用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物、人皮肤组织模型动物及其制造方法
文献发布时间:2023-06-19 11:35:49
技术领域
本发明涉及用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物及其制造方法。另外,本发明涉及应用了用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物的具有毛囊的人皮肤组织模型动物及其制造方法。
背景技术
毛发由存在于皮肤的毛囊产生。毛囊是包围毛发的组织层,由外胚层来源的毛母(毛母细胞)、内毛根鞘、外毛根鞘,中胚层来源的真皮鞘、毛乳头等构成。包围毛乳头的毛母细胞被由毛乳头供给的营养、蛋白质诱导而反复分裂、角质化,从而形成毛发。
由于毛发的发育出现问题而产生头发稀疏、脱发症。头发稀疏、脱发症分为早秃(早老性脱发)、斑秃、静止期脱发症等,发生率最高的是早秃。早秃在男性中主要是由于雄性激素的影响而引起的,也称为男性型脱发症。头发一边重复由生长期、退化期和静止期组成的头发生长周期一边长新头发。男性型脱发症是由在该头发生长周期中生长期变短、细且短的毛发的比例增加而引起的症状。
现在,作为早秃的治疗,主要使用外用剂米诺地尔、口服药非那雄胺。这些治疗法均被确认了有效性、安全性,但未必对全部早秃有效。
此外,作为早秃的治疗,实施了自身植发术。自身植发术是将从颞区、枕区采集的包含发根的毛发移植到自己的脱发部的手术方法。然而,该手术方法是将自己的毛发移植到别的地方的手术方法,因此并不增加毛发的总量。
近年来,开发了针对各种疾病的再生医疗技术,在毛发再生领域也正在开发新的技术。为了开发新的毛发再生技术,确立用于正确地评价生发效果的评价系统是重要的,各种研究课题组开发了具有毛囊的重构皮肤(例如,专利文献1和非专利文献1、2等)。
现有技术文献
非专利文献
专利文献1:日本特开2015-97524号公报
非专利文献
非专利文献1:Ehama R.,et al.,Hair follicle regeneration using graftedrodent and human cells.J Invest Dermatol.2007 Sep;127(9):2106-2115.Epub 2007Apr 12.
非专利文献2:Lee LF.,et al.,A simplified procedure to reconstitutehair-producing skin.Tissue Eng.Part C Methods.2011 Apr;17(4):391-400
发明内容
发明要解决的课题
虽然在毛发再生领域持续开发使用毛囊来源的细胞的治疗法,但为了正确地评价所开发的治疗法的效果,确立利用能够长时间维持其结构的包含人毛囊的重构人皮肤的评价系统是重要。但是,到目前为止,通过使用能够稳定获得的材料而重现性良好地提供包含人毛囊的重构人皮肤尚处于困难状况。
因此,本发明的目的在于通过使用能够稳定获得的材料,重现性良好地提供用于重构具有人毛囊的人皮肤组织的组合物及其制造方法。另外,本发明的目的在于提供应用了用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物的具有毛囊的人皮肤组织模型动物及其制造方法。
用于解决课题的手段
本发明者们进行了深入研究,结果发现,通过在组合物中包含经过了球状体形成的非胎儿来源的人毛乳头的细胞群,能够稳定且重现性良好地重构具有毛囊的人皮肤组织,从而完成了本发明。即,本发明包含以下发明。
[1]用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物,其特征在于,
该组合物包含人表皮细胞和人真皮细胞,
其中,所述人真皮细胞包含经过了球状体形成的非胎儿来源的人毛乳头细胞的细胞群。
[2]根据[1]所述的组合物,所述非胎儿来源的人毛乳头细胞是经Wnt信号激活剂刺激的非胎儿来源的人毛乳头细胞。
[3]根据[2]所述的组合物,所述Wnt信号激活剂是Wnt配体家族蛋白质或Wnt激动剂。
[4]根据[3]所述的组合物,所述Wnt配体家族蛋白质从Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16和它们的组合中选择。
[5]根据[3]所述的组合物,所述Wnt激动剂是CHIR99021或BIO。
[6]根据[1]~[5]的任一项所述的组合物,所述人真皮细胞包含人成纤维细胞。
[7]具有毛囊的人皮肤组织模型动物,是对非人哺乳动物应用[1]~[6]的任一项所述的组合物而得的。
[8]用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物的制造方法,该方法包括:
工序(1),制备包含非胎儿来源的人毛乳头细胞的球状体,
工序(2),将所述球状体、人表皮细胞和人真皮细胞混合而进行培养。
[9]根据[8]所述的方法,所述工序(1)在Wnt信号激活剂的存在下实施。
[10]根据[9]所述的方法,所述Wnt信号激活剂是Wnt配体家族蛋白质或Wnt激动剂。
[11]根据[10]所述的方法,所述Wnt配体家族蛋白质从Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16和它们的组合中选择。
[12]根据[10]所述的方法,所述Wnt激动剂是CHIR99021或BIO。
[13]根据[8]~[12]的任一项所述的方法,所述工序(1)通过悬滴法实施。
[14]根据[8]~[13]的任一项所述的方法,所述非胎儿来源的人毛乳头细胞是成人来源的人毛乳头细胞。
[15]根据[8]~[14]的任一项所述的方法,所述人真皮细胞包含人成纤维细胞。
[16]根据[8]~[15]的任一项所述的方法,所述人表皮细胞是经细胞外基质蛋白质或其衍生物刺激的所述人表皮细胞。
[17]根据[16]所述的方法,所述细胞外基质蛋白质包含层粘连蛋白或其片段。
[18]根据[8]~[17]的任一项所述的方法,所述工序(2)是在具备多孔膜的培养基材上进行培养的工序。
[19]具有毛囊的人皮肤组织模型动物的制造方法,包括将通过[8]~[18]的任一项所述的方法获得的组合物应用于非人哺乳动物的工序。
[20]用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物,是通过[8]~[18]的任一项所述的方法获得的。
[21]具有毛囊的人皮肤组织模型动物,是通过[19]的方法获得的。
发明的效果
根据本发明,能够提供能够稳定且重现性良好地重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物及其制造方法。另外,能够提供应用了该组合物的具有毛囊的人皮肤组织模型动物及其制造方法。由本发明提供的评价系统能够重现性良好地评价开发中的药剂、再生医疗技术、或美容技术的效果、特别是生发效果。
附图说明
图1是显示一实施方案中的通过应用本发明的组合物而得的SCID小鼠的皮肤的照片。(A)重构的皮肤的外观照片。(B)(A)的生发部分的放大图。
图2显示一实施方案中的通过应用本发明的组合物而得的SCID小鼠的皮肤的组织分析结果。(A)H&E染色后的、重构的皮肤的组织切片。(B)(A)的虚线部分的放大图。显示了重构皮肤中包含大量毛囊。
图3显示一实施方案中的通过应用本发明的组合物而得的SCID小鼠的皮肤的组织分析结果。(A)通过使用人Alu序列特异性探针的原位(in situ)杂交染色而得的、重构的皮肤的组织切片的染色图像。(B)重构皮肤与宿主组织的边界部分的利用原位(in situ)杂交的染色图像。重构皮肤被显示由人细胞组成,可知是人重构皮肤。
图4显示一实施方案中的通过应用本发明的组合物而得的SCID小鼠的皮肤的组织分析结果。(A)通过使用人Alu序列特异性探针的原位(in situ)杂交染色而得的、重构的皮肤的组织切片的染色图像。(B)通过特异性地识别毛干的抗体AE13染色而得的、重构的皮肤的组织切片的染色图像。毛发和毛囊被显示由人细胞组成,可知是人毛囊。
图5显示用Wnt激动剂(CHIR99021)刺激而得的毛乳头(DP)球状体。(A)用红色荧光色素PKH-26标记后的毛乳头(DP)球状体(左:微分干涉图像、右:荧光图像)。(B)重构的皮肤的组织切片的荧光图像。左列:红色荧光图像(DP球状体来源)、右列:来自抗Pan-keratin(泛角蛋白)抗体(绿)和DAPI(蓝)的荧光图像。上部区域和下部区域分别显示同一组织切片的图像。可知在重构皮肤中形成的毛囊来源于用Wnt激动剂(CHIR99021)刺激而得的毛乳头(DP)球状体。由此可知,为了形成重构皮肤中的人毛囊,用Wnt激动剂(CHIR99021)刺激而得的毛乳头(DP)球状体是必不可少的。
具体实施方式
以下,对于用于实施本发明的方式进行说明,但本发明的技术的范围不仅限于下述方式。另外,以下的对于用于实施本发明的方式进行说明的内容只要没有特别限定,在用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物及其制造方法、以及具有毛囊的人皮肤组织模型动物及其制造方法中可以相互应用。
1.用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物
在一实施方式中,本发明的用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物的特征在于,
该组合物包含人表皮细胞和人真皮细胞,
其中,所述人真皮细胞包含经过了球状体形成的非胎儿来源的人毛乳头细胞的细胞群。
在本说明书中,“重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物”是指具有在应用于皮肤时,在其应用部位重构具有毛囊的结构的人皮肤样的组织的能力的组合物。
“毛囊(Hair Follicle:HF)”一般是指包含作为上皮细胞的毛母(毛母细胞)、内毛根鞘、外毛根鞘、作为间充质细胞的真皮鞘、毛乳头等的、包围毛发的组织层。通过应用本发明的组合物,能够在应用部位重构这样的具有人毛囊的人皮肤样的组织。另外,由重构的毛囊生发。
在本发明中,“表皮细胞”是指构成表皮的细胞,包含分化阶段不同的细胞(主要为角质形成细胞)。在生物体中,表皮由分化阶段不同的表皮细胞层状重叠而形成。表皮的最深部被称为基底层,由圆柱状的细胞形成单层。表皮细胞随着分化阶段进行而一边变化为扁平形状一边向外层移动。基底层位于与真皮的界面,在其上层存在棘层。分化阶段由棘层开始进行而得的表皮细胞形成具有形透明角质颗粒、层状颗粒的颗粒层。颗粒层在生物体组织中由2~3层左右构成。如果分化阶段由颗粒层进一步进行,则细胞核消失,形成角质层。表皮除了表皮细胞以外还包含黑素细胞、朗格汉斯细胞、梅克尔细胞等。本发明的组合物除了表皮细胞之外,也可以包含表皮中所含的其他细胞。
在一实施方案中,本发明的组合物所包含的表皮细胞是人来源的表皮细胞。人表皮细胞可以是市售的人表皮细胞,也可以是将生物体组织细细地切碎,用胶原酶、胰蛋白酶等蛋白质分解酶进行处理而获得的原代人表皮细胞,也可以是将原代人表皮细胞进行传代使其增殖而得的成纤维细胞。在一实施方案中,本发明的组合物所包含的表皮细胞可以是人胎儿、新生儿(例如,0岁~2岁)、未成年人(例如,3岁~17岁)、或成人(例如,18岁以上、20岁以上、25岁以上、30岁以上、35岁以上、40岁以上)来源等。另外,在一实施方案中,本发明的组合物所包含的表皮细胞可以是由多能干细胞或成体干细胞分化而成的表皮细胞。多能干细胞可以是iPS细胞、ES细胞或Muse细胞等,可以使用由这些多能干细胞通过公知的方法分化诱导而得的表皮细胞。
在一实施方案中,本发明的组合物所包含的表皮细胞是经细胞外基质蛋白质或其衍生物刺激的表皮细胞。作为细胞外基质蛋白质,可列举例如,层粘连蛋白、巢蛋白、生腱蛋白、血小板应答蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白等。用于刺激表皮细胞的细胞外基质蛋白质可以是天然型的细胞外基质蛋白质,也可以是它们的衍生物(重组体)。另外,可以是具有刺激表皮细胞的功能的细胞外基质蛋白质的片段。通过在本发明的组合物中包含经细胞外基质蛋白质刺激的表皮细胞,该组合物的重构具有人毛囊的人皮肤样的组织的能力进一步提高,因而优选。
在一实施方案中,用于刺激表皮细胞的细胞外基质蛋白质包含层粘连蛋白或其片段。层粘连蛋白是通过α链(LAMA1、LAMA2、LAMA3、LAMA4、LAMA5)、β链(LAMB1、LAMB2、LAMB3、LAMB4)、γ链(LAMC1、LAMC2、LAMC3)的组合而构成的蛋白质,到目前为止已知17种类(层粘连蛋白1~15以及层粘连蛋白212/222和层粘连蛋白522)的组合。例如,α链、β链和γ链的组合为LAMA5、LAMB1和LAMC1的层粘连蛋白被称为“层粘连蛋白511”。层粘连蛋白511别名也被称为层粘连蛋白10。在一实施方案中,用于刺激表皮细胞的细胞外基质蛋白质可以是层粘连蛋白的片段,例如,可以使用层粘连蛋白511-E8片段。
在本说明书中,“真皮细胞”是指皮肤中存在于表皮与皮下组织之间的真皮所包含的细胞,主要包含成纤维细胞。真皮由成纤维细胞、以及胶原蛋白、弹性纤维(弹性蛋白)、细胞外基质、透明质酸等构成。
在一实施方案中,本发明的组合物所包含的真皮细胞是人来源的真皮细胞。人真皮细胞可以是市售的人真皮细胞,也可以是将生物体组织细细地切碎,用胶原酶、胰蛋白酶等蛋白质分解酶进行处理而获得的原代人真皮细胞,也可以是将所得的原代人真皮细胞进行传代使其增殖而得的真皮细胞。在一实施方案中,本发明的组合物所包含的真皮细胞可以是人胎儿、新生儿(例如,0岁~2岁)、未成年人(例如,3岁~17岁)、或成人(例如,18岁以上、20岁以上、25岁以上、30岁以上、35岁以上、40岁以上)来源等。另外,在一实施方案中,本发明的组合物所包含的真皮细胞可以是由多能干细胞或成体干细胞分化而成的表皮细胞。多能干细胞可以是iPS细胞、ES细胞或Muse细胞等,可以使用由这些多能干细胞通过公知的方法分化诱导而得的真皮细胞。
将毛发的皮肤内部最深部的膨胀部分称为毛球部(hair bulb),将位于毛球部的中央部的由间充质细胞形成的部分称为毛乳头(真皮乳头,dermal papilla:DP)。另外,将构成毛乳头的细胞称为“毛乳头细胞”。毛乳头中钻入了毛细血管、神经,摄取来自食物的营养、氧,掌管毛发的产生、生长。在与毛乳头相接的地方有毛母细胞(hair matrix cell),毛发在该部位产生。毛母细胞通过从钻入毛乳头的毛细血管摄取营养、氧,反复分裂,从而形成毛发。
在一实施方案中,本发明的组合物所包含的毛乳头细胞是人来源的毛乳头细胞。在一实施方案中,人毛乳头细胞可以通过分离人毛囊(优选为人头皮毛囊),由所分离的人毛囊进一步分离毛乳头区域的组织而进行培养,从而使其增殖。具体地,例如,将头皮切成5mm左右的长条状,用磷酸缓冲生理盐水(PBS)等洗涤,然后根据需要使用蛋白质分解酶等进行处理或外科地处理,除去表皮层和真皮层,制成仅皮下脂肪层,接着利用物理手段、例如镊子等分离毛囊。从毛囊切取毛球部,使毛乳头从该毛球部下部露出从而分离毛乳头(细胞)。
毛乳头细胞的培养可以直接使用在动物细胞的培养中使用的市售的营养培养基,或使用将市售的营养培养基改性而得的培养基进行培养(原代培养和传代培养)。作为可以在毛乳头细胞的培养中使用的代表性培养基,可列举包含胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle medium)、Chang’s培养基(Chang’s medium)、MesenPRO培养基(Thermo fisher社)等。培养基中可以进一步根据需要加入细胞增殖因子、激素、其他微量营养素。作为它们的具体物质,可列举运铁蛋白、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸、胰高血糖素、氢化可的松、睾酮、雌二醇、孕酮、硒等。
本发明的组合物所包含的人毛乳头细胞是非胎儿来源的人毛乳头细胞,例如,是未成年人(例如,3岁~17岁)、或成人(例如,18岁以上)来源的毛乳头细胞。根据本发明,即使使用到目前为止困难的非胎儿来源的人毛乳头细胞,也能够重构具有毛囊的人皮肤组织。
在其他实施方案中,本发明的组合物所包含的毛乳头细胞可以是由多能干细胞或成体干细胞分化而成的毛乳头细胞。多能干细胞可以是iPS细胞、ES细胞或Muse细胞等,可以使用由这些多能干细胞分化诱导而得的毛乳头细胞。
在一实施方案中,本发明的组合物包含经过了球状体形成的非胎儿来源的人毛乳头细胞的细胞群。在本说明书中,“球状体”是指细胞彼此集合或凝集而成的球状的细胞集合体。作为形成球状体的方法,例如有,在具有细胞粘附性低的表面的U底的孔中使在细胞悬浮的状态下形成球状体的方法;使细胞在粘附于规定的凹凸结构面上的状态下形成球状体的方法;悬滴法;一边使包含培养基的细胞培养腔室旋转一边培养大量的细胞从而制作球状体的方法等。本发明的组合物所包含的人毛乳头细胞的细胞群优选为通过悬滴法而形成的球状体。通过在组合物中包含经过了球状体形成的非胎儿来源的人毛乳头细胞的细胞群,从而重构具有毛囊的人皮肤组织的效率上升。
形成每1个球状体的人毛乳头细胞的细胞群所包含的人毛乳头细胞的数可以为例如1×10个~1×10
在一实施方案中,本发明的组合物所包含的非胎儿来源的人毛乳头细胞是经Wnt信号激活剂刺激的非胎儿来源的人毛乳头细胞。所谓Wnt信号,是指促进β-联蛋白的核转运、发挥作为转录因子的功能的一系列作用。本信号起因于细胞间相互作用,包括例如,从某细胞分泌的称为Wnt3A的蛋白质进一步作用于别的细胞,细胞内的β-联蛋白进行核转运,作为转录因子发挥作用的一系列流程。一系列流程引起以上皮间充质相互作用为例的器官构建的最初现象。已知Wnt信号通过激活β-联蛋白途径、PCP途径、Ca
Wnt信号激活剂可以是Wnt配体家族蛋白质或Wnt激动剂。作为Wnt配体家族蛋白质,可列举例如Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16等,可以将这些Wnt配体家族蛋白质组合使用。
作为Wnt激动剂,可列举例如糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂、R-spongin(海绵硬蛋白)1~4、Norrin等。作为GSK-3抑制剂,可列举例如,CHIR99021、双吲哚(靛玉红)化合物(BIO)((2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟)、其丙酮肟类似物BIO-丙酮肟((2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-丙酮肟)、噻二唑烷(TDZD)类似物(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)、氧代噻二唑烷-3-硫酮类似物(2,4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮)、噻吩基-α-氯甲基酮化合物(2-氯-1-(4,4-二溴噻吩-2-基)-乙酮)、苯基-α-溴甲基酮化合物(α-4-二溴苯乙酮)、含有噻唑的脲化合物(N-(4-甲氧基苄基)-N’-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲)、GSK-3β肽抑制剂例如H-KEAPPAPPQSpP-NH
Wnt信号激活剂的添加量不特别限制,可以由本领域技术人员适当决定。例如,对毛乳头细胞使用CHIR99021作为Wnt信号激活剂的情况下,其量可以以例如0.1μM~10μM左右进行刺激,但不限于这样的量。
本发明的组合物除了上述的细胞之外,还可以包含例如能够生物相容的物质。能够生物相容的物质可以是例如,水、生理盐水、磷酸缓冲液、细胞培养用培养基、生物相容性水凝胶(脱乙酰壳多糖凝胶、胶原蛋白凝胶、明胶、肽凝胶、层粘连蛋白凝胶和纤维蛋白凝胶等)等,但不限于这些。
本发明的组合物优选在具备多孔膜的培养基材上制备。具备多孔膜的培养基材可以使用例如,细胞培养插件。本发明的组合物的制造方法在后面叙述。
通过将本发明的组合物应用于人、非人哺乳动物,能够在所应用的部位重构具有毛囊的人皮肤组织。
2.具有毛囊的人皮肤组织模型动物
在一实施方案中,本发明的组合物应用于非人哺乳动物。由此,获得了具有毛囊的人皮肤组织模型动物。作为非人哺乳动物,可列举例如,大鼠、小鼠、豚鼠、狨、兔、狗、猫、绵羊、猪、山羊、猴、黑猩猩或者它们的免疫系统被抑制的非人哺乳动物等,优选为免疫系统被抑制的非人哺乳动物。发明的具有毛囊的人皮肤组织模型动物的制造方法在后面叙述。
可以对本发明的具有毛囊的人皮肤组织模型动物应用期待生发或育发效果的候选物质,通过例如,观察由毛囊的生发状态、毛囊组织的状态、与生发相关的标志物等,从而评价候选物质的生发或育发效果。作为候选因子,可以是例如,低分子化合物、肽、核酸、蛋白质、哺乳动物(例如,小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、猴、人等)的细胞、组织提取物或细胞培养上清、植物来源的化合物或提取物(例如,生药提取物、生药来源的化合物)、和微生物来源的化合物或提取物或培养产物等。另外,例如,可以评价本发明的组合物所包含的人毛乳头细胞的供体、培养条件等的差异对所形成的毛囊和/或由毛囊的生发的影响。
3.用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物的制造方法、和由此获得的用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物
在一实施方式中,用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物的制造方法包括:
工序(1),制备包含非胎儿来源的人毛乳头细胞的球状体,
工序(2),将所述球状体、人表皮细胞和人真皮细胞混合而进行培养。
在本发明的组合物的制造方法中,制备包含非胎儿来源的人毛乳头细胞的球状体的工序可以应用例如,在具有细胞粘附性低的表面的U底的孔中使在细胞悬浮的状态下形成球状体的方法;使细胞在粘附于规定的凹凸结构面上的状态下形成球状体的方法;悬滴法;一边使包含培养基的细胞培养腔室旋转一边培养大量的细胞从而制作球状体的方法等,但优选为悬滴法。
悬滴法是指将包含细胞的培养液的液滴滴加在培养皿的盖的顶部内侧,或者利用特殊的培养工具(例如,Elplasia MPc(クラレ社、日本)),从而制作液滴,通过表面张力将培养液内的细胞以液滴的状态培养的方法。这样通过培养,可以使细胞受到与培养基材表面的接触的影响为最小限。
包含非胎儿来源的人毛乳头细胞的球状体、人表皮细胞和人真皮细胞可以根据目的而制备各自的细胞数(或球状体的数),例如,可以以球状体:人表皮细胞:人真皮细胞为10~10000:0.1×10
在一实施方案中,上述工序(1)在Wnt信号激活剂的存在下实施。通过Wnt信号激活剂而激活了的人毛乳头细胞中毛囊的重构被进一步促进。用Wnt信号激活剂处理人毛乳头细胞的时间为6小时~120小时、优选为12小时~108小时、更优选为24小时~96小时、进一步优选为36小时~84小时。
在一实施方案中,本发明的方法中使用的人表皮细胞是经细胞外基质蛋白质或其衍生物刺激的人表皮细胞。作为刺激人表皮细胞的方法,可列举例如,用添加了细胞外基质蛋白质或其衍生物的培养基进行培养的方法、在涂布了细胞外基质蛋白质或其衍生物的培养基材上培养的方法等。优选为在涂布了细胞外基质蛋白质或其衍生物的培养基材上培养的方法。涂布的方法按照公知的方法即可,不特别限定。通过使用经细胞外基质蛋白质或其衍生物刺激的人表皮细胞,毛囊的重构被进一步促进。
在一实施方案中,本发明的方法所包含的工序(2)是在具备多孔膜的培养基材上培养的工序。具备多孔膜的培养基材可以使用例如,市售的细胞培养插件。多孔膜的平均孔径可以适当选择,例如为约0.01μm~约100μm、优选为0.05μm~50μm、更优选为0.1μm~25μm、最优选为1μm~10μm。
在一实施方案中,工序(2)将所述球状体、人表皮细胞和人真皮细胞混合而得的悬浮液应用于具备多孔膜的培养基材上,培养规定时间(例如,培养基等的液体成分排出的时间、例如0.5小时~3小时)。由此,在培养基材上形成片状的组合物。
在一实施方案中,通过实施上述的方法,可以获得用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物。
4.具有毛囊的人皮肤组织模型动物的制造方法
本发明提供具有毛囊的人皮肤组织模型动物的制造方法。在一实施方案中,具有毛囊的人皮肤组织模型动物通过包括将上述的组合物应用于非人哺乳动物的工序的方法来制造。
在一实施方案中,将本发明的组合物应用于非人哺乳动物的工序可以通过例如,将非人哺乳动物的任意部位(例如背部)的皮肤切开任意的大小,在切开的部位移植组合物,从而实施。切开部位的大小可以根据所应用的组合物的大小和形态(悬浮液形态、或片形态等)等而适当设定,因而不特别限定。另外,切开部位的深度依赖于所应用的非人哺乳动物的皮肤的厚度,因此不限定。在通过切开而皮肤被除去的部位应用本发明的组合物,与切开部位周围的皮肤一起缝合,从而可以移植组合物。应用组合物之后,通过任意的敷料等保护应用部位,防止组合物的物理脱落。
实施例
以下,基于实施例更详细地说明本发明,但这些实施例不对本发明造成任何限定。
<实施例1:重构皮肤的制作>
(1)细胞的准备
毛乳头细胞由人毛囊(20~65岁、男性)使用手术刀和镊子分离毛乳头区域,然后在培养皿中静置,通过MesenPRO培养基(Thermo fisher社)进行培养,获得毛乳头细胞。人成纤维细胞和表皮细胞从岩井化学药品购买市售的细胞而准备。
(2)细胞的制备
对分离的人毛乳头细胞添加CHIR99021(Axon Medchem社)3μM而进行培养,然后通过使用Elplasia MPc(クラレ社、日本)的悬滴法形成球状体。
人表皮细胞在用iMatrix-511(ニッピ社)涂布了的培养烧瓶上通过Epilife培养基(Thermo fisher社)进行培养。
人成纤维细胞用将DMEM培养基与F12培养基以3:1进行混合,包含5%FBS和40ng/ml bFGF(PeproTech社)、20ng/ml EGF(PeproTech社)、B27(注册商标)补剂(Thermo fisherScientiFic K.K.)的培养基进行培养。
(3)重构皮肤的形成
将包含人成纤维细胞300万~600万个、人表皮细胞300万~600万个、人毛乳头球状体100~1000个的混合物静置在市售的细胞培养插件(コーニング社)中,在37℃孵育器中短时间培养直到溶液被排出、仅残存细胞,制备移植物。
(4)移植物的移植
将麻醉下的SCID个体(チャールズリバー社)的背部皮肤以约1~2cm×约1~2cm的大小切开,将制备的移植物应用于切开部位,将其与周围的皮肤缝合。然后,用敷料和绷带保护移植部。约10天之后,除去敷料,在约2~3个月后确认重构皮肤的有无,用带相机的体视显微镜进行照片拍摄。其结果确认了在移植片的移植部位生发(图1)。
<实施例2:重构皮肤的组织分析>
摘出重构皮肤,用4%多聚甲醛溶液固定一晚,然后制成石蜡包埋组织块。用切片机制成4μm厚度的组织切片,然后实施各种组织染色。将实施了亲水处理的组织切片用一般的方法进行H.&E.染色,用AxioScan(zeiss社)进行照片拍摄(图2)。
另外,为了确认包含重构的毛囊的组织是否是由人细胞构成的组织,通过一般的方法实施以人基因组特异性重复序列(Alu序列)为探针的原位(in situ)杂交(以下ISH),同样地实施照片拍摄(图3)。
进而实施特异性地识别毛干的抗体AE13(Abcam社)的免疫染色与Alu-ISH的双重染色(图4)。免疫染色和ISH的基本技法参照“ポストゲノム研究時代の免疫染色/in situハイブリダイゼーション(宿主基因组研究时代的免疫染色/原位杂交)”(羊土社)来实施。
其结果确认了包含毛囊的、重构的皮肤组织是移植的人细胞来源的。另外,也能够确认形成了毛干。
<实施例3:荧光标记的毛乳头球状体的跟踪实验>
将在CHIR99021 3uM存在下培养的毛乳头细胞用红色荧光色素PKH-26(シグマアルドリッチ社)按照附带的方案进行标记(图5)。制作包含标记的毛乳头球状体的重构皮肤的结果是,在作为毛囊形成的基础的毛乳头部位确认了红色的荧光。由此得出在重构皮肤中确认的毛囊是通过毛乳头球状体诱导形成的结论(图5)。
<实施例4:利用球状体化的毛乳头细胞的有无、和CHIR99021刺激的有无来确认具有毛囊的人皮肤组织的重构的能力>
除了球状体化的毛乳头细胞的有无、和CHIR99021刺激的有无的条件以外,按照实施例1中记载的方法尝试在SCID小鼠中重构具有毛囊的人皮肤组织。将结果在以下显示。
表1
※1:确认的毛囊数为少数,表皮细胞的一部分为小鼠来源。
- 用于重构具有毛囊的人皮肤组织的组合物、人皮肤组织模型动物及其制造方法
- 通过微波辐照产生的具有提高的人参皂苷Rg3、Rg5和Rk1含量比的人参属植物提取物、制备所述人参属植物提取物的方法以及包含所述人参属植物提取物的组合物