肺炎球菌融合蛋白疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月12日提交的美国临时申请第62/730,199号的权益，所述临时申请的内容特此整体并入本文。

背景技术

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)仍是严重疾病的主要原因，所述严重疾病包括全世界儿童和成人中的菌血症、败血症、脑膜炎和肺炎。婴儿、幼儿、老年和患有某些潜在医学疾患的受试者中的发病率和死亡率高。

肺炎链球菌是在约5-10％健康成人和20-40％健康儿童中定殖鼻咽的革兰氏阳性包囊球菌(Gram-positive encapsulated coccus)。当肺炎链球菌携载至耳咽管、鼻窦、肺脏、血流、脑膜、关节空间、骨骼和腹腔中时，正常定殖变得具有感染性。肺炎链球菌感染是菌血症、肺炎、脑膜炎、窦炎和急性中耳炎的最常见原因[CDC，2010]。

肺炎球菌疾病可为侵袭性或非侵袭性的。最常见形式的非侵袭性疾病非菌血症性肺炎球菌肺炎仍是肺炎住院的最常见原因中的一种。侵袭性肺炎球菌疾病(Invasivepneumococcal disease，IPD)定义为从正常无菌部位(例如脑脊髓液、血液、关节液、胸膜液或腹膜液)分离的肺炎链球菌。在年龄极值即在老年成人和年龄小于2岁的幼儿中存在IPD的最高发生率。在美国，在第一种肺炎球菌疫苗出现之前，肺炎链球菌每年在年龄小于5岁的儿童中导致约17,000例侵袭性疾病，包括700例脑膜炎和200例死亡[CDC，2000]。在发展中国家报道了最高发病率和死亡率，但疾病负担在工业化国家中也相当大。

肺炎链球菌具有使得生物体能够避开免疫系统的若干毒力因子。实例包括防止宿主免疫细胞吞噬作用的多糖囊，抑制补体介导的调理作用的蛋白酶和引起宿主细胞裂解的蛋白质。在多糖囊中，复合多糖的存在形成肺炎球菌分化成不同血清型的基础。迄今为止，已鉴定出接近100种肺炎链球菌血清型。

两种针对肺炎链球菌的疫苗当前在美国可用：肺炎球菌缀合疫苗(PCV13或

因此，医学上需要提供针对宽范围的肺炎链球菌血清型的T细胞依赖性免疫的疫苗。

发明内容

本公开解决了用于预防和/或治疗肺炎球菌感染的合适技术的缺乏。尤其，本公开解决了在提供具有保护免患侵袭性肺炎球菌疾病和肺炎的足够免疫原性的疫苗方面的挑战。本文所描述的技术可诱导T细胞和B细胞反应和/或提供针对宽范围的肺炎链球菌血清型(包括一种或多种未包括在市售疫苗例如PCV13或PPSV23中的血清型)的免疫。

在一些实施方案中，当向受试者施用时，本文所描述的融合蛋白可诱导更高的Th17反应，与由融合蛋白的单个抗原性组分所诱导的Th17反应相比，高至少25％或更多，包括例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或更多。在一些实施方案中，当向受试者施用时，本文所描述的融合蛋白可诱导更高的Th17反应，与由融合蛋白的单个抗原性组分所诱导的Th17反应相比，高至少1.1倍或更多，包括例如至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或更多。

在一些实施方案中，当向受试者施用时，本文所描述的融合蛋白可诱导针对一种或多种代表性非疫苗肺炎球菌血清型的免疫反应，所述肺炎球菌血清型不包括在市售疫苗例如PCV13或PPSV23中。在一些实施方案中，当向受试者施用时，本文所描述的融合蛋白可诱导针对一种或多种选自由6B、16F、15A和35B组成的组的非疫苗肺炎球菌血清型的免疫反应。

附图说明

当与附图一起阅读时，将根据各种说明性实施方案的以下描述更充分地理解本文所描述的本发明教导内容。应理解，下文所描述的附图仅出于说明的目的，而并不旨在以任何方式限制本发明教导内容的范围。

图1是示例性CP1融合蛋白的示意图。这种示例性CP1融合蛋白包含生物素结合蛋白例如截短根瘤菌抗生物素蛋白(rhizavidin)(例如，野生型根瘤菌抗生物素蛋白的氨基酸45-179(标示为Rhavi))、第一接头(例如，GGGGSSS接头)、SP1500多肽(例如，肺炎链球菌蛋白SP1500的氨基酸27-278)、第二接头(例如，氨基酸序列或接头AAA)和SP0785多肽(例如，肺炎链球菌蛋白SP0785的氨基酸33-399)。在一些实施方案中，CP1融合蛋白还可包含His标签。对于GGGGSSS接头，SSS氨基酸序列可来自PET21/24b质粒上的Sac I位点，其中添加了GGGG氨基酸序列以产生具有最小空间位阻的柔性接头。或者，可合成GGGGSSS接头。AAA氨基酸序列可来自PET21/24b质粒上的Not I位点，或者是合成的。

图2说明对示例性融合蛋白CP1的SP1500和SP0785多肽组分的免疫反应。左图显示对示例性融合蛋白CP1的SP1500多肽和SP0785多肽的Th17反应。Th17反应显示为在用单独的霍乱毒素或用佐以霍乱毒素的SP1500或SP0785多肽免疫接种的小鼠的外周血样品刺激后培养基中分泌的IL-17A的几何平均浓度。图上的每个点代表一只小鼠的分泌的IL-17A。右图显示了在用单独的霍乱毒素或用佐以霍乱毒素的SP1500或SP0785多肽免疫接种以及用肺炎链球菌鼻内攻击后免于肺炎链球菌定殖的保护。图上的每个点代表一只小鼠的每次鼻部洗涤的肺炎链球菌CFU。两个图中的水平条分别代表每个组的分泌的IL-17A的几何平均值(左图)和每次鼻部洗涤的CFU的几何平均值(右图)。通过曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)对数据进行统计分析。CT：霍乱毒素；CFU：菌落形成单位；ELISA：酶联免疫吸附测定；IL-17A：白介素17A。**p<0.01；***p<0.001。

图3说明对示例性融合蛋白CP1的免疫反应。左图显示了对示例性融合蛋白CP1的Th17反应。Th17反应显示为在用截短根瘤菌抗生物素蛋白(Rhavi)或CP1(均佐以霍乱毒素)免疫接种的小鼠的外周血样品刺激后培养基中分泌的IL-17的几何平均浓度。图上的每个点代表一只小鼠的分泌的IL-17A。右图显示了在用截短根瘤菌抗生物素蛋白(Rhavi)、CP1或杀灭的(灭活的)肺炎球菌全细胞(WCC)(佐以霍乱毒素)免疫接种和用肺炎链球菌鼻内攻击后免于肺炎链球菌定殖的保护。图上的每个点代表一只小鼠的每次鼻部洗涤的肺炎链球菌CFU。两个图中的水平条分别代表每个组的分泌的IL-17A的几何平均值(左图)和每次鼻部洗涤的CFU的几何平均值(右图)。通过曼-惠特尼U检验对数据进行统计分析。CT：霍乱毒素；CFU：菌落形成单位；IL-17A：白介素17A；rhavi：截短根瘤菌抗生物素蛋白；(全长根瘤菌抗生物素蛋白的氨基酸45-179)。***p<0.001。

图4说明在CP1免疫血清中存在针对代表性肺炎链球菌血清型(例如，血清型6B)的功能抗体。在改良集中调理吞噬测定(COPA)中将肺炎链球菌血清型6B与来自用佐以磷酸铝的CP1免疫接种的两只兔子(87和88)中的每一者的热灭活的免疫前(P0)和免疫(P3)血清在各种稀释度下一起温育。过夜温育后，计数血琼脂板上的每个稀释度和血清组合的菌落形成单位(CFU)。通过杀灭肺炎链球菌，即与免疫血清一起温育后的CFU减少，表明功能抗体的存在。图上的每个垂直条代表在指定时间点(图底部)的指定CP1血清和稀释度的每个样品的CFU/ml。

图5说明在CP1免疫血清中存在针对代表性肺炎链球菌血清型(例如，血清型15A)的功能抗体。在改良集中调理吞噬测定(COPA)中将肺炎链球菌血清型15A与来自用佐以磷酸铝的CP1免疫接种的两只兔子(87和88)中的每一者的热灭活的免疫前(P0)和免疫(P3)血清在1/2稀释度下一起温育。过夜温育后，计数血琼脂板上的每种血清的菌落形成单位(CFU)。通过杀灭肺炎链球菌，即与免疫血清一起温育后的CFU减少，表明功能抗体的存在。图上的每个垂直条代表在指定时间点(图底部)的指定CP1血清的每个样品的CFU/ml。

图6说明在CP1免疫血清中存在针对代表性肺炎链球菌血清型(例如，血清型35B)的功能抗体。在改良集中调理吞噬测定(COPA)中将肺炎链球菌血清型35B与来自用佐以磷酸铝的CP1免疫接种的两只兔子(87和88)中的每一者的热灭活的免疫前(P0)和免疫(P3)血清在1/2稀释度下一起温育。过夜温育后，计数血琼脂板上的每种血清的菌落形成单位(CFU)。通过杀灭肺炎链球菌，即与免疫血清一起温育后的CFU减少，表明功能抗体的存在。图上的每个垂直条代表在指定时间点(图底部)的指定CP1血清的每个样品的CFU/ml。

图7说明针对代表性肺炎链球菌血清型的功能抗体的存在。在改良集中调理吞噬测定(COPA)中将肺炎链球菌血清型6B(A组)、16F(D组)、15A(B组)和35B(C组)分别与来自用佐以磷酸铝的CP1免疫接种的兔子(87、88和1762)的热灭活的免疫前(P0)和免疫(P3)血清在各种稀释度下一起温育。通过杀灭肺炎链球菌显示功能抗体的存在。结果表示为相对于与匹配免疫前(P0)血清一起温育，在与免疫(P3)血清一起温育后的杀灭活性百分比，即肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)的减少百分比。图A-D的每个垂直条代表在指定CP1血清(每个图底部)的指定稀释度下观测到的针对指定肺炎链球菌血清型(每个图顶部)的杀灭活性百分比。

图8说明与SP1500或SP0785多肽相比对示例性融合蛋白CP1的免疫反应(例如，Th17反应)。小鼠用佐以霍乱毒素的CP1、SP1500或SP0785多肽免疫接种，或者用佐以霍乱毒素的Rhavi蛋白(对照)免疫接种。Th17反应显示为用纯化的SP0785多肽(图A)、纯化的SP1500多肽(图B)或杀灭的(灭活的)肺炎球菌全细胞(WCV；图C)对免疫接种小鼠的外周血样品刺激后培养基中分泌的IL-17A的几何平均浓度。图上的每个点代表一只小鼠的分泌的IL-17A。水平条代表每个组的分泌的IL-17A的几何平均值。CT：霍乱毒素。

图9说明与融合蛋白SP0785-接头(SSSGG)-SP1500-接头(SSVDKL)-PdT相比对示例性融合蛋白CP1的免疫反应(例如，Th17反应)。小鼠用佐以霍乱毒素的CP1或SP0785-接头(SSSGG)-SP1500-接头(SSVDKL)-PdT免疫接种，或者用佐以霍乱毒素的Rhavi蛋白(对照)免疫接种。Th17反应显示为用纯化的SP0785多肽(图A)或纯化的SP1500多肽(图B)对免疫接种小鼠的外周血样品刺激后培养基中分泌的IL-17A的几何平均浓度。图上的每个点代表一只小鼠的分泌的IL-17A。水平条代表每个组的分泌的IL-17A的几何平均值。CT：霍乱毒素。

图10说明与SP0785、SP1500和Rhavi多肽的混合物(未缀合)相比，对示例性融合蛋白CP1的免疫反应(例如，Th17反应)。小鼠用佐以霍乱毒素的CP1或者SP0785、SP1500和Rhavi多肽的混合物(未缀合)免疫接种，或者用佐以霍乱毒素的Rhavi蛋白(对照)免疫接种。Th17反应显示为用纯化的SP0785多肽(图A)、纯化的SP1500多肽(图B)或杀灭的(灭活的)肺炎球菌全细胞(WCV；图C)对免疫接种小鼠的外周血样品刺激后培养基中分泌的IL-17A的几何平均浓度。图上的每个点代表一只小鼠的分泌的IL-17A。水平条代表每个组的分泌的IL-17A的几何平均值。CT：霍乱毒素；混合物：SP0785、SP1500和Rhavi多肽的混合物(未缀合)。

图11说明示例性融合蛋白CP1和融合蛋白SP0785-接头(SSSGG)-SP1500-接头(SSVDKL)-PdT(PdT融合物)对绵羊红细胞的溶血活性。将绵羊红细胞与阳性对照蛋白肺炎球菌溶血素(pneumolysin)(Ply)、类肺炎球菌溶血素(pneumolysoid)PdT、CP1或融合蛋白SP0785-接头(SSSGG)-SP1500-接头(SSVDKL)-PdT在x轴上指示的浓度下一起温育。如通过上清液的OD

某些定义

在本申请中，除非另外从上下文显而易见，否则(i)术语“一”可理解为是指“至少一个/种”；(ii)术语“或”可理解为是指“和/或”；(iii)术语“包含”和“包括”可理解为涵盖详细列举的组分或步骤，无论其自身或连同一个或多个额外组分或步骤呈现均如此；并且(iv)术语“约”和“大约”可理解为容许如本领域的普通技术人员所理解的标准偏差；并且(v)在提供范围的情况下，包括端点。

约：术语“约”在提及值而用于本文中时是指在所提及的值的情形下类似的值。一般来说，熟悉所述情形的本领域技术人员应了解由所述情形下的“约”所涵盖的相关变化程度。举例来说，在一些实施方案中，术语“约”可涵盖介于所提及的值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低内的一系列值。

施用：如本文所用的术语“施用”通常是指向受试者或系统施用组合物以实现作为组合物或包括于组合物中的剂的递送。本领域的普通技术人员应意识到可在适当情形下用于向例如人类的受试者的施用的各种途径。举例来说，在一些实施方案中，施用可为经眼、经口、肠胃外、局部等。在一些特定实施方案中，施用可为经支气管(例如通过支气管滴注)、经颊、经皮(其可为或包含例如局部至真皮、皮内、皮间、透皮等中的一者或多者)、经肠、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、室内、特定器官内(例如肝内)、经粘膜、经鼻、经口、经直肠、皮下、舌下、局部、经气管(例如通过气管内滴注)、经阴道、经玻璃体等。在一些实施方案中，施用可涉及仅单次给药。在一些实施方案中，施用可涉及施用固定次数的给药。在一些实施方案中，施用可涉及作为间歇性(例如在时间上分隔开的多个剂量)和/或周期性(例如由恒定时间段分隔开的单独剂量)给药的给药。在一些实施方案中，施用可涉及连续给药(例如灌注)持续至少所选时间段。

剂：一般来说，如本文所用的术语“剂”可用于指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖、脂质、小分子、金属或其组合或复合物。在适当情形下，如本领域技术人员从上下文显而易见，所述术语可用于指作为或包含细胞或生物体或其部分、提取物或组分的实体。可替代地或另外，如上下文显而易见，所述术语可用于指天然产物，这是因为其发现于自然界中和/或从自然界获得。在一些情况下，此外如从上下文显而易见，所述术语可用于指一种或多种人造实体，这是因为其是经由人工动作设计、工程改造和/或产生和/或在自然界中未发现。在一些实施方案中，剂可以分离的形式或纯形式利用；在一些实施方案中，剂可以粗物质形式利用。在一些实施方案中，潜在剂可以集合或文库形式，例如可被筛选以鉴定或表征其内的活性剂的形式提供。在一些情况下，术语“剂”可指作为或包含聚合物的化合物或实体；在一些情况下，所述术语可指包含一种或多种聚合部分的化合物或实体。在一些实施方案中，术语“剂”可指不为聚合物和/或基本上不含任何聚合物和/或基本上不含一种或多种特定聚合部分的化合物或实体。在一些实施方案中，所述术语可指缺乏或基本上不含任何聚合部分的化合物或实体。

氨基酸：在其最广泛意义上，如本文所用的术语“氨基酸”是指可例如经由形成一个或多个肽键而并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通式结构H

抗体：如本文所用的术语“抗体”是指包括足以赋予与特定目标抗原的特异性结合的典型免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域中已知，如在自然界中产生的完整抗体是大约150kDa四聚体剂，其由彼此缔合成通常称为“Y形”结构的结构的两个相同重链多肽(各自约50kDa)和两个相同轻链多肽(各自约25kDa)构成。每条重链由以下构成：至少四个结构域(各自约110个氨基酸长)—氨基末端可变(VH)结构域(位于Y结构的顶端处)，接着是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端CH3(位于Y的茎的基底处)。称为“开关”的短区连接重链可变区和恒定区。“铰链”连接CH2结构域和CH3结构域与抗体其余部分。这个铰链区中的两个二硫键使完整抗体中的两个重链多肽彼此连接。每条轻链由以下构成：两个结构域—氨基末端可变(VL)结构域，接着是羧基末端恒定(CL)结构域，其通过另一“开关”彼此间隔开。完整抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体构成，其中重链和轻链是通过单个二硫键彼此连接；另外两个二硫键使重链铰链区彼此连接，以使得二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也通常在CH2结构域上被糖基化。天然抗体中的每个结构域具有特征在于以下的结构：由相对于彼此包装于压缩反平行β桶中的两个β折叠(例如3股、4股或5股折叠)形成的“免疫球蛋白折叠”。每个可变结构域含有三个称为“互补决定区”(CDR1、CDR2和CDR3)的高变环和四个在某种程度上不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为结构域提供结构框架的β折叠，并且使来自重链和轻链两者的CDR环区在三维空间中结合在一起以使得其产生位于Y结构顶端处的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区结合至互补系统的元件，并且也结合至包括例如介导细胞毒性的效应细胞的效应细胞上的受体。如本领域中已知，Fc区对Fc受体的亲和力和/或其他结合属性可经由糖基化或其他修饰来加以调节。在一些实施方案中，根据本发明产生和/或利用的抗体包括被糖基化的Fc结构域，包括具有被修饰或被工程化的这种糖基化的Fc结构域。出于本发明的目的，在一些实施方案中，包括如在天然抗体中发现的足够免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物可指和/或用作“抗体”，无论这种多肽是天然产生(例如通过使生物体与抗原反应而生成)或通过重组工程、化学合成或其他人工系统或方法产生均如此。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体；在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体具有为小鼠、兔子、灵长类动物或人类抗体所特有的恒定区序列。在一些实施方案中，如本领域中已知，抗体序列元件是人源化的、灵长类化的、嵌合的等。此外，如本文所用的术语“抗体”在适当实施方案中(除非另外陈述或从上下文显而易见)可指本领域已知或开发的用于在替代性呈现中利用抗体结构性和功能性特点的构建体或格式中的任一者。举例来说，在一些实施方案中，根据本发明利用的抗体呈选自但不限于以下的格式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如

抗原：如本文所用的术语“抗原”是指(i)诱导免疫反应的剂；和/或(ii)结合至T细胞受体(例如当通过MHC分子呈递时)或结合至抗体的剂。在一些实施方案中，抗原诱导体液反应(例如包括抗原特异性抗体产生)；在一些实施方案中，抗原诱导细胞反应(例如涉及T细胞，所述T细胞的受体特异性地与抗原相互作用)。在一些实施方案中，抗原诱导体液反应和细胞反应。在一些实施方案中，抗原结合至抗体并且可诱导或可不诱导生物体中的特定生理反应。一般来说，抗原可为或包括例如小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚合物(在一些实施方案中除生物聚合物以外(例如除核酸或氨基酸聚合物以外))等的任何化学实体中。在一些实施方案中，抗原是或包含多肽。在一些实施方案中，抗原是或包含多糖。本领域的普通技术人员应了解，一般来说，抗原可以分离的形式或纯形式提供，或者可替代地可以粗物质形式提供(例如连同其他材料，例如以例如细胞提取物的提取物或含有抗原的来源的其他相对粗制剂形式)。在一些实施方案中，根据本发明利用的抗原是以粗物质形式提供。在一些实施方案中，抗原为重组抗原。在一些实施方案中，抗原为在向受试者施用后诱导针对所述多肽或多糖的特异性和/或临床上相关的免疫反应的多肽或多糖。在一些实施方案中，选择抗原以诱导针对所述多肽或多糖的特异性和/或临床上相关的免疫反应。

与……相关联：当术语“相关联”用于本文中时，如果一个实体的存在、水平和/或形式与另一实体的存在、水平和/或形式相关，则两个实体彼此“相关联”。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或间接相互作用，以使得其与彼此物理上靠近和/或保持物理上靠近，则其与彼此物理上“相关联”。在一些实施方案中，彼此物理上相关联的两个或更多个实体彼此共价连接。在一些实施方案中，彼此物理上相关联的两个或更多个实体彼此不共价连接，但例如借助于亲和力相互作用、静电相互作用、氢键、范德华相互作用(vander Waals interaction)、疏水相互作用、磁性及其组合而非共价缔合。

结合：应理解，如本文所用的术语“结合”通常是指在两个或更多个实体之间或之中的非共价缔合。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触；间接结合涉及借助于与一个或多个中间实体物理接触进行的物理相互作用。两个或更多个实体之间的结合通常可在各种情形中的任一者下评估，包括在相互作用实体或部分隔离研究或在更复杂系统的情况下研究(例如在与载体实体共价或以其他方式缔合和/或处于生物系统或细胞中时)的情况下评估。

载体蛋白：如本文所用，术语“载体蛋白”是指蛋白质或肽，其与半抗原(例如小肽或脂质)或较低免疫原性抗原(例如多糖)偶联、复合或以其他方式缔合，并且诱导或改善针对这种偶联或复合或以其他方式缔合的半抗原(例如小肽或脂质)或较低免疫原性抗原(例如多糖)的免疫反应。在一些实施方案中，这种免疫反应是或包含针对与这种载体蛋白偶联、复合或以其他方式缔合的半抗原或较低免疫原性抗原的反应。在一些实施方案中，这种免疫反应是或包含针对载体蛋白和与这种载体蛋白偶联、复合或以其他方式缔合的半抗原或较低免疫原性抗原两者的反应。在一些实施方案中，未发生针对载体蛋白本身的明显免疫反应。在一些实施方案中，可检测到针对载体蛋白的免疫反应；在一些这样的实施方案中，针对这种载体蛋白的免疫反应强。在一些实施方案中，载体蛋白与一种或多种其他分子偶联、复合或以其他方式缔合。

定殖：如本文所用，术语“定殖”一般是指微生物在目标部位或表面处生长的能力。举例来说，术语“定殖”是指微生物(例如细菌)在宿主的解剖部位(例如粘膜、胃肠道、损伤部位、器官等)处生长的能力。

组合疗法：如本文所用，术语“组合疗法”是指其中受试者暴露于两种或更多种治疗方案(例如两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施方案中，两种或更多种方案可同时施用；在一些实施方案中，这些方案可依序施用(例如在施用任何剂量的第二方案之前施用所有“剂量”的第一方案)；在一些实施方案中，这些剂是在重叠给药方案中施用。在一些实施方案中，“施用”组合疗法可涉及向接受呈组合形式的其他剂或用药程式治疗的受试者施用一种或多种剂或用药程式治疗。为了清楚起见，组合疗法不需要单独剂以单一组合物形式一起施用(或甚至不必要同时)，但在一些实施方案中，两种或更多种剂或其活性部分可以组合组合物形式或甚至以组合化合物形式(例如作为单一化学复合物或共价实体的一部分)一起施用。

衍生物：如本文所用的术语“衍生物”或其语法等效物是指参考物质的结构类似物。也就是说，“衍生物”是显示与参考物质的显著结构类似性，例如共用核心或共有结构，但也以某些离散方式不同的物质。这种物质应称为“衍生自”所述参考物质。在一些实施方案中，衍生物是可通过化学操作由参考物质生成的物质。在一些实施方案中，衍生物是可经由执行基本上类似于生成参考物质的方法(例如与其共用多个步骤)的合成方法生成的物质。

结构域：如本文所用的术语“结构域”是指实体的区段或部分。在一些实施方案中，“结构域”与实体的特定结构性和/或功能性特点相关联，以使得当结构域与其亲本实体的其余部分物理上分离时，其基本上或完全保留特定结构性和/或功能性特点。可替代地或另外，结构域可为或包括实体的一部分，所述实体在与该(亲本)实体分离并且与不同(受者)实体连接时，基本上保留和/或赋予受者实体以在亲本实体中表征其的一种或多种结构性和/或功能性特点。在一些实施方案中，结构域是分子(例如小分子、碳水化合物、脂质、核酸或多肽)的区段或部分。在一些实施方案中，结构域是多肽的区段；在一些这样的实施方案中，结构域的特征在于特定结构性元件(例如特定氨基酸序列或序列基序、α-螺旋特性、β-折叠特性、卷曲螺旋特性、无规螺旋特性等)和/或在于特定功能性特点(例如结合活性、酶活性、折叠活性、信号传导活性等)。

剂型或单位剂型：本领域技术人员应了解，术语“剂型”可用于指用于向受试者施用的活性剂(例如治疗剂或诊断剂)的物理离散单位。通常，每个这种单位含有预定量的活性剂。在一些实施方案中，这种量是适合于根据已确定当向相关群体施用(即以治疗性给药方案)时与所需或有益结果相关的给药方案施用的单位剂量量(或其整体部分)。本领域的普通技术人员了解，向特定受试者施用的治疗组合物或治疗剂的总量由一名或多名主治医师决定并且可涉及多个剂型施用。

给药方案：本领域技术人员应了解，术语“给药方案”可用于指通常通过时间段间隔开的单独地向受试者施用的单位剂量的集合(通常超过一个)。在一些实施方案中，给定治疗剂具有可涉及一次或多次剂量的推荐给药方案。在一些实施方案中，给药方案包含多个剂量，所述多个剂量中的每一者均在时间上与其他剂量间隔开。在一些实施方案中，单独剂量是通过相同长度的时间段彼此间隔开；在一些实施方案中，给药方案包含多个剂量和间隔开单独剂量的至少两个不同时间段。在一些实施方案中，给药方案内的所有给药均具有相同单位剂量。在一些实施方案中，给药方案内的不同给药具有不同量。在一些实施方案中，给药方案包含呈第一给药量的第一剂量，接着是呈不同于第一给药量的第二给药量的一种或多种额外剂量。在一些实施方案中，给药方案包含呈第一给药量的第一剂量，接着是呈与第一给药量相同的第二给药量的一种或多种额外剂量。在一些实施方案中，给药方案在跨相关群体施用时与所需或有益结果相关(即为治疗性给药方案)。

片段：如本文所描述的材料或实体的“片段”具有包括整体的离散部分但缺乏在整体中找到的一个或多个部分的结构。在一些实施方案中，片段由这种离散部分组成。在一些实施方案中，片段包括整体的离散部分，所述离散部分共有在整体中找到的一个或多个功能特征。在一些实施方案中，片段由这种离散部分组成。在一些实施方案中，片段由以下组成或包含以下：在整体中找到的特征结构元件或部分。在一些实施方案中，例如多肽或多糖的聚合物的片段包含以下或由以下组成：如在整体聚合物中找到的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个单体单元(例如残基)。在一些实施方案中，聚合物片段包含以下或由以下组成：在整体聚合物中找到的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、25％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％单体单元(例如残基)。在一些实施方案中，整体材料或实体可称为整体的“亲本”。

同源性：如本文所用，术语“同源性”是指例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的聚合性分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，则其视为彼此“同源”。在一些实施方案中，如果聚合物分子序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％类似性(例如在对应位置处含有具有相关化学特性的残基)，则其视为彼此“同源”。举例来说，如本领域的普通技术人员所熟知，某些氨基酸通常彼此类似地分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸和/或分类为具有“极性”或“非极性”侧链。一种氨基酸取代相同类型的另一种氨基酸可常常视为“同源”取代。

同一性：如本文所用，术语“同一性”是指例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的聚合性分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，则其视为彼此“基本上同一”。举例来说，两个核酸或多肽序列的同一性百分比的计算可通过出于最佳比较目的而比对两个序列来执行(例如可将空位引入第一序列和第二序列中的一者或两者以用于最佳比对，并且可出于比较目的而忽略非同一序列)。在一些实施方案中，出于比较目的比对的序列的长度是参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或基本上100％。然后比较在对应位置处的核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的对应位置相同的残基(例如核苷酸或氨基酸)占据时，则在所述位置处分子具有同一性。考虑到为最佳比对两个序列而需要引入的空位数目和每个空位长度，两个序列之间的同一性百分比随序列共用的一致位置的数目变化。可使用数学演算法来实现序列比较和两个序列之间的同一性百分比确定。举例来说，可使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的Meyers和Miller,1989的算法来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。在一些示例性实施方案中，利用ALIGN程序进行的核酸序列比较使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。或者，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵来确定。

改善、增加、抑制或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”、“抑制”、“减少”或其语法等效物指示相对于基线或其他参考测量值的值。在一些实施方案中，适当参考测量值可为或包含特定系统中(例如单个受试者中)的测量值，所述特定系统是在缺乏(例如之前和/或之后)特定剂或治疗存在的其他方面相当的条件下，或在存在适当的相当参考剂的情况下。在一些实施方案中，适当参考测量值可为或包含在相当系统中的测量值，已知或预期所述相当系统在存在相关剂或治疗的情况下以特定方式反应。

免疫有效量或免疫有效剂量：如本文所用，“免疫有效量”或“免疫有效剂量”是指例如抗原、免疫原、免疫原性复合物、免疫原性组合物、疫苗或药物组合物的抗原或免疫原性物质的量，所述抗原或免疫原性物质在以单次剂量或以一系列剂量的一部分向受试者施用时，足以增强受试者自身对后续暴露于病原体的免疫反应。在一些实施方案中，病原体是肺炎链球菌。在一些实施方案中，免疫反应是针对肺炎链球菌的一个或多个不同血清型。在一些实施方案中，免疫反应是针对肺炎链球菌的两个或更多个不同血清型。在一些实施方案中，免疫反应是针对肺炎链球菌的九个或更多个不同血清型。在一些实施方案中，免疫反应是针对肺炎链球菌的十三个或更多个不同血清型。在一些实施方案中，免疫反应是针对肺炎链球菌的十五个或更多个不同血清型。在一些实施方案中，免疫反应是针对肺炎链球菌的二十三个或更多个不同血清型。在一些实施方案中，免疫反应是针对肺炎链球菌的二十四个或更多个不同血清型。免疫有效量可基于待治疗的受试者、受试者的种类、期望诱导的免疫反应的程度等而变化。在一些实施方案中，免疫有效量足以治疗或保护患有疾病或处于患有疾病的风险下的受试者。在一些实施方案中，免疫有效量是指无毒但足够的量，其可为在任何受试者中治疗、减弱或预防感染和/或疾病(例如细菌性感染、肺炎链球菌感染、细菌定殖、肺炎球菌定殖、与细菌性感染相关联的并发症、与肺炎球菌感染相关联的并发症等)的量。在一些实施方案中，免疫有效量足以在向受试者施用后诱导免疫保护性反应。

免疫保护性反应或保护性反应：如本文所用，“免疫保护性反应”或“保护性反应”是指介导抗原或免疫原诱导的免疫学记忆的免疫反应。在一些实施方案中，免疫保护性反应是通过向受试者施用例如抗原、免疫原、免疫原性复合物、免疫原性组合物、疫苗或药物组合物的物质来诱导。在一些实施方案中，免疫保护涉及以下中的一者或多者：主动免疫监视，相较于在未处理受试者中所观测到的反应的更快速且有效的免疫活化后反应，活化剂或病原体有效清除，接着是炎症快速消退。在一些实施方案中，免疫保护性反应是适应性免疫反应。在一些实施方案中，免疫保护性反应足以保护被免疫接种的受试者免受由疫苗所针对的一种或多种特定病原体所致的产毒性感染(例如肺炎链球菌感染)。

免疫接种：如本文所用，“免疫接种”或其语法等效物是指在受试者中诱导针对感染性生物体或剂的免疫反应(“主动免疫接种”)，或者可替代地向受试者提供针对感染性生物体或剂的免疫系统组分(“被动免疫接种”)的过程。在一些实施方案中，免疫接种涉及向受试者施用一种或多种抗原、免疫原、免疫原性复合物、疫苗、免疫分子(例如抗体)、免疫血清、免疫细胞(例如T细胞或B细胞)或药物组合物。在一些实施方案中，免疫接种是通过向受试者施用免疫有效量的例如抗原、免疫原、免疫原性复合物、免疫原性组合物、疫苗、免疫分子(例如抗体)、免疫血清、免疫细胞(例如T细胞或B细胞)或药物组合物的物质来执行。在一些实施方案中，免疫接种在受试者中引起免疫保护性反应。在一些实施方案中，主动免疫接种是通过向受试者施用例如抗原、免疫原、免疫原性复合物、疫苗或药物组合物的抗原性物质或免疫原性物质来执行。在一些实施方案中，被动免疫接种是通过向受试者施用例如免疫分子(例如抗体)、免疫血清或免疫细胞(例如T细胞或B细胞)的免疫系统组分来执行。

分离的：如本文所用，术语“分离的”或其语法等效物是指物质和/或实体已(1)从与其在最初产生(无论在自然界中和/或在实验环境中)时所缔合的组分中的至少一些分离，和/或(2)由人工设计、产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的最初与其缔合的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则其为“纯的”。在一些实施方案中，如本领域技术人员应理解，在已与例如一种或多种载体或赋形剂(例如缓冲剂、溶剂、水等)的某些其他组分组合之后，物质仍可视为“分离的”或甚至“纯的”；在这些实施方案中，物质的分离或纯度百分比是在不包括这些载体或赋形剂的情况下计算。在一些实施方案中，为给出仅一个实例，在自然界中出现的例如多肽或多糖的生物聚合物在以下情况时视为“分离的”：a)由于其衍生起源或来源而不与在自然界中在其原生状态下伴随其的组分中的一些或全部缔合；b)其基本上不含与在自然界中产生其的种类相同的种类的其他多肽或核酸；c)由来自不具有在自然界中产生其的种类的细胞或其他表达系统的组分表达或以其他方式与其缔合。因此，例如，在一些实施方案中，化学上合成或在与在自然界中产生其的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽或多糖视为“分离的”多肽或多糖。可替代地或另外，在一些实施方案中，已经受一种或多种纯化技术的多肽或多糖可在其已与a)在自然界中与其所缔合；和/或b)其在最初产生时所缔合的其他组分分离的程度上视为“分离的”多肽或多糖。

接头：如本文所用，术语“接头”用于指连接两种或更多种元件以形成多元件剂的实体。举例来说，本领域的普通技术人员应了解，其结构包括两个或更多个功能结构域或组织结构域的多肽常常包括介于使其彼此连接的这些结构域之间的一段氨基酸。在一些实施方案中，包含接头元件的多肽具有通式S1-L-S2的总体结构，其中S1和S2可相同或不同并且代表通过接头(L)彼此缔合的两个结构域。在一些实施方案中，多肽接头的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头的特征在于其趋向于不采用刚性三维结构，而是向多肽提供柔性。可在工程改造多肽(例如融合多肽)时适当地使用的各种不同接头元件是本领域中已知的(Holliger等人,1993；Poljak,1994)。

药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指其中活性剂连同一种或多种药学上可接受的载体一起配制的组合物。在一些实施方案中，活性剂以适合于施用的单位给药量存在于治疗方案中，所述治疗方案在向相关群体施用时显示统计学上显著的实现预定治疗效果的概率。在一些实施方案中，药物组合物可被专门配制以用于以固体或液体形式施用，所述固体或液体形式包括适于以下的固体或液体形式：经口施用，例如灌药(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如靶向经颊、舌下和全身吸收的片剂)、大丸剂、散剂、颗粒剂、用于向舌头施用的糊剂；肠胃外施用，例如以例如无菌溶液或悬浮液或持续释放制剂的形式通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；局部施用，例如以施用至皮肤、肺脏或口腔的乳膏、软膏或控制释放贴片或喷雾的形式；阴道内或直肠内，例如以子宫托、乳膏或发泡体的形式；舌下；经眼；透皮；或经鼻、经肺和向其他粘膜表面。

药学上可接受的：如本文所用，应用于用以配制如本文所公开的组合物的载体、稀释剂或赋形剂的术语“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与组合物的其他成分相容并且对其受者无害。

多糖：如本文所用，术语“多糖”是指聚合物碳水化合物分子，其由通过糖苷、磷酸二酯或其他键结合在一起的单糖单元的长链构成，并且在水解时得到成分单糖或寡糖。多糖的结构范围为直链至高度支链。实例包括例如淀粉和肝糖的储存多糖；例如纤维素和几丁质以及微生物多糖的结构多糖；和包括但不限于荚膜多糖(CPS)、O多糖(OPS)、核心O多糖(COPS)和脂多糖(LPS)的在微生物体中发现的抗原多糖。

多肽：如本文所用，术语“多肽”一般具有其本领域中公认的例如通过肽键彼此连接的至少三个氨基酸的聚合物的含义。本领域的普通技术人员应了解，术语“多肽”意在具有足够通用性，以便不仅涵盖具有本文中所列举的完整序列的多肽，而且也涵盖代表这些完整多肽的功能片段(即保持至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域的普通技术人员应理解，蛋白质序列一般容许一些取代而不破坏活性。因此，如本文所用的相关术语“多肽”内涵盖保持活性并且与相同类别的另一多肽共用至少约30-40％(常常大于约50％、60％、70％或80％)总体序列同一性并且进一步通常包括通常涵盖至少3-4个且常常高达20个或更多个氨基酸的具有远远更高同一性(在一个或多个高度保守区中常常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％)的至少一个区域的任何多肽。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可含有本领域中已知的各种氨基酸修饰或类似物中的任一者。适用修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。

预防：如本文结合疾病、病症和/或医学疾患所使用的术语“预防(prevent/prevention)”是指降低患上疾病、病症和/或疾患的风险，和/或延迟发作，和/或降低特定疾病、病症或疾患的一个或多个特征或症状的频率和/或严重程度。在一些实施方案中，在群体基础上评估预防以使得如果在易患疾病、病症或疾患的群体中观测到疾病、病症或疾患的一个或多个症状的发展、频率和/或强度的统计学上显著的降低，则将剂视为“预防”特定疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，当疾病、病症或疾患的发作已延迟预定时间段时，预防可视为完成。

蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”涵盖多肽。蛋白质可包括除氨基酸外的部分(例如可为糖蛋白、蛋白多糖等)和/或可以其他方式加工或修饰。本领域的普通技术人员应了解，“蛋白质”可为如由细胞(在具有或不具有信号序列的情况下)产生的完整多肽链，或者可为其特征部分。本领域的普通技术人员应了解，蛋白质有时可包括例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他手段缔合的超过一个多肽链。多肽可含有l-氨基酸、d-氨基酸或两者，并且可含有本领域中已知的各种氨基酸修饰或类似物中的任一者。适用修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”一般用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物学活性部分和/或其特征部分。

重组：如本文所用，术语“重组”意在是指被设计、被工程化、被制备、被表达、被产生、被制造和/或通过例如多肽的重组手段被分离的多肽，例如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽；从重组的组合人类多肽库分离的多肽；从转基因或以其他方式被操控以表达一个或多个基因或者编码和/或引导多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域的表达的基因组分的动物(例如小鼠、兔子、绵羊、鱼等)分离的多肽；和/或通过涉及剪接所选核酸序列元件或使所选核酸序列元件彼此连接、化学上合成所选序列元件和/或以其他方式生成编码和/或引导多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域的表达的核酸的任何其他手段制备、表达、产生或分离的多肽。在一些实施方案中，在自然界中发现这些所选序列元件中的一者或多者。在一些实施方案中，这些所选序列元件中的一者或多者被计算机模拟设计。在一些实施方案中，一个或多个这些所选序列元件由已知序列元件的突变诱发(例如体内或体外)产生，所述已知序列元件例如来自例如目标来源生物体(例如人类、小鼠等)的种系中的天然或合成来源。

参考物：如本文所用，术语“参考物”描述相对于所执行的比较的标准物或对照。举例来说，在一些实施方案中，将目标剂、动物、受试者、群体、样品、序列或值与参考或对照剂、动物、受试者、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，基本上在目标测试或测定的同时测试和/或测定参考物或对照。在一些实施方案中，参考物或对照是任选地在有形介质中实施的历史参考物或对照。通常，如本领域技术人员应理解，在与所评估的条件或情况相当的条件或情况下测定或表征参考物或对照。本领域技术人员应了解，何时存在足够类似性以证明对特定可能性参考物或对照的依赖和/或与其进行的比较。

反应：如本文所用，对治疗的“反应”可指由治疗引起或与治疗相关的受试者疾患中的任何有益变化。这种变化可包括疾患的稳定(例如在不存在治疗的情况下发生的恶化的预防)、疾患症状的改善和/或疾患治愈前景的改善等。它可指受试者反应或肿瘤反应。可根据包括临床标准和客观标准的广泛多种的标准测量受试者或肿瘤反应。用于评估反应的技术包括但不限于临床检查、正电子发射断层摄影术、胸部X射线CT扫描、MRI、超声、内视镜检法、腹腔镜术、从受试者获得的样品中的生物标志物的存在或水平、细胞学和/或组织学。可以任何适当方式选择准确反应标准，其条件是当比较受试者组和/或肿瘤组时，基于相同或相当的测定反应率标准来评估待比较的组。本领域的普通技术人员将能够选择适当标准。

风险：如根据上下文将理解，疾病、病症和/或疾患的“风险”是指特定受试者患上疾病、病症和/或疾患的可能性。在一些实施方案中，风险表示为百分比。在一些实施方案中，风险为0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％至100％。在一些实施方案中，风险表示为相对于与参考样品或参考样品组相关联的风险的风险。在一些实施方案中，参考样品或参考样品组具有已知疾病、病症、疾患和/或事件风险。在一些实施方案中，参考样品或参考样品组来自与特定受试者相当的受试者。在一些实施方案中，相对风险为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。

血清型：如本文所用，术语“血清型”也称为血清变异型，是指细菌或病毒物种内或不同受试者的免疫细胞中的不同变化。这些微生物、病毒或细胞是基于其细胞表面抗原而分类在一起，允许生物体至亚种水平的流行病学分类。具有常见抗原的血清变异型组可称为血清组或有时称为血清群。

受试者：如本文所用，术语“受试者”是指生物体，通常是哺乳动物(例如人类，在一些实施方案中包括产前人类形式)。在一些实施方案中，受试者患有相关疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，受试者展示疾病、病症或疾患的一个或多个症状或特征。在一些实施方案中，受试者不展示疾病、病症或疾患的任何症状或特征。在一些实施方案中，受试者是具有一个或多个特点的某人，所述一个或多个特点的特征在于对疾病、病症或疾患的易患性或疾病、病症或疾患风险。在一些实施方案中，受试者是患者。在一些实施方案中，受试者是施用和/或已施用诊断和/或疗法的受试者。

易患：“易患”疾病、病症或疾患的受试者处于患上疾病、病症或疾患的风险下。在一些实施方案中，易患疾病、病症或疾患的受试者不展示疾病、病症或疾患的任何症状。在一些实施方案中，易患疾病、病症或疾患的受试者尚未诊断患有疾病、病症和/或疾患。在一些实施方案中，易患疾病、病症或疾患的受试者是已暴露于与患上疾病、病症或疾患相关联的条件的受试者。在一些实施方案中，患上疾病、病症和/或疾患的风险是基于群体的风险(例如患有疾病、病症或疾患的受试者的家族成员)。

症状减少：如本文所用，当特定疾病、病症或疾患的一个或多个症状程度(例如强度、严重程度等)和/或频率降低例如至统计学上和/或临床上显著或相关的水平时，“症状减少”。出于清楚起见，将特定症状发作延迟视为症状频率降低的一种形式。

治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(以及“治疗(treat/treating)”)是指部分或完全缓解、改善、减轻、抑制特定疾病、病症和/或疾患的一个或多个症状、特点和/或病因、延迟其发作、降低其严重程度和/或减少其发生的任何疗法施用。在一些实施方案中，这种治疗可属于不展现相关疾病、病症和/或疾患的征象的受试者和/或仅展现疾病、病症和/或疾患的早期征象的受试者。可替代地或另外，这种治疗可属于展现相关疾病、病症和/或疾患的一个或多个确立征象的受试者。在一些实施方案中，治疗可属于已诊断为患有相关疾病、病症和/或疾患的受试者。在一些实施方案中，治疗可属于已知具有统计学上与增加的患上相关疾病、病症和/或疾患的风险相关的一个或多个易患性因素的受试者。

疫苗接种：如本文所用，术语“疫苗接种”是指例如向致病原施用旨在生成免疫反应的组合物。出于本发明的目的，疫苗接种可在暴露于致病原之前、期间和/或之后并且在一些实施方案中在暴露于致病原之前、期间和/或之后不久施用。在一些实施方案中，疫苗接种包括在时间上适当间隔开的疫苗接种组合物的多次施用。在一些实施方案中，疫苗接种引发免疫接种。

具体实施方式

本公开总体上涉及肺炎链球菌的新型免疫原性融合蛋白，其可用于例如在具有肺炎球菌感染风险或患有肺炎球菌感染的受试者中诱导和/或增加免疫保护反应或减少肺炎球菌定殖。

两种肺炎链球菌疫苗当前在美国可用。PCV13，一种13价缀合疫苗，已被批准用于在儿童中预防由疫苗中所含有的13个血清型引起的侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)以及用于在成人中预防肺炎和IPD。在这种疫苗中，13个肺炎球菌血清型的糖与CRM197蛋白的共价缀合产生糖-蛋白质缀合物，其能够诱导针对由糖代表的13个肺炎球菌血清型中的一者或多者的T细胞依赖性免疫反应。[PREVNAR 13处方信息，2017]。尽管在这种疫苗批准之后，PCV13中所含有的多重耐药性血清型的肺炎链球菌感染似乎减少，但注意，多重耐药性血清型35B、23A、23B和15B感染增加，所述血清型仅仅是PCV13中未包括的超过84种已知肺炎链球菌血清型中的几个。此外，据报道，PCV13具有针对血清型3的边际活性，这是因为其盛行率存留于群体中[Richter等人,2014]。

第二种疫苗PPSV23是一种23价多糖疫苗，并且指定用于预防年龄大于50岁的成人或处于增加的肺炎球菌疾病风险下的年龄大于2岁的个人的肺炎球菌疾病。其由来自23个肺炎球菌血清型的纯化荚膜多糖构成。尽管该疫苗在与PCV13相比时具有针对更多血清型的保护潜力，但其不提供针对新出现的血清型35B、23A和23B的保护。另外，PPSV23引发刺激成熟B-淋巴细胞而非T-淋巴细胞的T细胞非依赖型多糖免疫反应。因此，这种疫苗仅诱导既不长效，也不在后续攻击时具有记忆性的免疫反应。PPSV23对于定殖并不有效。另外，多糖型疫苗不用于年龄小于2岁的婴儿和儿童，因为这些儿童对T细胞非依赖型抗原反应不良[PNEUMOVAX 23处方信息,2017；CDC,2010]。数据表明，PPSV23可保护成人和老年人免患IPD；然而，在肺炎预防中未观测到一致作用[Gruber等人,2008]。

当前公开的新型免疫原性蛋白代表了用于对患者免疫接种以抗肺炎球菌感染的当前可用选择的实质性进展。这种免疫原性蛋白可用于例如在受试者中(例如处于肺炎球菌感染风险下或患有肺炎球菌感染的受试者中)诱导和/或增加免疫保护反应或减少肺炎球菌定殖。

本公开描述了肺炎链球菌的新型免疫原性融合蛋白。在WO2014/124228中，发明人证实肺炎球菌抗原SP0785和SP1500在暴露于肺炎球菌的小鼠的再刺激的人类PBMC和脾细胞中分别引发了强烈的IL-17回忆应答。用SP0785+霍乱毒素佐剂或者SP1500+霍乱毒素佐剂对小鼠进行免疫接种，导致肺炎球菌定殖显著减少(大约100倍)。用SP0785与类肺炎球菌溶血素PdT的融合物或者与伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的多糖进一步缀合的SP0785与类肺炎球菌溶血素PdT的融合物进行免疫接种，可保护80％的小鼠免于活肺炎链球菌的致死性攻击中的败血症。用与伤寒沙门氏菌的多糖进一步缀合的SP0785、SP1500和类肺炎球菌溶血素PdT的融合物进行的免疫接种还导致肺炎球菌定殖显著减少(大约10倍)。

本文所描述和/或利用的融合蛋白提供了改善的免疫原性和对蛋白质刺激的IL-17反应，以及肺炎链球菌定殖的进一步减少和对侵袭性疾病的防御。

融合蛋白包括引起(例如，主要引起)T细胞反应或者同时引起T细胞和B细胞反应的一种、两种或更多种多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含表1中列出的一种或多种多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含表1中列出的两种多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含表1中列出的三种多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含由表1中列出的一种或多种基因编码的一种或多种多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含由表1中列出的两种或更多种基因编码的两种多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含由表1中列出的三种基因编码的三种多肽。

表1.融合蛋白的示例性多肽组分

在一些实施方案中，融合蛋白包含肺炎链球菌的一种或多种抗原多肽，其具有包含SEQ ID NO:3-8中的任一者的氨基酸序列，或其抗原性片段。在一些实施方案中，融合蛋白包含两种抗原多肽，其具有包含SEQ ID NO:3-8中的任一者的氨基酸序列，或其抗原性片段。在一些实施方案中，融合蛋白包含(i)两种抗原多肽，其具有包含SEQ ID NO:3-8中的任一者的氨基酸序列，或其抗原性片段，和(i)生物素结合部分，其包含SEQ ID NO:1或2，或其生物素结合片段。在一些这样的实施方案中，至少一种抗原多肽是或包含SP0785多肽(例如，SEQ ID NO:3-5)。在一些这样的实施方案中，至少一种抗原多肽是或包含SP1500多肽(例如，SEQ ID NO:6-8)。

在一些实施方案中，融合蛋白包含与表1中列出的肺炎链球菌多肽同源的一种或多种多肽，例如，从肺炎链球菌的不同血清型分离的SP0785多肽或SP1500多肽。肺炎链球菌的个别血清型相对于彼此包含许多突变，其中这些中的一些导致不同血清型之间的蛋白质序列不同。本领域技术人员可容易地用来自不同肺炎链球菌血清型的同源氨基酸序列替代氨基酸序列或其一部分。在一些实施方案中，抗原多肽与表1中列出的多肽或其抗原性片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的同一性。血清型变异可用于设计表1中列出的多肽的此类变体。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含表1中列出的多肽的一个或多个片段，例如，根瘤菌抗生物素蛋白的生物素结合片段，具有或不具有信号序列的SP0785多肽的抗原性片段，或者具有或不具有信号序列的SP1500多肽的抗原性片段。在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含截短突变体，其大小与表1中列出的多肽的大小接近。例如，它们可能缺乏来自一个或两个末端的至多一个、两个、三个、四个、五个、十个或二十个氨基酸(指融合蛋白中的组成多肽)。在一些实施方案中，片段是SEQ ID NO:1-8中任一者的截短片段，其缺少来自SEQ ID NO:1-8中任一者的N末端、C末端或两者的1-5、1-10或1-20个氨基酸残基。在一些实施方案中，片段是SEQ ID NO:1-8中任一者的截短片段，其缺少来自SEQID No:1-8中任一者的N末端、C末端或两者的1-10个氨基酸残基。例如，片段可缺少在SEQID NO:1-8中任一者的N末端和C末端处的10个氨基酸残基，产生缺少20个氨基酸残基的蛋白质。还考虑了内部缺失，例如1-10、11-20、21-30或31-40个氨基酸的内部缺失。

在一些实施方案中，融合蛋白包含N末端多肽和C末端多肽。在一些实施方案中，N末端多肽和C末端多肽中的一者或两者是抗原多肽，例如，具有包含SEQ ID NO:3-8中的一者或多者的氨基酸序列的多肽，或其抗原性片段或变体。在一些实施方案中，N末端多肽和C末端多肽中的一者或两者是生物素结合部分，例如具有包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的多肽，或其生物素结合片段。在一些实施方案中，N末端多肽或C末端多肽中的一者是生物素结合部分，例如具有包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的多肽，或其生物素结合片段，并且另一末端多肽是抗原多肽，例如具有包含SEQ ID NO:3-8中的一者或多者的氨基酸序列的多肽，或其抗原性片段或变体。

在一些实施方案中，N末端多肽和C末端多肽彼此直接结合。在一些实施方案中，N末端多肽和C末端多肽经由接头肽连接。当存在接头时，可调节其长度和/或氨基酸以获得更柔性、半刚性或刚性的接头。示例性的柔性肽接头显示为SEQ ID NO:37-40。接头的长度通常可以是1-40个，例如3-10个或10-30个，并且特别是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白包含一个接头。在一些实施方案中，融合蛋白包含两个接头。在一些实施方案中，一个或两个接头选自SEQ ID NO:37(GGGGSSS)和SEQ ID NO:38(AAA)。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:37(GGGGSSS)和SEQ ID NO:38(AAA)。在一些实施方案中，融合蛋白包含来自Not I限制性位点的氨基酸序列AAA残基。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:37(GGGGSSS)的接头和来自Not I限制性位点的氨基酸序列AAA残基。

表2中示出了示例性融合蛋白。

表2.示例性融合蛋白

在一些实施方案中，本公开提供了与表2中列出的融合蛋白具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白是或包含与SEQ ID NO:17-26中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白是或包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白是或包含与CP1具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含表2中所示的融合蛋白的抗原性片段。在一些实施方案中，融合蛋白是或包含SEQ ID NO:17-26中任一者的抗原性片段。例如，融合蛋白可能缺少来自SEQ ID NO:17-26中任一者的N末端、C末端或两者的至多一个、两个、三个、四个、五个、十个或二十个氨基酸。在一些实施方案中，从N末端和C末端去除相同数目的残基，而在其他实施方案中，从N末端去除的残基数目与C末端相比不同。在一些实施方案中，融合蛋白是或包含SEQ ID NO:23的抗原性片段。在一些实施方案中，融合蛋白是或包含CP1的抗原性片段。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含生物素结合部分。在一些实施方案中，融合蛋白包含生物素结合部分和一种或多种多肽抗原。在一些实施方案中，融合蛋白包含生物素结合部分和两种或更多种多肽抗原。如本文所用，“生物素结合部分”是指生物素结合多肽或蛋白质、其生物素结合片段或其生物素结合结构域。在一些实施方案中，融合蛋白的生物素结合部分包含根瘤菌抗生物素蛋白或其生物素结合片段，如WO 2012/155053中进一步描述的，所述文献的内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含生物素结合部分，所述生物素结合部分是或包含与SEQ ID NO:1的序列(根瘤菌抗生物素蛋白)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，或其生物素结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包含生物素结合部分，所述生物素结合部分是或包含与SEQ ID NO:2的序列(根瘤菌抗生物素蛋白的氨基酸45-179，标示为Rhavi)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，或其生物素结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4的序列(肺炎链球菌SP0785多肽的氨基酸33-399)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其抗原性片段。在一些实施方案中，融合蛋白包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:7的序列(肺炎链球菌SP1500多肽的氨基酸27-278)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其抗原性片段。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含以下各者：(a)生物素结合部分，所述生物素结合部分是或包含与SEQ ID NO:1的序列(根瘤菌抗生物素蛋白)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，或其生物素结合片段；(b)多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4的序列(肺炎链球菌SP0785多肽的氨基酸33-399)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其抗原性片段；和(c)多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:7的序列(肺炎链球菌SP1500多肽的氨基酸27-278)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其抗原性片段。在一些实施方案中，融合蛋白还包含一个或多个接头。在一些实施方案中，一个或多个接头选自SEQ ID NO:37(GGGGSSS)和SEQ ID NO:38(AAA)。在一些实施方案中，融合蛋白包含来自Not I限制性位点的氨基酸序列AAA残基。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:37(GGGGSSS)的接头和来自Not I限制性位点的氨基酸序列AAA残基。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含以下各者：(a)生物素结合部分，所述生物素结合部分是或包含与SEQ ID NO:2的序列(根瘤菌抗生物素蛋白的氨基酸45-179，标示为Rhavi)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，或其生物素结合片段；(b)多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4的序列(肺炎链球菌SP0785多肽的氨基酸33-399)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其抗原性片段；和(c)多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:5的序列(肺炎链球菌SP1500多肽的氨基酸27-278)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其抗原性片段。在一些实施方案中，融合蛋白还包含一个或多个接头。在一些实施方案中，一个或多个接头选自SEQ ID NO:37(GGGGSSS)和SEQ ID NO:38(AAA)。在一些实施方案中，融合蛋白包含来自Not I限制性位点的氨基酸序列AAA残基。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:37(GGGGSSS)的接头和来自Not I限制性位点的氨基酸序列AAA残基。在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含与序列SEQ ID NO:23具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，融合蛋白由氨基酸序列SEQ ID NO:23(CP1)组成。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包括表1中列出的多肽的变体或片段。在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包括由表1中列出的基因的变体或片段编码的多肽。在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白中包含的片段的大小接近全长多肽或表1中列出的多肽。例如，它们可能缺乏来自一个或两个末端的至多一个、两个、三个、四个、五个、十个、二十个或三十个氨基酸。在一些实施方案中，片段的长度为25-50个氨基酸，或者长度为50-100个、或100-150个、或150-200个、或200-250个、或250-300个、或300-350个氨基酸。在一些实施方案中，片段是由表达宿主例如大肠杆菌、昆虫细胞系(例如杆状病毒表达系统)或哺乳动物(例如人类或中国仓鼠卵巢)细胞系对信号序列的加工或部分加工产生的。上述片段或其亚片段(例如8-50、8-30或8-20个氨基酸残基的片段)优选具有下述生物活性之一，例如使释放的IL-17量增加至少1.5倍或2倍或更多(例如，作为绝对量度或相对于对照蛋白)。

每个基因和多肽的DNA和蛋白质序列可通过在公开可用的数据库(例如EntrezGene)(在万维网的NCBI NIH网站上，www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)中在肺炎链球菌TIGR4基因组中搜索基因座标签来鉴定，并且指示序列也包括在本公开的范围内。

下面更详细地描述表1的某些多肽、其变体以及构成融合蛋白的各种实施方案的组分的额外的示例性多肽和接头。

SP0785多肽(例如SEQ ID NO:3-5)及其变体

SP0785是WO 2014/124228中描述的保守的假设肺炎链球菌蛋白。在一些实施方案中，SP0785多肽是跨肺炎链球菌菌株保守的外排转运蛋白。在一些实施方案中，SP0785多肽是或包含全长SP0785多肽。例如，在一些实施方案中，全长SP0785多肽具有399个氨基酸(38kDa)，并由如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列表示。SEQ ID NO:3的氨基酸1-32预测是SP0785多肽的信号序列和跨膜结构域(全长蛋白的氨基酸1-32)。在一些实施方案中，融合蛋白包含肺炎链球菌的SP0785多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含SP0785多肽的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、367或399个连续氨基酸。

在一些实施方案中，融合蛋白的SP0785多肽包含SEQ ID NO:3所示序列[全长]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、367或399个连续氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白的SP0785多肽包含与SEQ ID NO:3所示序列[全长]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、367或399个连续氨基酸具有至少60％或更高(包括例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，融合蛋白的SP0785多肽包含SEQ ID NO:4所示序列[减去信号序列和跨膜结构域]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350或367个连续氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白的SP0785多肽包含与SEQ ID NO:4所示序列[减去信号序列和跨膜结构域]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350或367个连续氨基酸具有至少60％或更高(包括例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

序列变异发生在不同肺炎链球菌血清型之间的蛋白质水平上，并且说明来自不同肺炎链球菌血清型的SP785序列的组合的共有序列以SEQ ID NO:5提供。因此，在一些实施方案中，融合蛋白包括具有包含SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成的氨基酸序列或其抗原性片段的多肽(例如，代替具有包含SEQ ID NO:3或4之一的氨基酸序列的多肽)。在一些实施方案中，融合蛋白的SP0785多肽包含SEQ ID NO:5所示序列[共有]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350或367个连续氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白的SP0785多肽包含与SEQ ID NO:5所示序列[共有]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350或367个连续氨基酸具有至少60％或更高(包括例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

编码SP0785多肽的示例性核苷酸序列在本文以SEQ ID NO:11提供。

SP1500多肽(例如SEQ ID NO:6-8)及其变体

在WO 2014/124228中描述了SP1500。在一些实施方案中，SP1500多肽是跨肺炎链球菌菌株保守的氨基酸ABC转运蛋白、氨基酸结合多肽。在一些实施方案中，SP1500多肽是或包含全长SP1500多肽。例如，在一些实施方案中，全长SP1500多肽具有278个氨基酸(28kDa)，并由如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列表示。SEQ ID NO:6的氨基酸1-26预测是SP1500多肽的信号序列(全长蛋白的氨基酸1-26)。在一些实施方案中，融合蛋白包含肺炎链球菌的SP1500多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含SP1500多肽的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、252或278个连续氨基酸。

在一些实施方案中，融合蛋白的SP1500多肽包含SEQ ID NO:6所示序列[全长]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、252或278个连续氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白的SP1500多肽包含与SEQ ID NO:6所示序列[全长]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、252或278个连续氨基酸具有至少60％或更高(包括例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，融合蛋白的SP1500多肽包含SEQ ID NO:7所示序列[减去信号序列]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或252个连续氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白的SP1500多肽包含与SEQ ID NO:7所示序列[减去信号序列]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或252个连续氨基酸具有至少60％或更高(包括例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

序列变异发生在不同肺炎链球菌血清型之间的蛋白质水平上，并且说明来自不同肺炎链球菌血清型的SP1500序列的组合的共有序列以SEQ ID NO:8提供。在一些实施方案中，融合蛋白包括具有包含SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的氨基酸序列或其抗原性片段的多肽(例如，代替具有包含SEQ ID NO:6或7之一的氨基酸序列的多肽)。在一些实施方案中，融合蛋白的SP1500多肽包含SEQ ID NO:8所示序列[共有]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或252个连续氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白的SP1500多肽包含与SEQ ID NO:8所示序列[共有]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或252个连续氨基酸具有至少60％或更高(包括例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

编码SP1500多肽的示例性核苷酸序列在本文以SEQ ID NO:14提供。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白是非共价多重抗原呈递系统(MAPS)免疫原性复合物的组分。在一些实施方案中，MAPS复合物利用生物素或生物素衍生物与根瘤菌抗生物素蛋白之间的高亲和力(解离常数[K

根瘤菌抗生物素蛋白是抗生物素蛋白家族中的天然存在的二聚体蛋白，最早发现于菜豆的共生细菌菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)中。根瘤菌抗生物素蛋白与鸡蛋中常见的蛋白质鸡抗生物素蛋白只有22％的氨基酸同一性，但是与生物素结合相关的氨基酸残基具有高保守性[Helppolainen等,2007]。在一些实施方案中，根瘤菌抗生物素蛋白的核苷酸序列以SEQ ID NO:9示出。在一些实施方案中，根瘤菌抗生物素蛋白的氨基酸序列以SEQ IDNO:1示出。SEQ ID NO:1的氨基酸1-44预测是根瘤菌抗生物素蛋白的信号序列(全长蛋白的氨基酸1-44)。在一些实施方案中，融合蛋白包含根瘤菌抗生物素蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含根瘤菌抗生物素蛋白多肽的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150或179个连续氨基酸。

在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽包含SEQ ID NO:1所示序列[全长]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150或179个连续氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1所示序列[全长]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150或179个连续氨基酸具有至少60％或更高(包括例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽包含SEQ ID NO:2所示序列[减去信号序列]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100或135个连续氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽包含与SEQ ID NO:2所示序列[减去信号序列]的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100或135个连续氨基酸具有至少60％或更高(包括例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽是或包含SEQ ID NO:1的氨基酸50-179。在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽是或包含SEQID NO:1的氨基酸55-179。在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽是或包含SEQ ID NO:1的氨基酸60-179。在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽是或包含SEQ ID NO:1的氨基酸65-179。

在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽是或包含SEQ ID NO:1的氨基酸45-175。在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽是或包含SEQID NO:1的氨基酸45-171。在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽是或包含SEQ ID NO:1的氨基酸45-167。在一些实施方案中，融合蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白多肽是或包含SEQ ID NO:1的氨基酸45-163。

接头或间隔子

在一些实施方案中，融合蛋白包含一个或多个接头。在一些实施方案中，接头是或包含一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白包含通过接头与生物素结合部分连接的抗原多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含第一抗原多肽、第二抗原多肽、生物素结合部分和至少一个接头。在一些实施方案中，第一抗原多肽和第二抗原多肽通过接头连接。在一些实施方案中，第一抗原多肽或第二抗原多肽通过接头连接到生物素结合部分。在一些实施方案中，第一抗原多肽和第二抗原多肽通过第一接头连接；并且第一抗原多肽或第二抗原多肽通过第二接头与生物素结合部分连接。

在一些实施方案中，接头在两个蛋白质部分之间插入结构。在一些实施方案中，所述结构是或包含α螺旋。在一些实施方案中，所述结构是或包含β链。在一些实施方案中，所述结构是或包含卷曲/弯曲。在一些实施方案中，所述结构是或包含回转。在一些实施方案中，接头降低了由接头连接的两个蛋白质部分之间的空间位阻。在一些实施方案中，接头减少了由接头连接的两个蛋白质部分之间的不利相互作用。在一些实施方案中，接头包含甘氨酸和丝氨酸残基的混合物。在一些实施方案中，接头可另外包含苏氨酸、脯氨酸和/或丙氨酸残基。在一些实施方案中，接头是亲水性的。在一些实施方案中，接头是疏水性的。在一些实施方案中，接头增加了包含接头的融合蛋白的稳定性。

在一些实施方案中，接头不干扰与其连接的抗原多肽的折叠。在一些实施方案中，接头不干扰与其连接的抗原多肽的抗原性。在一些实施方案中，接头不降低与其连接的抗原多肽的抗原性。在一些实施方案中，接头不消除与其连接的抗原多肽的抗原性。在一些实施方案中，通过将多肽与连接到接头的多肽进行比较来确定接头的作用。

在一些实施方案中，接头不干扰与其连接的生物素结合部分的折叠。在一些实施方案中，接头不干扰与其连接的生物素结合部分的生物素结合能力。在一些实施方案中，接头不降低与其连接的生物素结合部分的生物素结合能力。在一些实施方案中，接头不消除与其连接的生物素结合部分的生物素结合能力。在一些实施方案中，通过比较生物素结合部分与连接到接头的生物素结合部分来确定接头的作用。

在一些实施方案中，接头不是抗原性的。在一些实施方案中，接头不引起T细胞反应。在一些实施方案中，接头不引起B细胞反应。在一些实施方案中，接头不诱导T细胞或B细胞反应。

在一些实施方案中，接头包含两个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度可以是3-100、5-100、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100、5-55、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4或2-3个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、10-15个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95个氨基酸。在一些实施方案中，接头是或包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。

在一些实施方案中，接头是柔性接头。柔性接头可用于连接需要一定程度的运动或相互作用的结构域，并且可包括小的非极性(例如Gly)或极性(例如Ser或Thr)氨基酸。Ser或Thr的并入还可通过与水分子形成氢键来维持接头在水溶液中的稳定性，并因此减少了接头与蛋白质部分之间的不利相互作用。在一些实施方案中，接头包含小的非极性(例如Gly)或极性(例如Ser或Thr)氨基酸。在一些实施方案中，接头是Gly-Ser接头。

在一些实施方案中，接头是或包含GGGGSSS(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头是或包含(GGGGS)

在一些实施方案中，接头是刚性接头。刚性接头对于保持结构域之间的固定距离并维持其独立功能很有用。当结构域的空间分离对于保持融合物中一种或多种组分的稳定性或生物活性至关重要时，刚性接头也可能有用。在一些实施方案中，接头是或包含(EAAAK)

在一些实施方案中，接头是或包含(X-Pro)

在一些实施方案中，接头是或包含(Lys-Pro)

在一些实施方案中，接头是或包含GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG接头，SEQ ID NO:58)。在一些实施方案中，接头是或包含GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG2接头，SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，接头是或包含GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGG GGAP(GAG3接头，SEQ ID NO:60)。

合适的接头或间隔子还包括具有与上述示例性接头具至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列的那些。

适用于一些实施方案的额外接头可见于2012年3月2日提交的美国专利公开第2012/0232021号和[Chen,2013]，所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白可包含标签。标签可以是N末端或C末端的。例如，可将标签添加至多肽(经由在编码DNA序列上的添加或修饰)以促进纯化、检测、溶解性或赋予蛋白质以其他所需特性。在一些实施方案中，标签可以是可用于亲和纯化的肽、寡肽或多肽。在一些实施方案中，标签是、包含或衍生自以下中的一者或多者：聚组氨酸(His)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、串联亲和纯化(TAP)、FLAG、myc、人流感血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、水泡性口腔炎病毒糖蛋白(VSV-G)、硫氧还蛋白、V5、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、钙调蛋白、Nus、S标签、脂蛋白D和半乳糖苷酶。在一些实施方案中，His标签是或包含H

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白可包含膜移位序列(MTS)，以促进将融合蛋白引入哺乳动物细胞并随后刺激细胞介导的免疫反应。示例性的膜移位序列包括Kaposi成纤维细胞生长因子的信号序列中的疏水区，突触核蛋白的MTS，触角足突变(Antennapedia)同源结构域的第三螺旋，SN50，整联蛋白3h区，HIV Tat，pAntp，PR-39，abaecin，apidaecin，Bac5，Bac7，伯氏疟原虫(P.berghei)CS蛋白，以及美国专利第6,248,558号、第6,432,680号和第6,248,558号中所述的那些MTS。

在一些实施方案中，本公开提供编码本文所描述的一种或多种多肽和/或融合蛋白的核酸，例如DNA、RNA或其类似物。本文所描述的多肽的基础DNA序列可以不影响蛋白质产物的序列的方式修饰，并且这类序列包括在本发明中。在一些实施方案中，可对DNA序列进行密码子优化以改善在宿主如细菌细胞系例如大肠杆菌、昆虫细胞系(例如，使用杆状病毒表达系统)或哺乳动物(例如，人类或中国仓鼠卵巢)细胞系中的表达。

在一些实施方案中，本公开提供了与表1、表2中提供的核酸序列或其变体或部分具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的核酸，例如DNA、RNA或其类似物。在一些实施方案中，核酸的长度为600-2000、800-1800、1000-1600、1200-1400个核苷酸。在一些实施方案中，核酸的长度为600-1600、800-1800、1000-2000、2000-3000或3000-4000个核苷酸。在一些实施方案中，核酸可用于重组产生表1或表2的多肽或融合蛋白或其抗原性片段。在一些实施方案中，核酸可用作疫苗。

编码SP0785变体(SEQ ID NO:3和4)的核酸序列以SEQ ID NO:11和12提供。编码SP1500变体(SEQ ID NO:6和7)的核酸序列以SEQ ID NO:13和14提供。编码不同融合蛋白(SEQ ID NO:17-26)的核酸序列以SEQ ID NO:27-36提供。在所有情况下，由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员可想到其他DNA序列(包括多个密码子优化的序列)来编码这些多肽和融合蛋白。

可在多种调控元件的控制下将编码表1或表2的多肽或融合蛋白或其片段的核酸克隆到多种表达载体中的任一者中，并与其他目标序列产生融合。克隆核酸的方法是本领域中的例行程序和常规的。对于描述本申请中提到的分子生物学方法(例如分离、克隆、修饰、标记、操纵、测序以及以其他方式处理或分析核酸和/或蛋白质)的一般参考，参见例如Sambrook等人,1989；Ausubel等人,1995；Davis等人,1986；Hames等人,1985；Dracopoli等人,2018；和Coligan等人,2018。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白不具有溶血活性或具有最小的溶血活性。例如，在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白的溶血活性可在将不同稀释度的融合蛋白与红细胞(例如，绵羊红细胞)一起温育后通过比浊法(OD

在一些实施方案中，本文所描述的肺炎链球菌的多肽和融合蛋白及其片段和变体是免疫原性的。这些多肽和融合蛋白在哺乳动物例如小鼠、大鼠、天竺鼠或人类中可以是免疫原性的。抗原多肽或融合蛋白通常是能够在测定中或在受试者中引起明显的免疫反应者。免疫反应可以是先天的，体液的，细胞介导的或粘膜的(将先天的、体液的和细胞介导的免疫的要素组合)。例如，抗原多肽或融合蛋白可增加由T细胞产生的IL-17的量。可替代地或另外地，抗原多肽或融合蛋白可(i)诱导与多肽和/或整个细菌结合的抗体(例如中和抗体)的产生，(ii)诱导Th17免疫，(iii)激活CD4+T细胞反应，例如通过增加CD4+T细胞的数量和/或增加CD4+T细胞在感染或再感染部位的定位，(iv)激活CD8+T细胞反应，例如通过增加CD8+T细胞的数量和/或增加CD8+T细胞在感染或再感染部位的定位，(v)激活CD4+和CD8+反应，(vi)激活CD4-/CD8-免疫，(vii)诱导Th1免疫，(viii)诱导抗微生物肽，(ix)激活先天免疫，或前述的任何组合。在一些实施方案中，抗原多肽或融合蛋白引起可检测量的对所述抗原具特异性的抗体的产生。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白是抗原或具有抗原特性。在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白是载体蛋白或具有载体特性。在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白既是抗原又是载体蛋白。在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白同时具有载体特性和抗原特性。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白是免疫原性复合物(例如，如WO2012/155007中所述的多重抗原呈递系统(MAPS)复合物，出于本文所指示的目的，所述文献的全部内容通过引用并入本文)的抗原。在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白是免疫原性复合物的载体蛋白。在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白既是载体蛋白又是免疫原性复合物的抗原。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白的多肽与人类自身抗原和/或肠道共生细菌(例如某些拟杆菌(Bacteroides)、梭状芽胞杆菌(Clostridium)、梭杆菌(Fusobacterium)、真细菌(Eubacterium)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、肽球菌(Peptococcus)、肽链球菌(Peptostreptococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、大肠埃希氏菌(Escherichia)和乳杆菌(Lactobacillus)物种)具有小于20％、30％、40％、50％、60％或70％的同一性。人类自身抗原的实例包括胰岛素、增殖细胞核抗原、细胞色素P450和髓磷脂碱性蛋白。

本文所描述的融合蛋白中包含的多肽可包含一个或多个免疫原性部分和一个或多个非免疫原性部分。可通过各种方法来鉴定免疫原性部分，包括蛋白质微阵列、ELISPOT/ELISA技术和/或对所讨论的多肽的不同缺失突变体(例如片段)的特异性测定。免疫原性部分也可通过计算机算法鉴定。一些这样的算法，如EpiMatrix(由EpiVax产生)，使用计算矩阵方法。用于鉴定抗原表位的其他计算工具包括PEPVAC(基于混杂表位的疫苗，由丹娜法伯癌症研究所(Dana Farber Cancer Institute)在万维网上托管，网址为immunax.dfci.harvard.edu/PEPVAC)，MHCPred(其使用偏最小二乘法，并且由詹纳研究所(Jenner Institute)在万维网上托管，网址为www.jenner.ac.uk/MHCPred)，以及在万维网上网址为tools.immuneepitope.org的Immune Epitope数据库算法。本文所描述的多肽的抗原性片段包含至少一个免疫原性部分，如通过实验方式测量或通过算法(例如，SYFPEITHI算法，见于www.syfpeithi.de)所鉴定的。

表3和表4分别呈现了SP0785和SP1500的代表性预测表位。

表3.示例性SP0785多肽的353个总预测MHC II结合位点(HLA-DRB1*0101)中的前20个

表4.示例性SP1500多肽的239个总预测MHC II结合位点(HLA-DRB1*0101)中的前20个

本公开还提供了一种或多种本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物(例如疫苗组合物)，或者包含一种或多种本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物(例如疫苗组合物)。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白与表2中列出的融合蛋白具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白是或包含与SEQ ID NO:17-26中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白是或包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白是或包含与CP1(例如，如图1中所描述)具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，免疫原性组合物还可包含本文所描述的融合蛋白的部分，例如内部缺失突变体、截短突变体和片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白的部分是免疫原性的。使用用于确定全长融合蛋白的免疫原性的相同测定法容易地确定融合蛋白的一部分的免疫原性。在一些实施方案中，融合蛋白的部分具有与全长融合蛋白基本上相同的免疫原性。在一些实施方案中，免疫原性不小于表2的融合蛋白的免疫原性的10％、20％、30％、40％或50％。

在一些实施方案中，本文所描述的免疫原性组合物(例如疫苗组合物)包括本文所描述的融合蛋白以及另外一种或多种、或两种或更多种已知的肺炎链球菌抗原。在一些情况下，已知的肺炎链球菌抗原主要是抗体靶标。在一些情况下，已知的肺炎链球菌抗原是多糖。在一些情况下，已知的肺炎链球菌抗原可保护免于肺炎链球菌定殖，或防止由肺炎链球菌引起的败血症、肺炎、脑膜炎、中耳炎、窦炎或者其他部位或器官的肺炎链球菌感染。

本领域公认的一类适当的肺炎链球菌抗原是肺炎球菌表面蛋白A(PspA)和PspA的衍生物。PspA的衍生物包括带有非脯氨酸嵌段的富脯氨酸区段(PR+NPB，也称为PRN，并在Daniels等人,2010中进一步描述)，以及包含PspA的富脯氨酸区域的全部或片段的相关构建体(例如，包含序列PAPAP、PKP、PKEPEQ和PEKP中的一者或多者并且任选地包括非脯氨酸嵌段的区域)。在一些实施方案中，PspA的片段或变体包含具有非脯氨酸嵌段和PspA序列的10、20、30、40或更多个其他氨基酸的富脯氨酸区段。含有NPB的肽特别具有免疫原性，表明NPB可能是重要的表位。

本领域公认的另一类适当的肺炎链球菌抗原是类肺炎球菌溶血素。类肺炎球菌溶血素与肺炎链球菌蛋白肺炎球菌溶血素(PLY或Ply)具有同源性，但与肺炎球菌溶血素相比毒性降低。类肺炎球菌溶血素可以是肺炎球菌溶血素的天然存在的或工程化的衍生物。在一些实施方案中，类肺炎球菌溶血素与肺炎球菌溶血素具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，在对红细胞的溶血活性和多形核白细胞抑制作用中的一者或两者的测定法中，类肺炎球菌溶血素显示小于肺炎球菌溶血素毒性的1/2、1/10、1/20、1/50、1/100、1/200、1/500或1/1000。两种测定法均在Saunders等人,1989中进行了描述。示例性的类肺炎球菌溶血素包括PdT，一种三重突变体，在Berry等人,1995中进一步描述；Pd-A和Pd-B，在Paton等人,1991中进一步描述；rPd2和rPd3，在Ferreira等人,2006中进一步描述；Ply8、MPLY和L460D，在例如US 2009/0285846和L.Mitchell,2011中进一步描述；或其变体。在一些实施方案中，肺炎球菌溶血素在催化中心，例如在氨基酸428或433或其附近具有突变。

其他适当的肺炎链球菌抗原包括胆碱结合蛋白A(CbpA)及其衍生物(Ogunniyi等人,2001)；肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)；酪蛋白水解蛋白酶；分选酶A(SrtA)；菌毛1RrgA粘附素；PpmA；PrtA；PavA；LytA；Stk-PR；PcsB；RrgB及其衍生物。CpbA衍生物包括WO 2012/134975中描述的构建体。这类构建体可包含CpbA的R2结构域、R21和/或R22亚结构域的一个或多个拷贝，或其活性变体和片段，或其任何组合。这类构建体还可包含类肺炎球菌溶血素。

在一些实施方案中，免疫原性组合物(例如疫苗组合物)包含呈混合物的形式的一种或多种本文所描述的融合蛋白与一种或多种来自表1的多肽或其抗原性片段或变体。在一些实施方案中，所述混合物包含全长多肽和片段，所述片段是由表达宿主例如大肠杆菌、昆虫细胞系(例如杆状病毒表达系统)或哺乳动物细胞系(例如人类或中国仓鼠卵巢)对信号序列的加工或部分加工产生的。

在一些实施方案中，在不存在任何其他抗原的情况下，免疫原性组合物包含SEQID NO:17-26中任一者的一种或多种融合蛋白。在一些实施方案中，在不存在任何其他抗原的情况下，免疫原性组合物包含SEQ ID NO:23的融合蛋白。在一些实施方案中，在不存在其他抗原的情况下，免疫原性组合物包含SEQ ID NO:17-26中任一者的一种或多种融合蛋白与SEQ ID NO:1-8中任一者的一种或多种额外蛋白质的组合。在一些实施方案中，在不存在任何其他抗原的情况下，免疫原性组合物包含SEQ ID NO:23的融合蛋白与SEQ ID NO:1-8中任一者的一种或多种额外蛋白质的组合。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白可与肺炎链球菌多糖缀合。在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白可与肺炎链球菌多糖非共价复合。肺炎链球菌多糖可例如如美国专利第5,623,057号、美国专利第5,371,197号或PCT/US2011/023526中所描述。非共价复合物可以是例如多重抗原呈递系统(MAPS)的那些，如PCT/US2012/037412、PCT/US2012/037541和Zhang等人,2013中所描述。

在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白与另一分子共价结合。例如，这可增加融合蛋白的半衰期、溶解性、生物利用度或免疫原性。可与融合蛋白共价结合的分子包括碳水化合物、生物素、聚(乙二醇)(PEG)、聚唾液酸、N-丙酰化聚唾液酸、核酸、多糖和PLGA。PEG有许多不同类型，分子量范围从低于300g/mol到超过10,000,000g/mol。PEG链可以是直链的、支链的，或具有梳齿或星形几何形状。在一些实施方案中，融合蛋白与刺激免疫系统的部分共价结合。这样的部分的一个实例是脂质部分。在一些情况下，脂质部分被Toll样受体(TLR)如TLR-2或TLR-4识别，并激活先天免疫系统。

在一些实施方案中，使用已知方法将本文所描述的融合蛋白和一种或多种其他组分混合在一起以形成多组分免疫原性组合物。在一些实施方案中，使用已知方法将本文所描述的融合蛋白和一种或多种其他组分进行纳米包囊。在一些实施方案中，使用已知方法将本文所描述的融合蛋白和一种或多种其他组分模制成纳米粒子或微粒。在一些实施方案中，使用已知方法将本文所描述的融合蛋白和一种或多种其他组分通过共价键缀合以形成多组分免疫原性组合物。在一些实施方案中，使用已知方法将本文所描述的融合蛋白和一种或多种其他组分非共价连接以形成多组分免疫原性组合物。将融合蛋白和一种或多种其他组分组合的其他方法在例如PCT/US20I2/374I2和PCT/US2009/44956中进行了描述。

本公开还提供了一种或多种编码本文所描述的融合蛋白的核酸的免疫原性组合物(例如疫苗组合物)，或者包含一种或多种编码本文所描述的融合蛋白的核酸的免疫原性组合物(例如疫苗组合物)。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含一种或多种编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白与表2中列出的融合蛋白具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白是或包含与SEQ ID NO:17-26中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白是或包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白是或包含与CP1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，免疫原性组合物包含与SEQ ID NO:27-36中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的一种或多种核酸。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含与SEQ ID NO:33具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的核酸。在所有情况下，由于遗传密码的简并性，其他DNA序列(包括多个密码子优化的序列)可编码此类融合蛋白。在一些实施方案中，这些核酸在经免疫接种的个体中表达，导致编码的肺炎链球菌融合蛋白的产生，并且如此产生的肺炎链球菌融合蛋白在经免疫接种的个体中具有免疫刺激或免疫保护作用。

这种含核酸的免疫刺激性组合物可包含例如复制起点和/或驱动一种或多种编码SEQ ID NO:27-36的一种或多种融合蛋白的核酸表达的启动子。这样的组合物还可包含细菌质粒载体，在该细菌质粒载体中插入启动子(有时是强病毒启动子)，编码一种或多种SEQID NO:17-26的融合蛋白的一种或多种核酸，以及多腺苷酸化/转录终止序列。在一些情况下，核酸是DNA。在一些情况下，核酸是RNA。

在一些实施方案中，包含一种或多种本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗的特征在于，相对于预定水平，针对一种或多种融合蛋白的一种或多种调理作用潜力或免疫反应增加，如通过ELISA和/或通过功能抗体测定所测量。在一些实施方案中，相对于预定水平，针对一种或多种融合蛋白的一种或多种调理作用潜力或免疫反应增加至少30％或更多，包括例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，如通过ELISA和/或通过功能抗体测定所测量。在一些实施方案中，相对于预定水平，针对一种或多种融合蛋白的一种或多种调理作用潜力或免疫反应增加至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍，如通过ELISA和/或通过功能抗体测定所测量。在一些实施方案中，预定水平是免疫前水平(例如，当受试者未被免疫接种或者在不存在一种或多种本文所描述的融合蛋白的情况下被免疫接种时观测到的水平)。

在一些实施方案中，在向受试者施用后，包含一种或多种本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗诱导针对肺炎链球菌的免疫反应。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗诱导针对一种或多种肺炎链球菌血清型的免疫反应。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗诱导针对一种或多种肺炎链球菌血清型的保护性免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是抗体反应或B细胞反应。在一些实施方案中，免疫反应是T细胞反应。在一些实施方案中，免疫反应是先天免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是CD4+T细胞反应，包括Th1、Th2或Th17反应，或CD8+T细胞反应，或CD4+和CD8+T细胞反应，或CD4-/CD8-T细胞反应。在一些实施方案中，免疫反应是抗体反应或B细胞反应和T细胞反应。在一些实施方案中，免疫反应是抗体反应或B细胞反应、T细胞反应和先天免疫反应。

在一些实施方案中，包含一种或多种本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗可用于肺炎链球菌的预防性和/或治疗性处理。因此，本公开提供了一种使患有或易患肺炎链球菌感染的受试者免疫的方法，所述方法包括施用免疫有效量的任何免疫原性组合物或疫苗，所述免疫原性组合物或疫苗包含一种或多种本文所描述的融合蛋白。接受免疫接种的受试者可以是男性或女性，并且可以是婴儿、儿童、青少年或成人。在一些实施方案中，被治疗的受试者是人类。在其他实施方案中，受试者是非人类动物。

在一些实施方案中，在向受试者施用后，包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗治疗或预防肺炎链球菌感染。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗治疗或预防由肺炎链球菌感染所致的侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗治疗或预防由肺炎链球菌感染所致的菌血症。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗治疗或预防由肺炎链球菌感染所致的败血症。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗治疗或预防由肺炎链球菌感染所致的器官损伤。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗治疗或预防由肺炎链球菌感染所致的脑膜炎。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗治疗或预防由肺炎链球菌感染所致的肺炎。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗治疗或预防由肺炎链球菌感染所致的中耳炎。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗治疗或预防由肺炎链球菌感染所致的窦炎。

在一些实施方案中，在向受试者施用后，包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗抑制肺炎链球菌感染或降低其发生率。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗抑制由肺炎链球菌感染所致的侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)或降低其发生率。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗抑制由肺炎链球菌感染所致的菌血症或降低其发生率。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗抑制由肺炎链球菌感染所致的败血症或降低其发生率。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗抑制由肺炎链球菌感染所致的器官损伤或降低其发生率。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗抑制由肺炎链球菌感染所致的脑膜炎或降低其发生率。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗抑制由肺炎链球菌感染所致的肺炎或降低其发生率。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗抑制由肺炎链球菌感染所致的中耳炎或降低其发生率。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗抑制由肺炎链球菌感染所致的窦炎或降低其发生率。

在一些实施方案中，在向受试者施用后，包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗降低肺炎链球菌感染的严重程度。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗降低由肺炎链球菌感染所致的侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)的严重程度。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗降低由肺炎链球菌感染所致的菌血症的严重程度。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗降低由肺炎链球菌感染所致的败血症的严重程度。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗降低由肺炎链球菌感染所致的器官损伤的严重程度。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗降低由肺炎链球菌感染所致的脑膜炎的严重程度。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗降低由肺炎链球菌感染所致的肺炎的严重程度。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗降低由肺炎链球菌感染所致的中耳炎的严重程度。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗降低由肺炎链球菌感染所致的窦炎的严重程度。

在一些实施方案中，在向受试者施用后，包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗抑制肺炎链球菌从受试者向另一受试者的传播。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗抑制受试者中的肺炎链球菌定殖。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗抑制受试者鼻咽中的肺炎链球菌定殖。

在一些实施方案中，在向受试者施用后，包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗诱导受试者中的针对肺炎链球菌的免疫反应，其水平高于对照组合物。在一些实施方案中，在向受试者施用后，所述免疫原性组合物或疫苗诱导针对一种或多种肺炎链球菌血清型的免疫反应，其水平高于对照组合物。在一些实施方案中，所述更高水平是对照组合物的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。

在一些实施方案中，在向受试者施用后，包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗诱导免疫反应，该免疫反应可帮助预防肺炎链球菌的建立，其水平高于对照组合物。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗防止定殖，其水平高于对照组合物。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗抑制非定殖或未感染的受试者中的肺炎链球菌感染，其水平高于对照组合物。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗在已经定殖的受试者中减少了肺炎链球菌定殖的持续时间，其水平高于对照组合物。在一些实施方案中，所述更高水平是对照组合物的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。

一些实施方案提供了包含在用包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗免疫接种的哺乳动物中产生的抗体的抗体组合物。在一些实施方案中，抗体包含选自由单克隆抗体(mAb)和抗独特型抗体组成的组的至少一种抗体。在一些实施方案中，抗体组合物包含分离的γ球蛋白级分。在一些实施方案中，抗体组合物包含多克隆抗体。在一些实施方案中，将抗体组合物施用于受试者。

用于包含本文所描述的融合蛋白的特定疫苗的组分的最佳量可通过涉及观测受试者中的适当免疫反应的标准研究来确定。在初始免疫接种之后，受试者可接受在时间上充分间隔开的一次或若干次加强免疫接种。

包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗和/或其制剂可以单位剂型配制以易于施用和剂量均一性。任何特定受试者或生物体特有的治疗上有效的剂量水平可取决于包括以下的各种因素：感染的严重程度或风险程度；所采用的特定疫苗或疫苗组合物的活性；所采用的特定疫苗或疫苗组合物的其他特征；受试者的年龄、体重、一般健康、性别，受试者的膳食，受试者的药物动力学状况，施用时间(例如关于例如进食、睡觉、接受包括其他疫苗给药的其他药品等的其他受试者活动而言)，施用途径，所采用的特定疫苗或疫苗组合物的排泄速率；与所采用的疫苗组合物组合或同时使用的疫苗；以及医学领域中众所周知的类似因素。

可根据已知技术将根据本公开使用的包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗配制到组合物(例如药物组合物)中。疫苗制备一般描述于Vaccine Design(Powell和Newman,1995)中。举例来说，免疫量的疫苗产物可与一种或多种有机或无机、液体或固体、药学上合适的载体材料一起配制。

一般来说，药学上可接受的载体包括与药物施用相容的溶剂、分散介质等。举例来说，根据配制者的判断(Martin,1975)，可充当药学上可接受的载体的材料包括但不限于：糖，例如乳糖、葡萄糖、右旋糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄蓍；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；多元醇，例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁；海藻酸；无热原质水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁的其他无毒可相容润滑剂，以及防腐剂，并且抗氧化剂也可存在于组合物中。

疫苗可通过经由包括例如常规混合、粒化、溶解、冻干或类似工艺的任何可用手段来组合一种或多种本文所描述的融合蛋白与载体和/或其他任选组分来配制。

可将包含一种或多种本文所描述的融合蛋白的疫苗冻干直至将要使用其为止，此时临时地用稀释剂将其重构。在一些实施方案中，使疫苗组分或组合物在存在一种或多种其他组分(例如佐剂)的情况下冻干，并且临时地用盐水溶液重构。或者，可分别将个别组分或组分集合冻干和/或储存(例如在疫苗接种试剂盒中)，重构所述组分，并且在使用之前混合或分别施用至受试者。

冻干可产生更稳定的组合物(例如通过防止或减少多糖抗原分解)。疫苗或疫苗组分的冻干在本领域中众所周知。通常，使液体疫苗或疫苗组分常常在存在防结块剂(例如糖，如蔗糖或乳糖)的情况下冷冻干燥。在一些实施方案中，防结块剂例如以10-200mg/ml的初始浓度存在。冻干通常在一系列步骤内发生，例如循环以-69℃开始，在3h内逐渐调节至-24℃，然后保持此温度达18h，接着在1h内逐渐调节至-16℃，然后保持此温度达6h，接着在3h内逐渐调节至+34℃，并且最后保持此温度超过9h。

在一些实施方案中，包含本文所描述的融合蛋白的疫苗是液体。在一些实施方案中，液体是重构冻干物(lyophylate)。在一些实施方案中，疫苗的pH是约5、约6、约7或约8。在一些实施方案中，疫苗的pH介于约5与约7.5之间。在一些实施方案中，疫苗的pH介于5与7.5之间。在一些实施方案中，疫苗的pH介于约5.3与约6.3之间。在一些实施方案中，疫苗的pH介于5.3与6.3之间。在一些实施方案中，疫苗的pH是约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4或约7.5。

根据本公开使用的疫苗或疫苗组分可并入脂质体、脂质卷(cochleate)、生物可降解聚合物(例如聚丙交酯、聚乙交酯和聚丙交酯-共-乙交酯)或免疫刺激复合物(ISCOMS)中。

在某些情况下，可能需要例如通过减缓一种或多种疫苗组分的吸收来延长根据本发明使用的疫苗的作用或释放。这种吸收的延迟可例如通过使用具有不良水溶性的结晶或非晶形材料的液体悬浮液来实现。然后，产物的吸收速率取决于其溶解速率，而其溶解速率转而又取决于尺寸和形式。可替代地或另外，延迟的吸收可通过将一种或多种疫苗组分溶解或悬浮于油媒介物中来实现。也可采用可注射储库形式(Injectable depot form)来延迟吸收。这些储库形式可通过将一种或多种疫苗组分的微囊基质成形为生物可降解聚合物网状物来制备。取决于聚合物与疫苗组分的比率和所采用的特定聚合物的性质，可控制释放速率。

可根据本公开采用的生物可降解聚合物的实例包括例如聚(原酸酯)和聚(酸酐)。一种特定的示例性聚合物是聚丙交酯-聚乙交酯。

储库可注射制剂也可通过将产物包覆于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。

聚合物递送系统也可用于包括例如口服制剂的非储库制剂中。举例来说，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸等的生物可降解的生物相容性聚合物可用于口服制剂中。多糖抗原或缀合物可与这些聚合物一起配制，例如以制备粒子、微粒、挤出物、固态分散体、混合物或其他组合以便促进适用制剂(例如口服制剂)的制备。

根据本公开使用的包含一种或多种本文所描述的融合蛋白的疫苗包括免疫原性组合物，并且可另外包括一种或多种额外活性剂(即发挥生物作用的剂-非惰性成分)。举例来说，在疫苗制备中常包括一种或多种佐剂。应了解，这些额外剂可与一种或多种其他疫苗组分一起配制，或者可分开保持并在施用时或接近施用时组合。在一些实施方案中，这些额外组分可与其他疫苗组分中的一些或全部在用于实现相关效果的适当时间窗口内分开施用。

佐剂

包含本文所描述的融合蛋白的疫苗制剂和免疫原性组合物可包括佐剂。一般来说，佐剂是增强针对抗原的免疫反应的剂。佐剂可基于其主要作用机制大致分成两类：疫苗递送系统和免疫刺激性佐剂(参见例如Singh等人,2003)。在大部分疫苗制剂中，佐剂向免疫系统提供信号以使得其生成针对抗原的反应，并且需要抗原来驱动针对病原体的反应的特异性。疫苗递送系统常常是例如乳液、微粒、免疫刺激性复合物(ISCOM)、纳米粒子(其可为例如粒子和/或基质)和脂质体的颗粒制剂。相比之下，免疫刺激性佐剂有时来自或衍生自病原体，并且可代表激活先天性免疫系统的细胞的病原体相关分子模式(PAMP)，例如脂多糖(LPS)、单磷酰基脂质A(MPL)或含CpG的DNA。

或者，佐剂可分类为有机佐剂和无机佐剂。无机佐剂包括常用于人类疫苗中的例如磷酸铝、非晶形羟基磷酸硫酸铝和氢氧化铝的明矾盐。有机佐剂包含包括高分子的有机分子。有机佐剂的非限制性实例包括霍乱毒素(cholera toxin)/类毒素、其他肠毒素/类毒素或革兰氏阴性细菌的不稳定毒素/类毒素、白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(例如γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)。

佐剂也可根据其所诱导的反应来分类。在一些实施方案中，佐剂诱导Th1细胞或Th2细胞的生成、增殖或激活。在其他实施方案中，佐剂诱导B细胞的生成、增殖或激活。在又其他实施方案中，佐剂诱导抗原呈递细胞的激活。这些类别不相互排斥；在一些情况下，佐剂激活超过一种类型的细胞。

在一些实施方案中，佐剂诱导Th17细胞的生成、增殖或激活。佐剂可促进CD4+T细胞或CD8+T细胞分泌IL-17。在一些实施方案中，诱导Th17细胞的生成、增殖或激活的佐剂是在以下测定中产生实验样品与对照比率的至少2倍并且在一些情况下10倍的佐剂。在所述测定中，实验者比较由以下两个细胞群体所分泌的IL-17水平：(1)来自用佐剂和已知诱导Th17生成、增殖或激活的多肽免疫接种的动物的细胞，和(2)来自用佐剂和无关(对照)多肽治疗的动物的细胞。诱导Th17细胞的生成、增殖或激活的佐剂可使得群体(1)的细胞产生比群体(2)的细胞多超过2倍或超过10倍的IL-17。IL-17可例如通过ELISA或ELISPOT来测量。例如霍乱毒素和不稳定毒素的某些毒素(由肠毒性大肠杆菌(E.coli)或ETEC产生)激活Th17反应。因此，在一些实施方案中，佐剂是毒素或类毒素。霍乱毒素成功地用于小鼠模型中以与来自表1的某些多肽结合诱导保护性免疫。不稳定毒素的一种形式是由Intercell生产。也可使用作为佐剂具有活性但毒性显著较低的不稳定毒素(类毒素)的突变衍生物。不稳定毒素的示例性的解毒的突变衍生物包括缺乏ADP核糖基转移酶活性的突变体。不稳定毒素的特定解毒的突变衍生物包括LTK7(Douce等人,1995)和LTK63(Williams等人,2004)、LT-G192(Douce等人,1999)和LTR72(Giuliani等人,1998)。

在一些实施方案中，佐剂包含VLP(病毒样粒子)。一种这样的佐剂平台α病毒复制子使用α病毒诱导Th17细胞的激活并由Alphavax生产。在α病毒复制子系统的一些实施方案中，α病毒可被工程化以表达目标抗原、目标细胞因子(例如IL-17或刺激IL-17产生的细胞因子)或两者，并且可在辅助细胞系中产生。更详细的信息可见于美国专利第5,643,576号和第6,783,939号中。在一些实施方案中，将疫苗制剂与编码细胞因子的核酸组合施用至受试者。

某些类别的佐剂激活toll样受体(TLR)以便激活Th17反应。TLR是可存在于白细胞膜上并识别外来抗原(包括微生物抗原)的众所周知的蛋白质。施用已知TLR配体以及目标抗原(例如呈融合蛋白形式)可促进对目标抗原具有特异性的免疫反应的发展。激活TLR的一种示例性佐剂包含单磷酰基脂质A(MPL)。传统上，已产生呈从例如明尼苏达沙门氏菌(S.minnesota)的革兰氏阴性细菌获得的解毒的脂多糖(LPS)内毒素形式的MPL。特别是，LPS的依序酸和碱水解产生免疫活性脂质A部分(其为MPL)，并且缺乏糖基和除LPS中所存在的磷酸盐中的一者之外的全部。多种合成TLR激动剂(特别是TLR-4激动剂)公开于Evans等人,2003中。与MPL佐剂类似，这些合成化合物经由TLR激活先天性免疫系统。另一类型的TLR激动剂是例如E6020的合成磷脂二聚体(Ishizaka等人,2007)。各种TLR激动剂(包括TLR-4激动剂)已由例如传染病研究所(Infectious Disease Research Institute，IRDI)、Corixa、Esai、Avanti Polar Lipids,Inc.和Sigma Aldrich生产和/或出售。激活TLR的另一种示例性佐剂包含MPL、海藻糖双白喉菌酸酯(Trehalose Dicoynomycolate，TDM)和溴化双十八烷基二甲基铵(DDA)的混合物。另一种TLR激活佐剂是R848(雷西莫特(resiquimod))。

在一些实施方案中，佐剂是或包含皂素。通常，皂素是三萜糖苷，例如从皂皮树(Quillaja saponaria tree)的树皮分离的三萜糖苷。来自生物来源的皂素提取物可进一步分级分离(例如通过色谱法)以分离具有最佳佐剂活性并具有可接受毒性的提取物的部分。用作佐剂的来自皂皮树的提取物的典型级分称为级分A和C。

在一些实施方案中，使用佐剂组合。三个示例性佐剂组合是MPL和明矾，E6020和明矾，以及MPL和ISCOM。

佐剂可与抗原共价或非共价结合。在一些实施方案中，佐剂可包含经由抗原呈递细胞(APC)激活来诱导发炎反应的蛋白质。在一些实施方案中，这些蛋白质中的一者或多者可以重组方式与所选抗原融合，以使得所得融合分子促进树突状细胞成熟，激活树突状细胞以产生细胞因子和趋化因子，并且最终增强抗原对T细胞的呈递和T细胞反应的起始(例如参见Wu等人,2005)。

在一些实施方案中，包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗与佐剂组合配制和/或施用。在一些实施方案中，佐剂选自由磷酸铝、氢氧化铝和磷酸氢氧化铝组成的组。在一些实施方案中，佐剂包含磷酸铝。在一些实施方案中，佐剂是磷酸铝。

通常，相同佐剂或佐剂混合物存在于每个剂量的疫苗中。然而，任选地，佐剂可与第一剂量的疫苗一起并且不与后续剂量(即加强注射)的疫苗一起施用。或者，强佐剂可与第一剂量的疫苗一起施用，并且较弱佐剂或较低剂量的强佐剂可与后续剂量的疫苗一起施用。佐剂可在向受试者施用抗原之前、与向受试者施用抗原同时或在向受试者施用抗原之后(有时在1、2、6或12小时内，并且有时在1、2或5天内)施用。某些佐剂适合于人类受试者、非人类动物或两者。

根据本公开使用的疫苗可包括其他抗微生物疗法，或与抗微生物疗法同时施用。举例来说，这些疫苗可包括杀灭病原体或阻滞病原体生长的一种或多种剂或与其一起施用。这些剂包括例如青霉素(penicillin)、万古霉素(vancomycin)、红霉素(erythromycin)、阿奇霉素(azithromycin)和克拉霉素(clarithromycin)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、左氧氟沙星(levoflaxin)、加替沙星(gatifloxacin)。

可替代地或另外，根据本发明使用的疫苗可包括一种或多种其他疫苗或疗法或与其一起施用。举例来说，一种或多种非肺炎球菌抗原可包括在疫苗中或与疫苗一起施用。

额外组分和赋形剂

除本文所描述的融合蛋白和上文所描述的佐剂以外，疫苗制剂或免疫原性组合物还可包括一种或多种额外组分。

在一些实施方案中，疫苗制剂或免疫原性组合物可包括例如以下的一种或多种稳定剂：糖(例如蔗糖、葡萄糖或果糖)、磷酸盐(例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸二氢钠)、谷氨酸盐(例如L-谷氨酸单钠)、明胶(例如加工明胶、水解明胶或猪明胶)、氨基酸(例如精氨酸、天冬酰胺、组氨酸、L-组氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及其烷基酯)、肌苷或硼酸钠。

在一些实施方案中，疫苗制剂或免疫原性组合物包括例如碳酸氢钠和抗坏血酸的混合物的一种或多种缓冲剂。在一些实施方案中，疫苗制剂可在例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)的盐水或蒸馏水中施用。

在一些实施方案中，疫苗制剂或免疫原性组合物包括例如但不限于以下的一种或多种表面活性剂：聚山梨醇酯80(TWEEN 80)、聚山梨醇酯20(TWEEN 20)、聚乙二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯醚(TRITON X-100)以及4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚与甲醛和环氧乙烷的聚合物(TYLOXAPOL)。表面活性剂可为离子表面活性剂或非离子表面活性剂。

在一些实施方案中，疫苗制剂或免疫原性组合物包括例如氯化钠、氯化铵、氯化钙或氯化钾的一种或多种盐。

在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物中包括防腐剂。在其他实施方案中，不使用防腐剂。防腐剂最常用于多剂量疫苗小瓶中，并且不太常被需要用于单剂量疫苗小瓶中。在一些实施方案中，防腐剂是2-苯氧基乙醇、对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、苄醇和/或山梨酸。

在一些实施方案中，将包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗施用至处于患上肺炎球菌疾病的风险下的受试者，例如婴儿、幼儿、少年或更年长成人。在一些实施方案中，将所述免疫原性组合物或疫苗施用至处于患上肺炎球菌疾病的升高风险下的受试者，例如免疫功能不全受试者、患有镰状细胞疾病或其他血红素病、先天性或后天性无脾症、脾功能障碍、慢性肾衰竭或肾病综合征、与用免疫抑制性药物或辐射疗法进行的治疗相关的疾病包括恶性赘瘤、白血病、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)或实体器官移植、先天性或后天性免疫缺乏、HIV感染、脑脊髓液泄漏、耳蜗植入、慢性心脏病、慢性肺病、糖尿病、酒精中毒、慢性肝病、吸烟、哮喘、全身性恶性肿瘤、多发性骨髓瘤或实体器官移植的受试者。应了解，可在受试者未诊断患有疾病的任何症状的情况下认为受试者处于患上疾病的风险下。举例来说，如果已知受试者已处于或打算处于具有相对高感染风险的情况下，则将认为受试者处于患上疾病的风险下。

可利用例如以下的任何有效施用途径：经口、经鼻、肠内、肠胃外、肌内或静脉内、皮下、透皮、皮内、经直肠、经阴道、局部、经眼、经肺或通过接触施用。在一些实施方案中，免疫原性组合物或疫苗可(例如经由肌内、腹膜内、皮内和/或皮下途径)注射；或经由粘膜递送(例如至口腔/消化道、呼吸道和/或生殖泌尿道)。在一些情况下，鼻内施用可尤其适用于例如治疗肺炎或中耳炎(因为肺炎球菌的鼻咽携载可得到更有效地预防，因此在其最早阶段缓解感染)。在一些实施方案中，可能需要通过不同途径施用不同剂量的免疫原性组合物或疫苗；在一些实施方案中，可能需要经由不同途径施用一种剂量的不同组分。

在一些实施方案中，皮内施用药物组合物(例如，免疫原性组合物或疫苗)。皮内注射的常规技术“曼托程序(Mantoux procedure)”包括以下步骤：清洁皮肤，并且然后用一只手拉伸，并且在窄规格针(26-31规格)的斜面朝向上方的情况下，将针以介于10-15°之间的角度插入。一旦插入针的斜面，则降低针的针筒并进一步推进，同时提供轻微压力以使其在皮肤下抬升。然后，极缓慢地注射液体，由此在皮肤表面上形成泡或凸起，接着缓慢地抽出针。

已描述被特定设计以将液体剂施用至皮肤中或皮肤上的装置，例如WO 99/34850和EP 1092444中所描述的装置，以及例如WO 01/13977；美国专利第5,480,381号、美国专利第5,599,302号、美国专利第5,334,144号、美国专利第5,993,412号、美国专利第5,649,912号、美国专利第5,569,189号、美国专利第5,704,911号、美国专利第5,383,851号、美国专利第5,893,397号、美国专利第5,466,220号、美国专利第5,339,163号、美国专利第5,312,335号、美国专利第5,503,627号、美国专利第5,064,413号、美国专利第5,520,639号、美国专利第4,596,556号、美国专利第4,790,824号、美国专利第4,941,880号、美国专利第4,940,460号、WO 97/37705和WO 97/13537中所描述的喷射装置。皮内施用免疫原性组合物或疫苗的其他方法可包括常规注射器和针，或者被设计用于冲击式递送固体疫苗的装置(WO 99/27961)，或透皮贴片(WO 97/48440；WO 98/28037)；或者施用至皮肤表面的装置(透皮或经皮递送WO 98/20734；WO 98/28037)。

如上文所描述，药物组合物(例如免疫原性组合物或疫苗)可以单次剂量或以多次剂量施用。应了解，只要在时间窗口内向受试者施用所有相关组分，施用即可为单次“剂量”；每一组分不必都存在于单个组合物中。举例来说，在小于24小时的时段内的两种不同免疫原性组合物或疫苗的施用视为单次剂量。仅给出一个实例，具有不同抗原组分的免疫原性组合物或疫苗可以单独组合物形式但作为单次剂量的一部分施用。如上文所指出，这些单独组合物可经由不同途径或经由相同途径施用。可替代地或另外，在其中免疫原性组合物或疫苗与额外类型的活性剂组合的实施方案中，免疫原性组合物或疫苗可经由一种途径施用，并且第二活性剂可通过相同途径或通过不同途径施用。

如实现所需结果所需，以这些量并持续这些时间施用药物组合物(例如免疫原性组合物或疫苗)。在本发明的一些实施方案中，免疫原性组合物或疫苗包含免疫有效量的至少免疫原性组合物。实现免疫有效量所需的精确量可根据免疫原性组合物而变化，并且在不同受试者之间，根据受试者的种类、年龄和一般状况、疾病阶段、特定药物混合物、其施用模式等而变化。

选择每个药物组合物(例如免疫原性组合物或疫苗)剂量中的本文所描述的融合蛋白的量以允许疫苗在如本文所描述进行施用时诱导适当免疫保护性反应而无明显不良副作用。

在一些实施方案中，包含本文所描述的融合蛋白的药物组合物在向受试者施用后诱导Th1和/或Th17细胞反应。在一些实施方案中，药物组合物在向受试者施用后诱导针对肺炎链球菌的调理素/杀菌反应。在一些实施方案中，包含本文所公开的融合蛋白的药物组合物在向受试者施用后降低肺炎链球菌的粘膜表面传播速率和/或减少肺炎链球菌的粘膜表面定殖。在一些实施方案中，药物组合物降低肺炎链球菌的鼻咽或肺脏传播速率和/或减少肺炎链球菌在鼻咽或肺脏传播后的定殖。

一些实施方案提供使受试者对肺炎链球菌感染免疫的方法，所述方法包括向受试者施用免疫有效量的包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物。一些实施方案提供使受试者对肺炎链球菌感染免疫的方法，所述方法包括向受试者施用免疫有效量的包含本文所描述的融合蛋白的疫苗组合物。一些实施方案提供使受试者对肺炎链球菌感染免疫的方法，所述方法包括向受试者施用免疫有效量的包含本文所描述的融合蛋白的药物组合物。

组合预防或组合疗法

在一些实施方案中，包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗可与另一剂组合施用。在一些实施方案中，所述剂是或包含PCV13。在一些实施方案中，所述剂是或包含PPSV23。在一些实施方案中，所述剂是或包含抗生素。

给药

在一些实施方案中，包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗的施用可涉及单次剂量递送。在一些实施方案中，施用可涉及初始剂量，接着是一个或若干个充分间隔开的额外免疫接种剂量。免疫接种时程是用于在受试者的一个或多个指定年龄时通过一种或多种指定施用途径来施用一种或多种指定剂量的一种或多种指定肺炎球菌疫苗的程序。

本公开提供涉及向婴儿受试者施用至少一次剂量的疫苗的免疫接种方法。在一些实施方案中，婴儿受试者为18月龄或更小。在一些实施方案中，婴儿受试者为12月龄或更小。在一些实施方案中，婴儿受试者先前已接受一次或多次剂量的缀合肺炎球菌多糖疫苗；在其他实施方案中，婴儿受试者未接受过肺炎球菌疫苗。在一些实施方案中，婴儿受试者先前已感染肺炎链球菌或暴露于肺炎链球菌感染。

本公开提供涉及向幼儿受试者施用至少一次剂量的疫苗的免疫接种方法。在一些实施方案中，幼儿受试者年龄为5岁或更小。在一些实施方案中，幼儿受试者年龄为4岁或更小。在一些实施方案中，幼儿受试者先前已接受一次或多次剂量的缀合肺炎球菌多糖疫苗；在其他实施方案中，幼儿受试者未接受过肺炎球菌疫苗。在一些实施方案中，幼儿受试者先前已感染肺炎链球菌或暴露于肺炎链球菌感染。

本公开提供涉及向少年受试者施用至少一次剂量的疫苗的免疫接种方法。在一些实施方案中，少年受试者年龄为18岁或更小。在一些实施方案中，少年受试者年龄为15岁或更小。在一些实施方案中，少年受试者先前已接受一次或多次剂量的缀合肺炎球菌多糖疫苗；在其他实施方案中，少年受试者未接受过肺炎球菌疫苗。在一些实施方案中，少年受试者先前已感染肺炎链球菌或暴露于肺炎链球菌感染。

本公开提供涉及向成年受试者施用至少一次剂量的疫苗的免疫接种方法。在一些实施方案中，成年受试者年龄大于约50岁。在一些实施方案中，成年受试者年龄大于约65岁。在一些实施方案中，成年受试者先前已接受一次或多次剂量的缀合肺炎球菌多糖疫苗；在其他实施方案中，成年受试者未接受过肺炎球菌疫苗。在一些实施方案中，成年受试者先前已感染肺炎链球菌或暴露于肺炎链球菌感染。

提供本公开的免疫接种时程以在受试者中诱导免疫反应(例如免疫保护性反应)，其足以在受试者群体和/或亚群中减少选自由以下组成的组的至少一个量度：至少一种感染、疾病或病症的发生率、盛行率、频率和/或严重程度，和/或所述感染、疾病或病症的至少一种替代标志物。补充免疫接种时程是相对于其所补充的标准时程具有这种作用的免疫接种时程。补充时程可能需要在标准时程中所见的本文所公开的免疫原性组合物或疫苗的额外施用和/或超免疫原性剂量，或者需要非标准时程的部分的免疫原性组合物或疫苗施用。本发明的完整免疫接种时程可包含标准时程和补充时程两者。出于说明性目的，提供示例性样品免疫时程。用以评估本文所论述的免疫原性反应的方法的详细描述允许在无过度实验的情况下对样品免疫接种时程进行更改。

在本公开的一个实施方案中，当受试者年龄超过约2周、超过约5周、超过约1岁、超过约2岁、超过约15岁或超过约18岁时，通常进行第一次肺炎球菌疫苗施用。

在本公开的一些实施方案中，当受试者年龄超过约50岁、超过约55岁、超过约60岁、超过约65岁或超过约70岁时，进行第一次肺炎球菌疫苗施用。

在本公开的一些实施方案中，采用单次疫苗施用。有可能地，本发明的目的可提供单次施用，尤其当一种或多种所用疫苗多肽、多糖和/或缀合物或其组合强力时如此，并且在这种情形下，单次剂量时程足以诱导持续免疫保护性反应。

在一些实施方案中，期望施用两次或更多次剂量的疫苗以用于更高的免疫保护性功效和覆盖范围。因此，在一些实施方案中，剂量的次数为至少两次、至少三次或更多次剂量。不存在固定的最大剂量次数，然而，良好的临床实践是不比实现所需效果所需更频繁地进行免疫接种。

在不受理论束缚的情况下，根据本公开施用的疫苗的第一剂量可视为“初免”剂量。在一些实施方案中，免疫接种时程中包括超过一次剂量。在这种情境下，后续剂量可视为“加强”剂量。

初免剂量可施用至未处理受试者(此前从未接受过缀合多糖疫苗的受试者)。在一些实施方案中，初免剂量可在根据本发明施用初始疫苗剂量之前至少五年或更多年施用至先前已接受缀合多糖疫苗的受试者。在其他实施方案中，初免剂量可在根据本发明施用初免疫苗之前至少二十年或更多年施用至先前已接受缀合多糖疫苗的受试者。

当免疫接种时程需要两次或更多次单独剂量时，考虑剂量之间的间隔。两次连续剂量之间的间隔可在整个免疫接种时程中相同，或者其可随受试者年龄而变化。在本发明的免疫接种时程中，一旦已施用第一疫苗剂量，则存在在施用后续剂量之前的第一间隔。第一间隔一般是至少约2周、1个月、6周、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或更长时间。在施用超过一次后续剂量的情况下，可在这些后续剂量之间设置第二(或更大)间隔。在一些实施方案中，后续剂量之间的所有间隔均具有相同长度；在其他实施方案中，第二间隔的长度可变化。在一些实施方案中，后续剂量之间的间隔可为至少约12个月、至少约15个月、至少约18个月、至少约21个月或至少约2年。在一些实施方案中，剂量之间的间隔可为至多3年、至多约4年或至多约5年或10年或更长时间。在一些实施方案中，后续剂量之间的间隔可随受试者年龄而减小。

本领域技术人员应了解，存在第一次施用的时序、最短间隔、最大间隔和总施用次数(绝对而言，或在所陈述的时段内)的各种条件的各种可能性组合和子组合，并且这些组合和子组合的全部均应视为在发明者预期内，但在此处未明确列举。

在一些实施方案中，评估包含本文所描述的融合蛋白的药物组合物、免疫原性组合物或疫苗的免疫原性的方法包括使用一种或多种体外生物测定(包括B细胞和T细胞反应如根据ELISA、多重ELISA、MSD、Luminex、流式细胞术的抗体水平，Th1/Th17细胞反应，细胞因子水平测量和如通过OPK、血清杀菌杀灭(SBA)、凝集、运动性、细胞毒性或粘附性所测量的功能抗体水平)；以及在肺炎球菌疾病(例如肺炎、菌血症、脑膜炎、败血症、中耳炎、鼻咽定殖)动物模型中使用体内测定，来评价、测量和/或比较免疫反应。体内测定的参数包括从粘膜表面或血流的细菌清除，菌血症、脑膜炎、败血症或中耳炎的减轻或预防，鼻咽定殖的减少或预防，死亡率降低，以及在作为免疫原性组合物的靶标的肺炎球菌病原体攻击后的被动和主动保护。在一些实施方案中，将免疫反应与对照组合物进行比较。

在一些实施方案中，评估包含本文所描述的融合蛋白的药物组合物、免疫原性组合物或疫苗的效力的方法包括使用一种或多种体外生物测定(包括B细胞和T细胞反应如根据ELISA、多重ELISA、MSD、Luminex、流式细胞术的抗体水平，Th1/Th17细胞反应，细胞因子水平测量和如通过OPK、血清杀菌杀灭(SBA)、内化、活性中和、凝集、运动性、细胞毒性或粘附性所测量的功能抗体水平)；以及在肺炎球菌疾病(例如肺炎、菌血症、脑膜炎、败血症、中耳炎、鼻咽定殖)动物模型中使用体内测定，来评价、测量和/或比较免疫反应。参数包括从粘膜表面或血流的细菌清除或减少，菌血症、脑膜炎、败血症或中耳炎的减轻或预防，鼻咽定殖的减少或预防，死亡率降低，以及在作为免疫原性组合物的靶标的肺炎球菌病原体攻击后的被动和主动保护。在一些实施方案中，将免疫反应与对照组合物进行比较。

一般来说，可能需要评估两者之间的体液反应、细胞反应和/或相互作用。在评估体液反应的情况下，可例如在施用初始或加强剂量的疫苗之前和/或之后(和/或与在不存在抗原性刺激的情况下的抗体水平相比)测定特定病原体抗原(例如，多肽或多糖，具血清型特异性或者在两个或更多个血清型上保守)的抗体滴度和/或类型(例如总IgG、IgG1、IgG2、IgM、IgA等)。细胞反应可通过监测例如迟发型过敏反应等的针对抗原的反应来评估。细胞反应也可通过评价外周血单核细胞(PBMC)单核细胞对目标抗原刺激的反应来直接测量。前体和记忆B细胞群体可在针对特定病原体抗原的酶联免疫斑点(ELISpot)测定中进行评估。

RIA方法经由在悬浮液中将血清与放射性标记多糖或多肽一起温育来检测特异性抗体(例如Schiffiman等人,1980)。然后，用硫酸铵使抗原-抗体复合物沉淀，并且测定放射性标记团粒的每分钟计数(cpm)。

在ELISA检测方法中，来自经疫苗接种的受试者血清的特异性抗体是通过与已吸附至固体支撑物的抗原(例如，多肽或多糖，具血清型特异性或者在两个或更多个血清型上保守)一起温育来定量(例如Koskela和Leinonen(1981)；Kojima等人,1990；Concepcion和Frasch,2001)。使用酶缀合二级检测抗体来检测结合的抗体。ELISA还允许通过使用同型或子类别特异性二级抗体对免疫反应进行同型和子类别分析(即IgM对IgG，或IgG1对IgG2)，并且可被调适以评价抗体的亲合力(Anttila等人,1998；Romero-Steiner等人,2005)。多重测定(例如Luminex)有助于同时检测针对多种抗原的抗体。抗原与在光谱上不同的微球缀合，所述在光谱上不同的微球与血清一起混合且温育。使用二级抗体(例如R-藻红素缀合山羊抗人类IgG)检测与包覆微球上的抗原结合的抗体。

用于评估血清中的功能抗体的方法是调理吞噬测定(OPA)，其仅定量可调理细菌、引起细菌摄取和杀灭的抗体。标准测定利用人类吞噬效应细胞、补体源、细菌和稀释血清。测定读数是相较于仅与补体和人类细胞一起温育的细菌来说存在≥50％杀灭时的血清终点滴度(Romero-Steiner等人,1997)。这种杀灭OPA也可通过利用携带不同耐抗生素性标志物的病原体的靶标菌株来进行多重作用(Kim等人,2003)。另一类型的多重调理素测定是非杀灭测定，在所述非杀灭测定中通过FC评价在存在稀释血清加上补体源的情况下，与来自靶标病原体的抗原缀合的荧光染色包囊病原体或荧光微球的吞噬效应细胞的摄取(Martinez等人,1999)。血清抗体加上补体的调理素活性也可通过测量吞噬人类效应细胞对所摄取的病原体的氧化反应来评价(Munro等人1985；Ojo-Amaize等人,1995)。

某些体内模型系统可用于评价由包含本文所描述的融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗诱导的血清抗体所提供的保护。在这样的被动保护系统中，用病原体加上稀释血清攻击小鼠或大鼠，并且测定提供针对肺炎、菌血症、器官或组织定殖的防御的血清的终点滴度或死亡率(Stack等人,1998；Saeland等人,2000)。

在一些实施方案中，免疫接种的功效可通过测定一种或多种细胞因子水平来测定，所述测定是通过刺激来自免疫接种后的受试者的T细胞来进行。可将一种或多种细胞因子水平与免疫接种之前的同一受试者中的一种或多种细胞因子水平进行比较。一种或多种细胞因子的水平增加(例如相比于免疫接种前细胞因子水平增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍)将指示对免疫原性组合物或疫苗的反应增加。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子选自GM-CSP；IL-1α；IL-1β；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；IL-8；IL-10；IL-12；IL-17A；IL-17F或IL-17家族的其他成员；IL-22；IL-23；IFN-α；IFN-β；IFN-γ；MIP-1α；MIP-1β；TGF-β；TNFα或TNF-β。在一个非限制性实例中，免疫接种的功效可通过测定IL-17(特别是IL-17A)水平来测定，所述测定是通过刺激来自免疫接种后的受试者的T细胞来进行。可将IL-17水平与免疫接种之前的同一受试者中的IL-17水平进行比较。IL-17(例如IL-17A)水平增加(例如增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍)将指示对免疫原性组合物或疫苗的反应增加。

在一些实施方案中，可在存在来自患者的T细胞或抗体的情况下针对肺炎球菌杀灭测定嗜中性粒细胞。肺炎球菌杀灭增加(例如增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍)将指示对免疫原性组合物或疫苗的反应增加。举例来说，可测量Th17细胞活化，其中Th17细胞活化增加(例如增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍)与对免疫原性组合物或疫苗的反应增加相关。在另一个非限制性实例中，可测量Th1细胞活化，其中Th1细胞活化增加(例如增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍)与对免疫原性组合物或疫苗的反应增加相关。还可测量对免疫原性组合物或疫苗具有特异性的抗体的水平，其中特异性抗体水平增加(例如增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍)与功效增加相关。在一些实施方案中，使用这些测定中的两种或更多种。举例来说，可测量IL-17水平和免疫原性组合物特异性或疫苗特异性抗体水平。或者，可追踪流行病学标志物，例如与未经疫苗接种的受试者相比的经疫苗接种的受试者中的肺炎链球菌感染的发生率、严重程度或持续时间。

免疫原性组合物或疫苗功效也可在例如小鼠攻击模型的各种模型系统中进行测定。例如，可使用小鼠BALB/c或C57BL/6菌株。在向受试者施用测试免疫原性组合物或疫苗(以单次剂量或多次剂量形式)之后，实验者施用攻击剂量的肺炎链球菌。在一些情况下，鼻内施用的攻击剂量足以在未经疫苗接种的动物中造成肺炎链球菌定殖(尤其鼻定殖)，并且在一些情况下，经由吸入施用的攻击剂量足以在未经疫苗接种的动物中造成败血症和高致死率。在一些情况下，经由腹膜内注射施用的攻击剂量足以在未经疫苗接种的动物中造成败血症和高致死率。在一些情况下，经由静脉内注射施用的攻击剂量足以在未经疫苗接种的动物中造成败血症和高致死率。然后，可测量经疫苗接种的动物中的定殖减少或致死率降低。

某些体内模型系统可用于评价由本发明的疫苗诱导的血清抗体所提供的保护。在这些被动保护系统中，用病原体加上稀释血清攻击小鼠或大鼠，并且测定提供针对菌血症、器官或组织定殖的防御的血清的终点滴度或死亡率(Stack等人,1998；Saeland等人,2000)。

例证

目的：

该实施例比较了在用佐剂霍乱毒素(CT)经鼻免疫接种后，单个肺炎链球菌蛋白SP0785和SP1500与示例性融合蛋白CP1刺激Th17反应并保护小鼠免受肺炎链球菌鼻定殖的能力。示例性融合蛋白CP1是包含截短根瘤菌抗生物素蛋白(氨基酸[45-179]，标示为Rhavi)、SP0785多肽和SP1500多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白CP1是或包含Rhavi-接头(GGGGSSS)-SP1500-接头(AAA)-SP0785。

概述：

1.如通过用佐剂霍乱毒素(CT)鼻内免疫接种后的白介素17A(IL-17A)分泌所证实，肺炎链球菌蛋白SP0785和SP1500以及融合蛋白CP1可各自在小鼠中产生稳健的Th17反应。

2.通过用SP1500或SP0785和CT或者CP1和CT分别对小鼠进行鼻内免疫接种，显著减少了肺炎链球菌的鼻定殖。

材料和方法：

带组氨酸标签的重组蛋白在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中表达，并使用Ni-次氮基三乙酸亲和色谱法纯化。用具有Superdex 200柱的尺寸排阻色谱法执行第二次纯化。使用双辛可宁酸(bicinchoninic acid/BCA)蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad)测量蛋白质浓度。

霍乱毒素(CT)被用作鼻内免疫接种的佐剂，以促进对单独蛋白质的T细胞反应的诱导。在施用前，将蛋白质或肺炎球菌全细胞疫苗(表5中所示的量)与1μg CT混合在盐水溶液中，最终体积为每剂20μl。

对于用佐以CT的蛋白和用氯仿灭活的肺炎球菌全细胞疫苗(WCC)进行的鼻内免疫接种，C57BL/6小鼠(n＝10的组)间隔1周接受2次免疫接种。在最后一次免疫接种后3周采集外周血样品，用于在适当抗原作为刺激物存在下进行离体IL-17A刺激。

表5.小鼠鼻内免疫接种研究组

缩写：CP1：融合蛋白1(Rhavi-接头(GGGGSSS)-SP1500-接头(AAA)-SP0785)；Rhavi：截短根瘤菌抗生物素蛋白，氨基酸[45-179]；WCC：肺炎球菌全细胞疫苗(氯仿灭活)；CT：霍乱毒素

注意：所有重组蛋白均带有His标签。

在96孔圆底板中进行最后一次鼻内免疫接种后3周采集的外周血样品的离体刺激。将所有刺激物在刺激培养基(DMEM F-12；10％FBS，50μM 2-巯基乙醇，10μg/ml环丙沙星)中稀释，最终浓度为10μg/ml。在每个孔中，将25μl肝素化血液添加到225μl包含指定刺激物的刺激培养基中，接着在37℃和5％CO

在血液采集后1至2周，用10

使用PRISM(GraphPad软件)进行统计分析。使用曼-惠特尼U检验分析有关IL-17A浓度和鼻咽定殖密度的所有数据。计算每个组的IL-17A的几何平均浓度，并计算每个组的定殖几何平均密度。

结果与讨论：

如图2左图所示，与用单独CT免疫接种相比，用佐以CT的SP0785或SP1500鼻内免疫接种引起强烈的抗原特异性Th17反应，如通过用纯化的SP0785或SP1500离体刺激外周血后IL-17A产生增加所表明。IL-17A分泌的增加与经免疫接种小鼠攻击后第7天从鼻咽洗液中回收的肺炎链球菌CFU的相应统计学显著降低相关(图2，右图)。

如图3左图所示，在用CT鼻内免疫接种后，当将Rhavi蛋白与Rhavi-接头(GGGGSSS)-SP1500-接头(AAA)-SP0785(CP1)的蛋白融合物进行比较时，CP1保留了IL-17A的抗原特异性诱导。当这些小鼠受到肺炎链球菌攻击并与肺炎球菌全细胞疫苗鼻内免疫接种相比时，如通过肺炎球菌CFU所测量，单独的Rhavi不具有保护作用，而CP1的保护作用与杀灭的(灭活的)肺炎球菌全细胞相当(图3，右图)。

材料和方法：

将肺炎链球菌菌株6B、15A、16F和35B接种到具有酵母提取物的10mL托德休伊特肉汤(Todd Hewitt Broth/THB)培养物中。将培养物在5％CO

将肺炎链球菌的冷冻储备液解冻，并以2×10

用每剂100ug Rhavi-接头(GGGGSSS)-SP1500-接头(AAA)-SP0785(CP1，带His标签)和0.625mg来自AlPO

结果与讨论：

建立了改良集中调理吞噬测定(COPA)，以研究蛋白抗体介导的肺炎链球菌杀灭。与免疫前血清(P0)相比，测定了用CP1免疫接种的两只兔子的血清(P3，来自兔子87和88)。在对两只兔子测试的所有稀释度下，与肺炎链球菌血清型6B(并入市售Prevnar 13疫苗中的类型)的免疫前血清(P0)一起温育相比，与P3免疫血清一起温育导致CFU降低(图4)，或者在相同结果的替代显示中，杀灭活性百分比提高(图7，图A)。免疫血清的杀灭活性取决于HL60细胞和活性补体(数据未示出)。对两种未并入市售疫苗中的血清型即肺炎链球菌血清型15A(图5和图7，图B：1/2稀释度)和血清型35B(图6和图7，图C：1/2稀释度)测定相同血清。与针对肺炎链球菌血清型16F(另一种未并入市售疫苗中的血清型(图7，图D：1/2、1/6、1/18、1/54稀释度)的免疫前血清(P0)进行比较，测定了用CP1免疫接种的第三只兔子的血清(P3，来自兔子1762)。对于所有测试的兔子和非疫苗血清型，与免疫前血清(P0)一起温育相比，与P3免疫血清一起温育导致CFU降低，或者可替代地显示出杀灭活性百分比提高。免疫血清的杀灭活性取决于HL60细胞和活性补体(数据未示出)。

材料和方法：

带组氨酸标签的重组蛋白在大肠埃希氏菌中表达，并使用Ni-次氮基三乙酸亲和色谱法纯化。用具有Superdex 200柱的尺寸排阻色谱法执行第二次纯化。使用双辛可宁酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad)测量蛋白质浓度。

霍乱毒素(CT)被用作鼻内免疫接种的佐剂，以促进对单独蛋白质的T细胞反应的诱导。在施用前，将蛋白质(表6中所示的量)与1μg CT混合在盐水溶液中，最终体积为每剂20μl。

对于用佐以CT的蛋白进行的鼻内免疫接种，C57BL/6小鼠(n＝15的组)间隔1周接受2次免疫接种。在最后一次免疫接种后3周采集外周血样品，用于在适当抗原作为刺激物存在下进行离体IL-17A刺激。

表6.小鼠鼻内免疫接种研究组

缩写：CP1：融合蛋白1(Rhavi-接头(GGGGSSS)-SP1500-接头(AAA)-SP0785)；Rhavi：截短根瘤菌抗生物素蛋白，氨基酸[45-179]；CT：霍乱毒素

注意：所有重组蛋白均带有His标签。

在96孔圆底板中进行最后一次鼻内免疫接种后3周采集的外周血样品的离体刺激。将所有刺激物(纯化蛋白或杀灭的(灭活的)肺炎球菌全细胞)均在刺激培养基(DMEM F-12；10％FBS，50μM 2-巯基乙醇，10μg/ml环丙沙星)中稀释，最终浓度为10μg/ml。在每个孔中，将25μl肝素化血液添加到225μl包含指定刺激物的刺激培养基中，接着在37℃和5％CO

使用PRISM(GraphPad软件)进行统计分析。使用曼-惠特尼U检验分析了所有关于IL-17A浓度的数据。计算每个组的IL-17A的几何平均浓度。

结果与讨论：

如图8所示，与用佐以CT的SP0785或SP1500或者单独的CT(对照)进行免疫接种相比，佐以CT的CP1的鼻内免疫接种诱导了更强的抗原特异性Th17反应。Th17反应通过用纯化的SP0785(图A)、纯化的SP1500(图B)或杀灭的(灭活的)肺炎球菌全细胞(WCV；图C)离体刺激经免疫接种小鼠的外周血后IL-17A产生增加来表明。

如图9所示，与用佐以CT的融合蛋白SP0785-接头(SSSGG)-SP1500-接头(SSVDKL)-PdT或单独的CT(对照)进行免疫接种相比，用佐以CT的CP1进行鼻内免疫接种也诱导了更强的抗原特异性Th17反应。Th17反应通过用纯化的SP0785(图A)或纯化的SP1500(图B)离体刺激经免疫接种小鼠的外周血后IL-17A产生增加来表明。

如图10所示，与用佐以CT的SP0785、SP1500和Rhavi的组合(混合物)或单独的CT(对照)进行免疫接种相比，用佐以CT的CP1进行鼻内免疫接种诱导了更强的抗原特异性Th17反应。Th17反应通过用纯化的SP0785(图A)、纯化的SP1500(图B)或杀灭的(灭活的)肺炎球菌全细胞(WCV；图C)离体刺激经免疫接种小鼠的外周血后IL-17A产生增加来表明。

带组氨酸标签的重组融合蛋白CP1和SP0785-接头(SSSGG)-SP1500-接头(SSVDKL)-PdT在大肠埃希氏菌中表达，并使用Ni-次氮基三乙酸亲和色谱法纯化。用具有Superdex200柱的尺寸排阻色谱法执行第二次纯化。使用双辛可宁酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad)测量蛋白质浓度。

测定改编自Benton等人,1997。测定缓冲液包含10mM二硫苏糖醇，PBS pH 7.4中的0.1％牛血清白蛋白，和2％绵羊红细胞。绵羊红细胞的制备如下：添加200μl绵羊血+1mlPBS pH 7.4，充分混合，沉淀，并以8,000rpm洗涤3次，每次30sec；最后将血细胞重悬于10ml冰冷的PBS中并置于冰上直至使用。通过以下进行测定：将肺炎球菌溶血素标准物(Ply)、类肺炎球菌溶血素PdT和融合蛋白稀释以在指定浓度下在板上以100μl/孔来测试(CP1和SP0785-接头(SSSGG)-SP1500-接头(SSVDKL)-PdT)，然后向所有孔添加50μl的2％绵羊红细胞。将板在37℃下温育30分钟。温育后，将板在室温下以2,000rpm离心5分钟，并且将100μl上清液转移至空的96孔板中以测量OD

结果与讨论：

如图11所示，在任何测试浓度下，绵羊红细胞与融合蛋白CP1的温育均不会导致溶血。分别与浓度高于1mg/ml和0.5mg/ml的融合蛋白SP0785-接头(SSSGG)-SP1500-接头(SSVDKL)-PdT或单独的类肺炎球菌溶血素PdT一起温育，导致绵羊红细胞几乎完全溶血。这些结果表明两个融合蛋白的SP0785和SP1500部分对溶血活性没有贡献。相反，融合蛋白SP0785-接头(SSSGG)-SP1500-接头(SSVDKL)-PdT的溶血活性可归因于类肺炎球菌溶血素PdT。

序列

SEQ ID NO:1，根瘤菌抗生物素蛋白，全长[氨基酸1-179]：

SEQ ID NO:2，截短根瘤菌抗生物素蛋白，标示为Rhavi[氨基酸45-179]：

SEQ ID NO:3，SP0785蛋白，全长[氨基酸1-399]，TIGR4菌株：

SEQ ID NO:4，缺乏信号序列的SP0785蛋白[氨基酸33-399]：

注释：一个T394A与SP0785 NCBI序列ABJ54007.1和YP816180错配

SEQ ID NO:5，共有SP0785蛋白[氨基酸1-399]：

SEQ ID NO:6，SP1500蛋白，全长[氨基酸1-278]，TIGR4菌株：

SEQ ID NO:7，缺乏信号序列的SP1500蛋白[氨基酸27-278]：

SEQ ID NO:8，共有SP1500蛋白[氨基酸1-278]：

SEQ ID NO:9，编码全长根瘤菌抗生物素蛋白的根瘤菌抗生物素蛋白基因：

SEQ ID NO:10，编码截短根瘤菌抗生物素蛋白(标示为Rhavi[氨基酸45-179])的根瘤菌抗生物素蛋白基因：

SEQ ID NO:11，编码全长SP0785蛋白[氨基酸1-399]的SP0785基因，TIGR4菌株：

SEQ ID NO:12，编码缺乏信号序列的SP0785蛋白[氨基酸33-399]的SP0785基因：

SEQ ID NO:13，编码全长SP1500蛋白[氨基酸1-278]的SP1500基因，TIGR4菌株：

SEQ ID NO:14，编码缺乏信号序列的SP1500蛋白[氨基酸27-278]的SP1500基因：

SEQ ID NO:15,His标签1：

SEQ ID NO:16，His标签2：

SEQ ID NO:17，融合蛋白SP1500-SP0785：

SEQ ID NO:18，融合蛋白SP0785-SP1500：

SEQ ID NO:19，融合蛋白Rhavi-SP1500-SP0785：

SEQ ID NO:20，融合蛋白Rhavi-SP0785-SP1500：

SEQ ID NO:21，融合蛋白SP1500-SP0785-Rhavi：

SEQ ID NO:22，融合蛋白SP0785-SP1500-Rhavi：

SEQ ID NO:23，融合蛋白CP1，Rhavi-接头(GGGGSSS)-SP1500-接头(AAA)-SP0785：

SEQ ID NO:24，融合蛋白Rhavi-GGGGSSS-SP0785-AAA-SP1500：

SEQ ID NO:25，融合蛋白SP1500-GGGGSSS-SP0785-AAA-Rhavi：

SEQ ID NO:26，融合蛋白SP0785-接头(GGGGSSS)-SP1500-接头(AAA)-Rhavi：

SEQ ID NO:27，编码融合蛋白SP1500-SP0785的密码子优化的核酸序列

SEQ ID NO:28，编码融合蛋白SP0785-SP1500的密码子优化的核酸序列

SEQ ID NO:29，编码融合蛋白Rhavi-SP1500-SP0785的密码子优化的核酸序列：

SEQ ID NO:30，编码融合蛋白Rhavi-SP0785-SP1500的密码子优化的核酸序列：

SEQ ID NO:31，编码融合蛋白SP1500-SP0785-Rhavi的密码子优化的核酸序列：

SEQ ID NO:32，编码融合蛋白SP0785-SP1500-Rhavi的密码子优化的核酸序列：

SEQ ID NO:33，编码融合蛋白CP1 Rhavi-接头(GGGGSSS)-SP1500-接头(AAA)-SP0785的密码子优化的核酸序列：

SEQ ID NO:34，编码融合蛋白Rhavi-接头(GGGGSSS)-SP0785-接头(AAA)-SP1500的密码子优化的核酸序列：

SEQ ID NO:35，编码融合蛋白SP1500-接头(GGGGSSS)-SP0785-接头(AAA)-Rhavi的密码子优化的核酸序列：

SEQ ID NO:36，编码融合蛋白SP0785-接头(GGGGSSS)-SP1500-接头(AAA)-Rhavi的密码子优化的核酸序列：

SEQ ID NO:37，接头序列[7个氨基酸]：

GGGGSSS

SEQ ID NO:38，接头序列[3个氨基酸]：

AAA

SEQ ID NO:39，接头序列[5个氨基酸的重复序列]：

(GGGGS)

SEQ ID NO:40，接头序列[6个氨基酸]：

GGGGGG

SEQ ID NO:41，接头序列[15个氨基酸]：

GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:42，接头序列[30个氨基酸]：

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:43，接头序列[18个氨基酸]：

KESGSVSSEQLAQFRSLD

SEQ ID NO:44，接头序列[14个氨基酸]：

EGKSSGSGSESKST

SEQ ID NO:45，接头序列：

(Gly)

SEQ ID NO:46，接头序列[8个氨基酸]：

GGGGGGGG

SEQ ID NO:47，接头序列[12个氨基酸]：

GSAGSAAGSGEF

SEQ ID NO:48，接头序列[5个氨基酸的重复序列]：

(EAAAK)

SEQ ID NO:49，接头序列：

A(EAAAK)

SEQ ID NO:50，接头序列：

A(EAAAK)

SEQ ID NO:51，接头序列：

[A(EAAAK)

SEQ ID NO:52，接头序列[12个氨基酸]：

AEAAAKEAAAKA

SEQ ID NO:53，接头序列[2个氨基酸的重复序列]：

(XP)

SEQ ID NO:54，接头序列：

(AP)

SEQ ID NO:55，接头序列：

(KP)

SEQ ID NO:56，接头序列：

(QP)

SEQ ID NO:57，接头序列[14个氨基酸]：

APAPAPAPAPAPAP

SEQ ID NO:58，GAG接头序列[21个氨基酸]：

GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP

SEQ ID NO:59，GAG2接头序列[39个氨基酸]：

GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP

SEQ ID NO:60，GAG3接头序列[57个氨基酸]：

GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP

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WO2012/155007

WO 2012/155053

US 2009/0285846

等同物

本领域技术人员应认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。本发明的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所述。