2D和3D生物支架细胞外结构单元和组织结构设计及制造方法

本申请是要求2018年5月7日提交的美国临时申请62/668203的优先权权益的国际申请，该申请全文以引用方式并入本文。

技术领域

本文所公开的实施方案整体涉及可以包括单元格的多孔细胞外结构和/或生物支架结构以及用于制造所述结构的方法。更具体地，需要具有多孔构造的多孔细胞外结构和/或生物支架结构，所述结构适于促进最佳细胞浸润、组织再生并使患者体内不良免疫应答和/或病原体污染的风险最小化。

背景技术

本文所公开的实施方案整体涉及用于最佳细胞浸润的三维多孔细胞外结构和/或生物支架结构以及用于生产所述结构的方法。生物支架结构通常是可以用于临时或永久替换器官或组织的结构和/或功能的细胞外构造。生物支架结构的目的可以是帮助恢复所涉及的器官或组织的正常功能或外观。生物支架结构可以通过提供细胞可以从其渗透和吸收的平台来实现该目的。这可导致细胞替换生物支架结构，同时恢复和/或改善器官或组织功能和/或外观。

为了提供适于最佳细胞浸润的生物支架结构，生物支架通常可以包括允许细胞向内生长的一系列孔。生物支架还可以由当细胞向内生长替换生物支架并恢复器官或组织功能和/或外观时允许必需的生物降解和生物吸收的材料构成。然而，这些材料不应引起不利的生物学应答。生物支架还将具有最佳拉伸强度，以承受初始植入、体内生理需求和随后的浸润的应力。生物支架组合物还可以具有表面化学性质以允许必需的细胞粘附。

常规生物支架由细胞外基质(ECM)制造而成，所述细胞外基质由从人尸体或猪类(猪)产品提取的组织中制造出来，随后进行脱细胞以留下完整的细胞外基质。当来源于真皮(皮肤)时，这些支架被称为脱细胞真皮基质(ADM)。

然而，这些常规的细胞外基质材料可能具有许多潜在的缺点。这些材料在被植入患者体内时可能触发免疫原性应答，因为这些材料可具有来自供体源的残余细胞或细胞外组分。此外，由于ADM材料通常取自成年人或老年人供体，因此这些材料可能含有过高比率的胶原I与胶原III，这比含有较低比率的胶原I与胶原III的组织提供了降低的结构支撑、缓冲、保护、增强和覆盖。

除了产生不利的生物学应答之外，常规的生物支架通常无法提供细胞外基质蛋白(例如，胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、细胞因子、多糖、生长因子等)的最佳组成，所述最佳组成有助于促进细胞向内生长到生物支架中，因此促进整体组织再生，这可有助于患者恢复并减少整体瘢痕形成。

除了无法提供细胞外基质蛋白的最佳混合物以促进细胞向内生长和组织再生之外，常规ADM生物支架可能无法适当地平衡必需的孔尺寸和结构以促进最佳细胞和组织生长以及血管形成，从而无法提供足以承受常规生物支架使用场景(例如，缝合和扩张)所需的结构特性(诸如拉伸强度和弹性)。此外，显而易见的是，细胞生态位(尺寸、形状、基底等)而不是细胞本身可以最终引导和控制细胞的命运。因此，被提供用于宿主细胞浸润的细胞核生态位的架构将最终影响将引导细胞行为的分子信号和机械信号。

此外，由于常规ADM生物支架通常作为不可定制的两片材料出现，因此在植入患者体内之前，外科医生可能需要对它们进行广泛处理或操纵(例如，切割、成形、缝编等)。这可导致对患者的污染风险增加。

因此，需要开发二维和三维多孔细胞外结构和/或生物支架结构，所述结构使宿主免疫原性应答最小化并且更好地促进细胞生长，同时保持足够的机械性能。此外，需要提供精确控制所产生的细胞生态位的架构和尺寸的手段，从而使得细胞外构造内的最佳几何单元能够以再生应答而不是纤维化应答促进细胞浸润、重塑和端细胞命运。

发明内容

在一个方面，提供了一种生物支架结构，所述生物支架包括多个连接的单元格，每个单元格包括多根细丝，所述多根细丝由含有胶原I和胶原III的细胞外材料构成，其中所述多个单元格中的每个单元格包括连接到内部体积的至少一个开口。

在另一方面，提供了一种生物支架结构，所述生物支架结构包括细丝层，所述细丝层由含有胶原I和胶原III的细胞外材料构成，其中所述层包括多个孔。

在又一方面，提供了一种用于生产生物支架结构的方法，所述方法包括将液化聚合物的小滴沉积到基底表面上以形成包括多个连接的单元格的生物支架结构(其中所述多个单元格中的每个单元格包括连接到内部体积的至少一个开口)，以及将胶原I和胶原III的涂层施加到所述生物支架结构上。

在另一方面，提供了一种用于生产生物支架结构的方法，所述方法包括将液化聚合物的料流沉积到基底表面上以形成包括多个连接的单元格的生物支架结构(其中所述多个单元格中的每个单元格包括连接到内部体积的至少一个开口)，以及将胶原I和胶原III的涂层施加到所述生物支架结构上。

在又一方面，提供了一种用于生产生物支架结构的方法，所述方法包括通过加热喷嘴供应液化聚合物的料流，生成电场以将所述液化聚合物的料流抽吸到收集器板上，将多个液化聚合物的料流沉积到所述收集器板上以形成包括多个连接的单元格的生物支架结构(其中所述多个单元格中的每个单元格包括连接到内部体积的至少一个开口)，以及将胶原I和胶原III的涂层施加到所述生物支架结构上。

根据下面的具体实施方式以及所附权利要求和附图，附加方面将是显而易见的。

附图说明

为了更完整地理解本文所公开的原理及其优点，现在结合附图来参考以下描述，其中：

图1a至图1e示出了根据各种实施方案的由不同类型的单元格结构构成的各种生物支架结构。

图2示出了根据各种实施方案的平片生物支架植入物。

图3示出了根据各种实施方案的密切贴合生物支架植入物。

图4示出了根据各种实施方案的即用型生物支架植入物。

图5示出了根据各种实施方案的用于生产生物支架结构的基于熔体静电纺纱的制造工艺。

图6示出了根据各种实施方案的用于生产生物支架结构的熔融沉积成型制造工艺。

图7示出了根据各种实施方案的用于生产生物支架结构的熔融沉积成型制造工艺。

图8是示出根据各种实施方案的用于生产生物支架结构的工艺的流程图。

图9是示出根据各种实施方案的用于生产生物支架结构的工艺的流程图。

图10是示出根据各种实施方案的用于生产生物支架结构的工艺的流程图。

应当理解，附图未必按比例绘制，附图中的对象也未必相对于彼此按比例绘制。附图是旨在使本文所公开的设备、系统和方法的各种实施方案清晰和易于理解的而进行的描绘。在可能的情况下，在所有附图中将使用相同的参考标号来指代相同或类似的部件。此外，应当理解，附图并非旨在以任何方式限制本教导内容的范围。

具体实施方式

本说明书描述了本公开的示例性实施方案和应用。然而，本公开不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于在本文中操作或描述的示例性实施方案和应用的方式。根据说明书和附图以及权利要求书，本教导内容的其他实施方案、特征、目的和优点将是显而易见的。此外，附图可能显示简化视图或局部视图，并且附图中元件的尺寸可能被放大或以其他方式不是成比例的。此外，在本文中使用术语“在......上”、“附接到......”、“连接到......”、“联接到......”或类似词语时，一个元件(例如，材料、层、基底、托盘、基板、单独的金属结构等)可以“在另一个元件上”、“附接到另一个元件”、“连接到另一个元件”或“联接到另一个元件”，而不论所述一个元件是直接在另一个元件上、附接到另一个元件、连接到另一个元件或联接到另一个元件，还是在所述一个元件与另一个元件之间存在一个或多个居间元件。此外，在提及要素列表(例如，要素a、b、c)的情况下，此类提及旨在包括单独所列要素中的任一个、少于所列要素中的全部的任何组合和/或所列要素中的全部的组合。本说明书中的章节划分只是为了便于查看，并不限制所讨论的元素的任何组合。

如本文所用，“细胞外”在用于指例如“细胞外材料”、“细胞外结构”、“细胞外基质”、“细胞外构造”和“细胞外组分”时表示存在于细胞外的特性，并且可以指合成材料或天然材料。细胞外材料的示例包括合成聚合物和天然聚合物；代谢物；离子；各种蛋白质和非蛋白质物质(例如，DNA、RNA、脂质、微生物产物等)，诸如胶原、蛋白聚糖、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子；各种酶，包括例如消化酶(例如，胰蛋白酶和胃蛋白酶)、细胞外蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶、具有血小板反应蛋白基序的解联蛋白与金属蛋白酶(ADAMTS)、组织蛋白酶)和抗氧化酶(例如，细胞外超氧化物歧化酶)；蛋白水解产物；细胞外基质蛋白(诸如弹性蛋白、糖胺聚糖(GAG)、层粘连蛋白、纤连蛋白等)、所选细胞群、小分子和小分子抑制剂、抗生素、抗微生物剂、纳米粒子、中孔二氧化硅、丝纤蛋白、酶降解位点；抗纤维化剂，诸如抗转化生长因子β(抗TGF-β)和抗肿瘤坏死因子α(抗TNF-α)；促血管生成剂，诸如血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PlGF)；以及影响脂肪形成和增殖的因子，诸如胰岛素样生长因子1(IGF-1)和地塞米松。

如本文所用，“生物油墨”表示模拟细胞外基质环境以支持活细胞的粘附、增殖和分化并且可以在增材制造工艺中作为细丝、纤维或原纤沉积的任何生物活性、生物可打印的天然或人工来源的材料。

如本文所用，“生物支架”表示用于组织工程中能够被植入体内以便促进细胞粘附和组织再生、通常用于损伤恢复的生物相容性和生物可吸收性结构。生物支架可以用于例如骨、软骨、皮肤、器官、组织区域/体积(例如，乳房组织)和肌肉再生的区域。

如本文所用，“角度范围”表示两个对象可以相对于彼此放置的角度的范围。

如本文所用，术语“包含”、“含有”、“具有”和“包括”以及它们的变型并非旨在是限制性的，而是包括性的或开放式的，并且不排除附加的未列举添加剂、组分、整数、元件或方法步骤。例如，包括一系列特征的工艺、方法、系统、组合物、套件或设备不一定仅限于那些特征，而是可包括此类工艺、方法、系统、组合物、套件或设备的未明确列出或固有的其他特征。

除非另有定义，否则结合本文所述的本教导内容使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

本公开涉及多孔二维和三维细胞外结构和/或生物支架以及用于制造所述结构的方法。这些多孔细胞外结构具有多种有用的应用，特别是医学应用。就医学应用而言，多孔细胞外结构诸如生物支架独特地适于促进医学植入物(包括例如与乳房肿瘤学相关的乳房植入物)中的细胞浸润。此类结构提供用于组织增强的平台。这些结构的多孔性质可以允许植入物促进感兴趣的区域内的细胞生长，同时提供所需的结构完整性以承受伴随植入程序(例如，缝合、切割、成形等)以及随后的扩张和细胞浸润的应力。

根据各种实施方案，提供了一种生物支架结构，如例如图1a的结构100所示。结构100可以包括多个连接的单位格110。每个单元格110可以包括多根细丝120，所述多根细丝由含有天然聚合物(例如，多糖、脂质、蛋白质等)或人造聚合物(例如，聚己内酯、聚乙二醇、乙烯丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等)、胶原(例如，胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V等)的细胞外材料构成。此外，多个单元格110中的每个单元格可以包括连接到内部体积140的至少一个开口130。对于单元格110的放大视图，参见图1b，其仅示出了单元格结构。对于具有与图1a和图1b的单元格110不同的单元格几何形状的单元格结构的另一个示例，参见图1c的单元格160，其示出了六边形多面体，该六边形多面体可以由多根细丝(或撑条)170构成。对于单元格结构的又一个示例，参见图1e，其示出了由四侧结构构成的单元格200，该四侧结构具有连接到内部体积216的相对侧开口214。在各种实施方案中，四侧结构的每个侧面由细丝212(撑条)的叠堆形成。此外，如图1e所示，生物支架结构300可以由多个这些单元格200构成。

单元格将遇到的推定几何形状可以是具有可在nm或μm范围内间隔开的原纤210和开口214(孔)的同质或异质互连结构。具体的几何形状可以通过以光栅图案218打印原纤210来实现，例如以彼此成约10度至约90度取向的光栅角度连续或半连续打印原纤210以形成单元格几何形状的网络，所述几何形状可以包括例如但不限于三角形、四边形、凹多边形和凸多边形、规则多边形和不规则多边形、弯曲2D形状和3D形状以及柏拉图体。

在各种实施方案中，生物支架结构的细胞外材料可以含有与如表I所示的人真皮(例如，胎儿、青少年、成年人和老年人)内所含的胶原I与胶原III比率相似的胶原I与胶原III比率。

即，在各种实施方案中，细胞外材料可以具有介于约0.5至约3.5之间的范围内或介于约0.75至约3.0之间的范围内或介于约0.9至约2.5之间的优选范围内的胶原I与胶原III比率。介于约0.9至约2.5之间的优选胶原I与胶原III比率范围可提供优于常规组织供应物的优点，所述常规组织供应物主要取自成年人和老年人供体，含有高得多的胶原I与胶原III比率，从而比含有较低比率的组织提供降低的支持、缓冲、保护、增强和覆盖。

更具体的胶原I与胶原III比率可以为约0.5、约0.55、约0.6、约0.65、约0.7、约0.75、约0.8、约0.85、约0.9、约0.95、约1.0、约1.05、约1.1、约1.15、约1.2、约1.25、约1.3、约1.35、约1.4、约1.45、约1.5、约1.55、约1.6、约1.65、约1.7、约1.75、约1.8、约1.85、约1.9、约1.95、约2.0、约2.05、约2.1、约2.15、约2.2、约2.25、约2.3、约2.35、约2.4、约2.45、约2.5、约2.55、约2.6、约2.65、约2.7、约2.75、约2.8、约2.85、约2.9、约2.95、约3.0、约3.05、约3.1、约3.15、约3.2、约3.25、约3.3、约2.35、约3.4、约3.45、约3.5以及这些值中任两者之间的范围。

胶原I和胶原III可以通过提供广泛的细胞外基质提示网络来有助于为浸润细胞提供平台以附接到生物支架结构，所述细胞外基质线索为乳房、其他器官或其他解剖结构和周围组织内的宿主细胞受体识别、向内生长、血管形成和重塑提供了当前在合成基质供应物中难以实现的适当细胞生态位。胶原I和胶原III也可以有助于引导细胞命运和分化。细胞表面受体对这些胶原组分的鉴定会诱导组织生成和支架重塑所需的信号分子的产生。

细胞外材料还可以由生物活性材料构成。这些生物活性材料可以包括但不限于其他类型的胶原(例如，胶原II、IV、V、VI等)、细胞外基质蛋白(诸如弹性蛋白、糖胺聚糖(GAG)、层粘连蛋白、纤连蛋白等)、生长因子、细胞因子、多糖、所选细胞群、小分子和小分子抑制剂、抗生素、抗微生物剂、纳米粒子、中孔二氧化硅、丝纤蛋白、酶降解位点以及它们的任何组合。抗纤维化剂可以包括在细胞外材料中，示例为诸如抗转化生长因子β(抗TGF-β)和抗肿瘤坏死因子α(抗TNF-α)。促血管生成剂可以包括在细胞外材料中，示例诸如血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PlGF)。影响脂肪形成和增殖的因子可以包括在细胞外材料中，诸如胰岛素样生长因子1(IGF-1)和地塞米松。

至少一个开口(130或214)可以具有介于约100微米(μm)至约500微米之间的直径。另选地，至少一个开口可以为除圆形之外的形状，其中至少一个开口可以具有介于约50微米至约1000微米或约50微米至约500微米或约100微米至1000微米之间的长度。生物支架结构的每根细丝可以具有小于或等于约100微米的直径。

为了允许适当的组织向内生长，至少一个开口的尺寸以及多个开口相对于彼此的取向及其几何形状可能是重要的。开口(即，孔)应足够大以容纳浸润细胞的尺寸和几何形状，但应足够小以使得浸润细胞可以附接到生物支架结构并且彼此附接，以形成复杂的互连细胞信号传导网络，从而允许支架降解、胶原合成和组织再生。因此，所述材料必须足够“海绵状”以允许细胞浸润到整个构造(长度、宽度、高度和深度)中。例如，当施加于人皮肤时，人真皮成纤维细胞的宽度通常为大约30微米至70微米。因此，确定约100微米至约500微米的孔尺寸将允许细胞浸润，同时仍提供细胞能够经由膜或细胞因子信号传导进行通信的生态位。在各种实施方案中，孔尺寸可以为约50微米至约1000微米或约50微米至约500微米或约100微米至约1000微米。

生物支架结构的细胞外材料还可以含有一种或多种聚合物。聚合物可以为可溶解聚合物。聚合物可以为天然的或合成的。聚合物的示例包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(l-乳酸)(PLLA)、乙烯丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、藻酸酯、多糖、透明质酸、明胶、大豆蛋白、纤维蛋白原、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、淀粉或其他类型的聚合物。在各种实施方案中，聚合物可以仅为PCL。

虽然常规组织基质供应物通常难以实现，但使用如上所述的天然和/或合成聚合物可以有助于为生物支架提供机械稳定性并且产生一致的生物支架降解特征，这允许整形外科医生能够更好地预测和控制患者的临床结果。

生物支架结构中的多个连接的单元格可以形成基本上平面的片材，如图2中所示。生物支架结构中的多个连接的单元格也可以形成3D宏观结构，如图3和4所示。此外，生物支架结构可以具有介于约0.5mm至约200mm之间或介于约0.5mm至约20mm之间或介于约0.5mm至约2.5mm之间的厚度。3D宏观结构可以包括例如下文更详细地讨论的“密切”贴合构型(图3)和“即用型”实心植入物构型(图4)。

关于单元格几何形状和支架设计，单元格的具体几何形状可以与构成单元格的生物打印细丝(撑条)的尺寸和布置以及开口(孔)的布置和由材料沉积(材料沉积工艺在下文更详细地讨论)产生的开口尺寸(孔尺寸)相关。细胞命运和功能可以由以下因素决定：纤维(原纤)尺寸(例如，聚合物和/或生物油墨材料的沉积线或股线的直径，下文更详细地讨论)、整个基质(例如，单个平面和非平面片材或者构成植入物的多个片材)的孔尺寸、基质密度/高度、基础聚合物(如果使用)、细胞外材料组成以及(例如，整个基质的)标准化孔结构和/或(例如，整个基质的)随机布置的孔结构之间的用途/相互影响。因此，当生物打印多根纤维(原纤)以形成层时，可以以平行形式沉积那些纤维以形成至少一个形成生物支架的层。可能甚至更有益的是具有随机布置的打印纤维以在层上产生随机布置的孔结构。此外，即使层包括平行沉积的纤维，后续的覆盖层也可以包括随机布置的打印纤维，以在多个层上产生随机布置的孔结构，进而在整个生物支架结构上产生随机布置的孔结构。因此，可以以光栅图案打印纤维，其中光栅角度相对于彼此介于约10度与约90度取向之间(也称为角度范围)，以产生随机孔布置。此外，可以打印纤维以在生物支架结构的多个层上形成介于约100至约500微米之间的孔。在各种实施方案中，孔尺寸可以为约50微米至约1000微米或约50微米至约500微米或约100微米至约1000微米。

此外，单元格几何形状可以在整个矩阵上相同，可以包括一组特定限定的交替几何形状，或者可以为完全随机的。虽然每种类型的单元格几何形状分布都可以提供必需的浸润、细胞附接以及组织重塑或再生特征，但随机或特定变化的单元格几何形状的分布可以提供甚至更有益的浸润、附接和重塑/再生。此外，即使在整个矩阵上应用一致的单元格几何形状，单元格的随机取向也可以提供类似的有益特性。如图1d所示，例如，虽然单元格几何形状可相同，但单元格相对于彼此在整个多层矩阵上的随机取向可以提供上述有益特性。

当涉及结构完整性时，根据各种实施方案，结构特性可以包括例如拉伸强度、刚度、最大负荷、拉伸应力、拉伸应变(生物支架结构的延伸与初始长度之比)和弹性模量。生物支架结构可以具有介于约10牛顿/厘米(N/cm)至约200N/cm之间的拉伸强度。此外，生物支架结构可以具有介于约30N/cm至约100N/cm之间的拉伸强度。优选地，生物支架结构可以具有介于约50N/cm至约85N/cm之间的拉伸强度。

根据各种实施方案，生物支架结构可以具有约3兆帕(MPa)至约100MPa的拉伸应力极限。优选地，生物支架结构可以具有约10MPa至约30MPa的拉伸应力极限。

根据各种实施方案，生物支架结构还可以具有大于约10％的拉伸应变极限。此外，生物支架结构还可以具有大于约35％的拉伸应变极限。优选地，生物支架结构还可以具有约20％至约80％的拉伸应变。

根据各种实施方案，生物支架结构可以具有小于约80N/mm的刚度。此外，生物支架结构可以具有小于约18N/mm的刚度。优选地，生物支架结构可以具有大于约5N/mm且小于约18N/mm的刚度。

根据各种实施方案，生物支架结构可以具有大于约50N的最大负荷。此外，生物支架结构可以具有大于约150N的最大负荷。优选地，生物支架结构可以具有大于约150N且小于约400N的最大负荷。

根据各种实施方案，生物支架结构可以具有约10MPa至约450MPa的弹性模量。此外，生物支架结构可以具有小于约150MPa的弹性模量。优选地，生物支架结构可以具有约60MPa至约150MPa的弹性模量。

应当理解，生物支架结构的细胞外材料(可以包括聚己内酯(PCL)和/或另一种可溶解或可液化聚合物，以及该聚合物的后续分层)可以有助于提供生物支架结构以及构成该结构的单元格的结构完整性和功能(例如，缝合和扩张)。

根据各种实施方案，提供了一种生物支架结构。该结构可以包括纤维(原纤)层，所述纤维层由含有胶原I和胶原III的细胞外材料构成。该层可以包括多个孔。多个孔可以具有基本上相等的直径，或者在替代形式中，可以在整个生物支架结构上是随机的。在各种实施方案中，多个孔可以具有介于约100微米至约500微米之间的直径。另选地，孔中的至少一个孔可以为除圆形之外的形状，其中至少一个孔可以具有介于约100微米至约500微米或约50微米至约1000微米之间或者介于约50微米至约500微米或约100微米至约1000微米之间的长度。在各种实施方案中，生物支架结构的每根纤维(原纤)可以具有至少约100微米的直径。

生物支架结构的细胞外材料可以含有与胎儿和青少年真皮内所含的胶原I与胶原III比率相似的胶原I与胶原III比率。当前组织供应物主要取自成年人和老年人供体，含有高得多的胶原I与胶原III比率，从而比含有较低比率的组织提供降低的支持、缓冲、保护、增强和覆盖。生物支架结构的细胞外材料可以含有与如上表I所示的人真皮(例如，胎儿、青少年、成年人和老年人)内所含的胶原I与胶原III比率相似的胶原I与胶原III比率。

即，在各种实施方案中，细胞外材料可以具有介于约0.5至约3.5之间的范围内或介于约0.75至约3.0之间的范围内或介于约0.9至约2.5之间的优选范围内的胶原I与胶原III比率。介于约0.9至约2.5之间的优选胶原I与胶原III比率范围可提供优于常规组织供应物的优点，所述常规组织供应物主要取自成年人和老年人供体(含有高得多的胶原I与胶原III比率)，从而比含有较低比率的组织提供降低的支持、缓冲、保护、增强和覆盖。

更具体的胶原I与胶原III比率可以包括约0.5、约0.55、约0.6、约0.65、约0.7、约0.75、约0.8、约0.85、约0.9、约0.95、约1.0、约1.05、约1.1、约1.15、约1.2、约1.25、约1.3、约1.35、约1.4、约1.45、约1.5、约1.55、约1.6、约1.65、约1.7、约1.75、约1.8、约1.85、约1.9、约1.95、约2.0、约2.05、约2.1、约2.15、约2.2、约2.25、约2.3、约2.35、约2.4、约2.45、约2.5、约2.55、约2.6、约2.65、约2.7、约2.75、约2.8、约2.85、约2.9、约2.95、约3.0、约3.05、约3.1、约3.15、约3.2、约3.25、约3.3、约2.35、约3.4、约3.45、约3.5以及这些值中任两者之间的范围。

胶原I和胶原III可以通过提供广泛的细胞外基质提示网络来有助于为浸润细胞提供平台以附接到生物支架结构，所述细胞外基质线索为乳房、其他器官或其他解剖结构和周围组织内的宿主细胞受体识别、向内生长、血管形成和重塑提供了当前在合成基质供应物中难以实现的适当细胞生态位。胶原I和胶原III也有助于引导细胞命运和分化。细胞表面受体对这些胶原组分的鉴定会诱导组织生成和支架重塑所需的信号分子的产生。

细胞外材料可以包含另外的生物活性材料。这些生物活性分子可以包括但不限于其他类型的胶原(例如，胶原II、胶原IV、胶原V等)、细胞外基质蛋白(诸如弹性蛋白、糖胺聚糖(GAG)、层粘连蛋白、纤连蛋白等)、生长因子、细胞因子、多糖、所选细胞群、小分子和小分子抑制剂、抗生素、抗微生物剂、纳米粒子、中孔二氧化硅、丝纤蛋白、酶降解位点以及它们的任何组合。抗纤维化剂可以包括在细胞外材料中，示例为诸如抗转化生长因子β(抗TGF-β)和抗肿瘤坏死因子α(抗TNF-α)。促血管生成剂可以包括在细胞外材料中，示例诸如血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PlGF)。影响脂肪形成和增殖的因子可以包括在细胞外材料中，诸如胰岛素样生长因子1(IGF-1)和地塞米松。

多个孔可以具有介于约100微米至约500微米之间的直径。另选地，多个孔可以为除圆形之外的形状，其中至少一个开口可以具有介于约100微米至约500微米或约50微米至约1000微米之间或者介于约50微米至约500微米或约100微米至约1000微米之间的长度。生物支架结构的每根纤维(原纤)可以具有小于或等于约100微米的直径。

如上所述，为了充分促进适当的组织向内生长，孔的尺寸以及它们相对于彼此的取向及其几何形状将是关键的。孔应足够大以容纳浸润细胞的尺寸和几何形状，但应足够小以使得浸润细胞不仅可以附接到生物支架结构而且可以彼此附接，以形成复杂的互连细胞信号传导网络，从而允许支架降解、胶原合成和组织再生。因此，所述材料可以为足够“海绵状”以允许细胞浸润到整个构造(长度、宽度、高度和深度)中。例如，当施加于人皮肤时，人真皮成纤维细胞的宽度通常为大约30微米至70微米。因此，确定约100微米至约500微米的孔尺寸将允许细胞浸润，同时仍提供细胞能够经由膜或细胞因子信号传导进行通信的生态位。

生物支架结构的细胞外材料还可以含有聚合物。聚合物可以为可溶解或可液化聚合物。聚合物可以为天然的或合成的。聚合物的示例包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(1-乳酸)(PLLA)、乙烯丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、藻酸酯、透明质酸、明胶、大豆蛋白、纤维蛋白原、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、淀粉或其他类型的聚合物。在各种实施方案中，聚合物可以为聚己内酯。

生物支架结构的层可以形成基本上平面的片材的一部分，如图2所示。生物支架结构的层可以形成3D宏观结构的一部分，如图3和图4所示。生物支架结构的层可以具有介于约0.5mm至约200mm之间或介于约0.5mm至约20mm之间或介于约0.5mm至约2.5mm之间的厚度。3D宏观结构可以包括例如下文更详细地讨论的“密切”贴合构型(图3)和“即用型”实心植入物构型(图4)。

与上文讨论的类似，单元格(由多组细丝构成)的具体几何形状可以与构成单元格的生物打印细丝的尺寸和布置以及开口(孔)的布置和由材料沉积(材料沉积工艺在下文更详细地讨论)产生的开口尺寸(孔尺寸)相关。细胞命运和功能可以由以下因素决定：纤维尺寸、整个基质(例如，单个平面和非平面片材或者构成植入物的多个片材)的孔尺寸、基质密度/高度、基础聚合物(如果使用)、细胞外材料组成以及(例如，整个基质的)标准化孔结构和/或(例如，整个基质的)随机布置的孔结构之间的用途/相互影响。因此，当生物打印多根纤维以形成层时，可以以平行形式沉积那些纤维以形成至少一个形成生物支架的层。可能甚至更有益的是具有随机布置的打印纤维以在层上产生随机布置的孔结构。此外，即使层包括平行沉积的纤维，后续的覆盖层也可以包括随机布置的打印纤维，以在多个层上产生随机布置的孔结构，进而在整个生物支架结构上产生随机布置的孔结构。因此，可以以光栅图案打印纤维，其中光栅角度相对于彼此介于约10度与约90度取向之间(也称为角度范围)，以产生随机孔布置。此外，可以打印纤维以在生物支架结构的多个层上形成介于约100至约500微米之间的孔。参见下文与生物支架结构的制造工艺有关的进一步讨论。

此外，如上所述，单元格几何形状可以在整个矩阵上相同，可以包括一组特定限定的交替几何形状，或者可以为完全随机的。虽然每种类型的单元格几何形状分布都可以提供必需的浸润、细胞附接以及组织重塑或再生特征，但随机或特定变化的单元格几何形状的分布可以提供甚至更有益的浸润、附接和重塑/再生。此外，即使在整个矩阵上应用一致的单元格几何形状，单元格的随机取向也可以提供类似的有益特性。如图1d所示，例如，虽然单元格几何形状可相同，但单元格相对于彼此在整个多层矩阵上的随机取向可以提供上述有益特性。

当涉及结构完整性时，根据各种实施方案，生物支架结构或生物支架结构的层的结构特性可以包括例如拉伸强度、刚度、最大负荷、拉伸应力、拉伸应变和弹性模量。生物支架结构的层可以具有介于约10牛顿/厘米(N/cm)至约200N/cm之间的拉伸强度。此外，生物支架结构的层可以具有介于约30N/cm至约100N/cm之间的拉伸强度。优选地，生物支架结构的层可以具有介于约50N/cm至约85N/cm之间的拉伸强度。

根据各种实施方案，生物支架结构的层可以具有约3兆帕(MPa)至约100MPa的拉伸应力极限。优选地，生物支架结构的层可以具有约10MPa至约30MPa的拉伸应力极限。

根据各种实施方案，生物支架结构的层还可以具有大于约10％的拉伸应变极限。此外，生物支架结构的层还可以具有大于约35％的拉伸应变极限。优选地，生物支架结构的层还可以具有约20％至约80％的拉伸应变。

根据各种实施方案，生物支架结构的层可以具有小于约80N/mm的刚度。此外，生物支架结构的层可以具有小于约18N/mm的刚度。优选地，生物支架结构的层可以具有大于约5N/mm且小于约18N/mm的刚度。

根据各种实施方案，生物支架结构的层可以具有大于约50N的最大负荷。此外，生物支架结构的层可以具有大于约150N的最大负荷。优选地，生物支架结构的层可以具有大于约150N且小于约400N的最大负荷。

根据各种实施方案，生物支架结构的层可以具有约10MPa至约450MPa的弹性模量。此外，生物支架结构的层可以具有小于约150MPa的弹性模量。优选地，生物支架结构的层可以具有约60MPa至约150MPa的弹性模量。

如上所述，生物支架结构的细胞外材料(可以包括聚己内酯(PCL)和/或另一种可溶解或可液化聚合物，以及该聚合物的后续分层)可以有助于提供生物支架结构以及构成该结构的单元格的结构完整性和功能(例如，缝合和扩张)。

根据各种实施方案，生物支架结构可以采用许多形式，包括例如膜、微珠、抓绒、纤维、凝胶和纤维网。例如，实现根据本文各种实施方案的生物支架结构的成品网可以提供必需的孔隙度以允许最佳细胞浸润并为细胞附接提供足够大的生态位，并且最终将细胞命运导向重塑/再生表型而非纤维化/收缩表型。此外，从机械/结构角度来看，支架结构的布置提供了将在生理上相关以及可用作支撑基质的适当机械强度和弹性。这些特征可以由生物支架结构使用例如如先前所述的最佳细胞外材料组成来提供，从而提供同样如先前所述的必要的结构完整性特性。确定最佳组成以提供必需的完整性可以通过系统性改变例如孔尺寸、角度细丝沉积范围、密度、高度、聚合物类型和细丝尺寸(例如，直径)来实现。

根据各种实施方案，并且如图2中以举例的方式提供，最终组织构造可以是例如二维(2D)的平片。如图3中以举例的方式提供，另一个且更先进的最终组织构造可以是例如模制片材/构造，所述模制片材/构造为组织增强提供“密切贴合”，以将乳房植入物或其他医学装置、解剖结构或生理结构保持在乳房(例如，乳房袋)、其他器官或其他解剖结构内。如图4中以举例的方式提供，又一个先进的最终组织构造可以是例如乳房(例如，乳房袋)、其他器官或其他解剖结构内的“即用型”乳房肿瘤切除术缺损植入物。实心植入物样式的构造(参见图4)针对乳房应用(例如，乳房肿瘤切除术)的尺寸打印范围可以为约20g至约4500g，或者针对其他解剖应用可以为定制尺寸。例如，植入物可以为长球形状(即足球)(参见图4)、定制形状或另一种预定几何构型。

此类最终组织构造可以有利地通过使术中操纵最小化同时改善患者的手术效率来改善植入物手术期间的易用性。例如，根据各种实施方案的三维(3D)构造将为患者提供“即用型”植入物选项，从而改善例如组织增强和乳房肿瘤切除术植入物领域的医生和患者的手术效率。相比之下，当前的尸体脱细胞真皮基质(ADM)供应物以二维(2D)组织片的形式提供，需要对组织片进行广泛操纵，这需要外科医生在植入前将脱细胞真皮基质片缝合(或者粘结或连接)成袋状结构，以形成用于乳房植入物或组织增强应用的适当3D袋。这种广泛操纵需要额外的手术时间，并且可能引入潜在的污染。

此外，ADM受到组织质量(由于年龄、吸烟史、药物使用)、不同国家监管约束、供体可用性、供体匹配性、宿主免疫状态、成本等的阻碍。相比之下，根据本文各种实施方案的生物打印支架有利地消除了供体可用性、可变性和质量/健康状态、组织质量和监管政策的问题。此外，通过使用支架的受控参数进行生物打印以满足最终产品的所需特性，生物打印支架允许ADM完全不允许的个性化医学应用。这些个性化医学应用包括例如但不限于乳房肿瘤切除术(如上所述)、管状软骨应用、瓣膜心脏病应用和冠状动脉疾病应用、疝修复应用、组织移植应用、静脉、动脉和淋巴血管应用、其中存在软组织缺陷的结构应用或支撑应用。

关于组织增强，根据各种实施方案的生物脱细胞真皮基质的用途和优点是不同且显著的。一种示例性用途是通过允许用于两阶段乳房重建的更大初始组织扩张器填充体积或用于单阶段乳房重建的植入物放置来重新附接胸肌。另一个示例性用途是通过帮助限定乳房袋的形状(通过限定乳房下皱襞，支撑胸大肌前乳房重建中的植入物，并且矫正植入物错位(诸如并乳、下移等))来保持(支撑)植入物位置。另一个示例性用途是通过使用支架作为缓冲件或使组织增厚以掩盖不需要的美容效果(诸如波纹)的装置来掩饰美学缺陷。其他示例性用途和益处是在放射治疗期间减少囊膜挛缩和组织响应更积极。

根据各种实施方案，构造中的独特组合组分(即，聚合物和生物活性材料诸如胶原I和III)一起提供了用于重塑的适当支撑基质。聚合物和生物构造材料的组合还提供了用于添加如上所述的其他生物活性材料的稳固支架，以引起特定的宿主应答，从而增强恢复，使不期望的并发症最小化，并促进进一步的血管形成、重塑和宿主细胞向内生长。此外，该构造可以通过含有已知和期望的组分(以包括使用上述合成组分、蛋白质组分、分子组分或其他组分)来使宿主免疫原性应答最小化，从而使非特异性免疫应答最小化。

相比之下，当前可用的供应物虽然不含细胞材料，但可含有分子部分(外科医生未知)，这可证明对愈合过程有害并触发免疫原性响应或“移植物与宿主响应”。通过控制支架中的组分的组合以提供特定的物理特性和植入物结果，根据本文的各种实施方案的构造消除了免疫原性应答问题，并且将允许标准化患者内和患者间的临床结果。

另外，当前可用的组织供应物可始终具有不一致的表面形貌。在织造、纺丝或针织合成构造的情况下，缺乏适当的微观架构会影响宿主细胞将移植物识别为自身的能力，并促进细胞粘附，从而抑制稳固的再生响应。通过控制支架中的组分的组合以提供特定的物理特性和植入物结果，根据本文的各种实施方案，该构造将始终具有一致的表面形貌以及工程化微观架构(控制微观架构特性，诸如孔隙度、纤维直径、间距、基质高度、纤维取向等)，该工程化微观架构为稳固的伤口愈合、再生、浸润和重塑响应提供了适当的支架。

此外，该构造将例如为其他组织提供缓冲和结构支撑，在乳房、其他器官或其他解剖结构和周围组织内提供补充支撑、保护、增强和覆盖，同时刺激宿主细胞重塑。在例如乳房、其他器官或其他解剖结构和周围组织中存在需要添加材料以获得期望的外科结果的薄弱部或空隙的情况下，该构造将允许例如整形外科医生支撑、修复、提升和增强缺陷。此外，该构造将允许修复乳房、其他器官或其他解剖结构和周围组织内需要添加增强或桥接材料以获得期望的外科结果的筋膜缺陷。

增材制造工艺诸如例如3D打印制造方法允许控制构造的宏观(总体成品形状)和微观(单元格)结构，这将在下文详细讨论。3D生物打印的制造工艺例如允许灵活且准确地产生所有最终产品组织构造构型，而不限制传统的制造限制条件(诸如工具进入)，从而允许最终自由设计所需的复杂单元格几何形状。

概括地说，该构造将最小化供体可用性问题，缓解增加的成本，成为非美国监管限制的可能解决方案，并且消除组织质量、可变性、免疫原性和污染可能性问题。产品的简单性将不会增加手术的额外复杂性。相反，它将无缝替换当前外科技术中的现有技术。随着乳房、器官和组织重建的外科原理不断发展成为新颖的外科平面以及满足独特患者群体和需求的方法，对3D、解剖学上准确的ECM产品的需求从未如此重要。

可以使用多种不同的增材制造技术来制备上文所述的多孔三维细胞外结构或生物支架结构，所述增材制造技术是涉及使用数字3D设计数据通过沉积连续的细胞外材料层来分层构建细胞外构造的工艺。增材制造工艺可以包括例如材料喷射(或喷墨)3D打印、挤出3D打印、熔融沉积3D打印、液态材料3D打印、熔体静电纺纱等。由于包括那些类型的结构的单元格的几何形状和结构元件的复杂性，增材制造工艺在多孔三维细胞外结构(上文所公开)的制造方面提供了优于其他细胞外部件制造技术的一些独特优点。

根据各种实施方案，提供了一种用于生产生物支架结构的方法，例如在图5中通过图8的方法800所示。如图8中所提供，方法800可以包括在步骤810处通过加热喷嘴供应液化聚合物(即，PCL)的料流。在各种实施方案中，液化聚合物由含有一种或多种聚合物组分的溶液或混合物构成。在各种实施方案中，液化聚合物由已被加热超过其熔点至流体状态的聚合物材料构成。方法800还可以包括在步骤820处生成电场以将液化聚合物的料流抽吸到收集器板上。在各种实施方案中，电场通过在供应液化聚合物的喷嘴头(喷丝头)与收集器板之间生成高电位差(电压)而产生。在步骤830中，将多个液化聚合物的料流沉积到收集器板上以形成包括多个连接的单元格的生物支架结构，其中多个单元格中的每个单元格包括连接到内部体积的至少一个开口(如图1a和图1e中所示)。在各种实施方案中，重复步骤810和820，使得将多个液化聚合物的料流连续沉积在彼此的顶部上以形成生物支架结构。在各种实施方案中，所生成的电场的强度(以及因此所施加的电压)随着沉积的每个连续聚合物层和/或随着生物支架结构的厚度而增加。

在步骤840中，将胶原(例如，胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V等)的涂层施加到生物支架上。在各种实施方案中，将所施加的胶原涂层沉积在生物支架结构的外表面(即，外侧表面)和内表面(例如，孔、孔体积表面等)上。

在各种实施方案中，胶原涂层包括胶原I和胶原III。在各种实施方案中，胶原涂层可以含有与人胎儿和青少年真皮内所含的胶原I与胶原III比率相似的胶原I与胶原III比率。常规组织供应物主要取自成年人和老年人供体，含有较高的胶原I与胶原III比率(例如，大于约2.4)，从而比含有较低比率的组织提供降低的支持、缓冲、保护、增强和覆盖。

在各种实施方案中，胶原涂层可以具有介于约0.5至约3.5之间的范围内或介于约0.75至约3.0之间的范围内或介于约0.9至约2.5之间的优选范围内的胶原I与胶原III比率。介于约0.9至约2.5之间的优选胶原I与胶原III比率范围可提供优于常规组织供应物的优点，所述常规组织供应物主要取自成年人和老年人供体，含有高得多的胶原I与胶原III比率，从而比含有较低比率的组织提供降低的支持、缓冲、保护、增强和覆盖。

更具体的胶原I与胶原III比率可以包括约0.5、约0.55、约0.6、约0.65、约0.7、约0.75、约0.8、约0.85、约0.9、约0.95、约1.0、约1.05、约1.1、约1.15、约1.2、约1.25、约1.3、约1.35、约1.4、约1.45、约1.5、约1.55、约1.6、约1.65、约1.7、约1.75、约1.8、约1.85、约1.9、约1.95、约2.0、约2.05、约2.1、约2.15、约2.2、约2.25、约2.3、约2.35、约2.4、约2.45、约2.5、约2.55、约2.6、约2.65、约2.7、约2.75、约2.8、约2.85、约2.9、约2.95、约3.0、约3.05、约3.1、约3.15、约3.2、约3.25、约3.3、约2.35、约3.4、约3.45、约3.5以及这些值中任两者之间的范围。

在各种实施方案中，可以将胶原(例如，胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V等)和/或其他ECM材料与液化聚合物组合以形成生物油墨，可在单个工艺步骤而非连续工艺步骤中沉积所述生物油墨以形成生物支架结构。

在各种实施方案中，可以将胶原和/或ECM材料涂层冻干以使用于产生悬浮液的溶剂升华，从而允许胶原和/或ECM材料涂层粘附到生物支架结构。

在各种实施方案中，可以在施加胶原和/或ECM材料涂层之前用电子束、紫外光或化学试剂(诸如EDAC、碳二亚胺(或者其他物理或化学交联剂))扫描生物支架结构，以便使聚合物交联并增加生物支架结构的结构强度和完整性。

如图5中所示，可以经由喷嘴(喷丝头)520将液化聚合物的料流512沉积到收集器板510上。可以使用加热元件(夹套)540来将固体或半固体聚合物材料550的温度升高超过其熔点至流体状态以形成液化聚合物。可以通过由高电压元件520生成的电场将液化聚合物的料流从喷嘴530抽出。液化聚合物的料流512可以形成由多个单元格结构200构成的单层或多层。可以重复沉积过程以添加另外的层以增加液化聚合物沉积的厚度，直到成品达到期望的厚度。如上所述，成品可以是基本上平面的片材或3D宏观结构。3D宏观结构可以包括例如上文更详细地讨论的“密切”贴合构型和“即用型”实心植入物构型。

根据各种实施方案，提供了一种用于生产生物支架结构的方法，如图6所示并通过图9的方法900所提供。如图9中所提供，方法900可以包括在步骤910处将液化聚合物的小滴沉积到基底表面上以形成包括多个连接的单元格的生物支架结构，其中多个单元格中的每个单元格包括连接到内部体积的至少一个开口。在各种实施方案中，液化聚合物由含有一种或多种聚合物组分的溶液或混合物构成。在各种实施方案中，液化聚合物由已被加热超过其熔点至流体状态的聚合物材料构成。

在各种实施方案中，可以重复步骤910，使得将液化聚合物小滴连续沉积在彼此的顶部上以形成生物支架结构。

方法900还包括在步骤920处将胶原(例如，胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V等)涂层施加到生物支架结构上。在各种实施方案中，将所施加的胶原涂层沉积在生物支架结构的外表面(即，外侧表面)和内表面(例如，孔、孔体积表面等)上。

在各种实施方案中，胶原涂层包括胶原I和胶原III。在各种实施方案中，胶原涂层可以含有与胎儿和青少年真皮内所含的胶原I与胶原III比率相似的胶原I与胶原III比率。当前组织供应物主要取自成年人和老年人供体，含有高得多的胶原I与胶原III比率，从而比含有较低比率的组织提供降低的支持、缓冲、保护、增强和覆盖。

在各种实施方案中，胶原涂层可以具有介于约0.5至约3.5之间的范围内或介于约0.75至约3.0之间的范围内或介于约0.9至约2.5之间的优选范围内的胶原I与胶原III比率。介于约0.9至约2.5之间的优选胶原I与胶原III比率范围可提供优于常规组织供应物的优点，所述常规组织供应物主要取自成年人和老年人供体，含有高得多的胶原I与胶原III比率，从而比含有较低比率的组织提供降低的支持、缓冲、保护、增强和覆盖。

更具体的胶原I与胶原III比率可以包括约0.5、约0.55、约0.6、约0.65、约0.7、约0.75、约0.8、约0.85、约0.9、约0.95、约1.0、约1.05、约1.1、约1.15、约1.2、约1.25、约1.3、约1.35、约1.4、约1.45、约1.5、约1.55、约1.6、约1.65、约1.7、约1.75、约1.8、约1.85、约1.9、约1.95、约2.0、约2.05、约2.1、约2.15、约2.2、约2.25、约2.3、约2.35、约2.4、约2.45、约2.5、约2.55、约2.6、约2.65、约2.7、约2.75、约2.8、约2.85、约2.9、约2.95、约3.0、约3.05、约3.1、约3.15、约3.2、约3.25、约3.3、约2.35、约3.4、约3.45、约3.5以及这些值中任两者之间的范围。

在各种实施方案中，可以将胶原(例如，胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V等)和/或其他ECM材料与液化聚合物组合以形成生物油墨，可在单个工艺步骤而非连续工艺步骤中沉积所述生物油墨以形成生物支架结构。

在各种实施方案中，可以将胶原和/或ECM材料涂层冻干以使用于产生悬浮液的溶剂升华，从而允许胶原和/或ECM材料涂层粘附到生物支架结构。

在各种实施方案中，可以在施加胶原和/或ECM材料涂层之前用电子束、紫外光或化学试剂(诸如EDAC、碳二亚胺(或者其他物理或化学交联剂))扫描生物支架结构，以便使聚合物交联并增加生物支架结构的结构强度和完整性。

在各种实施方案中，多个单元格中的每个单元格的至少一个开口可以具有介于约100微米至约500微米之间的直径。此外，多个单元格中的每个单元格可以包括具有小于或等于约100微米的直径的细丝。多个连接的单元格还可以形成基本上平面的片材。此外，多个连接的单元格可以形成3D宏观结构。3D宏观结构可以包括例如上文更详细地讨论的“密切”贴合构型和“即用型”实心植入物构型。

如图6的步骤(1)所示，可以经由注射器或喷嘴(或任何其他沉积装置)620将液化聚合物小滴610沉积到基底630上。小滴610可以形成单层640。如步骤(2)所示，可以重复沉积过程以添加另外的液化聚合物层以增加液化聚合物沉积的厚度，直到成品650达到期望的厚度，如步骤(3)中所提供。液化聚合物小滴可以形成由多个单元格结构构成的单层或多层。如上所述，成品可以是基本上平面的片材或3D宏观结构。3D宏观结构可以包括例如上文更详细地讨论的“密切”贴合构型和“即用型”实心植入物构型。

生物支架结构的每个单元格可以包含具有胶原涂层的聚合物。聚合物可以为聚己内酯。沉积的组合物可以为聚合物的浆液形式，其中胶原I/胶原III嵌入、混合或包封有聚合物。另选地，可以单独沉积胶原I/胶原III小滴和液化聚合物小滴，然后将它们交织以形成结构。例如，沉积可以例如通过使用诸如喷嘴或注射器的部件的生物打印机来进行。这些部件可以是例如气动、活塞或螺杆驱动的。气动驱动的注射器例如可以将液化聚合物沉积在顺序层中以产生最终将被交联的构造。可以将生物活性分子(例如，基于胶原I/胶原III的生物墨水与如上所述的任何其他附加生物活性组分)与基础聚合物一起共打印，或顺序地层叠在基础聚合物层上。

与传统的基于聚合物的组合物(其可以经由增材制造技术在加热条件和相对较高的压力下沉积以促进支架形成，同时仍保持基于聚合物的组合物的结构稳定性)相比，除了包含聚合物之外还含有生物活性分子的某些生物油墨可能必须在相对于基于聚合物的组合物更温和的条件下沉积。这可能是由于生物油墨结构具有相对更精细的性质(例如，更高的水含量、非结晶结构等)。因此，在降低一些生物油墨上的剪切应力时可以考虑生物打印工艺参数诸如打印压力或喷嘴/注射器直径，以防止产生可能影响生物油墨中的细胞活力的受损或裂解细胞。可考虑并相应地控制的其他参数包括例如打印温度(例如，比基于聚合物的组合物更低的温度)、构成单元格的细丝的直径均匀性、细丝相互作用时的角度、细丝相交在一起时的渗色以及在打印之后但在与基于聚合物的组合物交联之前形状保真性的保持。因此，并且根据各种实施方案，可以单独利用单独定义的工艺参数以小滴或料流(参见下文更多细节)来沉积聚合物和生物活性分子(例如，胶原I/胶原III和如上所述的任何其他附加生物活性组分)，以确保支架制造，同时保持每种相应的沉积组合物的结构完整性。可以如上所述单独发生聚合物和生物活性分子(例如，胶原I/胶原III和如上所述的任何其他附加生物活性组分)的沉积，然后使它们交织或交联以形成支架。为了实现这一点，可以将生物活性分子与基础聚合物一起共打印，或顺序地层叠在基础聚合物层上。

根据各种实施方案，提供了一种用于生产生物支架结构的方法，如图7所示并通过图10的方法1000所提供。如图10所提供，方法1000可以包括在步骤1010处将液化聚合物的料流施加到基底上以形成包括多个连接的单元格的生物支架结构，其中多个单元格中的每个单元格包括连接到内部体积的至少一个开口。在各种实施方案中，液化聚合物由含有一种或多种聚合物组分的溶液或混合物构成。在各种实施方案中，液化聚合物由已被加热超过其熔点至流体状态的聚合物材料构成。

在各种实施方案中，可以重复步骤1010，使得将液化聚合物的料流连续沉积在彼此的顶部上以形成生物支架结构。

方法1000还包括在步骤1020处将胶原(例如，胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V等)涂层施加到生物支架结构上。在各种实施方案中，将所施加的胶原涂层沉积在生物支架结构的外表面(即，外侧表面)和内表面(例如，孔、孔体积表面等)上。

在各种实施方案中，胶原涂层包括胶原I和胶原III。在各种实施方案中，胶原涂层可以含有与胎儿和青少年真皮内所含的胶原I与胶原III比率相似的胶原I与胶原III比率。常规组织供应物主要取自成年人和老年人供体，含有较高的胶原I与胶原III比率(例如，大于约2.4)，从而比含有较低比率的组织提供降低的支持、缓冲、保护、增强和覆盖。

在各种实施方案中，胶原涂层可以具有介于约0.5至约3.5之间的范围内或介于约0.75至约3.0之间的范围内或介于约0.9至约2.5之间的优选范围内的胶原I与胶原III比率。介于约0.9至约2.5之间的优选胶原I与胶原III比率范围可提供优于常规组织供应物的优点，所述常规组织供应物主要取自成年人和老年人供体，含有高得多的胶原I与胶原III比率，从而比含有较低比率的组织提供降低的支持、缓冲、保护、增强和覆盖。

更具体的胶原I与胶原III比率可以包括约0.5、约0.55、约0.6、约0.65、约0.7、约0.75、约0.8、约0.85、约0.9、约0.95、约1.0、约1.05、约1.1、约1.15、约1.2、约1.25、约1.3、约1.35、约1.4、约1.45、约1.5、约1.55、约1.6、约1.65、约1.7、约1.75、约1.8、约1.85、约1.9、约1.95、约2.0、约2.05、约2.1、约2.15、约2.2、约2.25、约2.3、约2.35、约2.4、约2.45、约2.5、约2.55、约2.6、约2.65、约2.7、约2.75、约2.8、约2.85、约2.9、约2.95、约3.0、约3.05、约3.1、约3.15、约3.2、约3.25、约3.3、约2.35、约3.4、约3.45、约3.5以及这些值中任两者之间的范围。

在各种实施方案中，可以将胶原(例如，胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V等)和/或其他ECM材料与液化聚合物组合以形成生物油墨，可在单个工艺步骤而非连续工艺步骤中沉积所述生物油墨以形成生物支架结构。

在各种实施方案中，可以将胶原和/或ECM材料涂层冻干以使用于产生悬浮液的溶剂升华，从而允许胶原和/或ECM材料涂层粘附到生物支架结构。

在各种实施方案中，可以在施加胶原和/或ECM材料涂层之前用电子束、紫外光或化学试剂(诸如EDAC、碳二亚胺(或者其他物理或化学交联剂))扫描生物支架结构，以便使聚合物交联并增加生物支架结构的结构强度和完整性。

在各种实施方案中，多个单元格中的每个单元格的至少一个开口可以具有介于约100微米至约500微米之间的直径。此外，多个单元格中的每个单元格可以包括具有小于或等于约100微米的直径的细丝。多个连接的单元格还可以形成基本上平面的片材。此外，多个连接的单元格可以形成3D宏观结构。3D宏观结构可以包括例如上文更详细地讨论的“密切”贴合构型和“即用型”实心植入物构型。

如图7中的步骤(1)所示，可以经由注射器或喷嘴(或任何其他料流沉积装置)720将液化聚合物的料流710沉积到基底730上。液化聚合物料流710可以形成单层740。如步骤(2)所示，可以重复沉积过程以添加另外的液化聚合物层以增加液化聚合物沉积的厚度，直到成品750达到期望的厚度，如步骤(3)中所提供。液化聚合物料流可以形成由多个单元格结构构成的单层或多层。如上所述，成品可以是基本上平面的片材或3D宏观结构。

生物支架结构的每个单元格可以包含具有胶原涂层的聚合物。聚合物可以为聚己内酯。沉积的组合物可以为聚合物的浆液形式，其中胶原I/胶原III嵌入、混合或包封有聚合物。另选地，可以单独沉积胶原I/胶原III的涂层和液化聚合物的料流，然后将它们交织以形成结构。例如，沉积可以例如通过使用诸如喷嘴或注射器的部件的生物打印机来进行。这些部件可以是例如气动、活塞或螺杆驱动的。气动驱动的注射器例如可以将液化聚合物沉积在顺序层中以产生最终将被交联的构造。可以将生物活性分子(例如，基于胶原I/胶原III的生物墨水与如上所述的任何其他附加生物活性组分)与基础聚合物一起共打印，或顺序地层叠在基础聚合物层上。

与传统的基于聚合物的组合物(其可以经由增材制造技术在加热条件和相对较高的压力下沉积以促进支架形成，同时仍保持基于聚合物的组合物的结构稳定性)相比，除了含有聚合物之外还含有生物活性分子的某些生物油墨可能必须在相对于基于聚合物的组合物更温和的条件下沉积。这可能是由于生物油墨结构具有相对更精细的性质(例如，更高的水含量、非结晶结构等)。因此，在降低一些生物油墨上的剪切应力时可以考虑生物打印工艺参数诸如打印压力或喷嘴/注射器直径，以防止产生可能影响生物油墨中的细胞活力的受损或裂解细胞。可考虑并相应地控制的其他参数包括例如打印温度(例如，比基于聚合物的组合物更低的温度)、构成单元格的细丝的直径均匀性、细丝相互作用时的角度、细丝相交在一起时的渗色以及在打印之后但在与基于聚合物的组合物交联之前形状保真性的保持。因此，并且根据各种实施方案，可以单独利用单独定义的工艺参数以小滴或料流(参见下文更多细节)来沉积聚合物和生物活性分子(例如，胶原I/胶原III和如上所述的任何其他附加生物活性组分)，以确保支架制造，同时保持每种相应的沉积组合物的结构完整性。可以如上所述单独发生聚合物和生物活性分子(例如，胶原I/胶原III和如上所述的任何其他附加生物活性组分)的沉积，然后使它们交织或交联以形成支架。为了实现这一点，可以将生物活性分子与基础聚合物一起共打印，或顺序地层叠在基础聚合物层上。

根据各种实施方案，可以通过使用生物打印机诸如CELLINK

此外，根据各种实施方案，可以将含有胶原I/胶原III(SIGMA ALDRICH

沉积的股线(纤维或原纤)可以是基本上平行的。可以基本上彼此垂直(即，以光栅图案)沉积相邻股线。可以相对于相邻股线以介于约10度至约90度之间的角度范围沉积每条股线。沉积的股线可以在层上具有随机取向。

根据各种实施方案，沉积多条股线以形成层的步骤还可以包括重复沉积步骤以形成多个聚合物材料层。可以基本上彼此垂直沉积至少一个层的相邻股线。可以相对于相邻股线以介于约10度至约90度之间的角度范围沉积至少一个层的每条股线。至少一个层的股线可以在层上具有随机取向。多个层中的沉积股线可以是基本上平行的。

根据各种实施方案，每个层的股线是基本上平行的。例如，对于三层生物支架结构，第一层的股线是彼此平行的，第二层的股线是彼此平行的，并且第三层的股线是彼此平行的。可以基本上垂直于另一个层的股线沉积至少一个层上的股线。可以基本上垂直于相邻层的股线沉积至少一个层上的股线。可以相对于另一个层的股线以介于约10度至约90度之间的角度范围沉积至少一个层上的股线。可以相对于相邻层的股线以介于约10度至约90度之间的角度范围沉积至少一个层上的股线。每个层的股线可以具有随机沉积角度。随机沉积角度可以具有介于约10至约90度之间的角度范围。

已经发现，通过控制上述生物支架结构的特定特性的变化，并且测试细胞对这些生物支架微几何形状的应答，可以允许确定用于优化参数诸如细胞浸润、细胞附接、细胞存活、细胞命运和细胞再生/重塑(上文详细讨论)的理想几何形状。这些特性包括孔尺寸(例如，通过改变打印细丝之间的距离)、孔形状(例如，通过改变细丝彼此垂直打印的取向程度，或改变所使用的基础单元格几何形状)、细丝尺寸(例如，通过改变用来打印细丝的针/注射器/喷嘴的规格)、细丝的弹性模量(例如，通过用各种聚合物、聚合物组合、聚合物类型(诸如合成的和天然的)进行打印)、生物支架结构的厚度(例如，通过打印不同顺序层的构造或层数)和纤维的布置(例如，通过打印纤维的随机布置以及相对于有组织的和重复的结构)。

确定构造的有效性(由微几何结构提供的最佳微环境的适当性)的测试包括例如体外细胞迁移测定、体外细胞附接(染色和蛋白质印迹)、体外细胞存活和增殖测定(增殖细胞核抗原、碘化丙啶)、体外细胞命运分析(波形蛋白、α平滑肌肌动蛋白)以及响应于对构造的培养进行的体外胶原合成(羟脯氨酸测定，Sirius红/FCF绿)。

尽管在本说明书中已经描述了具体实施方案，但这些实施方案和应用仅是示例性的，并且许多变型是可能的。应当理解，虽然详细描述了元件、部件和工艺操作次序(即，方法步骤)的具体组合，但这些示例并非旨在进行限制，并且对于本领域的普通技术人员而言显而易见的所有此类变型和修改旨在落入本公开的范围内。例如，尽管将上文所公开的制造工艺描述为顺序的工艺操作次序，但每个工艺操作可以以任何次序发生，这取决于制造工艺的具体要求。