作为工程化活体材料的可编程和可打印的生物膜

引言

细菌生物膜、骨骼组织和其它天然生物系统是活体和非活体组分的多功能和环境响应性集合

生物膜由各种表面上的细菌经由粘着的和保护性细胞外基质的合成和分泌而形成，所述细胞外基质帮助其耐受严苛的或低营养的环境

尽管有这些重要的进步，但是在淀粉样蛋白纤维可以在活体功能材料的设计中常规和可靠地使用之前，必须克服多个技术挑战。在工程化的生物膜研究中，已知的问题包括细菌输出机制不能分泌大蛋白(例如，大肠杆菌淀粉样蛋白纤维系统(curli system)局限于分泌含有59个氨基酸的短肽或蛋白质结构域)

发明概述

细菌生物膜可以被编程以产生具有自愈和可进化功能性的活体材料。然而，人造生物膜的广泛使用已经受到可加工性和功能性蛋白质分泌能力的限制。我们描述了基于细菌枯草芽孢杆菌的TasA淀粉样蛋白机制的非常灵活的和可调的活体功能材料平台。我们证明包含不同功能性蛋白或结构域的可基因编程的TasA融合蛋白可以被分泌并且可以组装成具有可调的生理化学性质的不同细胞外纳米结构。我们的工程化的生物膜具有水凝胶的粘弹性能，并且可以使用3D打印和微囊化技术将其精确地制成具有多种三维(3D)形状的微结构。值得注意的是，这些持久且对环境有响应的制造的活体材料保持有活力、自我再生和功能性。这种新的可调平台为应用于生物材料、生物技术和生物医学的各种活体功能材料提供了以前无法获得的性质。

本发明提供了用于生产作为工程化活体材料的可编程且可打印的生物膜的方法和组合物。一方面，本发明提供了预定几何形状的三维、活体、自我再生的结构，其包含固化的打印材料，所述固化的打印材料包含枯草芽孢杆菌的生物膜，所述枯草芽孢杆菌的生物膜包含TasA-R蛋白，其中R是重组的异源官能团，其中所述TasA-R提供优选的可调的生理化学性质，如作为R基团的函数的粘度、反应性、亲和力。

在实施方案中：

-所述R基团包含His标签，并且所述TasA-R蛋白任选地与金纳米颗粒复合；

-几何形状的分辨率为50-250um，优选100-200um；和/或

-将所述结构包封在水凝胶或微凝胶中。

另一方面，本发明提供一种制造所公开的结构的方法，其包括打印所述结构。

本发明的另一个方面，本发明提供了一种复制所公开的结构的方法，其包括使所述结构与包含生长培养基的基质接触，其中所述结构的枯草芽孢杆菌生长形成复制结构。

本发明包括所列举的具体实施方案的所有组合，就好像每个组合都被着力地列举。

附图简述

图1a-c：用于可编程和可打印的枯草芽孢杆菌生物膜生产平台的设计。(A)基于枯草芽孢杆菌的TasA淀粉样蛋白输出机制的可编程活体生物膜平台的示意图；(b)使用3D打印技术的可打印的活体生物膜的示意图。活体枯草芽孢杆菌生物膜表现出粘弹性质，使其适合于3D打印；(c)显示当被捕获在水凝胶或微囊中时，活体枯草芽孢杆菌生物膜保持它们的天然活力和各种细胞能力，诸如自我再生的示意图。

图2：将TasA-HisTag生物膜和无机NP 3D复合打印成各种图案。打印的复合结构在正常(上)和UV光(下)下拍摄的数码照片。数字1、2和3是指具有以下类型的固定化量子点(QD)的TasA-HisTag生物膜：(1)蓝色CdZnS@ZnS QD，(2)绿色CdZnSeS@ZnS QD，和(3)红色Co-NTA CdSeS@ZnS QD，最大发射峰值波长分别在464、496和627nm。标尺：5mm。

图3a-e：使用3D打印和微囊化技术的水凝胶捕获的枯草芽孢杆菌生物膜的自我再生、生物制造、长期活力和功能性能。(a)工程化的枯草芽孢杆菌生物膜在载玻片上3D打印成图案化结构，在琼脂平板上对图案化生物膜连续两代的自我再生：动画显示3D打印和自我再生过程。(b)对于自我再生实验，将3D打印的样品倒置放置在琼脂平板上。从左至右：载玻片上的打印图案，生物膜在第一富营养琼脂平板上以六边形图案再生长，并且生物膜仍在第二富营养琼脂平板上以初始六边形图案生长(右)。(c)比较最初生长和自我再生的生物膜的储能模量(G')和损耗模量(G”)。(d-e)生物制造的生物膜的功能性能：(d)在含有5％w/v明胶和2％w/v藻酸钠的混合水凝胶内捕获的或(e)在藻酸盐-聚(L-赖氨酸)-藻酸盐(APA)微囊内微囊化的。当浸入含有IPTG的溶液中时，在这两种情况下，捕获的生物膜在整个5天的培养期间发射红色荧光(中间图)。在藻酸盐水凝胶微球中包封生物膜是基于微囊化技术

图4a-g：通过3D打印技术得到的打印生物膜和复合生物膜/QD结构。显示打印在(a)玻璃、(b)PV板和(c)明胶水凝胶上的生物膜的数码相机图像。显示(d)正常和(e-g)350nm UV光下打印的复合生物膜/QD结构的数码相机图像。d-g中的数字1、2和3是指具有以下类型的固定化量子点(QD)的TasA-HisTag生物膜：(1)蓝色CdZnS@ZnS QD，(2)绿色CdZnSeS@ZnS QD，和(3)红色Co-NTA CdSeS@ZnS QD，最大发射峰值波长分别在464nm、496nm和627nm。标尺：5mm。

发明的具体实施方式的说明

本文的实施方案和实施例仅通过说明的方式而非限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本上相似的结果的各种非关键参数。

应理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据其的各种修改或变化将被提示给本领域技术人员，并且将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的通过引用整体在此并入。

用于可编程枯草芽孢杆菌生物膜生产平台的设计

我们使用了基因工程和生物制造方法的组合来操作由枯草芽孢杆菌产生的生物膜，枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性、好氧、形成内生孢子的细菌，“通常被认为是安全的(GRAS)”。我们开发了具有若干实际应用的非常灵活和可调的活体功能材料平台(图1a-c)。具体来说，我们利用枯草芽孢杆菌的TasA淀粉样蛋白机制，开发了具有多种结构域组合的可基因编程的TasA融合蛋白，为细胞生物学、酶学和其他应用提供了多种功能。这些融合蛋白可以被分泌并且可以在活细胞周围自组装成具有可调的生理化学性质(例如，粘弹性)的不同细胞外纳米架构(图1a)并且还可以在空间方面灵活地配置(例如，活体生物膜的3D打印)(图1b)。在化学诱导剂的存在下，枯草芽孢杆菌细胞表达合理设计的包含致淀粉样蛋白产生的TasA结构域(蓝色)和可调功能结构域(绿色)的TasA融合蛋白。在分泌时，融合蛋白自组装成与细胞表面紧密相关的细胞外纤维网络，产生具有可调非天然功能性质的可编程生物膜。重要的是，在保持它们的天然活力和像自我再生的各种细胞能力的同时，这些构建的活体材料还可以被设计为表现出非天然功能，所述非天然功能取决于所掺入的功能结构域，包括改变的酶活性、红色荧光和用于无机纳米颗粒(NP)模板化组装的能力。

在一系列越来越复杂的概念验证的证明中，我们将这些工程化的生物膜配置在荧光检测、缀合化学、单底物生物修复以及掺入NP的多反应生物修复级联中。我们还开发了我们的工程化生物膜的固有粘弹性质，并且制造了明确限定的“活体形状”，然后使用3D打印和微囊化技术将这些材料截留在水凝胶和微凝胶中(图1c)。最后，由于这些细菌生物膜由活体细胞以明确限定的几何形状组成，所以我们评估了它们的自我再生能力、储存和长期活力。我们的研究证明，我们已经构建了可编程和可打印的活体功能材料平台，其提供了在纳米制造、生物催化、生物医学和其它技术领域中的应用。

与大肠杆菌或其他革兰氏阴性菌不同，枯草芽孢杆菌仅具有一个外膜，该特征长期使得该细菌普遍用于以工业规模生产分泌酶和其它蛋白质

我们将我们的工程化努力集中在TasA上，因为这种淀粉样蛋白家族蛋白在不破坏其自组装能力的情况下对化学加工和功能化具有高度耐受性是众所周知的

与我们的设计一致，生物膜缺陷型菌株枯草芽孢杆菌2569ΔtasAΔsinRΔeps(ΔtasAΔsinRΔeps)不产生胞外TasA纤维，但在IPTG诱导后含有用于TasA-R变体(例如，TasA-mCherry)的外源表达质粒pHT01的ΔtasAΔsinRΔeps细胞恢复了淀粉样蛋白纤维的产生。通过透射电子显微术(TEM)证实了淀粉样蛋白的产生，其显示免疫金标记的抗-TasA抗体可以特异性结合至TasA-R纤维网络。用标准结晶紫(CV)测定进一步证实了生物膜产生，其中与其没有IPTG诱导的对照相比，IPTG的存在增加了每种TasA-R变体的生物质。此外，我们还基于TEM成像比较了不同官能化的纳米纤维(以TasA-HisTag、TasA-mefp5和TasA-OPH为代表)的形态和直径，发现不同类型的纳米纤维的直径有明显的趋势：纳米纤维的直径随着单体融合结构域尺寸的增加而增加；顺序：TasA-OPH(18.7±2.3nm)>TasA-mefp5(15.7±2.0nm)>TasA-HisTag(13.6±1.6nm)。

枯草芽孢杆菌生物膜的工程化功能的功能表征

我们接下来评估含有分泌的TasA-R纳米纤维的生物膜是否由于其各种工程化的融合结构域而具有新的功能性质。

我们从与mCherry蛋白融合的TasA-R变体(TasA-mCherry)开始，发现在IPTG诱导后，表达TasA-mCherry纳米纤维的生物膜显示红色荧光，证实mCherry在由我们的平台产生的生物膜中表达时保持其功能。我们接着产生了TasA-R变体，其使用SpyTag(TasA-SpyTag)和SpyCatcher蛋白结合伙伴

为了进一步探索我们的可编程生物膜平台的能力，我们设计了产生细胞外TasA-MHET酶纳米纤维的菌株。MHET酶—一种将有毒的工业化合物MHET(单(2-羟乙基)对苯二甲酸)降解为低毒性的TPA(对苯二甲酸)的酶，在此特意被选择为测试物，不仅因为其实际使用，而且因为其非常大(603个氨基酸)

已经证明了单一酶应用，我们接下来测试我们的可编程生物膜平台是否可以用于多步反应(即生物催化级联反应)以将有机磷酸酯杀虫剂降解为无害化学物。我们选择两步级联反应，由以下组成：1)有机磷酸酯水解酶(OPH)催化的杀虫剂对氧磷(PAR)降解为危害较小的中间产物对硝基苯酚(PNP)，以及2)由HisTag固定化的金纳米颗粒(AuNP)催化的反应，其中PNP被进一步降解为无害的对氨基苯酚(PAP)。TasA-HisTag纳米纤维利用His-金属配位化学促进AuNP的组装。

因此我们改造了分别表达和组装功能性TasA-OPH和TasA-HisTag纳米纤维的两种单独的菌株。我们首先证实了仅含有TasA-OPH纳米纤维的生物膜可以有效地催化PAR至PNP的反应，并且在AuNP和NaBH

利用TEM成像对该共培养的混合反应体系的生物膜中的纤维网络的复杂和不均匀特征进行了评估，其证实了AuNP特异性地结合至TasA-HisTag纳米纤维，而不是结合至TasA-OPH纳米纤维。纳米纤维上固定的AuNP避免了NP与细菌的直接接触，防止了游离NP造成的对细胞的潜在损伤

活体功能材料的粘弹性质和生物制造

已经证明我们的平台可以用于制备能够进行复杂的多步骤化学的多菌株生物膜，我们接下来探索我们是否可以精细地操作生物膜几何形状。精确控制复杂化学反应的物理环境的能力将在纳米制造和材料应用中具有明显的实用性

我们接下来转向使用3D打印技术将生物膜制成限定的几何形状。当我们使用野生型和TasA-HisTag生物膜以相同的打印条件(喷嘴直径设定为160μm)打印规则的五边形时，野生型的线在其沉积时扩展到500μm，而TasA-HisTag生物膜具有所需的宽度(160μm)。采用其他工程化生物膜，诸如TasA-mefp5和TasA-OPH生物膜发现了类似的趋势，它们均表现出比野生型生物膜更好的可打印性。详细的流变学测量和粘弹性网络的储能模量(G’，表示弹性变形)、损耗模量(G”，表示粘性变形)以及瞬时回复能力的比较表明，工程化生物膜的相对低的粘弹性使得它们比野生型生物膜更适合打印。具体地，当两个水凝胶样生物膜的内部网络结构在它们被挤出之前暴露于打印机腔中的极高压力下时，它们经受了类似的压缩；然而，两种生物膜的不同粘弹性质将谨慎地响应该压力：鉴于野生型生物膜的粘弹性网络的更高的储能模量和更强的瞬时回复能力，可以预期野生型生物膜具有比工程化TasA生物膜更好的可逆变形性(形状恢复)，并且因此将在其被挤出时表现出“扩展的”线特征。此外，在野生型生物膜中富含EPS多糖组分也可以有助于观察到的“扩展的”线特征，因为它们可以促进水分吸收

我们接下通过使用几种类型的无机NP来探索我们的工程化枯草芽孢杆菌生物膜的可控的几何形状和功能性。具体地，将含有具有不同固定量子点(QD)的TasA-HisTag纳米纤维的枯草芽孢杆菌生物膜用作构建材料，以采用3D打印技术制作明确限定的形状。我们通过向TasA-HisTag纳米纤维生物膜添加蓝色(CdZnS@ZnS)、红色(CdSeS@ZnS)和绿色(CdZnSeS@ZnS)QD来制备三种颜色的构建材料。当打印成不同的3D结构，诸如多边形和字母时，这些单元/无机混合材料在UV光(350nm)下是蓝色、红色和绿色的(图2；图4a-g)。通过共聚焦荧光显微术和荧光光谱法对这些材料的荧光性质进行了确认。

活体功能材料的自我再生、包封和活力

活体材料的最吸引人的属性之一是它们的自我再生的能力。为了评估我们的工程化生物膜是否维持这种能力，我们将TasA-HisTag纳米纤维生物膜在载玻片上打印成受控的六边形图案，然后将打印的生物膜与富含营养物的琼脂平板直接接触(图3a)。在琼脂平板上2天后，生物膜呈六方型图案再生长。然后，我们将第一个琼脂平板上的生物膜暴露于第二个琼脂平板，发现生物膜仍以最初的六边形图案生长，这证实了我们工程化和打印的生物膜的高保真度、自我再生能力(图3b)。引人注目地，对再生的生物膜的粘弹性质的分析显示，它们具有与最初生长的生物膜几乎相同的弹性和粘性模量水平(图3c)，该发现强调不仅可以再生给定生物膜的基因型，而且可以再生其表型特征(包括材料性质)。

我们接下来评估混合官能化的生物膜的活力。一开始，我们在等量的QD存在下培养对照(生物膜缺陷型)、TasA或TasA-HisTag生物膜，然后监测生物膜产生。我们发现QD的存在未有害地影响TasA-HisTag生物膜的生长和产生；然而，QD确实抑制生物膜缺陷型细菌和缺乏HisTag修饰的生物膜两者的生长。而且，TEM成像进一步揭示，有毒的QD可以固定在TasA-HisTag纳米纤维上，避免与细菌细胞直接接触。这些结果暗示HisTag可以与QD相互作用并将QD固定到生物膜上，从而保护官能化的生物膜免受这些有毒纳米颗粒的直接损害。实际上，在琼脂平板上测试再生长的自我再生实验显示，混合官能化的生物膜的细胞在暴露于QD之后保持存活。我们还证实，我们的生物膜在各种制造技术之后仍然是有活力的，所述制造技术尤其包括在玻璃和聚氯乙烯(PVC)聚合物等上打印成各种形状。

为了进一步证明我们的工程化生物膜对于生物制造的适用性，我们将生物膜包封到通过以下两种技术制造的几何形状预定义的水凝胶隔室中：3D打印和微囊化。然后，我们通过顺序打印水凝胶和可以产生TasA-mCherry纳米纤维生物膜的菌株来评价在这些受限环境中它们的功能性和它们的活力两者(图1c)。具体地，将打印的生物膜夹在由明胶和藻酸钠组成的两层水凝胶(用于水凝胶形成的两种常见类型的聚合物材料)之间

我们接下来研究使用微囊化技术制作工程化生物膜，该技术先前已被用于将哺乳动物细胞包封在藻酸盐-聚(L-赖氨酸)-藻酸盐(APA)水凝胶微球内

最近的研究已经报道了将基因工程化的细菌掺入到3D打印的水凝胶中以生成活体可穿戴装置

活体功能材料代表利用工程化生物系统的新能力的机会。通过利用基因工程的力量和枯草芽孢杆菌输出机制的固有优势，我们引入了一种新的基于枯草芽孢杆菌生物膜的活体功能材料平台。我们设计了细胞外淀粉样蛋白TasA，它是枯草芽孢杆菌生物膜纤维组分的主要亚基，通过将它与其他各种蛋白质或蛋白质结构域融合，赋予活体系统新的功能。我们使用我们的平台制备了可编程的活体材料，所述可编程的活体材料显示多样的功能性质，例如固有荧光、酶活性，以及各种功能性无机NP的模板化组装，以实施混合酶/无机混和反应级联。我们还使用3D打印和微凝胶包封技术，制备了显示吸引人的粘弹性质的活体材料，并将它们自身或与其他聚合物凝胶材料一起制成不同形状和微结构。因此，我们的可编程且可打印的枯草芽孢杆菌生物膜代表了一种新型的活体功能材料：它们是多功能的、自我再生的和可调的，并且具有相当大的制作加工性。由于该新型的活体功能材料提供了以前难以获得的与制造相关的材料性能性质，因此我们的发明提供了新类型的复合多功能材料以及动态和再生纳米技术。

菌株和质粒

原始野生型菌株枯草芽孢杆菌2569

生物膜培养条件

使种子培养物在37℃下在LB培养基中生长过夜。使生物膜培养物在30℃下在MSgg培养基

采用工程化生物膜降解对氧磷

对氧磷的降解遵循催化反应的两步级联反应，由镍次氮基三乙酸(Ni-NTA)修饰的AuNP(简称AuNP)的生物膜-模板化的组装实现，所述生物膜包含TasA-OPH纳米纤维和TasA-HisTag纳米纤维。首先使用独立的降解实验证实了TasA-OPH生物膜或TasA-HisTag生物膜组装的AuNP的酶活性。所述两步催化反应在独立的生物膜培养物或共培养的生物膜中相继进行。

使用3D打印生物制造工程化生物膜

将培养的生物膜从培养板刮下并放置(必要时与QD一起)到装料桶中。使用BioScaffolder3.1 3D打印机(GeSim)在玻璃、PVC板或明胶水凝胶表面上打印三维结构(包括多边形图或圆圈)。对于打印的“夹心”生物膜结构的底层和顶层，施用含有5％明胶和2％藻酸钠的混合物；中间层是打印的生物膜油墨。将所打印的结构浸入500mM CaCl

经由微囊法生物制造工程化生物膜

如前所述，使用B-395Pro包封机(

透射电子显微镜术(TEM)和免疫金标记

TEM样品制备和成像：将碳涂覆的TEM网格(Zhongjingkeyi Technology，EMSciences)放置在20μL含有生物膜液体培养物的溶液液滴的顶部之上1-5min。用20μLPBS缓冲液和20μL水洗涤网格。将过量的液体在Whatman no.1滤纸上吸掉，并且样品用20μL 1w/v％乙酸双氧铀溶液负染。将样品风干并在FEI T12透射电子显微镜中在120kV的加速电压下检查。用AMT 2k CCD相机拍摄图像。

为了TasA的免疫定位，将镍网格上的稀释样品漂浮在封闭缓冲液中30分钟，封闭缓冲液由PBS中的1％脱脂乳和0.1％Tween 20组成，与在封闭缓冲液中以1:150稀释的抗TasA一抗孵育2h

反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析

使用RP-HPLC来监测PAR和MHET及它们相关的降解产物。

RP-HPLC在Agilent 1260Infinity系统(Agilent Technologies)上进行，该系统配备有来自Agilent Technologies的ZORBAX SB-C18保护柱(4.6×12.5mm，5μm)和ZORBAXSB-C18分析柱(4.6×150mm，5μm)。流动相为甲醇/20mM磷酸盐缓冲液(pH＝2.5)，流速为1.0mL/min，并使用UV检测器在240nm波长处监测流出液。典型洗脱条件为：0至15min，25％(v/v)甲醇；15至25min，25-95％甲醇线性梯度；25至30min，95-25％甲醇线性梯度。

使用工程化生物膜的MHET降解

将ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-MHET酶生物膜(OD

接触角测量

小心地分离在MSgg琼脂平板上生长的生物膜，然后在室温下使用Theta Lite光学张力计(Biolin)按照座滴法测量这些生物膜的接触角

流变性质的评估

使用配备了直径为24.948mm的锥体的应变控制流变仪(Anton paar MCR101)进行了应变扫描实验和频率扫描实验两者，以评估工程化生物膜的流变性质。

荧光显微术

收集ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-mCherry生物膜和含有固定有不同的QD(包括蓝色QD(CdZnS@ZnS)，红色QD(Co-NTA CdSeS@ZnS)和绿色QD(CdZnSeS@ZnS)的ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-HisTag生物膜的所打印的样品用于荧光成像。如果没有特别指出，所有成像均使用激光扫描共焦显微术LSM 710(Zeiss)进行。用Nikon SMZ25立体显微镜对含有TasA-mCherry生物膜的3D打印水凝胶进行荧光成像。

荧光光谱测量

使用具有350nm光激发的HORIBA FL-3荧光分光计收集生物膜/QD复合物结构的荧光光谱。

统计分析

数据以平均值±s.d.(标准差)表示。s.d.的值基于三次重复计算。使用Studentt-检验比较样品组的平均值，并且P值小于0.05被认为是统计学上显著的。

参考文献

1.Chen,A.Y.et al.Synthesis and patterning of tunable multiscalematerials with engineered cells.Nat Mater 13,515-523(2014).

2.Nguyen,Peter Q.,et al.Engineered Living Materials:Prospects andChallenges for Using Biological Systems to Direct the Assembly of SmartMaterials.Adv Mater 30(19),1704847(2018).

3.Ball P.Synthetic biology—Engineering nature to make materials.MRSBulletin 43(7):477-484(2018).

4.Y.Wang,et al.Emerging Paradigms for Synthetic Design of FunctionalAmyloids.Journal of Molecular Biology(2018).

5.Tallawi,M.,Opitz,M.&Lieleg,O.Modulation of the mechanicalproperties of bacterial biofilms in response to environmentalchallenges.Biomater Sci 5,887-900(2017).

6.Barnhart,M.M.&Chapman,M.R.Curli biogenesis and function.Annu RevMicrobiol 60,131-147(2006).

7.Vlamakis,H.,Chai,Y.,Beauregard,P.,Losick,R.&Kolter,R.Stickingtogether:building a biofilm the Bacillus subtilis way.Nat Rev Microbiol 11,157-168(2013).

8.DeBenedictis,E.P.,Liu,J.&Keten,S.Adhesion mechanisms of curlisubunit CsgA to abiotic surfaces.Sci Adv 2,e1600998(2016).

9.Edwards,S.J.&Kjellerup,B.V.Applications of biofilms inbioremediation and biotransformation of persistent organic pollutants,pharmaceuticals/personal care products,and heavy metals.Appl MicrobiolBiotechnol 97,9909-9921(2013).

10.Donato,V.et al.Bacillus subtilis biofilm extends Caenorhabditiselegans longevity through downregulation of the insulin-like signallingpathway.Nat Commun 8,14332(2017).

11.Hobley,L.,Harkins,C.,MacPhee,C.E.&Stanley-Wall,N.R.Givingstructure to the biofilm matrix:an overview of individual strategies andemerging common themes.FEMS Microbiol Rev(2015).

12.Yates,M.D.et al.Measuring conductivity of living Geobactersulfurreducens biofilms.Nat Nanotechnol 11,910-913(2016).

13.Cao,Y.X.L.et al.Programmable assembly of pressure sensors usingpattern-forming bacteria.Nature Biotechnology 35,1087-+(2017).

14.Wang,X.P.,J.；An,B.；Li,Y.；Shang,Y.；Ning,Z.；Liu,Y.；Ba,F.；Zhang,J.；Zhong C.Programming cells for dynamic assembly of inorganic nano-objects withspatiotemporal control.Adv Mater 1705968(2018).

15.Nguyen,P.Q.,Botyanszki,Z.,Tay,P.K.&Joshi,N.S.Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres.Nat Commun 5,4945(2014).

16.Liu,X.et al.Stretchable living materials and devices withhydrogel-elastomer hybrids hosting programmed cells.Proc Natl Acad Sci U S A114,2200-2205(2017).

17.Liu,L.et al.Developing Bacillus spp.as a cell factory forproduction of microbial enzymes and industrially important biochemicals inthe context of systems and synthetic biology.Applied Microbiology andBiotechnology 97,6113-6127(2013).

18.Kesel,S.et al.Direct comparison of physical properties of Bacillussubtilis NCIB 3610 and B-1 biofilms.Applied and environmental microbiology82,2424-2432(2016).

19.Cairns,L.S.,Hobley,L.&Stanley-Wall,N.R.Biofilm formation byBacillus subtilis:new insights into regulatory strategies and assemblymechanisms.Molecular Microbiology 93,587-598(2014).

20.Liu,X.et al.3D Printing of Living Responsive Materials andDevices.Adv Mater(2017).

21.Driks,A.Tapping into the biofilm:insights into assembly anddisassembly of a novel amyloid fibre in Bacillus subtilis.Mol Microbiol 80,1133-1136(2011).

22.Diehl,A.et al.Structural changes of TasA in biofilm formation ofBacillus subtilis.Proc Natl Acad Sci U S A 115,3237-3242(2018).

23.Romero,D.,Aguilar,C.,Losick,R.&Kolter,R.Amyloid fibers providestructural integrity to Bacillus subtilis biofilms.Proceedings of theNational Academy of Sciences 107,2230-2234(2010).

24.Chai,L.et al.Isolation,characterization,and aggregation of astructured bacterial matrix precursor.Journal of Biological Chemistry 288,17559-17568(2013).

25.Zakeri,B.et al.Peptide tag forming a rapid covalent bond to aprotein,through engineering a bacterial adhesin.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 109,E690-E697(2012).

26.Yoshida,S.et al.A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate).Science 351,1196-1199(2016).

27.Botyanszki,Z.,Tay,P.K.,Nguyen,P.Q.,Nussbaumer,M.G.&Joshi,N.S.Engineered catalytic biofilms:Site-specific enzyme immobilization ontoE.coli curli nanofibers.Biotechnol Bioeng 112,2016-2024(2015).

28.Slavin,Y.N.,Asnis,J.,Hafeli,U.O.&Bach,H.Metal nanoparticles:understanding the mechanisms behind antibacterial activity.JNanobiotechnology 15,65(2017).

29.Schaffner,M.,Ruhs,P.A.,Coulter,F.,Kilcher,S.&Studart,A.R.3Dprinting of bacteria into functional complex materials.Sci Adv 3,eaao6804(2017).

30.Gladman,A.S.,Matsumoto,E.A.,Nuzzo,R.G.,Mahadevan,L.&Lewis,J.A.Biomimetic 4D printing.Nat Mater 15,413-418(2016).

31.Flemming H C,Wingender J.The biofilm matrix.Nat Rev Microbiol 8(9):623(2010).

32.Luo,Y.,Lode,A.&Gelinsky,M.Direct plotting of three-dimensionalhollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissueengineering.Adv Healthc Mater 2,777-783(2013).

33.Connell,J.L.,Ritschdorff,E.T.,Whiteley,M.&Shear,J.B.3D printing ofmicroscopic bacterial communities.Proc Natl Acad Sci U S A 110,18380-18385(2013).

34.Orive,G.,Tam,S.K.,Pedraz,J.L.&Halle,J.P.Biocompatibility ofalginate-poly-L-lysine microcapsules for cell therapy.Biomaterials 27,3691-3700(2006).

35.Xue,S.et al.A Synthetic-Biology-Inspired Therapeutic Strategy forTargeting and Treating Hepatogenous Diabetes.Mol Ther 25,443-455(2017).

36.Lehner,B.A.,Schmieden,D.T.&Meyer,A.S.A Straightforward Approachfor 3D Bacterial Printing.ACS Synth Biol(2017).

37.Wilking,J.N.,Angelini,T.E.,Seminara,A.,Brenner,M.P.&Weitz,D.A.Biofilms as complex fluids.Mrs Bulletin 36,385-391(2011).

38.Flemming,H.C.et al.Biofilms:an emergent form of bacterial life.NatRev Microbiol 14,563-575(2016).

39.Konkol,M.A.,Blair,K.M.&Kearns,D.B.Plasmid-encoded ComI inhibitscompetence in the ancestral 3610 strain of Bacillus subtilis.J Bacteriol 195,4085-4093(2013).

40.Branda,S.S.,Gonzalez-Pastor,J.E.,Ben-Yehuda,S.,Losick,R.&Kolter,R.Fruiting body formation by Bacillus subtilis.Proc Natl Acad Sci U S A 98,11621-11626(2001).

41.Arnaouteli,S.Bifunctionality of a biofilm matrix proteincontrolled by redox state.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 114,E6184-E6191(2018).

42.Hochuli,E.,Bannwarth,W.,Dobeli,H.,Gentz,R.&Stuber,D.GeneticApproach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a NovelMetal Chelate Adsorbent.Nat.Biotech 6,1321–1325(1988).

43.Zhong,C.et al.Strong underwater adhesives made by self-assemblingmulti-protein nanofibres.Nat Nanotechnol 9,858-866(2014).

44.Arakaki,A.,Webb,J.&Matsunaga,T.A novel protein tightly bound tobacterial magnetic particles in Magnetospirillum magneticum strain AMB-1.Journal of Biological Chemistry 278,8745-8750(2003).

45.McEvoy,A.L.et al.mMaple:a photoconvertible fluorescent protein foruse in multiple imaging modalities.PLoS One 7,e51314(2012).

46.Shaner,N.C.et al.Improved monomeric red,orange and yellowfluorescent proteins derived from Discosoma sp.red fluorescent protein.NatBiotechnol 22,1567-1572(2004).

47.Lu,H.D.,Wheeldon,I.R.&Banta,S.Catalytic biomaterials:engineeringorganophosphate hydrolase to form self-assembling enzymatic hydrogels.ProteinEngineering Design&Selection 23,559-566(2010).

补充信息

1.菌株构建

枯草芽孢杆菌2569 ΔtasAΔsinR和枯草芽孢杆菌2569 ΔtasAΔsinRΔeps突变体

为了创建生物膜缺陷型菌株，我们首先构建了两个自杀质粒，pMAD-ΔtasAsinR和pMAD-Δeps。使用sal-dAF/dcAR的引物对从位于tasAsinR(sinR和tasA基因彼此紧邻)基因上游的野生型菌株的基因组扩增1kb的片段。使用daCF/bgl-dCR的引物对扩增位于tasAsinR基因下游的1kb片段。将这两个片段融合在一起形成2kb的片段(导致目标tasAsinR基因的缺失)，然后通过SalI/BglII消化将其插入pMAD中，以获得自杀性质粒pMAD-ΔtasAΔsinR。

类似地，使用引物对Bam-d EPS A up F/d EPS A up R和d EPS O dw F/Sal-dEPS O dw R分别扩增位于epsA～O基因簇上游和下游的1kb片段。然后将这两个片段融合在一起形成2kb的片段(导致目标epsA～O基因簇的缺失)，然后将其在BamHI/SalI位点插入pMAD以获得自杀质粒pMAD-Δeps。

然后将自杀质粒分别转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，替换BamHI/SalI位点以释放该抗生素选择标记，如前所述

2.质粒构建

使用Gibson组装试剂盒或限制性内切酶，T4 DNA连接酶，用标准分子克隆技术构建本研究中使用的质粒。具有双48/48快速反应模块(Bio-Rad)的Bio-Rad S1000热循环仪用于进行PCR、连接和限制性酶切。用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶提取。定制的寡核苷酸引物从GENEWIZ订购。

用标准方案将所有用于质粒构建的连接物转化到大肠杆菌菌株DH5αPRO中。将分离的菌落接种到补充50μg/ml羧苄青霉素的LB培养基(Fisher)中。用QiagenQIAprep SpinMiniprep试剂盒提取质粒。通过限制性酶切证实质粒构建体序列，并通过Genewiz进行测序。构成本工作中使用的质粒的部件在补充表2中描述。

通过使用pHT01空质粒作为起点构建用于从grac启动子表达基因的质粒。基于枯草芽孢杆菌168基因组序列设计tasA的引物，并从枯草芽孢杆菌2569基因组模板扩增tasA片段。融合蛋白R的基因由Genewiz合成并针对枯草芽孢杆菌宿主表达进行优化。在基因合成或PCR过程期间，将tasA和R基因与对应于GGGSGGGS或GGGGSGGGGS的接头基因片段连接。然后将那些tasA-R基因片段在BamHI/SmaI位点或单个SmaI位点插入pHT01质粒中。在该研究中将构建的质粒命名为pHT01-tasA-R载体。使用的所有引物作为补充表3列出。

3.枯草芽孢杆菌生物膜培养

基于溶液的生物膜形成

从冷冻的甘油储备液中接种菌株，并使其在补充有5μg/mL氯霉素的LB培养基中生长。使种子培养物在37℃下生长过夜。然后将离心后收集的细胞团重悬于补充有5μg/mL氯霉素和0.5mM IPTG的MSgg培养基中，初始细胞密度为5×10

Luria-Bertani(LB)肉汤的组成：1％胰蛋白胨(Difco)，0.5％酵母提取物，1％氯化钠。MSgg肉汤的组成：100mM吗啉代丙磺酸(MOPS)(pH 7)，0.5％甘油，0.5％谷氨酸盐，5mM磷酸钾(pH 7)，50μg/mL色氨酸，50μg/mL苯丙氨酸，2mM MgCl

3.基于固体平板的生物膜形成：

对于固体平板培养，通过添加Bacto琼脂(Difco)至1.5％来固化液体MSgg培养基。从冷冻的甘油储备液中接种菌株，并使其在补充有5μg/mL氯霉素的LB培养基中生长。使种子培养物在37℃下生长过夜。然后将通过离心收集的团粒重悬于补充有5μg/mL氯霉素和0.5mM IPTG的MSgg培养基中，初始细胞密度为5×10

用于枯草芽孢杆菌培养物的抗生素是MLS(1μg/mL红霉素，25μg/mL林可霉素)或5μg/mL红霉素；大观霉素(100μg/mL)；氯霉素(5μg/mL)；用于大肠杆菌培养物的抗生素是羧苄青霉素(50μg/mL)。

4.结晶紫(CV)生物膜测定

按照在先前出版物中描述的结晶紫(CV)染色方案进行生物膜的定量

5.抗-TasA免疫标记测定

对于TasA蛋白的免疫定位，首先将生物膜样品(来自两天液体培养物)置于镍网格上，然后浸入20μL封闭缓冲液(含有1％脱脂牛奶和0.1％Tween 20的PBS缓冲液)中30分钟，然后在20μL封闭缓冲液液滴中与以1:150比例稀释的抗-TasA一抗孵育2小时。然后，将样品在20μL PBST(含有0.1％Tween 20的PBS缓冲液)中漂洗3次，随后转移至20μL封闭缓冲液液滴，其具有以1:5000的比率稀释的与20-nm金颗粒缀合的山羊抗兔二抗(Ted Pella,Inc.)，其中它被孵育1小时。然后用20μL PBS缓冲液和20μL ddH

6.透射电子显微镜(TEM)

将碳涂覆的TEM网格(Zhongjingkeyi Technology，EM Sciences)放置在20μL含有来自液体培养物(2天或3天培养样品)的生物膜的溶液液滴的顶部之上5min。用20μL PBS缓冲液和20μL水洗涤网格。将过量的液体在滤纸(Whatman no.1)上吸掉并将样品用20μL乙酸双氧铀(1-2％w/v水溶液)染色。将样品风干并在FEI T12透射电子显微镜上在120kV的加速电压下检查样品。用AMT 2k CCD相机拍摄图像。为了对不同官能化的生物膜的TasA-R纳米纤维成像和比较，施用3天液体培养样品以确保观察到成熟的TasA-R纳米纤维。

TEM成像也用于探测含有TasA-HisTag纳米纤维的生物膜是否能够锚定镍次氮基三乙酸修饰的金纳米颗粒(Ni-NTA-AuNP)。具体地，将20μL样品液滴小心地添加到放置在一块石蜡膜上的200目formvar/碳涂覆的镍TEM网格(Electron Microscopy Sciences)的顶部之上2min。用30μL ddH

7.荧光显微术

为了验证含有TasA-mCherry纳米纤维或TasA-SpyTag纳米纤维的生物膜的功能性质，使用Nikon共焦显微镜A1R和Zeiss Axio Imager 2进行荧光成像。分别使用587和488nm通道获取红色和绿色荧光的荧光图像。

从冷冻的甘油储备液接种枯草芽孢杆菌2569ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-mCherry(ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-mCherry)菌株并使用5μg/mL氯霉素使其在LB培养基中生长。使种子培养物在37℃下生长12小时。静态生物膜培养物在补充有5μg/mL氯霉素和0.5mM IPTG的MSgg培养基中在30℃下生长。对照组在相同条件下进行，但培养基中不添加IPTG。培养2天后，收获并浓缩生物膜。然后在尼康共聚焦显微镜A1R下对滴在载玻片上的10μL生物膜溶液成像。

从冷冻的甘油储备液接种枯草芽孢杆菌2569ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-SpyTag(ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-SpyTag)菌株并使用5μg/mL氯霉素使其在LB培养基中生长。使种子培养物在37℃下生长12小时。静态生物膜培养物在补充有5μg/mL氯霉素和0.5mM IPTG的MSgg培养基中在30℃下生长。对照组在相同条件下进行，但培养基中不添加IPTG。培养2天后，收获生物膜并用PBS重悬于试管中。将0.5mL 1mg/mL PBS中的纯化的SpyCatcher-GFP蛋白加入试管中，孵育1小时，然后用PBS缓冲液洗涤3次。然后在Zeiss Axio Imager 2下对滴在载玻片上的10μL混合物溶液成像。

为了通过SpyTag-SpyCatcher共价相互作用进一步确认SpyCatcher-GFP与生物膜的特异性结合，我们比较了三个样品的荧光：添加有SpyCatcher-GFP蛋白的TasA-SpyTag生物膜，添加有游离GFP蛋白的TasA-SpyTag生物膜和添加有SpyCatcher-GFP蛋白的TasA-HisTag生物膜。具体地，静态液体生物膜培养物在补充有5μg/mL氯霉素和0.5mM IPTG的MSgg培养基中在30℃下生长。培养2天后，收获生物膜并用PBS重悬于试管中。将0.5mL 1mg/mL PBS中的纯化的SpyCatcher-GFP蛋白分别添加到1mg TasA-SpyTag生物膜和1mg TasA-HisTag生物膜中。在1mg TasA-SpyTag生物膜中添加0.5mL的1mg/mL PBS中的纯化的GFP蛋白。将样品孵育1h，然后用PBS缓冲液洗涤3次。然后在Zeiss Axio Imager 2下对滴在载玻片上的10μL混合物溶液成像。

8.荧光光谱

使用荧光光谱仪表征生物膜/QD混合结构的荧光特征。向1g的ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-HisTag生物膜中添加200μL QD(蓝色(CdZnS@ZnS)、红色(CdSeS@ZnS)或绿色(CdZnSeS@ZnS)QD)以生产生物膜/QD混合结构。然后将10mg上述样品涂覆在玻璃板上。使用HORIBA FL-3在350nm的激发波长下收集涂覆样品的荧光光谱。

9.通过酶/AuNP混合生物催化体系降解对氧磷

对氧磷的降解遵循两步催化反应，由含有TasA-OPH纳米纤维和TasA-HisTag纳米纤维固定化的镍次氮基三乙酸(Ni-NTA)修饰的金纳米颗粒(缩写为AuNP)实现。

用cary 5000UV-Vis-NIR分光光度计进行PAR、PNP和PAP的全波长扫描。通过UV光谱测定PAR、PNP和PAP的最大吸收波长分别为290、405和230nm。通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)分别测定共培养体系中的三种化合物PAR、PNP和PAP。

(1)用含有TasA-OPH纳米纤维的生物膜将PAR降解成PNP

通过在5000rpm下离心10min收集来自液体培养物的含有TasA-OPH纳米纤维的生物膜，并重悬在补充有50μM CoCl

OPH的酶动力学遵循Michaelis-Menten方程：

通过使用Lineweaver-Burk方程测定了动力学参数Vmax和Km；

在Michaelis-Menten方程的线性化中：

V是反应速度，

Vmax是最大反应速度，

S为底物浓度，且Km为Michaelis常数。

获得的Vmax和Km分别为0.0602mM/min和0.2891mM。

(2)基于对锚定TasA-HisTag纳米纤维的AuNP生物膜的功能评估的PNP减少

从冷冻的甘油储备液接种枯草芽孢杆菌2569ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-HisTag(ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-HisTag)菌株并使用5μg/ml氯霉素使其在LB培养基中生长。使种子培养物在37℃、220rpm振荡下生长12h。生物膜培养物在12孔板中在补充有5μg/mL氯霉素、0.5mM IPTG和100μL 5nM Ni-NTA-AuNP的MSgg培养基中在30℃下生长。培养2-3天后，收获生物膜，在用10mL PBS缓冲液洗涤3-5次后再悬浮于PBS缓冲液(OD＝1)中。通过混合4mL的1mM PNP、100μL的2M NaBH

对硝基苯酚的减少遵循一级反应，并且反应动力学可以通过以下方程描述：

-d[A]/dt＝k[A]

当t＝0时，[A]＝[A

[A

A的浓度随时间变化的关系可以写成：

-ln(A/A

所有情况下的反应速率方程可用以下方程描述：

TH(IPTG ON)+AuNPs+NaBH4+PNP:y＝0.06708x+0.03788

TH(IPTG ON)+AuNPs+NaBH4+PNP:y＝0.02211x-0.00892

TH(IPTG ON)+NaBH4+PNP:y＝0.00218x+0.00037

PNP:y＝-0.00020x+0.00508

结果显示，在存在AuNP和NaBH

(3)通过独立培养的生物膜对对氧磷的生物催化级联降解

将2mL的10mM在10％甲醇中的paraxon添加到18mL含有TasA-OPH生物膜(OD＝4，pH＝10)和50μM CoCl

培养2天后，收获含有TasA-HisTag纳米纤维的生物膜，用大量PBS缓冲液洗涤3-5次，然后再悬浮于PBS缓冲液(OD＝1)中。通过添加8mL上清液(从步骤1收集的)，1mL 2MNaBH

(4)通过共培养的生物膜系统对对氧磷的生物催化级联降解

从冷冻的甘油储备液接种ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-OPH和ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-HisTag菌株，并在37℃下在补充有5μg/mL氯霉素的50mLLB培养基中使其独立生长12h。将来自上述培养物的细胞团成团，并将等量的细胞在少量MSgg培养基中混合。然后将混合物添加到补充有5μg/mL氯霉素、0.5mM IPTG和5nM AuNP的50mL MSgg培养基中。然后使培养物在30℃下生长2-3天以形成单个混合生物膜。

培养2-3天后，收获生物膜并重悬于补充有50μM CoCl

10.流变学测量

在配备有24.948mm直径锥板(48μm间隙)的应变控制流变仪(Anton paar MCR101)上展示工程化生物膜的流变特性。将所有生物膜样品从MSgg板刮下并置于锥板上。为了使生物膜中的水蒸发最小化，使用含有纯水的封闭的环境隔离室。为了确定生物膜样品的线性粘弹性区域，在1rad/s的固定频率下进行0.01-100％应变幅度的应变扫描实验。在1％应变幅度下进行100-0.01rad/s的频率扫描实验。使用珀尔帖热电装置在整个实验中将温度保持在恒定的温度25℃。

WT和TasA-HisTag生物膜的粘弹性网络的瞬时恢复能力是通过以下来测量的：振荡时间扫描(0.1％幅度应变，5rad/s角频率)120s，然后是在稳态下突然剪切过程(100s

11.3D打印实验

(1)生物膜的3D打印

将菌株在MSgg平板上培养2-3天。将所生长的生物膜从板上刮下并放入装料桶中。使用机器人3D打印机(GeSim BioScaffolder 3.1)打印可变形状的3D结构。多边形或圆形的形状是使用系统中现有的图形程序直接打印的，而其他形状，诸如代表上海科技大学的字母，则是使用输入的stl图形程序打印的。实验中采用的打印参数为：打印压力(150-250kPa)，喷嘴内径(160μm)，和打印速度(5-10mm/s)。

(2)生物膜/QD混合结构的3D打印。

将ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-HisTag生物膜在MSgg平板上培养2-3天。从开始向培养基中添加蓝色(CdZnS@ZnS)、红色(CdSeS@ZnS)和绿色(CdZnSeS@ZnS)QD。将具有QD的所生长的生物膜从平板刮下并且放置到具有160μm的喷嘴直径的5mL注射器筒中。使用三轴机器人沉积台(GeSim BioScaffolder 3.1)制作3D结构。使用系统中现有的图形程序直接打印多边形或圆形的3D形状，使用输入的stl程序打印其他图形或字母。实验中采用的打印参数：打印压力(150-250kPa)，喷嘴内径(160μm)，和打印速度(5-10mm/s)。

(3)通过顺序打印将打印的生物膜包封在水凝胶内

为了评价打印的生物薄膜在受限环境中的功能性和活力，我们顺序地打印了聚合物水凝胶和可以使用3D打印技术产生TasA-mCherry纳米纤维生物膜的菌株。

具体地，首先将5％(w/v)明胶和2％(w/v)藻酸钠溶解在MSgg液体中，然后将粘性溶液装入桶中。首先使用3D打印机(GeSim BioScaffolder 3.1)将明胶/藻酸盐混合物打印在PVC板上，具体打印参数如下：打印压力(200-300kPa)，打印速度(5-10mm/s)，和喷嘴直径(210μm)。从培养板中刮下ΔtasAΔsinRΔeps/TasA-mCherry生物膜并置于装料桶中。使用以下参数将生物膜直接打印在打印的明胶/藻酸盐水凝胶层的顶部之上：打印压力(150-250kPa)，打印速度(5-10mm/s)，和喷嘴直径(160μm)。然后，将由5％(w/v)明胶和2％(w/v)藻酸钠组成的另一水凝胶层直接打印在打印的生物膜的顶部之上，以将生物膜包封在水凝胶内。

为了固化打印的结构，将以上打印的样品合并在500mM CaCl

12.微囊化的生物膜制作

制作微囊化的生物膜。首先制备了由混合枯草芽孢杆菌细胞和藻酸钠组成的前体溶液。具体地，表达TasA-mCherry纳米纤维的细胞首先按照上述的固体平板生物膜培养方案进行培养和收获。将所制备的生物膜与1.5％藻酸钠溶液(1.5％低粘度藻酸盐在吗啉基丙磺酸，MOPS洗涤缓冲液中)均匀混合。然后将装有20mL混合物的连接到反应容器的25mL注射器连接到B-395Pro封装器(

在500mL固化缓冲液(100mM CaCl

最后将制作的微珠在补充有0.5mM IPTG诱导物的MSgg培养基中培养。微珠的荧光成像使用倒置荧光显微术(Nikon ECLIPSE Ti)进行。由于在溶液中溶胀，所制造的微凝胶珠粒的尺寸大于200μm。

13.自我再生实验

刮下在固体MSgg平板(补充有5μg/mL氯霉素和0.5mM IPTG)上生长的TasA-HisTag生物膜，并放置到3D打印机的装料桶中。首先将生物膜在载玻片上打印成设计的六边形图案。三个打印六边形的边长分别为5、7和9mm。然后将载玻片上3D打印的生物膜倒置放在新的固体MSgg平板上，2天后生物膜可以以六边形图案再生长。将在第一富营养琼脂平板上以六边形图案再生长的生物膜倒置放置在第二富营养琼脂平板上。将相似的再生实验再重复两轮，直到将在第三个琼脂平板上以六边形图案再生长的生物膜倒置放在第四个营养琼脂平板上。

14.量子点(QD)毒性测定

从冷冻的甘油储备液接种生物膜缺陷型菌株(pHT01)、TasA和TasA-HisTag生物膜产生菌株，并使用5μg/mL氯霉素使其在LB培养基中生长。使种子培养物在37℃生长12h。静态生物膜样品在含有5μg/mL氯霉素和0.5mM IPTG，补充有或没有10％红色Co-NTA CdSeS@ZnS QD的MSgg培养基中在30℃下生长。培养2天后，使用生物膜培养物的标准结晶紫(CV)测定法(存在或不存在QD)测量生物膜产生，并评估QD对生物膜生长和产生的影响。

15.水凝胶中捕获的生物膜的长期活力和功能性能评价

按照上述方案制备具有表达TasA-mCherry纳米纤维的捕获的细胞的打印水凝胶和含有表达TasA-mCherry纳米纤维的捕获的细胞的微囊。为了评估生物膜在受限环境中的功能功能，将样品浸入补充有5μg/mL氯霉素和0.5mM IPTG的MSgg液体培养基中。取出不同诱导时间后的夹心样品进行荧光检测。荧光成像使用立体显微镜(Nikon SMZ25)记录。

为了评估长期活力和功能性能，将水凝胶结构在4℃下储存超过5周，然后浸入补充有5μg/mL氯霉素和0.5mM IPTG的液体MSgg培养基中。取出夹心样品进行荧光检测。荧光成像使用立体显微镜(Nikon SMZ25)记录。将浸入无IPTG的培养基中的水凝胶用作对照样品。

补充表1.生物膜基质涉及的基因

补充表2.菌株和质粒

补充表3.引物

补充表4.序列

补充表5.氨基酸序列

补充参考资料

1.Arnaud,M.,Chastanet,A.&Debarbouille,M.New vector for efficientallelic replacement in naturally nontransformable,low-GC-content,gram-positive bacteria.Applied and environmental microbiology 70,6887-6891(2004).

2.Branda,et al..A major protein component of the Bacillus subtilisbiofilm matrix.Molecular microbiology 59,1229-1238(2006).

3.Chen,A.Y.et al.Synthesis and patterning of tunable multiscalematerials with engineered cells.Nat Mater 13,515-523(2014).

4.Vlamakis,H.,Chai,Y.,Beauregard,P.,Losick,R.&Kolter,R.Stickingtogether:building a biofilm the Bacillus subtilis way.Naturereviews.Microbiology 11,157-168(2013).