一种产中性蛋白酶的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）CYSZG-3及其应用

技术领域

本发明是关于产中性蛋白酶菌种及其应用，具体地说，是关于产中性蛋白酶的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3的其相关应用。

背景技术

蛋白酶作为一种生物催化剂，通过催化肽键水解将蛋白质类大分子物质分解为多肽和氨基酸。根据蛋白酶催化反应的最适pH值，可将蛋白酶分为酸性蛋白酶(pH 2.5-5.0)、中性蛋白酶(pH 7.0-8.0)和碱性蛋白酶(pH 9.5-10.5)。蛋白酶在全球酶制剂市场中占据重要份额，2019年蛋白酶产值约为13.4亿美元，其中蛋白酶占到了工业酶制剂市场的28％，涉及到皮革加工、肉类加工、洗涤日化、食品加工、饲料加工、生物活性肽、生丝羽绒、乳制品加工等各个行业。我国蛋白酶产业经过近50年的发展，取得了较大进步，但与国际先进企业相比仍有一些差距。如：国内碱性蛋白酶品种仅有传统的2709和1种基因改进型2709，而国外的碱性蛋白酶品种有诺维信的Alcalase、Esperase、Savinase，杜邦的Purafect OX、冷水酶Properase、P2000/P4000，以及巴斯夫的Lavergy Pro104L等，中性蛋白酶的产酶菌种也仅有枯草芽孢杆菌的AS1.398。因此，开发新的产酶菌种资源是目前我国蛋白酶产业深入发展亟需解决的问题，具有重要战略价值和实践生产意义。

发明内容

为解决上述的问题，本发明提出一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3。保藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东科学院微生物研究所)，保藏编号为GDMCC NO：63494，保藏日期为2023年05月24日。分类学名称为Bacillus velezensis。贝莱斯芽孢杆菌，作为中性蛋白酶的生产用菌种，中性蛋白酶用于皮革加工、洗涤剂、生物活性肽、动物加工、饲料等等蛋白原料的深加工行业。本发明还提及该菌的筛选方法、酶活特性、培养基配方和发酵生产条件。本发明提供一种如下的技术方案：

本发明的目的之一在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

本发明的第二目的是提供上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3的应用，所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3用于中性蛋白酶的生产，优选用于皮革加工、洗涤剂、生物活性肽、动物加工、饲料等等蛋白原料的深加工行业。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3可以以豆粕粉作为主要发酵培养基原料进行发酵产酶。

应用贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3产生的蛋白酶可在中性条件具有较高的蛋白水解活性，对碱性条件具有一定的耐受能力。

一种中性蛋白酶产酶菌种，所述的中性蛋白酶采用上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3制备而成，该菌种可用于生产中性蛋白酶，该蛋白酶可在中性和弱碱性条件下水解蛋白质，同时所述的产酶菌种还包括有营养培养基。营养培养基选自牛肉膏蛋白胨培养基、LB营养培养基、以及添加有碳氮源的无机盐培养基中的任意一种，其中，碳氮源优选为豆粕粉。

牛肉膏蛋白胨培养基的成分及含量为：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化钠5.0g/L，pH＝7.0-8.0。

LB营养培养基的成分及含量为：酵母粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L、蛋白胨10.0g/L，pH＝7.0-8.0。

发酵培养基的成分及含量为：豆粕粉2.0g/L、硝酸钾3.8g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸铵1.0g/L、氯化钙0.3g/L、七水合硫酸镁0.3g/L，pH＝7.5。

本发明提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3在生产中碱性蛋白酶制剂中的应用，其应用步骤如下：

a)、将所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3的培养基配方进行配置。无机盐溶液配方为：硝酸钾3.8g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸铵1.0g/L、氯化钙0.3g/L、七水合硫酸镁0.3g/L。优选的，玉米蛋白粉的最佳使用量为4.0g/L，配制后调节pH为7.5，121℃0.1MPa高温灭菌30min。

b)、按照1％的接种量接种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3进行培养，优选的，培养条件为37℃，180r/min振荡培养。优选的，最佳培养时间为40h。该培养条件下的产酶量最高。

本发明的有益效果在于，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3在优选的培养条件可生产中性蛋白酶。

附图说明

图1为本发明实施例2中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3的菌落形态图；

图2为本发明实施例3中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3产生的蛋白酶在不同pH条件下的酶活力；

图3为本发明实施例4中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3产生的蛋白酶在不同温度条件下的酶活力；

图4为本发明实施例5中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3产生的蛋白酶在不同NaCl盐浓度条件下的酶活力；

图5为本发明实施例6中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3在不同碳源培养基中的产酶能力；

图6为本发明实施例7中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3在在优化的培养基中使用发酵罐生产时的生长曲线。

图7为本发明实施例8中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3在优化的培养基中使用发酵罐生产时的产酶变化。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体的实施例以及附图对本发明作进一步的详细说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可通过商购获得。

实施例1

筛选获取产中性蛋白酶的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3，其筛选过程如下：

步骤1)、从某肠衣废水的好氧处理池中取活性污泥样品；

步骤2)、将10mL的活性污泥接种至100mL脱脂奶粉富集培养基(10％脱脂奶粉、磷酸氢二钾1.0g/L、氯化钠5.0g/L，微量元素溶液1mL/L，调节pH7.0)中在37℃、180r/min条件下富集培养5天，得富集培养液。

步骤3)、吸取步骤2)中的富集培养液采用稀释平板法，在筛选分离培养培养基(酪蛋白10g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，硫酸镁1.0g/L，氯化钙1.0g/L，氯化铁0.1g/L，氯化钠3.0g/L，琼脂10g/L，调节pH7.2、121℃高温高压灭菌)进行分离初筛培养，每个12h观察一次，将降解圈最大的前10名细菌菌落挑出，并接种在LB培养基，进行纯化和命名。

步骤4)、将步骤3)中命名的菌种，接种至复筛培养基(酪蛋白10g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，硫酸镁1.0g/L，氯化钙1.0g/L，氯化铁0.1g/L，氯化钠3.0g/L，调节pH7.2、121℃高温高压灭菌)进行摇瓶发酵培养，培养条件为37℃、180r/min，每隔24h取样一次，参考标准蛋白酶酶活测定方法(GB/T28715-2012)测定发酵液的蛋白酶酶活，选取产蛋白酶酶活最高的细菌作为最终复筛的产蛋白酶菌种。

步骤5)、吸取步骤4)中的复筛菌种，采用稀释涂布法在LB培养基中获得菌落形态相同的单菌落；

步骤6)、挑取步骤5)中的单菌落置于离心管中，与甘油(体积分数30％)1:1体积混合，制成菌液，并于-80℃超低温冰箱中保存。

实施例2

对实施例1筛选的菌种进行鉴定。

本发明的实施例1中，筛选到1株最优产中性蛋白酶菌，本发明中将其命名为CYSZG-3。其中，经鉴定，CYSZG-3为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)在LB琼脂平板培养基上生长良好，如图1所示，菌落呈规则形状，圆凸透明，大小统一，直径2～4mm，表面干燥，边缘平整，具有运动性，兼性好氧生长。菌株生长温度为25～40℃，pH 6～9，最适生长条件：生长温度为37℃，pH7.5。

对实施例1中的步骤5)获得的单菌落提取DNA，并对菌种进行DNA测序，其16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明中亦称该菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CYSZG-3。

实施例3

对实施例2获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3的产中性蛋白酶培养条件进行优化。具体步骤如下：

步骤1)、分别选用不同类型的碳源作为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3的主要发酵培养基材料配置培养基进行优化筛选，包括蛋白胨、玉米粕、黄豆粉、花生粕、黄豆粕、鱼粉等。

步骤2)、取实施例1获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3，分别接种于以上不同碳氮源的培养基中，使用摇瓶进行发酵，在发酵24h取样品测定发酵液的中性蛋白酶活性。

步骤3)、取步骤2)中的发酵液按照标准蛋白酶酶活测定方法(GB/T28715-2012)测定发酵液的蛋白酶活性。

结果详见图2。从图2中可见，编号为8508的碳源产酶量最高。

实施例4

对实施例3获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3产生的酶液进行性能评价，评价该菌生产酶在不同温度、pH和盐浓度下的酶活性的变化。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3，接种于培养基后在37℃180r/min进行培养。

步骤2)、取步骤1)中的发酵液，使用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌，作为粗酶液CYSZG-3。

步骤3)、采用标准蛋白酶酶活测定方法(GB/T28715-2012)测定粗酶液CYSZG-3的在不同温度下中的蛋白酶活性。酶活测定时的反应温度分别设置在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。

结果详见图3。结果表明：结果表明，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3产生的蛋白酶在温度60℃时具有最高酶活性。

步骤4)、采用标准蛋白酶酶活测定方法(GB/T28715-2012)测定粗酶液CYSZG-3的在不同pH缓冲液中的蛋白酶活性。酶活测定的缓冲液pH设定为7.0时，测定贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3产生的蛋白酶在中性条件的活性；酶活测定的缓冲液pH设定为10.5时，测定贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3产生的蛋白酶在碱性条件的活性；酶活测定的缓冲液pH设定为4.0时，测定贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CYSZG-3产生的蛋白酶在酸性条件的活性。

结果详见图4。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3产生的蛋白酶在酸性(4.0)条件下活性接近0，中性(7.0)条件下酶活最高，碱性(10.5)条件下酶活性次之。

步骤5)、采用标准蛋白酶酶活测定方法(GB/T28715-2012)测定粗酶液CYSZG-3的在不同盐溶液中的蛋白酶活性。酶活测定时反应体系中加入NaCl，使盐浓度为5、10、20、50g/L。

结果详见图5。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3产生的蛋白酶的活性随着反应体系中盐浓度的升高而降低。

实施例5

对实施例3获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3的获得的优化培养基进行发酵培养。具体步骤如下：

步骤1)、按照实施例1中获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3最优培养基配方。

步骤2)、调节培养基配方的pH值为7，在37℃条件下、通气量为1.0vvm的条件下，使用20L发酵罐对贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3进行产酶培养。

步骤3)、每隔一段时间取步骤2)中的发酵液，通过稀释平板法的菌落计数测定发酵过程中的活菌数量。测定贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3在发酵过程中的生长曲线。培养基配方的pH值为5.5、7.0、8.5，在37℃、条件下对贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CYSZG-3进行产酶培养，分别测定不同时间的酶活性。

结果详见图6。结果表明，8-10h，活菌数量最高，此时细菌的活性最高。

步骤4)、每隔一段时间取步骤2)中的发酵液，使用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，除菌后的滤液通过标准蛋白酶酶活测定方法(GB/T28715-2012)进行酶活测试。

结果详见图7。结果表明，0-8h，蛋白酶的产酶量急剧升高，之后缓慢上升，并保持平稳，步骤1)的发酵条件下最佳发酵时间为22h。发酵液最高酶活270U/mL。

上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。