一种从山芹中提取芹菜素的方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种从山芹中提取芹菜素的方法及其应用。

背景技术

山芹为伞形科、山芹属的多年生草本植物，山芹既有药用价值，又有食用价值。山芹有主治风湿痹痛、腰膝酸痛、感冒头痛、痈疮肿痛等功效。山芹是芹菜中的高级珍菜。山芹菜其营养成份在野菜中也是较高的，山芹幼苗可做春季野菜。其营养功效为：(1)芹菜含铁量较高，能补充妇女经血的损失，食之能避免皮肤苍白、干燥、面色无华，而且可使目光有神，头发黑亮。(2)芹菜是高纤维食物，它经肠内消化作用产生一种木质素或肠内脂的物质，这类物质是一种抗氧化剂，高浓度时可抑制肠内细菌产生的致癌物质。它还可以加快粪便在肠内的运转时间；减少致癌物与结肠粘膜的接触达到预防结肠癌的目的。

芹菜素(apigenin)，又称芹黄素、洋芹素，系统名为4',5,7-三羟基黄酮，英文名Apigenin，CAS号：520-36-5，是一种黄酮类化合物，在自然界广泛分布。主要存在于瑞香科、马鞭草科、卷柏科植物中，广泛分布于温热带的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量为高。结构式如下：

芹菜素具有清除自由基，提高自身免疫力，抗氧化、抗高血糖、高血压，抗炎、提高自身免疫，抗动脉粥样硬化，抑制癌细胞的功效。然而，现有技术中提取芹菜素的方法较少，且提取过程中的收率和纯度有待进一步提高。

中国专利申请CN104876901A公开了一种从芹菜中制取芹菜素的方法，具体步骤为：乙醇回流提取；水解，过滤；重结晶；离心；干燥；粉碎过筛，得芹菜素成品。该制备方法路线简单，原料便宜。从来源丰富的芹菜中制取。成本低，易于操作。但是该专利申请中芹菜素的收率和纯度有待进一步提高。

中国专利申请CN110551092A公开了一种芹菜素的提取方法，包括如下步骤：将芹菜干燥粉碎，过40目筛；向上述原料中加入非离子表面活性剂的多元醇混合体系，采用频率为60KHz的超声波进行萃取，过滤，滤液浓缩至无醇味；将所得浓缩液经DF01型大孔吸附树脂上柱、4～6倍柱体积的60～70％的氯仿洗脱，收集洗脱液，浓缩；回收试剂，得白色粉末即为芹菜素。本发明的提取方法简单易行，收率高，不需要大量的有机溶剂，安全无毒，适用于工业化生产。但是该专利申请中芹菜素的纯度较低。

尿酸是鸟类和爬行类的主要代谢产物，化学式是C

正常情况下，体内的尿酸大约有1200毫克，每天新生成约600毫克，同时排泄掉600毫克，处于平衡的状态。但如果体内产生过多来不及排泄或者尿酸排泄机制退化，则体内尿酸滞留过多，当血液尿酸浓度大于7毫克/分升，导致人体体液变酸，影响人体细胞的正常功能，长期置之不理将会引发痛风。另外，过于疲劳或是休息不足也可导致代谢相对迟缓进而导致痛风发病。

血中尿酸全部从肾小球滤过，正常人体内尿酸的生成与排泄速度基本恒定。体液中尿酸含量变化可以充分反映出人体内代谢、免疫等机能的状况。尿酸的积聚主要有四个原因：第一是过量食用高嘌呤的食物；第二是体内嘌呤代谢出现问题；第三是排泄量过少；第四是尿酸无法正常排泄。

现有技术中并未公开将山芹素用于降尿酸的报道。

因此，利用开发一种能解决上述技术问题的从山芹中提取芹菜素的方法及其应用是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种收率、纯度较高的从山芹中提取芹菜素的方法，且将山芹素与其它有效成分组合使用，降尿酸的效果显著。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种从山芹中提取芹菜素的方法，包括如下步骤：

(1)将山芹干燥后粉碎，加入溶剂A进行提取，将提取液进行浓缩，得到物质A；

(2)将物质A用溶剂B进行萃取，将萃取后的溶剂B层干燥，得到粗品；

(3)将粗品用溶剂C溶解，采用大孔吸附树脂进行吸附，采用溶剂D进行洗脱，得到洗脱液；

(4)将洗脱液进行浓缩结晶，即得。

优选地，步骤(1)中所述溶剂A为乙二醇、异丙醇与水的混合溶剂，三者体积比为2-4:1:1-3。

优选地，步骤(1)中所述溶剂A与山芹的液料比为5-10mL/g。

优选地，步骤(1)中所述提取的温度为30-40℃，提取的时间为1-2h。

优选地，步骤(1)中在山芹加入溶剂A的同时进行酶解。

更优选地，所述酶解采用的酶为木聚糖酶和葡萄糖苷酶中的至少一种。

更优选地，步骤(1)中在山芹加入溶剂A的同时，先加入3-8％木聚糖酶酶解10-25min，再加入5-10％葡萄糖苷酶。木聚糖酶和葡萄糖苷酶的用量百分比均为两种酶在溶剂A中的质量百分比。

更优选地，步骤(1)包括如下步骤：

将山芹干燥后粉碎，加入5-10倍量的溶剂A进行提取，同时加入3-8％木聚糖酶酶解10-25min，再加入5-10％葡萄糖苷酶，所述溶剂A为乙二醇、异丙醇与水的混合溶剂，三者体积比为2-4:1:1-3，提取的温度为30-40℃，提取的总时间为1-2h，将提取液浓缩至原体积的1/5-1/8，得到物质A。

优选地，步骤(2)中所述溶剂B为石油醚、氯仿和乙酸乙酯中的至少一种。

更优选地，步骤(2)中先后依次加入石油醚、氯仿和乙酸乙酯进行萃取，收集氯仿和乙酸乙酯的萃取层，分别进行干燥，合并后得到粗品。

更优选地，步骤(2)包括如下步骤：

将物质A先后依次加入等体积的石油醚、氯仿和乙酸乙酯进行萃取，收集氯仿和乙酸乙酯的萃取层，分别进行干燥，合并后得到粗品。

优选地，步骤(3)中所述溶剂C为30-90％乙醇。

优选地，步骤(3)中所述大孔吸附树脂为D101大孔吸附树脂。

优选地，步骤(3)中所述溶剂D为氯仿和甲醇的混合溶剂，两者体积比为1-3:1。

更优选地，步骤(3)包括如下步骤：

将粗品用30-90％乙醇溶解，采用D101大孔吸附树脂进行吸附，采用溶剂D进行洗脱，所述溶剂D为氯仿和甲醇的混合溶剂，两者体积比为1-3:1，得到洗脱液。

更优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)将山芹干燥后粉碎，加入5-10倍量的溶剂A进行提取，同时加入3-8％木聚糖酶酶解10-25min，再加入5-10％葡萄糖苷酶，所述溶剂A为乙二醇、异丙醇与水的混合溶剂，三者体积比为2-4:1:1-3，提取的温度为30-40℃，提取的总时间为1-2h，将提取液浓缩至原体积的1/8-1/5，得到物质A；

(2)将物质A先后依次加入等体积的石油醚、氯仿和乙酸乙酯进行萃取，收集氯仿和乙酸乙酯的萃取层，分别进行干燥，合并后得到粗品；

(3)将粗品用30-90％乙醇溶解，采用D101大孔吸附树脂进行吸附，采用溶剂D进行洗脱，所述溶剂D为氯仿和甲醇的混合溶剂，两者体积比为1-3:1，得到洗脱液；

(4)将洗脱液加热、浓缩，冷却后结晶、干燥，即得。

本发明还涉及一种组合物，包括上述的方法制备得到的芹菜素。

优选地，所述组合物，按照重量份数计，包括如下组分：20-35份芹菜素、15-20份儿茶素、0.5-2份叶酸和5-10份二氢欧山芹素。

本发明还涉及上述的组合物在制备降尿酸的药物中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明优化了溶剂A的组成，使得芹菜素尽可能多的提取出来，尤其是添加了酶解工序并优化了其具体酶解工艺，制备得到的芹菜素收率更高。

本发明优化了溶剂B的组成和萃取顺序，提高了芹菜素的收率和纯度。

本发明优化了溶剂D的组成，进一步提高了芹菜素的收率和纯度。

本发明的组合物，各组分之间协同作用，降尿酸的效果显著提高。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一种从山芹中提取芹菜素的方法，包括如下步骤：

(1)将山芹干燥后粉碎，加入5倍量的溶剂A进行提取，同时加入3％木聚糖酶酶解10min，再加入5％葡萄糖苷酶，所述溶剂A为乙二醇、异丙醇与水的混合溶剂，三者体积比为2:1:1，提取的温度为30℃，提取的总时间为1h，将提取液浓缩至原体积的1/5，得到物质A；

(2)将物质A先后依次加入等体积的石油醚、氯仿和乙酸乙酯进行萃取，收集氯仿和乙酸乙酯的萃取层，分别进行干燥，合并后得到粗品；

(3)将粗品用3倍量的30％乙醇溶解，采用D101大孔吸附树脂进行吸附，采用溶剂D进行洗脱，所述溶剂D为氯仿和甲醇的混合溶剂，两者体积比为1:1，得到洗脱液；

(4)将洗脱液加热、浓缩，冷却后结晶、干燥，即得。

实施例2

一种从山芹中提取芹菜素的方法，包括如下步骤：

(1)将山芹干燥后粉碎，加入10倍量的溶剂A进行提取，同时加入8％木聚糖酶酶解25min，再加入10％葡萄糖苷酶，所述溶剂A为乙二醇、异丙醇与水的混合溶剂，三者体积比为4:1:3，提取的温度为40℃，提取的总时间为2h，将提取液浓缩至原体积的1/8，得到物质A；

(2)将物质A先后依次加入等体积的石油醚、氯仿和乙酸乙酯进行萃取，收集氯仿和乙酸乙酯的萃取层，分别进行干燥，合并后得到粗品；

(3)将粗品用5倍量的90％乙醇溶解，采用D101大孔吸附树脂进行吸附，采用溶剂D进行洗脱，所述溶剂D为氯仿和甲醇的混合溶剂，两者体积比为3:1，得到洗脱液；

(4)将洗脱液加热、浓缩，冷却后结晶、干燥，即得。

实施例3

一种从山芹中提取芹菜素的方法，包括如下步骤：

(1)将山芹干燥后粉碎，加入8倍量的溶剂A进行提取，同时加入5％木聚糖酶酶解15min，再加入7％葡萄糖苷酶，所述溶剂A为乙二醇、异丙醇与水的混合溶剂，三者体积比为3:1:2，提取的温度为35℃，提取的总时间为1.5h，将提取液浓缩至原体积的1/6，得到物质A；

(2)将物质A先后依次加入等体积的石油醚、氯仿和乙酸乙酯进行萃取，收集氯仿和乙酸乙酯的萃取层，分别进行干燥，合并后得到粗品；

(3)将粗品用4倍量的60％乙醇溶解，采用D101大孔吸附树脂进行吸附，采用溶剂D进行洗脱，所述溶剂D为氯仿和甲醇的混合溶剂，两者体积比为2:1，得到洗脱液；

(4)将洗脱液加热、浓缩，冷却后结晶、干燥，即得。

实施例3-1

与实施例3的区别仅在于将步骤(1)中的木聚糖酶替换为等量的果胶酶，其余条件均相同。

实施例3-2

与实施例3的区别仅在于将步骤(1)中的木聚糖酶和葡萄糖苷酶同时添加，其余条件均相同，具体如下：

(1)将山芹干燥后粉碎，加入8倍量的溶剂A进行提取，同时加入5％木聚糖酶和7％葡萄糖苷酶，所述溶剂A为乙二醇、异丙醇与水的混合溶剂，三者体积比为3:1:2，提取的温度为35℃，提取的总时间为1.5h，将提取液浓缩至原体积的1/6，得到物质A。

实施例3-3

与实施例3的区别仅在于将步骤(1)中的溶剂A的组成不同，将溶剂A替换为等体积的70％乙醇溶液，其余条件均相同。

实施例3-4

与实施例3的区别仅在于将步骤(1)中的溶剂A的组成不同，所述溶剂A为乙二醇、异丙醇与水的混合溶剂，三者体积比为2:3:1，其余条件均相同。

实施例3-5

与实施例3的区别仅在于步骤(3)中的溶剂D的组成不同，所述溶剂D为氯仿和甲醇的混合溶剂，两者体积比为1:2，其余条件均相同。

实施例4

一种组合物，按照重量份数计，包括如下组分：20份芹菜素(实施例3制备得到)、15份儿茶素、0.5份叶酸和5份二氢欧山芹素。

组合物中的各组分混合均匀即可。

实施例5

一种组合物，按照重量份数计，包括如下组分：35份芹菜素(实施例3制备得到)、20份儿茶素、2份叶酸和10份二氢欧山芹素。

组合物中的各组分混合均匀即可。

实施例6

一种组合物，按照重量份数计，包括如下组分：28份芹菜素(实施例3制备得到)、16份儿茶素、1份叶酸和7份二氢欧山芹素。

组合物中的各组分混合均匀即可。

实施例6-1

与实施例6的区别仅在于各组分的用量配比不同，其余条件均相同，具体如下：

一种组合物，按照重量份数计，包括如下组分：17份芹菜素(实施例3制备得到)、12份儿茶素、3份叶酸和20份二氢欧山芹素。

实施例6-2

与实施例6的区别仅在于将二氢欧山芹素替换为等量的山芹素，其余条件均相同，具体如下：

一种组合物，按照重量份数计，包括如下组分：35份芹菜素(实施例3制备得到)、16份儿茶素和1份叶酸。

实施例6-3

与实施例6的区别仅在于将山芹素替换为等量的二氢欧山芹素，其余条件均相同，具体如下：

一种组合物，按照重量份数计，包括如下组分：35份二氢欧山芹素、16份儿茶素和1份叶酸。

测试例1

实施例1-3制备得到的山芹素的得率和纯度测试，结果如表1所示。

表1山芹素的得率和纯度测试

测试例2

实施例4-6制备得到的组合物降尿酸效果测试。

将雄性昆明小鼠分为空白对照组(8只)和高尿酸血症组，其中高尿酸血症组采用腹腔注射氧嗪酸钾盐法造模，300mg/kg剂量一次性腹腔注射给药，造模成功后随机分为模型组(8只)和实验组，实验组分别灌胃实施例4-6制备得到的组合物(每个实施例8只)，剂量180mg/kg，每天灌胃1次，灌胃7天，空白对照组和模型组给予等体积的生理盐水。观察各组小鼠血尿酸和黄嘌呤氧化酶活性(血尿酸和黄嘌呤氧化酶活性测试具体参照曹瑞竹,张三印,代勇,等.秦皮总香豆素降低小鼠急性高尿酸血症血尿酸水平及机理研究[J].辽宁中医杂志,2010(02):362-363.)，结果如表2所示。

表2小鼠血尿酸和黄嘌呤氧化酶活性测试结果

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。