结果；B为定量结果。

图9为碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂ACC脱氨酶分泌能力检测。A为DF、ADF定性结果；B为定量结果。

图10为碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂铁载体分泌能力检测(定性结果)。

图11为碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂溶磷能力检测。A为定性结果；B为定量结果。

图12为碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂固氮能力检测(定性结果)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。

LB液体培养基：向胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠30g中加入蒸馏水，调节pH至8.0，加水至体积为1L，然后121℃灭菌15min，冷却使用。

LB固体培养基：向LB液体培养基中加入琼脂并使其浓度为15g/L；然后121℃灭菌15min。将冷却到约55℃的LB液体培养基倒入培养皿，自然冷却。

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-0亚型记载于如下文献中：KimH，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.Agenetic linkbetween cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsisthaliana.Nature Genetics.2004，36:167-171。野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-0亚型在下文中简称拟南芥。

实施例1、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes.)YJ-DY2的分离、鉴定与保藏

一、YJ-DY2的分离

1、在45mL无菌蒸馏水中加入5g土壤样品，搅拌15min，静止放置10min，然后取上清液1mL，加入盛有9mL无菌水中的无菌试管中充分混匀(此时稀释度记为10

2、完成步骤1后，挑取LB固体培养基上的单菌落，反复纯化3次以上。将筛选到的一株菌命名为菌株YJ-DY2。

二、YJ-DY2的鉴定

1、形态学鉴定

(1)将菌株YJ-DY2接种至LB固体培养基上，3天后观察单菌落的形态。结果表明，菌株YJ-DY2的菌落圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，易挑起。

(2)革兰氏染色：

①制片

取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

要用活跃生长期的菌株YJ-DY2培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热(以玻片不烫手为宜)。

②初染

滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色1-2min，水洗。

③媒染

用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

④脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节：脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。因而脱色时间一般为20-30s。

⑤复染

用番红液复染约2min，水洗。

⑥镜检

干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

菌株YJ-DY2经革兰氏染色后，鉴定为革兰氏阴性菌。

2、生理生化特性鉴定

(1)分泌H

LB液体培养基中添加菌株YJ-DY2，摇床130r/min 12h,用分光光度计检测OD600值，取OD

(2)耐NaCl、NaHCO

LB液体培养基中添加NaHCO

LB液体培养基中添加NaCl模拟盐胁迫，NaCl浓度设置为0M、0.5M、1M和1.5M。每隔30min,用分光光度计检测OD

结果如图2所示，鉴定结果为菌株NaHCO

3、16S rDNA序列同源性分析

具体分析步骤如下：

(1)细菌基因组提取

(2)特异引物扩增16SrDNA序列

(3)纯化PCR产物

(4)DNA测序获得16SrDNA序列

(5)与数据库中已知细菌比较获得样品种属信息

(6)选取近似菌种序列，构建系统发育树

细菌YJ-DY2的16S rDNA如SEQ ID No.1所示。

利用Clustal X软件将SEQ ID No.1所示的双链DNA分子和GenBank中的序列进行比对。结果表明，菌株YJ-DY2与Klebsiella aerogenes strain rY29的同源性最高，达到99.57％。

三、产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌株的保藏

根据上述形态学、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的细菌YJ-DY2鉴定为产气克雷伯氏菌属(Klebsiella aerogenes)。产气克雷伯氏菌Klebsiella aerogenes YJ-DY2已于2022年9月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.25755。以下简称产气克雷伯氏菌CGMCC No.25755或者产气克雷伯氏菌YJ-DY2。

菌种保存：将产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes.)YJ-DY2的单菌落接种至LB液体培养基，30℃培养16h，得到培养菌液。将1体积份培养菌液和1体积份80％(v/v)甘油水溶液混匀，-80℃保存。

实施例2、产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌剂的制备

将实施例1中-80℃保存的产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)YJ-DY2菌种在LB固体培养基上活化。挑取LB固体培养基上的产气克雷伯氏菌YJ-DY2单菌落接种于装有100mL LB液体培养基的锥形瓶(规格为500mL)中，30℃、130r/min培养48h，得到OD

实施例3、产气克雷伯氏菌YJ-DY2在提高拟南芥抗盐碱性中的应用

培养皿的规格为10cm×10cm。

一、培养基的制备

碱固体培养基：将1/2MS固体培养基调节pH值至8.0；然后121℃灭菌60min，适当冷却后，加入NaHCO

碱+产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌剂的固体培养基：取装有碱固体培养基的培养皿，在其下部四分之一以下的培养基表面涂布0.1mL上述实施例2制备的产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌剂，自然风干。

二、产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌剂对拟南芥盐碱胁迫抗性的影响

培养条件为：22℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000Lx。

1)取拟南芥(野生型拟南芥Columbia-0亚型)种子，用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌10min，然后用灭菌水清洗三次。

2)完成步骤1)后，将拟南芥种子播种于固体培养基(碱固体培养基、碱+菌剂固体培养基)，4℃春化三天。需要注意的是，种子播种时不与菌剂直接接触，即播种于装有固体培养基的培养皿的四分之一以上部分，后续竖直培养后，拟南芥根部生长至已涂布菌剂的培养基处(本实验研究菌剂的分泌物对拟南芥根部生长的影响)。

3)将完成步骤2)的固体培养基竖直培养7天，观察拟南芥的生长状态。

拟南芥的生长状态见图3(左侧为碱固体培养基，右侧为碱+菌剂固体培养基)。

4)将完成步骤2的固体培养基竖直培养12天，使用ImageJ软件统计拟南芥幼苗的主根长(实验重复三次取平均值，每次使用拟南芥种子为80粒)。

统计结果见表1。显著性由单因素方差分析进行评价，****，P<0.0001。

表1、拟南芥主根长统计结果

结果表明，盐碱胁迫条件下，涂布产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌剂的固体培养基上拟南芥幼苗的平均主根长显著高于对照固体培养基(未涂布YJ-DY2菌剂)(P<0.0001)。由此可见，产气克雷伯氏菌YJ-DY2可以提高拟南芥的抗盐碱性。

实施例4、产气克雷伯氏菌YJ-DY2在提高玉米抗盐碱胁迫中的应用

琼脂固体培养基：将5g琼脂粉溶于500mL蒸馏水，121℃灭菌15min。将约55℃琼脂培养基倒入培养皿，自然冷却。

碱液(80mM)：将1.272g Na

玉米样品培养条件：28℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000Lx。

1)取120粒玉米自交系B73种子，先用70％(v/v)乙醇水溶液灭菌5min，灭菌水清洗1次；再用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌15min，灭菌水清洗5次。

2)将玉米种子播种于琼脂固体培养基，竖直培养7天，得到幼苗。

3)将幼苗播种在装有营养土的盆中(每盆3棵)，得到40盆玉米幼苗共120棵。

4)取20盆玉米幼苗，每周浇灌一次碱液，每次浇灌300mL。取另外20盆玉米幼苗，每周浇灌一次去离子水，每次浇灌300mL。共浇灌6周。

5)将浇灌碱液的20盆玉米幼苗随机分为碱液对照组和碱液菌剂组两组，每组10盆。将浇灌去离子水的20盆玉米幼苗随机分为水对照组和水菌剂组两组，每组10盆。实验如下：

对碱液菌剂组每隔3天向每株玉米幼苗根部滴加50μL实施例2制备的YJ-DY2菌剂，培养42天；对碱液对照组不施加菌剂，同等条件培养42天。

对水菌剂组每隔3天向每株玉米幼苗根部滴加50μL实施例2制备的YJ-DY2菌剂，培养42天；对水对照组不施加菌剂，同等条件培养42天。

6)观察分析各组玉米生长发育的表型，并记录各组玉米幼苗根系形态。

玉米幼苗地上部分和全苗的表型见图4(1为水对照组；2为水菌剂组；3为碱液对照组；4为碱液菌剂组)。玉米根部形态见图5(1为水对照组，2为水菌剂组，3为碱液对照组，4为碱液菌剂组)。

从图4可以看出，在碱液(80mM)和水处理条件下，含有YJ-DY2菌剂组的玉米幼苗均株高更高、叶片长度更长、叶片总表面积更大。从图5可以看出，在碱液(80mM)处理条件下，碱液菌剂组4的玉米幼苗总根长更长。

7)碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂处理42天对各株玉米幼苗的干重、鲜重和株高进行统计。

结果见表2。显著性由单因素方差分析进行评价。水处理条件下，施加YJ-DY2菌剂的水菌剂组2中的玉米幼苗的平均干重、平均鲜重和平均株高显著高于未施加YJ-DY2菌剂的水对照组1的玉米幼苗(P<0.05)，其中水菌剂组玉米幼苗的根长要比水对照组根长短，但水菌剂组玉米幼苗根的总量大幅度增加；碱胁迫条件下，施加YJ-DY2菌剂的碱液菌剂组4中的玉米幼苗的平均干重、平均鲜重和平均株高均显著高于未施加YJ-DY2菌剂的碱液对照组3中的玉米幼苗(P<0.001)，且根长有一定程度增长。由此可见，产气克雷伯氏菌属YJ-DY2能够提高玉米的抗碱胁迫能力。

表2、玉米幼苗的干重、鲜重和平均株高统计结果

实施例5、产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌剂在提高水稻抗碱胁迫中的应用

培养条件：28℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000Lx。

碱液(40mM)：将0.636g Na

1)将120粒水稻品种日本晴粳稻种子放入培养皿，加入少量水，然后置于37℃恒温培养箱培养至种子发出芽及短根。

2)将发芽的水稻幼苗移栽至装有营养土的盆中(每盆3棵)，得到40盆水稻幼苗共120棵。

3)取20盆水稻幼苗，每周浇灌一次碱液，每次浇灌300mL。另外20盆水稻幼苗，每周浇灌一次去离子水，每次浇灌300mL。共浇灌6周。

4)将浇灌碱液的20盆水稻幼苗随机分为碱液对照组和碱液菌剂组两组，每组10盆。将浇灌去离子水的20盆水稻幼苗随机分为水对照组和水菌剂组两组，每组10盆。实验如下：

对碱液菌剂组每隔3天向每株水稻幼苗根部滴加50μL实施例2制备的YJ-DY2菌剂，培养42天；对碱液对照组不施加菌剂，同等条件培养42天。

对水菌剂组每隔3天向每株水稻幼苗根部滴加50μL实施例2制备的YJ-DY2菌剂，培养42天；对水对照组不施加菌剂，同等条件培养42天。

5)观察分析各组水稻生长发育的表型，并记录各组水稻幼苗根系形态。

水稻幼苗地上部分和全苗的表型见图6(1为水对照组；2为水菌剂组；3为碱液对照组；4为碱液菌剂组)。水稻根部形态见图7(1为水对照组，2为水菌剂组，3为碱液对照组，4为碱液菌剂组)。

从图6可以看出，在碱液(40mM)和水处理条件下，均为YJ-DY2菌剂组水稻幼苗株高更高、叶片长度更长、叶片总表面积更大；在碱液(40mM)条件下，YJ-DY2菌剂组水稻幼苗的枯萎程度大大降低。从图7可以看出，在碱液(40mM)处理条件下，YJ-DY2菌剂组水稻幼苗总根长更长。

6)碱胁迫条件下YJ-DY2菌剂处理42天对各株水稻幼苗的鲜重、株高、叶长进行统计。

结果见表3。显著性由单因素方差分析进行评价。水处理条件下，施加YJ-DY2菌剂的水菌剂组2和未施加YJ-DY2菌剂的水对照组1的水稻幼苗的平均株高、平均叶长有显著差异(P<0.05)；碱胁迫条件下，施加YJ-DY2菌剂的碱液菌剂组4水稻幼苗的鲜重、叶长、株高、根长和根总量显著高于未施加YJ-DY2菌剂的碱液对照组3水稻幼苗(P<0.05)。由此可见，产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌剂能够提高水稻的抗盐碱性碱胁迫能力。

表3、水稻幼苗的鲜重、株高和叶长统计结果

实施例6、产气克雷伯氏菌YJ-DY2的促生特性—分泌IAA(吲哚乙酸)能力的分析

Salkowski溶液(250mL)：H

将分离纯化出的产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes.)YJ-DY2菌株接种于1mL200 mg/L的L-色氨酸(L-tryptophan)的LB液体培养基中，设置3个重复。在30℃，180r/min培养2d后取200μL菌悬液到48孔板上，加入800μL的Salkowski显色液，并以加入200μL未接菌剂的LB液体培养基与800μL显色液为对照。室温避光放置20min后，颜色变粉红为阳性，表明能分泌吲哚乙酸，颜色越深分泌强度越大。

结果见图8中A(左侧对照组，右侧为实验组)。通过Salkowski比色反应法检测，YJ-DY2具有分泌生长素的能力，进一步以IAA为标准，测得IAA标准曲线方程为：y＝0.0142x+0.0325(R

实施例7、产气克雷伯氏菌YJ-DY2促生特性—分泌1-氨基环丙烷基-1-羧酸(ACC)脱氨酶能力的分析

DF培养基(1L)：组分a 0.1mL，组分b 0.1mL，KH

ADF培养基(1L)：将DF培养基中的(NH

挑取微量的产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌株于10μL无菌水中制备菌液，将菌液接种在DF固体培养基(在上述DF液体培养基基础上增加了10％琼脂)上，培养3-4d后将菌株转接到ADF固体培养基(在上述ADF液体培养基基础上增加了10％琼脂)上，将平板放置28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否生长。

高浓度的乙烯会抑制植物生长。而有微生物含有ACC脱氨酶，可以抑制乙烯前体物质α-丁酮酸的产生，从而降低乙烯的生成，减少了其对植物生长的抑制作用。为检测产气克雷伯氏菌YJ-DY2是否具有ACC脱氨酶活性，将产气克雷伯氏菌YJ-DY2接种在只有ACC作为氮素唯一来源的ADF培养基上。如果产气克雷伯氏菌能在ADF培养基上生长说明细菌能产生ACC脱氨酶。如果不能生长，证明产气克雷伯氏菌YJ-DY2不具有产生ACC脱氨酶的能力。

实验结果见图9中A、B。结果显示，在ADF固体培养基上可观察到有YJ-DY2菌落生长，说明YJ-DY2能产生ACC脱氨酶。进一步检测产气克雷伯氏菌YJ-DY2的ACC脱氨酶活性，以α-丁酮酸(购于上海麦克林生化科技有限公司，货号：K835540-1g)为标准样品，测得标准曲线方程为：y＝0.114x+0.0584(R

实施例8、产气克雷伯氏菌YJ-DY2促生特性—分泌铁载体能力的分析

CAS检测培养基：溶液a：取0.012g刃天青(CAS)溶于10mL双蒸水中，并与2mL1mMFeCl

培养基d：10×MM9盐溶液20mL，用150mL蒸馏水溶解6.04g哌嗪二乙醇磺酸，两者混匀后用50％的NaOH调节pH至6.8，加入琼脂粉，即得培养基d。将已灭菌的培养基d中加入已分别灭菌的0.2mL 1mMCaCl

挑取微量的产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌株于10μL无菌水中制备菌液，点接种在CAS的固体平板上，放置于37℃下倒置培养。如YJ-DY2菌株在CAS平板产生明显的橙黄色透明圈，则说明该菌株具有分泌嗜铁素的能力，而透明圈的大小及其颜色，则表示菌株产嗜铁素能力，透明圈越大，产生的颜色越深说明菌株产嗜铁素的能力越强。

实验结果见图10。结果说明：YJ-DY2菌株在CAS平板产生明显的橙黄色透明圈，则说明该菌株具有分泌嗜铁素的能力。

实施例9、产气克雷伯氏菌YJ-DY2促生特性—溶磷能力的分析

PKO培养基(1L)：葡萄糖10.0g，磷酸三钙5.0g，氯化镁5g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，硫酸镁0.25g，琼脂17g，其余为水，pH7.0。

土壤中的有机磷和无机磷对植物生长有关键作用。在碱性土壤中的无机磷主要为Ca

将产气克雷伯氏菌YJ-DY2接种在PKO培养基上，发现在PKO培养基上培养72h后，产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌落周围出现透明圈，说明产气克雷伯氏菌YJ-DY2具有溶磷的特性，见图11中A。为进一步检测产气克雷伯氏菌YJ-DY2的解磷能力，用钼锑抗比色法进行了定量检测。以磷标准液为标准样，得到标准曲线，计算公式为：y＝0.183x+0.2651(R

实施例10、产气克雷伯氏菌YJ-DY2在促生特性——固氮能力的分析

Ashby培养基(1L)：KH

将筛选出的产气克雷伯氏菌YJ-DY2菌株点种在Ashby固体培养基(在上述Ashby液体培养基基础上增加了10％琼脂)上，设置重复3次，放置在28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否生长。

结果如图12所示，菌落为黏稠状，边缘整齐，表面光滑，产气克雷伯氏菌YJ-DY2可以生长，具有固氮的特性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。