生物活性剂及其相关方法
文献发布时间：2023-06-19 16:08:01
技术领域
本发明涉及生物活性剂，包括治疗剂，以及在所选生物样品中鉴定它们的方法。更具体地说，该方法涉及细胞与胞外基质(例如无细胞(acellular)胞外基质或脱细胞(decellularized)胞外基质)在体外相互作用的用途，由此该相互作用释放一种或多种感兴趣的生物活性剂，包括一种或多种具有潜在治疗功效的生物活性剂。在另一方面，本发明涉及一种此类生物活性剂，即具有干细胞募集活性的胞外基质蛋白核心蛋白聚糖(decorin)的多肽片段的鉴定、表征和用途。
发明背景
以下包括可能有助于理解本发明的信息。不认为此处提供的任何信息是现有技术，或与当前描述或要求保护的发明相关，或明确或隐含引用的任何出版物或文件是现有技术。本说明书中对现有技术的任何讨论都不应该视为承认这种现有技术已广为人知或构成本领域公知常识的一部分。
应当理解的是，对于一系列研究和治疗用途，持续需要生物活性剂，包括具有治疗活性的生物活性剂。虽然广泛的研究和开发工作集中在合成试剂上，但从生物系统中提取的生物活性剂具有重要的意义。
通常，已通过意外发现或靶向方法从完整组织中鉴定了来源于组织的生物活性剂，包括例如胞外基质(ECM)。然而，对于来自ECM的生物活性剂，这些方法面临许多挑战。例如，组织是复杂且高度异质的物质，不仅包括各种细胞类型，还包括ECM本身。因此，从作为正常组织的复杂混合物中鉴定物质需要各种级分、分离和分析技术，这些技术可能会遗漏可能有用的生物活性剂，包括治疗剂。此外，据信ECM及其组分的生物学特性取决于许多因素，包括组织的年龄、组织位置和任何疾病状态。此外，ECM和相互关联的细胞群通过各种生物活性剂介导，参与多种信号转导过程。这些信号转导事件可能是连续的或瞬时的，并且取决于所涉及的ECM组分和细胞。这使得重要的生物活性剂在组织中可能只是瞬时的或寿命短暂，使其鉴定具有挑战性。因此，现有方法受到组织ECM的复杂性、ECM中潜在治疗剂的相对丰度、组织ECM中发生的复杂相互作用以及分离和鉴定生物活性剂的实践挑战的限制。
因此，需要从ECM(包括无细胞胞外基质(aECM)或脱细胞胞外基质(dECM)材料)中鉴定潜在治疗性生物分子的新方法，以克服这些限制。
然而，目前还没有有效且方便的方法适用于鉴定来源于细胞与ECM相互作用的生物活性剂，尤其是那些适用于鉴定来源于一个或多个细胞群与ECM(包括aECM和dECM)相互作用的生物活性剂的方法。
因此，存在开发新的改进方法来鉴定这类物质的需求，以及对这类物质本身的相关需求。
因此，本发明的目的是提供一种或多种生物活性剂，例如生物活性多肽，和/或一种或多种检测/或鉴定此类物质的方法，或至少提供现有方法的有用替代方法，或至少向公众提供有用的选择。
发明概述
在第一方面中，本发明涉及选自下组的分离、纯化、重组或合成多肽：
a)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188的氨基酸序列组成；
b)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188的氨基酸序列组成；
c)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
d)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
e)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177的氨基酸序列组成；
f)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177的氨基酸序列组成；
g)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
h)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
i)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170的氨基酸序列组成；
j)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170的氨基酸序列组成；
k)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
l)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
m)多肽，其包含、基本上由或由SEQ ID NO:1-4中任一所述的氨基酸序列组成；
n)多肽，其包含、基本上由或由上述a)到m)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成；
o)多肽，其包含或由上述a)到n)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个细胞(包括一个或多个干细胞)的基序或区域；
p)多肽，其包含或由上述a)到o)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个间充质干细胞的基序或区域；
q)上述a)至p)中任一的功能片段、功能变体、肽类似物或模拟肽(peptidomimetic)或衍生物；和
r)与上述a)至q)中任一具有至少约70％氨基酸相同性的多肽。
本文所描述的任何实施方式可涉及本文所呈现的任何方面。
本发明的另一方面涉及组合物，包括药物组合物，其包含选自下组的一种或多种多肽：
a)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188的氨基酸序列组成；
b)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188的氨基酸序列组成；
c)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
d)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
e)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177的氨基酸序列组成；
f)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177的氨基酸序列组成；
g)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
h)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
i)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170的氨基酸序列组成；
j)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170的氨基酸序列组成；
k)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
l)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
m)多肽，其包含、基本上由或由SEQ ID NO:1-4中任一所述的氨基酸序列组成；
n)多肽，其包含、基本上由或由上述a)到m)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成；
o)多肽，其包含或由上述a)到n)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个细胞(包括一个或多个干细胞)的基序或区域；和
p)多肽，其包含或由上述a)到o)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个间充质干细胞的基序或区域；
q)上述a)至p)中任的功能片段、功能变体、肽类似物或模拟肽或衍生物；和
r)与上述a)至q)中任一具有至少约70％氨基酸相同性的多肽。
s)上述a)到r)中任意两个或多个的任意组合。
在一个实施方式中，组合物还包含药学上可接受的运载体。
本发明的另一方面涉及试剂，其包含本文所述的一种或多种多肽，和/或如本文所述的组合物。
本发明的另一方面涉及包含如本文所述的试剂和/或组合物的试剂盒。
根据另一方面，本发明涉及表达构建体，其包含编码选自下组的多肽的核酸：
a)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188的氨基酸序列组成；
b)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188的氨基酸序列组成；
c)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
d)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
e)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177的氨基酸序列组成；
f)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177的氨基酸序列组成；
g)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
h)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
i)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170的氨基酸序列组成；
j)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170的氨基酸序列组成；
k)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
l)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
m)多肽，其包含、基本上由或由SEQ ID NO:1-4中任一所述的氨基酸序列组成；
n)多肽，其包含、基本上由或由上述a)到m)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成；
o)多肽，其包含或由上述a)到n)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个细胞(包括一个或多个干细胞)的基序或区域；和
p)多肽，其包含或由上述a)到o)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个间充质干细胞的基序或区域；
q)上述a)至p)中任一的功能片段、功能变体、肽类似物或模拟肽或衍生物；和
r)上述a)至q)中任一具有至少约70％氨基酸相同性的多肽。
s)上述a)到r)中任意两个或多个的任意组合。
本发明的另一方面涉及包含如上所述的表达构建体的载体。
本发明的另一方面涉及包含如上所定义的表达构建体或载体的宿主细胞。
在另一方面，本发明涉及纯化、分离、重组或合成蛋白质介导生物效应的用途，其中所述蛋白质选自下组：
a)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188的氨基酸序列组成；
b)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188的氨基酸序列组成；
c)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
d)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
e)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177的氨基酸序列组成；
f)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177的氨基酸序列组成；
g)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
h)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
i)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170的氨基酸序列组成；
j)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170的氨基酸序列组成；
k)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
l)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
m)多肽，其包含、基本上由或由SEQ ID NO:1-4中任一所述的氨基酸序列组成；
n)多肽，其包含、基本上由或由上述a)到m)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成；
o)多肽，其包含或由上述a)到n)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个细胞(包括一个或多个干细胞)的基序或区域；和
p)多肽，其包含或由上述a)到o)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个间充质干细胞的基序或区域；
q)上述a)至p)中任一的功能片段、功能变体、肽类似物或模拟肽或衍生物；和
r)与上述a)至q)中任一具有至少约70％氨基酸相同性的多肽。
s)上述a)到r)中任意两个或多个的任意组合。
在一个实施方式中，在有此需要的对象体内介导生物效应，例如通过给予蛋白质。
在另一实施方式中，离体(例如在体外)介导生物效应，例如通过将生物样品与蛋白质接触。例如，通过将一个或多个细胞、一个或多个组织或一个或多个器官与蛋白质接触，在体外介导生物效应。
在各种实施方式中，生物样品、包括aECM或dECM的组织或细胞来自动物，例如哺乳动物对象，包括人对象，或乳业动物，例如牛、绵羊或山羊。
在另一方面，本发明涉及提供一种或多种生物活性剂的方法，该方法包括以下步骤：
i.提供胞外基质；
ii.使一个或多个细胞与胞外基质体外接触；
iii.任选地，至少部分纯化一种或多种生物活性剂；和
iv.回收所述一种或多种生物活性剂。
在另一方面，本发明涉及检测和/或鉴定一种或多种生物活性剂的方法，该方法包括以下步骤：
i.提供胞外基质；
ii.使一个或多个细胞与胞外基质体外接触足以释放一种或多种生物活性剂的时间；
iii.任选地，至少部分纯化一种或多种生物活性剂；和
iv.检测和/或鉴定所述一种或多种生物活性剂。
在各种实施方式中，胞外基质为无细胞ECM、脱细胞ECM或基本上不含细胞的胞外基质，例如基本上不含活细胞的ECM。在一个实施方式中，胞外基质基本上不含内源细胞，例如，完全不含内源细胞。
在一个实施方式中，无细胞ECM是天然产生的无细胞ECM。例如，无细胞ECM是或来源于玻璃体体液。
在一个实施方式中，胞外基质为脱细胞胞外基质。
在各种实施方式中，ECM由来自任何动物物种(包括哺乳动物、爬行动物、鸟类和昆虫)的真皮、心包、胃、小肠、膀胱、胎盘、肾小囊或体腔衬膜制备。
在一个实施方式中，ECM为绵羊前胃基质(OFM)。
在一个实施方式中，该时间足以允许一个或多个细胞与胞外或其组分相互作用。
在一个实施方式中，接触时间足以从ECM释放一种或多种生物活性剂。在一个实施方式中，接触时间足以诱导一个或多个细胞产生或分泌生物活性剂。
在一个实施方式中，时间是从约1小时到约7天或更长。在一个示例中，时间为至少约6小时、至少约12小时、至少约18小时或至少约24小时。
在一个实施方式中，一个或多个细胞包含同质细胞群。在一个示例中，细胞是巨噬细胞，例如活化的巨噬细胞。
在一个实施方式中，一个或多个细胞包含两个或多个细胞群。在一个示例中，一个群体包含巨噬细胞，和/或一个群体包含成纤维细胞。在其他示例中，一个或多个细胞包括一个或多个神经元细胞、一个或多个上皮细胞、一个或多个内皮细胞、一个或多个干细胞或一个或多个祖细胞。
在各种实施方式中，ECM和一个或多个细胞各自来自一种组织或各自属于在体内彼此不接触的类型。例如，无细胞ECM和一个或多个细胞各自来自一种组织或各自属于在体内无病理状态下彼此不接触的类型。
在各种实施方式中，当进行时，至少部分纯化包括过滤、色谱(例如HPLC和/或离子交换)、凝胶电泳、沉淀或尺寸排阻，包括尺寸排阻过滤。在某些实施方式中，采用一种以上的纯化方法。
在各种实施方式中，纯化和/或回收是通过色谱进行的，例如尺寸排阻色谱、凝胶电泳或快速蛋白质高压液相色谱。
在各种实施方式中，检测和/或鉴定是通过分析一种或多种生物功能，例如生物活性剂引发生物反应的能力。例如，检测和/或鉴定是通过分析趋化活性，一种或多种细胞反应的调节，例如基因表达的调节，细胞因子或趋化因子生产的调节，细胞周期进程的调节，细胞分化或增殖的调节，细胞活化的调节，如巨噬细胞或中性粒细胞活化。
在各种实施方式中，在体外或体内评估生物活性剂的生物活性，并且在某些实施方式中包括但不限于诸如细胞迁移、趋化性、增殖或细胞或酶过程的抑制等。
在各种实施方式中，通过直接检测和/或鉴定生物活性剂来检测和/或鉴定。例如，通过蛋白质或核苷酸测序、色谱、免疫分析或质谱进行检测和/或鉴定。
在各种实施方式中，一种或多种生物活性剂是通过蛋白水解切割、通过细胞加工(例如通过胞内溶酶体内吞和消化蛋白质)、通过氧化迸发(oxidative burst)或通过构象改变而释放的蛋白质或肽。
本发明的另一方面涉及组合物，其包含ECM和一个或多个细胞，例如一个或多个外源细胞，包括用于鉴定一种或多种生物活性剂的所述组合物。
在各种实施方式中，胞外基质为无细胞ECM、脱细胞ECM或基本上不含细胞的胞外基质，例如基本上不含活细胞的ECM。在一个实施方式中，胞外基质基本上不含内源细胞，例如，完全不含内源细胞。
在一个实施方式中，无细胞ECM是天然产生的无细胞ECM。例如，无细胞ECM是或来源于玻璃体体液。
在一个实施方式中，无细胞胞外基质为脱细胞胞外基质。
在一个实施方式中，通过一个或多个细胞与ECM(例如与aECM或dECM)的相互作用来释放一种或多种生物活性剂。
在如上所述的包含一个或多个细胞的组合物的一个实施方式中，该组合物包含同质细胞群。在一个示例中，细胞是巨噬细胞，例如活化的巨噬细胞。
在包含一个或多个细胞的组合物的一个实施方式中，该组合物包含两个或多个细胞群。在一个示例中，一个群体包含巨噬细胞，和/或一个群体包含成纤维细胞，和/或一个群体包含角质形成细胞。
在一个示例中，一个或多个细胞来源于与ECM来源相同的物种。
本发明的另一方面涉及包含通过如本文所述的方法鉴定的一种或多种生物活性剂的组合物。
在一个实施方式中，一种或多种生物活性剂通过一个或多个细胞与ECM的相互作用释放。
在另一方面，本发明涉及在生物样品或有此需要的对象中介导生物效应的方法，该方法包括接触生物样品或通过向对象给予有效量的选自下组的蛋白质：
a)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188的氨基酸序列组成；
b)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188的氨基酸序列组成；
c)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
d)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
e)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177的氨基酸序列组成；
f)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177的氨基酸序列组成；
g)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
h)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
i)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170的氨基酸序列组成；
j)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170的氨基酸序列组成；
k)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
l)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
m)多肽，其包含、基本上由或由SEQ ID NO:1-4中任一所述的氨基酸序列组成；
n)多肽，其包含、基本上由或由上述a)到m)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成；
o)多肽，其包含或由上述a)到n)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个细胞(包括一个或多个干细胞)的基序或区域；和
p)多肽，其包含或由上述a)到o)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个间充质干细胞的基序或区域；
q)上述a)至p)中任一的功能片段、功能变体、肽类似物或模拟肽或衍生物；和
r)与上述a)至q)中任一具有至少约70％氨基酸相同性的多肽；
s)上述a)到r)中任意两个或多个的任意组合。
在一个实施方式中，在有此需要的对象体内介导生物效应，例如通过向对对象给予蛋白质。在一个实施方式中，有效量为治疗有效量。
在另一实施方式中，离体(例如在体外)介导生物效应，例如通过将生物样品与蛋白质接触。例如，通过将一个或多个细胞、一个或多个组织或一个或多个器官与蛋白质接触，在体外介导生物效应。
在另一方面，本发明涉及在有此需要的对象中调节组织修复的方法，该方法包括给予对象治疗有效量的如本文所述的蛋白质。
在某些实施方式中，治疗有效量足以募集一个或多个干细胞到例如给药部位或给予的蛋白质定位的部位。
在另一方面，本发明涉及在有此需要的对象中治疗与干细胞缺陷相关的疾病或紊乱的方法，该方法包括给予对象治疗有效量的如本文所述的蛋白质。
在一个实施方式中，该疾病或紊乱是与局部干细胞缺陷相关的疾病或紊乱，例如特定组织或器官中的干细胞缺陷。
在还有一个方面，本发明涉及在有此需要的对象中调节干细胞募集或相关过程的方法，该方法包括给予对象治疗有效量的如本文所述的蛋白质。
在各种实施方式中，相关过程为血管生成，造血，蛋白质表达、诱导或沉积，组织重塑、修复或再生，细胞增殖，细胞分化，包括干细胞分化，细胞调节，细胞凋亡，一种或多种免疫应答的调节，肿瘤发生、趋化性或细胞募集的调节。
在另一方面，本发明涉及介导生物效应，调节有此需要的对象中组织修复，治疗有此需要的对象中与干细胞缺陷相关的疾病或紊乱，或调节有此需要的对象中干细胞募集或相关过程的方法，该方法包括向对象给予治疗有效量的如本文所述的药学可接受的组合物。
在另一方面，本发明涉及介导生物效应，调节有此需要的对象中组织修复，治疗有此需要的对象中与干细胞缺陷相关的疾病或紊乱，或调节有此需要的对象中干细胞募集或相关过程的方法，该方法包括向对象给予治疗有效量的如本文所述的方法鉴定出的生物活性剂。
在各种实施方式中，以约1ng/kg至约1mg/kg的剂量向对象给予本文所述多肽。例如，以约1ng/kg至约100μg/kg，或约1ng/kg至约10μg/kg，1ng/kg至约1μg/kg，或约1ng/kg至约100ng/kg的剂量给予本文所述多肽。
应理解，提到本文公开的数字范围(例如，1到10)时还指包括该范围内的所有有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内的任何有理数范围(例如，2到8、1.5到5.5和3.1到4.7)。这些仅仅是特别意指的例子，在列举的最低值和最高值之间的全部可能的数值组合都被认为以类似的方式在本申请中明确陈述。
本领域技术人员将理解本文中使用的各种程度术语的含义。例如，如本文在提及量(例如，“约9％”)时，术语“约”表示该量接近并包括仍执行期望功能或实现期望结果的量，例如，“约9％”可包括9％和接近9％的量，这些量仍能执行预期功能或实现预期结果。例如，术语“约”可指在少于所述量10％以内、5％以内、1％以内、0.1％以内或0.01％以内的量。还应预期的是，在使用术语“约”的情况下，例如与数字、浓度、量、整数或值相关时，还具体设想了准确的数字、浓度、量、整数或值。
通过以下详细说明，本发明的其他目的、方面、特征和优点将显而易见。然而，应当理解，在指示本发明的优选实施方式的同时，详细描述和具体实施例仅是示例说明，因为本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将由该详细描述变得显而易见。
附图简要说明
图1显示了如本文所述的利用哺乳动物细胞与组织衍生dECM的共培养的代表性分析方法的示意图。细胞修饰、释放或加工dECM的组分以产生生物活性剂，例如具有适合于治疗人类疾病的治疗性质的生物活性剂，然后评估其生物活性。
图2显示了全长绵羊核心蛋白聚糖的二级结构和功能域，以及MayDay多肽的位置和核心蛋白聚糖的X射线晶体结构。
图3显示了如本文实施例1所述的MSC迁移分析中条件培养基的生物活性数据，与仅OFM和仅巨噬细胞相比，建立了MSC对巨噬细胞和OFM共培养产生的培养基的生物反应。条件培养基由含有OFM(OFM)、RAW小鼠巨噬细胞(Mφ)以及与巨噬细胞共培养的OFM(OFM+Mφ)的培养基生成。使用ovAD-MSC进行跨孔迁移试验，并仅培养基(“对照”)和FGF2(50ng/mL)分别作为阳性和阴性对照。迁移的ovAD-MSC在6小时后成像。试验组的代表性显微照片包括在图A到E(A＝培养基对照；B＝FGF2(50ng/mL)；C＝OFM；D＝Mφ；E＝OFM+Mφ)。定量细胞迁移，结果表示为对培养基对照标准化的平均细胞迁移(“标准化细胞迁移”)(F)。误差条表示三个独立实验的标准偏差。用t-检验确定统计显著性，其中：‘*’p≤0.05‘**’p≤0.01‘***’p≤0.001；‘****’p≤0.0001。
图4显示MSC趋化性对通过纯化蛋白质富集测试样品的反应，所述蛋白质随后被鉴定为MayDay肽。使用10ng、25ng和100ng总蛋白富集肽样品。与培养基对照组(0ng)相比，通过单向ANOVA计算，MayDay富集样品显示MSC趋化性的剂量依赖性增加和细胞计数的显著增加‘*’p<0.05，‘**’p≤0.01。
图5显示了来自OFM
图6给出了绵羊DCN(1-360；登录号：Q9TTE2)(灰色)序列的两个代表，如实施例4所述。图6A显示了通过ESI MS/MS鉴定的肽片段的位置，包括推定的MayDay(31-189)序列(灰色下划线)，以及通过ESI分析鉴定的DCN肽片段，这些肽片段来自胰蛋白酶消化的培养基(“蓝色”)、尺寸排阻(“黄色”)和Tris-Tricine凝胶内消化(“绿色”)的样品。图6B显示了推定的MayDay(31-188)序列(灰色下划线)，以及MEROPS基于人DCN序列预测的蛋白酶切割位点的位置(1-360；登录号：P07585)。DCN序列上的切割位点用粗体文本表示，“↑”指每个指示蛋白酶的切割位点的预测C-端残基。
图7显示了巨噬细胞衍生的MMP12(见图6A)对OFM中存在的核心蛋白聚糖蛋白的体外切割，从而产生MayDay肽(图7A，泳道6)。如图7B所示，MayDay肽显示出比全长核心蛋白聚糖更大的趋化活性。重组人DCN用MMP-12消化，然后使用ovAD-MSC进行跨孔迁移试验。仅培养基(“对照”)和FGF2(50ng/mL)分别作为阳性和阴性对照。迁移的ovAD-MSC在6小时后成像。试验组的代表性显微照片包括在图A到E(A＝培养基对照；B＝FGF2(50ng/mL)；C＝MMP12；D＝DCN；E＝MMP12+DCN)。定量细胞迁移，结果表示为对培养基对照标准化的平均细胞迁移(‘标准化细胞迁移’)(F)。误差条表示三个独立实验的标准偏差。用t-检验确定统计显著性，其中：‘**’p≤0.01‘***’p≤0.001；‘****’p≤0.0001。
图8显示了描述重组MayDay肽与生长因子SDF1(基质衍生的生长因子)相比在MSC细胞募集中的生物活性的数据，如实施例6所述。重组HIS-标记的MayDay(31-170)[rec-HISovMayDay(31-170)]在三种浓度下使用ovAD-MSC进行跨孔分析。仅培养基(‘对照’)和SDF-1(50ng/mL)分别作为阳性和阴性对照。迁移的ovAD-MSC在6小时后成像。试验组的代表性显微照片包括在图A到E(A＝培养基对照；B＝SDF-1(50ng/mL)；C＝0.05ng/mL；D＝0.50ng/mL；E＝5.00ng/mL)。定量细胞迁移，结果表示为对培养基对照标准化的平均细胞迁移(‘标准化细胞迁移’)(F)。误差条表示三个独立实验的标准偏差。用t-检验确定统计显著性，其中：‘***’p≤0.001；‘****’p≤0.0001。
图9显示了重组MayDay肽在完整动物模型中募集MSC的体内生物活性，如实施例7所述。图9A显示了在注射标记的muBM-MSC后t＝0和t＝24小时，来自每个治疗组的动物(上图)的代表性图像。箭头表示每个治疗组的注射部位。还示出了切下的“正常”和“治疗”肌肉组织的代表性图像(下图)。图9B显示了每个治疗组切下的“正常”和“治疗”肌肉组织的荧光强度(像素)定量。误差条表示一式三份动物的标准误差。用t-检验确定统计显著性，其中‘*’p≤0.05，‘**’p≤0.01。
具体实施方式
本发明涉及用于鉴定一种或多种生物活性剂的方法，包括在一种或多种细胞与无细胞ECM相互作用期间产生或释放的治疗剂。在某些实施方式中，一种或多种生物活性剂来源于组织ECM，例如，其中该剂是ECM的组分、ECM组分的片段或经修饰的ECM的组分或片段，例如通过一个或多个细胞与ECM的相互作用，因此其与天然ECM中的形式不同。
在其他实施方式中，一种或多种生物活性剂由一个或多个细胞产生、分泌或表达，作为其与无细胞ECM相互作用的结果。
如本文所用，“生物活性剂”是能够引发生物反应的物质，例如，能够在一个或多个细胞中，或者实际上在一个或多个组织、器官或生物体中刺激生物反应。特别设想的生物活性剂是由生物系统或响应生物相互作用或刺激而产生的，因此其本身具有生物性质。例如，如本文所设想，生物活性剂在某些实施方式中为蛋白质或多肽、脂质、多糖、核酸、趋化因子、维生素、激素、代谢物、生长因子、细胞因子、外来体等。特别预期的生物活性剂是引发生物反应的那些，例如，引发一种或多种细胞趋化性和/或募集，组织重塑和/或组织修复、伤口愈合和/或再生的调节，免疫应答的调节，血管生成的调节，组织微环境的调节，血管生成，造血，蛋白质表达、诱导或沉积，细胞增殖，包括干细胞分化在内的细胞分化，包括细胞周期调节在内的细胞调节，细胞凋亡，一种或多种免疫应答的调节，以及肿瘤发生的调节。
阅读本说明书后，本领域技术人员将认识到提供了这些生物活性剂的各种用途，尤其是在涉及细胞趋化性和募集的研究和治疗方法中，例如，组织重塑、组织修复和伤口愈合的调节、免疫应答的调节，血管生成的调节和组织微环境的调节。
在以下小节中进一步详细描述本发明的各个方面。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。若有抵触，以本包括定义在内的本申请说明书为准。虽然在本发明的实践中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料的示例。本文所述材料、方法和实施例都仅是说明性的，不构成限制。
定义
如本文所用，术语“和/或”可指“和”或“或”。
本说明书和权利要求书中使用的术语“包含”、“包括”和“含有”不应以排他性或穷举的意义进行解释，而是指“至少部分由……组成”。在解释本说明书中包含术语“包含”、“包括”或“含有”的每处陈述时，也可以存在除该术语或以该术语开头的特征以外的特征。“包括有”、“包含有”和“涵盖”等相关术语的解释方式相同。
本说明书中使用的术语“基本上由……组成”指的是所述特征，并允许存在不会实质性改变所述特征的基本特征的其他特征。
本文使用的术语“由……组成”是指要求保护的发明的指定物质或步骤，不包括权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。
ECM
适于在本文中使用的ECM生物材料是基于胶原的生物可降解基质，其包含处于其天然构型和天然浓度的高度保守的胶原、糖蛋白、蛋白多糖和糖胺聚糖。
本发明中使用的一种胞外胶原基质是温血脊椎动物的ECM。ECM可以从各种来源获得，例如，从饲养用于肉类生产的动物(包括猪、牛、羊或其他温血脊椎动物)获取的肠组织。脊椎动物ECM是商业肉类生产操作的大量副产品，因此是一种低成本的组织移植材料。
ECM生物材料包括天然结合的ECM蛋白质、糖蛋白和ECM内天然存在的其他因子，具体取决于ECM的来源。
在本文设想的某些实施方式中，根据本公开使用的ECM是无细胞ECM(aECM)——即基本上不含细胞的组织ECM。
在各种实施方式中，本文中有用的aECM是天然产生的aECM——即，在体内基本上不含细胞的ECM。示例包括来自例如哺乳动物、爬行动物或鸟类眼睛的玻璃体体液ECM。
在其他实施方式中，ECM衍生自这样的ECM，其与体内一个或多个细胞相关联，但基本上所有细胞均已从中移除。本文中，无论是通过例如在实验室中的主动操作还是通过其他处理，已经脱细胞化的ECM通常被称为脱细胞ECM(dECM)。
因此，在本文设想的某些实施方式中，对组织中发现的ECM进行脱细胞化以分离或部分纯化ECM。这些类型的材料广泛用于伤口护理和软组织再生，通常用作临时替代患者体内缺失或受损ECM的支架。当dECM模拟组织ECM时，患者的细胞将附着到外源dECM上，生长并分裂。随着时间的推移，dECM将整合到患者的新组织中。据报道，dECM在再生过程中将通过模拟正常细胞与ECM相互作用的过程与患者细胞相互作用。例如据报道，dECM刺激新组织中的血管生成，并进行建设性重塑。与组织中发现的ECM一样，这些dECM包含结构、粘附和信号转导分子的异质混合物。
ECM可以从任何合适的来源获得，例如绵羊前胃。通常，ECM将被脱细胞化，以减少或完全除去宿主细胞。
前胃组织是用于本发明的优选ECM来源。合适的前胃ECM通常包括反刍动物前胃固有粘膜下层。在本发明的特定实施方式中，固有粘膜下层来自前胃的瘤胃、网胃或瓣胃。这些组织支架通常具有波状外形的腔体表面。ECM组织支架还可包含脱细胞化的组织，包括部分上皮、基底膜或肌层及其组合。组织支架还可包含一种或多种纤维状蛋白，包括但不限于I型胶原、III型胶原或弹性蛋白及其组合。
在一个特别设想的示例中，使用去除残余绵羊(羊)细胞并消毒所得ECM的方法从绵羊前胃组织制备dECM。此dECM在本文中称为“绵羊前胃基质”(OFM)。本文使用的术语“绵羊前胃基质”和缩写OFM是指含有反刍动物前胃固有粘膜下层的ECM支架。本文所使用的术语“固有粘膜下层”是指反刍动物前胃固有层和粘膜下层混合形成的组织结构。OFM已被证明含有组织ECM的各种组分以刺激血管形成和进行建设性重塑。
本文中使用的ECM通常易于操作、易于干燥(如冷冻干燥)以及易于灭菌。
在各种实施方式中，ECM来自人或动物组织来源，例如绵羊、牛、猪、山羊、鹿或人类组织。例如，ECM是或包含人dECM、绵羊dECM、牛dECM、猪dECM、鹿dECM或山羊dECM。
在一个实施方式中，ECM来自胎儿或新生儿组织。在另一实施方式中，ECM来自青少年、成人或老年组织。
在一个实施方式中，ECM来自健康组织。在其他实施方式中，ECM来自患病组织，例如来自癌组织的ECM。
在一个实施方式中，ECM来自整个器官或特定组织，例如，ECM来自肝、肾、肺、肠、羊膜、神经、皮肤或血管组织。
在特别设想的实施方式中，ECM来自反刍动物的前胃。在某些实施方式中，ECM来自前胃的瘤胃、网胃或瓣胃。在某些实施方式中，ECM将包括来自此类组织的上皮、基底膜或肌层的部分及其组合。
在各种实施方式中，ECM包含一种或多种纤维状蛋白，包括但不限于I型胶原、III型胶原或弹性蛋白及其组合。
应理解的是，在本文所述方法的某些实施方式中，源自特定组织的dECM在体内与来自该组织或与该组织相关的一个或多个细胞接触。然而在其他实施方式中，源自自特定组织的dECM在体内与通常不在该组织中或与该组织相关的一个或多个细胞接触。例如，在一个这样的实施方式中，来自小肠的ECM与从哺乳动物皮肤分离的角质形成细胞(keratinocyte)接触。
虽然具体设想了本文所述方法的实施方式使用了基本上不含细胞且也基本上不含其他物质的ECM，但应理解的是，在其他实施方式中，ECM可与其他物质相结合，例如一种或多种结构支持物，包括例如一个或多个聚合物片材。在本文描述的鉴定方法中，应当理解的是，当ECM与一个或多个细胞接触时存在的任何其他材料理想情况下为生物惰性的和/或不能影响一个或多个细胞与ECM的相互作用。能用于向ECM提供结构支持的聚合物的代表性示例包括聚乙烯醇、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸共-乳酸(PLLA)和聚(乳酸)-聚(乙醇酸)(PLGA)聚合物。
ECM脱细胞化的方法
本文描述的方法受益于使用基本上不含细胞的ECM。
本领域技术人员将熟悉适合于分离ECM并将制备其以供后续使用的手术方法，包括适合于从受试动物中或来自其的合适组织中分离aECM的手术方法。ECM脱细胞化的方法在本领域是众所周知的——例如，参见美国专利4,902,508、美国专利5,554,389、美国专利6,099,567和美国专利8,415,159，每一项都通过引用全部并入本文。
在一个实施方式中，适于如本文所述使用的ECM通过穿过器官壁(例如反刍动物前胃)的透壁渗透流制备。通常，用一种溶液填充器官，密封，然后浸入另一种溶液中。两种溶液之间的盐度差异导致透壁渗透流。应理解的是，通过改变溶液(即高渗和低渗溶液)的位置，可在任一方向上建立渗透梯度。梯度优选地建立在模仿器官自然流动的方向上。例如，当处理来自反刍动物前胃的组织时，优选建立从组织的腔面到近腔表面的梯度。
通过透壁渗透流使ECM脱细胞的示例性方法在PCT国际专利申请PCT/NZ2009/000152(作为WO2010/014021出版)和美国专利号8,415,159中介绍，每一项均通过引用全部并入本文。
简言之，对脊椎动物前胃的一段(优选获自绵羊物种)进行组织两侧之间的透壁渗透流，使得全部或部分组织内的组织层分离和/或脱细胞化。透壁渗透流的方向为从全部或部分组织的腔侧至近腔侧，或从全部或部分组织的近腔侧至腔侧。这可以通过例如在高渗和低渗溶液之间分离组织来实现，使得透壁渗透流的方向为从低渗溶液到高渗溶液。
在某些实施方式中，该方法将进一步涉及移除包括上皮、基底膜或肌层的组织层的全部或部分及其组合。
高渗和低渗溶液通常包括例如水和可选的至少一种缓冲液、去污剂或盐。高渗溶液比低渗溶液含有更高浓度的溶质。在特定方法中，高渗溶液包含4M NaCl，低渗溶液包含0.28％曲通X-200和0.1％EDTA。在另一特定方法中，低渗溶液包含0.1％SDS。在另一种方法中，低渗溶液包含0.028％曲通X-200、0.1％EDTA和0.1％SDS。
ECM可以在水合或脱水状态下储存。冻干或风干的ECM可根据本发明再水合或部分再水合并使用，而不会显著损失其生物营养和机械性能。
从本公开中可以明显看出，本文使用的术语“脱细胞化”是指从组织或器官的一部分(例如从ECM)去除细胞及其相关碎片。
从本公开中还可以理解的是，本文使用的术语“脱细胞胞外基质”(dECM)是指这样的动物或人类组织，其已脱细胞化，并提供结构完整的基质和与其他物质相互作用或携带其他物质的框架。
适于在本文方法中使用的细胞
本领域技术人员应理解的是，实际上，所有组织细胞，包括成纤维细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)、内皮细胞和干细胞(例如，间充质干细胞和祖细胞)在体内与ECM持续相互作用，例如，通过各种信号转导通路，ECM粘附分子和受体。例如，成纤维细胞合成胶原和其他ECM蛋白，然后组装成纤维。成纤维细胞在一个连续的反馈回路中密切参与控制纤维收缩和基质刚性。其他细胞也参与基质的降解和重新组装。例如，炎性细胞如巨噬细胞和肥大细胞在损伤后释放蛋白酶以分解基质。类似地，浸润性内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞释放蛋白酶以促进组织重塑，而许多细胞因子和生长因子参与重要的伤口愈合过程，包括血管生成、趋化性、增殖、胶原合成和炎症。
在一个实施方式中，体外与aECM接触的一个或多个细胞是或包含任何动物细胞。例如，细胞是哺乳动物细胞。在另一个示例中，细胞是任何组织细胞。
在一个实施方式中，一个或多个细胞是任何真核或原核细胞，例如，植物细胞，细菌细胞，包括酵母细胞的真菌细胞。
在一个实施方式中，一个或多个细胞是或包含来自永生化(immortalized)细胞系或来自原代细胞系的细胞。
在一个实施方式中，一个或多个细胞是或包含来自单一组织的细胞混合物，例如外周血单核细胞(PMNC)。
在一个实施方式中，一个或多个细胞是或包含不同细胞的混合物，无论是来自单个组织，例如来自皮肤的表皮细胞和角质形成细胞，还是来自多个组织，例如来自骨髓的干细胞和来自血液的巨噬细胞。
在各种实施方式中，一个或多个细胞受到或已经受到压力或一种或多种特定培养条件的影响，例如低氧分压、营养耗竭、改变的pH、特定培养基、升高的CO
在各种实施方式中，一个或多个细胞被诱导或已经被诱导以呈现特定表型，例如M1-或M2-巨噬细胞表型，例如通过添加细胞因子或LPS诱导的表型。
在各种实施方式中，一个或多个细胞经或已经被基因修饰，例如经基因修饰或诱导以表达一种或多种特定蛋白质，或包含一种或多种基因突变。
在各种实施方式中，细胞与ECM表面积的比率可以在1000个细胞/cm
在一个具体设想的实施方式中，巨噬细胞在OFM上培养，例如，如本文实施例中所示。
生物活性物质的鉴定
在某些实施方式中，如本文所设想的一种或多种生物活性剂的检测和/或鉴定将利用现代色谱分离技术(例如尺寸排阻色谱、凝胶电泳或快速蛋白质高压液相色谱)来将起始物质(例如在一个或多个细胞与aECM相互作用后回收的样品)分离成不同部分。
在某些实施方式中，使用适当的感兴趣的生物学模型对这些部分进行分析。通过连续几轮的分离和纯化，可以根据该部分的生物活性来鉴定治疗剂。
在某些实施方式中，一种或多种生物活性剂(例如本文所述的一种或多种生物活性多肽)的检测和/或鉴定涉及直接检测生物活性剂本身。在某些实施方式中，此类检测是通过本领域众所周知的检测方法进行，例如质谱、HPLC、2D SDS-PAGE或抗体结合。本文示出了用于此类检测的示范性方法，并且易于对样品进行快速筛选。
在某些实施方式中，检测和/或鉴定利用一种或多种抗体，该抗体能够选择性和特异性结合一种或多种生物活性剂，例如本文所述的一种或多种生物活性蛋白质。在本文所述检测或诊断方法的某些实施方式中，使用免疫分析法检测抗原-抗体结合。免疫分析法的设计可能会有所不同。例如，免疫分析法可基于竞争或直接反应。此外，方案可使用固相载体或可使用细胞或胞外物质。抗体-抗原复合物的检测可能涉及使用标记的抗体，包括标记的二抗。在各种实施方式中，标记物可以是例如酶、荧光-、化学发光-、放射性-或染料分子标记物。
免疫分析法可包括各种形式，例如基于芯片的免疫分析、酶联免疫吸附分析(ELISA)、流穿(垂直流动)检验或侧向流动分析、免疫荧光检验(IFT)或蛋白质印迹分析。
在某些实施方式中，检测一种或多种生物活性剂，例如本文所述的一种或多种生物活性多肽，涉及检测由生物活性剂介导的一种或多种生物效应。本文举例说明的代表性示例包括在细胞趋化性的体外分析中募集一个或多个细胞。本领域技术人员已知各种生物效应和/或反应的许多分析。示例包括细胞增殖分析，包括成纤维细胞增殖或角质形成细胞增殖的分析；细胞迁移分析，包括内皮细胞迁移、间充质干细胞迁移、成纤维细胞迁移、角质形成细胞迁移的分析；细胞分化分析，包括来自神经组织、骨髓细胞、软骨细胞(包括成骨、软骨形成等)的祖细胞的分析；细胞极化分析，如巨噬细胞极化分析；免疫细胞活化分析，包括中性粒细胞活化分析、肥大细胞活化分析、T细胞活化分析、B细胞活化分析，包括抗体产生分析；吞噬作用分析，包括中性粒细胞吞噬分析、巨噬细胞吞噬分析和肥大细胞吞噬分析；细胞凋亡分析，例如肿瘤细胞凋亡分析和内皮细胞凋亡分析；抗菌、抗真菌和抗病毒分析；和血管生成的分析，包括内皮细胞迁移分析和内皮细胞萌生分析。
生物活性剂
存在于ECM中或源自ECM的蛋白质，包括经改变或片段化的蛋白质和肽，例如通过一个或多个细胞产生的蛋白水解活性产生的蛋白质和肽，是根据本发明易于鉴定、分离和使用的生物活性剂的示例。
在一个示例中，该蛋白质是选自下组的蛋白质：
a)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188的氨基酸序列组成；
b)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188的氨基酸序列组成；
c)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
d)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至188内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
e)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177的氨基酸序列组成；
f)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177的氨基酸序列组成；
g)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
h)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至177内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
i)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170的氨基酸序列组成；
j)多肽，其包含、基本上包含或由对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170的氨基酸序列组成；
k)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基1至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
l)哺乳动物核心蛋白聚糖的N-端片段，其包含、基本上由或由至少10个对应于哺乳动物核心蛋白聚糖残基31至170内的任何氨基酸序列的连续氨基酸组成；
m)多肽，其包含、基本上由或由SEQ ID NO:1-4中任一所述的氨基酸序列组成；
n)多肽，其包含、基本上由或由上述a)到m)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成；
o)多肽，其包含或由上述a)到n)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个细胞(包括一个或多个干细胞)的基序或区域；和
p)多肽，其包含或由上述a)到o)中任一所述的至少约10个连续氨基酸组成，其中所述多肽包含能够相互作用于或招募一个或多个间充质干细胞的基序或区域；
q)上述a)至p)中任一的功能片段、功能变体、肽类似物或模拟肽或衍生物；和
r)与上述a)至q)中任一具有至少约70％氨基酸相同性的多肽。
在其它示例中，生物活性剂是基质因子(matrikine)、基质密码素(matricryptins)、ECM蛋白质的亚结构域或存在于或源自ECM蛋白质的配体。
据报道，存在于或源自ECM的蛋白质，包括改变或片段化的蛋白质和肽，例如通过蛋白水解活性产生的蛋白质和肽，参与许多过程，包括组织重塑、血管生成和细胞增殖。此类蛋白质的示例包括所谓的基质因子和基质密码素，它们是源自或包含ECM蛋白质的亚结构域的多肽，并且能够调节细胞信号转导。
基质因子是ECM蛋白质的特定区域，在配体-受体结合后起配体作用并改变细胞行为。例如，胶原的盘状结构域受体(DDR)结合序列是一种已经明确表征的基质因子(Bellon，Martiny等，2004年，Maquart，Pasco等，2004年，Tran，Lamb等，2005年)。据报道，在上皮细胞中，这种配体与受体DDR-1的结合导致平滑肌细胞迁移。据报道，在间充质干细胞(MSC)中，以相同共识与受体DDR-2的结合诱导MMP-1的产生，导致附近的纤维胶原降解。
相反，基质密码素是必须从其母体蛋白质释放的配体，例如通过蛋白水解切割、细胞加工或在母体蛋白质构象改变后释放，以激发其生物活性和/或结合其靶受体。
据报道，与通常在nM范围内起作用的细胞因子相比，在mM范围内，基质因子和基质密码素配体的结合亲和力通常较低。有人认为，这种较低的结合亲和力可以通过以下事实得到补偿：配体可以作为串联重复序列出现在母体蛋白质中，并且因为这些配体通常不会被靶细胞内化或耗竭。此外，由于这些配体来源于ECM，因此ECM内的细胞非常接近其产生位置，并且这些配体在ECM中存在的细胞处的局部浓度可能相对较高，这与从远处形成梯度的分泌性生长因子不同。
基质密码素或隐蔽肽片段在某些情况下与衍生它们的母体蛋白质具有不同或改变的生物活性功能。例如据报道，胶原和弹性蛋白的片段可促进愈伤细胞的迁移、分化和增殖。据报道，基底膜的破坏也破坏了角质形成细胞与蛋白质(如纤连蛋白、IV型胶原和层粘连蛋白)之间的粘附分子，从而活化角质形成细胞。据报道，临时性基质蛋白，特别是GAG和蛋白多糖的分解，会释放信号转导分子，从而改变纤维素增生、血管生成以及炎症反应。硫酸肝素被肝素酶分解，以产生促进FGF2活性的低分子量片段，，并且据报道，透明质酸的降解产物在鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型中诱导血管生成。层粘连蛋白5上存在基质密码素-EGF样重复序列，但这种配体必须通过MT1-MMP和MMP-2的作用才能发挥其生物学功能。基质密码素的其他示例包括内皮抑素，通过弹性蛋白酶、组织蛋白酶和MMP从XVIII型胶原中释放；肿瘤抑制素，通过MMP-9从IV型胶原释放；以及弹性蛋白的XGXXPG共有序列，通过MMP-2、MMP-9、MMP-7和MMP-12释放。
本领域技术人员在阅读本说明书时将认识到，这些蛋白质可被视为能够通过本文所设想的方法鉴定的生物活性剂的代表性示例。因此，提供了这些蛋白质的各种用途，尤其是在涉及细胞趋化性和募集的研究和治疗方法中，例如，组织重塑、组织修复和伤口愈合的调节、免疫应答的调节、血管生成的调节和组织微环境的调节。
适于在本文中使用的蛋白质包括天然存在的蛋白质和肽及其衍生物，包括与天然存在的蛋白质或肽相比具有一个或多个氨基酸改变的蛋白质和肽。
术语“氨基酸”指天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。除非另有说明，否则术语“氨基酸”包括D和L立体异构体，前提是各自的结构允许这种立体异构体形式。
天然氨基酸包括丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gin或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(He或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)，脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Tip或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。
非天然氨基酸包括但不限于氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、萘丙氨酸(“naph”)、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸(“tBuG”)、2,4-二氨基异丁酸、锁链素(desmosine)、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸(homoproline)(“hPro”或“homoP”)、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸(“3Hyp”)、4-羟基脯氨酸(“4Hyp”)、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸(“MeAla”或“Nime”)，N-烷基甘氨酸(“NAG”)，包括N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-烷基戊基甘氨酸(“NAPG”)，包括N-甲基戊基甘氨酸。N-甲基缬氨酸、萘基丙氨酸、正缬氨酸(norvaline)(“Norval”)、正亮氨酸(“Norleu”)、辛基甘氨酸(“OctG”)、鸟氨酸(“Orn”)、戊基甘氨酸(“pG”或“PGly”)、哌啶酸、硫代脯氨酸(“ThioP”或“tPro”)、高赖氨酸(homoLysine)(“hLys”)和高精氨酸(homoArginine)(“hArg”)。
术语“氨基酸类似物”是指一种天然或非天然氨基酸，其中一个或多个C端羧基、N端氨基和侧链官能团已经可逆或不可逆地化学封闭或以其他方式修饰成另一官能团。例如，天冬氨酸-(β-甲酯)是天冬氨酸的氨基酸类似物；N-乙基甘氨酸是甘氨酸的氨基酸类似物；或者丙氨酸甲酰胺是丙氨酸的氨基酸类似物。其他氨基酸类似物包括甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)半胱氨酸亚砜和S-(羧甲基)-半胱氨酸砜。
术语“表达构建体”是指遗传构建体，其包括允许转录感兴趣的多核苷酸分子并任选地将转录物翻译成多肽的元件。表达构建体从5'到3'方向通常包含：
(1)启动子，在将要引入该构建体的宿主细胞中起作用，
(2)待表达的多核苷酸，以及
(3)终止子，在将要引入该构建体的宿主细胞中起作用，
将本发明的表达构建体插入可复制载体中用于克隆或表达，或将其纳入宿主基因组。
本文所用术语“载体”指多核苷酸分子，通常是但不限于双链DNA，其适于在分子生物学技术中使用，例如修饰、操纵、复制、扩增或运输多核苷酸分子。在某些实施方式中，载体用于将多核苷酸分子(例如但不限于遗传构建体，例如表达构建体)运输到宿主细胞或生物体中。在某些示例中，载体能够在多个宿主系统中复制和/或维持。
多肽的“片段”是多肽的子序列，通常其执行活性所需的功能，例如酶活性或结合活性，和/或提供多肽或其部分的三维结构，例如表位。应理解的是，多肽的片段可具有或引发不同于其衍生的全长多肽所具有或展示的一种或多种功能。
本文所用的术语“肽”指通过肽键连接在一起的氨基酸的短聚合物。将认识到的是，虽然与各类氨基酸聚合物(例如肽、蛋白质、多肽等)相关的名称具有一定的任意性，但肽的长度通常约为50个氨基酸或更少。肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物和/或经修饰的氨基酸。肽可以是天然蛋白质或非天然(包括合成)序列的子序列。
如本文所用，术语“合成肽”包含具有与天然肽和/或蛋白质中发现的氨基酸序列不同的氨基酸序列的肽。如本文所使用的“合成肽”可通过任何合适的方法(例如，重组表达、化学合成、酶合成等)产生或合成，并且可包括对母体肽的任何化学修饰，并且可包括但不限于诸如截短、缺失、环化或非肽合成或半合成衍生物，其保留与起始肽相同的生物功能。蛋白质合成的方法，例如固态合成在本领域是众所周知的。
术语“肽拟物”或“模拟肽”指的是模拟源自蛋白质或肽的序列的类肽分子。肽拟物或模拟肽可包含氨基酸和/或非氨基酸组分。肽拟物的示例包括化学修饰的肽、类肽(侧基附加到肽主链的氮原子上，而不是附加到α-碳上)、β-肽(氨基结合到β-碳而不是α-碳上)等。化学修饰包括氨基酸侧基、α-碳原子、末端胺基或末端羧基上的一种或多种修饰。化学修饰可以是添加化学基团、创建新的键或移除化学基团。氨基酸侧基的修饰包括但不限于赖氨酸ε-氨基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化、谷氨酸或天冬氨酸羧基的烷基化、通过赖氨酸ε-氨基与谷氨酸或天冬氨酸侧基羧基的环化形成内酰胺，烃“装订(stapling)”(例如，以稳定α-螺旋构象)和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺作用。末端胺基的修饰包括但不限于脱氨基(desamino)、N-低级烷基、N-二-低级烷基、受限的烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)和N-酰基修饰。末端胺基的修饰包括但不限于酰胺、低级酰胺、受限的酰胺(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)烷基、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基为C1-C4烷基。此外，一个或多个侧基或端基可由一般熟练的肽化学家已知的保护基团保护。氨基酸的a-碳可以是单或二甲基化的。
应理解的是，在某些实施方式中本文所述的蛋白质或肽中的任何一种包含一种或多种非天然存在的氨基酸、一种或多种氨基酸类似物，或是或包含合成肽或多肽或肽拟物。类似地，应理解的是，本文所述的任何一种蛋白质或肽在某些实施方式中将是一种或多种修饰、合成方法或蛋白质工程方法的起点，以开发具有所需生物活性的肽类似物——例如，与母体蛋白质或肽在质量上相似，但在量上程度不同的效果的生物活性，或实际上与母体蛋白质或肽所引发的生物活性不同的生物活性。
如本文所使用的术语“融合多肽”是指包含两个或多个氨基酸序列的多肽，例如两个或多个多肽结构域，以肽键通过各自的氨基和羧基残基融合形成一条连续多肽。应当理解的是，两个或多个氨基酸序列可以直接融合，也可以通过其各自的氨基和羧基末端通过接头或间隔子或其他多肽间接融合。
如本文所使用的术语“多肽”包含任意长度但优选至少10个氨基酸的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本文所述的多肽是纯化的天然产物，或使用重组或合成技术部分或全部生产。该术语可指多肽、诸如二聚体或其它多聚体的多肽的聚集物、融合多肽、多肽变体或其衍生物。
应当理解的是，对于本文所设想的特定多肽和蛋白质，在各细菌菌株之间可以存在天然变化。这些变化可通过整个序列中的氨基酸差异或所述序列中的氨基酸缺失、取代、插入、反转或添加来证明。基本上不会改变生物和免疫活性的氨基酸取代是众所周知的。相关氨基酸之间的氨基酸替换或进化中频繁发生的替换包括Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val两两之间的替换。其他氨基添加取代包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。基于这一信息，开发了快速灵敏的蛋白质比较和确定同源蛋白质之间功能相似性的方法。只要所得蛋白质保持其免疫反应性，本文所述示范性实施方式的此类氨基酸取代以及具有缺失和/或插入的变化都在本发明的范围内。这解释了为什么本文所述的一种或多种蛋白质，当从不同的现场分离物分离时，可能具有低于100％的相同性水平，但是仍然代表具有相同免疫学特性的相同蛋白质。本文所述特定蛋白质氨基酸序列中这样的变化被认为是本文所鉴定蛋白质的免疫功能等效物，并因此基本上不会影响蛋白质的免疫原性，所述变化仍然提供能够与对本文特别鉴定的蛋白质具有特异性的抗体反应的蛋白质。
当蛋白质用于例如诊断或治疗目的，例如用于与抗体反应，或用于介导生物效应，例如与体内天然蛋白质相关的一种或多种生物功能时，尽管这样做是有利的，但不必使用整个蛋白质。也可以使用该蛋白质的多肽片段(例如，其本身或偶联到运载体或作为融合多肽中的组分)或衍生自该蛋白质的多肽片段或能够引发所需生物效应的相关氨基酸序列，例如针对该蛋白质的免疫应答或被该蛋白质特异性抗体识别的免疫应答，介导细胞信号转导效应的免疫应答等。这种多肽片段可参考其所具有的功能，例如与衍生出它的全长蛋白质共有的功能。例如，具有免疫效应的多肽片段可称为免疫原性片段，其中“免疫原性片段”被理解为全长蛋白质的片段，其保持其在脊椎动物宿主中诱导免疫应答或被对母体蛋白质特异性的抗体识别的能力。类似地，保留或具有衍生其的全长蛋白质引发的一种或多种生物效应的多肽片段，或具有相关或不同的生物效应的多肽片段在本文中称为“生物活性片段”或“生物活性多肽片段”。同样，具有生物效应的多肽，例如能够刺激细胞中的生物反应或引发治疗效应的多肽，在此可称为“生物活性片段”或“生物活性多肽片段”，或其语法上的等同物。
有多种技术可用于鉴定这种多肽片段以及编码这种片段的DNA片段。例如，在免疫原性片段的情况下，此类片段可包含一个或多个决定簇或表位。存在用于检测表位的成熟经验和计算机方法，并且本领域技术人员熟知这些方法。例如，计算机算法能够根据特定蛋白质片段与已知表位的顺序和/或结构一致性，将其指定为免疫学上重要的表位。这些区域的确定通常基于亲水性标准和二级结构特征的组合。免疫原性片段(或表位)的最小长度通常为6个，更通常为8个氨基酸，最好大于8个，例如9、10、12、15或甚至20个或更多个氨基酸。因此，编码这种片段的核酸序列的长度为至少18，更常见的为24，优选为27、30、36、45或甚至60个核酸。
类似地，本领域技术人员将了解使用旨在鉴定或检测特定生物反应的各种分析法来鉴定生物活性片段的方法。下文给出了适用于鉴定或检测本文所设想的生物活性片段的代表性方法，包括在实施例中。
关于多肽的术语“变体”包括天然产生、重组和合成产生的多肽，包括含一个或多个非天然氨基酸、一个或多个氨基酸类似物的多肽和肽拟物。变体多肽序列优选地显示与本发明序列至少50％、更优选至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性。在至少20个氨基酸位置，优选至少50个氨基酸位置、至少100个氨基酸位置或本发明多肽全长的比较窗口上发现相同性。
多肽序列相同性可通过以下方式确定。使用可从NCBI公开获得(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的bl2seq中的BLASTP(来自BLAST程序套件，版本2.2.10[2004年10月])将对象多肽序列与候选多肽序列进行比较.除应关闭低复杂度区域的过滤外，使用bl2seq的默认参数。
还可以使用全局序列比对程序在候选多核苷酸序列和对象多核苷酸序列之间的重叠的全长上计算多肽序列相同性。如上所讨论的EMBOSS-needle(可在http://www.ebi.ac.uk/EMBOSS/align/上获得)和GAP(Huang，X.(1994)关于全局序列比对(OnGlobal Sequence Alignment).计算机在生物科学中的应用(Computer Applications inthe Biosciences)10，227-235)也是计算多肽序列相同性的合适的全局序列比对程序。
本文所设想的多肽变体还包括那些与一个或多个特别鉴定的序列表现出相似性的变体，这些序列可能保持这些序列的功能等效性，并且不能合理地预期是随机发生的。可以使用NCBI的BLAST程序套件(版本2.2.10[2004年10月])中公开提供的bl2seq程序(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)来确定多肽的这种序列相似性.可使用以下unix命令行参数来检查多肽序列的相似性：
bl2seq–i peptideseq1–j peptideseq2-F F–p blastp
当与任何一个特别鉴定的序列相比时，变体多肽序列优选显示小于1×10
参数–F F关闭对低复杂度部分的过滤。参数–p为序列对选择适当的算法。该程序查找序列之间的相似区域，并为每个此类区域报告一个“E值”，该值是在包含随机序列的固定参比大小的数据库中偶然见到此类匹配的预期次数。对于比1小得多的小E值，这近似于这种随机匹配的概率。
本发明还包括在不显著改变其生物活性的情况下对所述多肽序列的一个或多个氨基酸进行保守取代。本领域技术人员将了解进行表型沉默氨基酸取代的方法(参见，例如，Bowie等，1990，Science 247，1306)。
本文所设想的多肽变体还包括这样的变体多肽序列，其由编码多肽的核酸产生，但与野生型多肽的不同之处在于其加工方式不同，从而具有改变的氨基酸序列。例如，在一个实施方式中，通过对产生野生型多肽的一级RNA转录本进行选择性剪接模式来产生变体。
在其他实施方式中，生物活性剂为脂质、多糖、核酸、趋化因子、维生素、激素等。
治疗方法和组合物
本文所述的方法和生物活性剂在某些实施方式中用于治疗方法，例如用于治疗有此需要的对象中的一种或多种疾病、紊乱、病状或症状。
本文使用的“对象”是动物，通常是哺乳动物，包括哺乳动物伴侣动物或人类。典型的伴侣动物包括猫、马和犬。代表性的农业动物包括牛、绵羊、山羊、鹿和猪。
应理解的是，本文所设想的各种治疗方法通常体现为给予有效量的生物活性剂。
“有效量”是指足以产生有益或预期结果(包括临床结果)的量。有效剂量可以通过不同的给药途径一次或多次给药。除其他因素外，有效量取决于所指疾病或症状、疾病或症状的严重程度、对象的年龄和相对健康状况、所给予的药剂的效力、给药方式和所需的治疗。本领域技术人员将能够在考虑到这些或任何其他相关因素的情况下确定适当的剂量。
具体设想的待治疗的疾病、紊乱、病状或症状包括那些将受益于调节对象中干细胞反应的疾病、紊乱、病状或症状。
本文中使用的术语“治疗”以及诸如“处理”和“进行治疗”等相关术语通常涉及人或非人对象的治疗，其中实现了一些所需治疗效果。例如，治疗效果可以是抑制、减少、改善、停止或预防疾病或症状。
本文使用的术语“干细胞”是指在没有分化的情况下能够自我更新并能够分化为其他细胞类型的细胞。根据上下文，术语“干细胞”将包括全能、多潜能和多能干细胞。
本文特别设想使用的代表性干细胞包括在从含有干细胞的组织源分离后在体外培养的干细胞。在一个实施方式中，所述干是间充质干细胞。
干细胞能够分化成其他类型的细胞，并且在没有分化的情况下具有自我更新的能力。通过提供所需的各种分化的功能细胞，干细胞对于新组织的形成以及受损或病变组织的修复至关重要[Li，L.和Xie，T.(2005).干细胞生态位：结构和功能(Stem cell niche:structure and function).Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,21,605-631]。除了这种祖细胞功能外，干细胞还表现出自身促进组织再生和修复的功能，例如，通过分泌生物活性因子和调节其他细胞类型的行为[Duscher，D.，Barrera，J.，Wong，V.W.，Maan，Z.N.，Whittam，A.J.，Januszyk，M.，和Gurtner，G.C.(2016)，干细胞在伤口愈合中的作用：再生医学的未来？简述(Stem cells in wound healing:the future of regenerative medicine？A mini-review).Gerontology,62(2),216-225.]。作为正常组织生长和修复的部分，局部内源性干细胞发挥这些功能，但在广泛组织损伤的情况下，或同时存在疾病因素时，正常的内源性干细胞数量可能不够[Kanji，S.，和Das，H.(2017年)干细胞疗法在皮肤创伤愈合和再生中的研究进展(Advances of stem cell therapeutics in cutaneous wound healing andregeneration).Mediators of inflammation,2017]。
干细胞疗法被认为在再生医学中具有巨大潜力，通过给予其他干细胞，可以改善一系列疾病和损伤的结果，包括皮肤创伤[Falanga，V.，Iwamoto，S.，Chartier，M.，Yufit，T.，Butmarc，J.，Kouttab，N.，和Carson，P.(2007年)在纤维蛋白喷雾中递送的自体同源骨髓来源的培养的间充质干细胞加速小鼠和人类皮肤伤口愈合(Autologous bone marrow–derived cultured mesenchymal stem cells delivered in a fibrin sprayaccelerate healing in murine and human cutaneous wounds).Tissue engineering,13(6),1299-1312.]，神经系统损伤[di Summa,P.G.,Kingham,P.J.,Raffoul,W.,Wiberg,M.,Terenghi,G.,和Kalbermatten,D.F.(2010).脂肪来源的干细胞促进外周神经再生(Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration).Journal ofPlastic,Reconstructive&Aesthetic Surgery,63(9),1544-1552.]和心肌梗塞[Berry,M.F.,Engler,A.J.,Woo,Y.J.,Pirolli,T.J.,Bish,L.T.,Jayasankar,V.,&和Sweeney,H.L.(2006).心肌梗死后间充质干细胞注射改善心肌顺应性(Mesenchymal stem cellinjection after myocardial infarction improves myocardial compliance).American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,290(6),H2196-H2203]。
然而，目前的干细胞给药技术效率低下且具有侵入性，需要采集供体组织、提取、富集和重新给予分离的干细胞群体。因此，能够诱导内源性干细胞局部募集的治疗剂在治疗受益于干细胞活性的病症方面具有相当大的效用。
例如，在成人骨髓中，间充质干细胞(MSC)是一个再生细胞库，能够自我更新，并在组织修复中发挥重要作用。首先，它们能够分化为损伤部位所需的细胞。它们通过维持造血干细胞生态位来支持造血。它们释放调节炎症反应的细胞因子和促进愈合过程(如细胞募集、血管生成和胶原合成)的营养因子。MSC与成纤维细胞、纤维细胞和周细胞一起可以分化为肌成纤维祖细胞，这些祖细胞受到细胞-基质相互作用、基质刚性和机械应力的刺激，成为肌成纤维细胞——创伤愈合中主要的基质生成细胞。
据报道，骨髓来源的干细胞也可形成周细胞、内皮细胞和角质形成细胞。除了能够分化为损伤部位所需的细胞类型外，MSC在调节其他愈伤细胞方面也具有重要作用。MSC增加成纤维细胞的迁移、增殖、胶原合成以及内皮细胞管的形成。在伤口愈合的炎症阶段，MSC调节免疫应答，通过阻断T细胞增殖，产生IL-10和IL-4。在增殖阶段，它们释放旁分泌信号以募集角质形成细胞、真皮成纤维细胞和其他附近的干细胞。它们分泌重要的愈伤生长因子，如角质形成细胞生长因子(KGF)、VEGF和PDGF。最后，在重塑过程中，MSC调节MMP的表达和胶原沉积。
因此，能够引发MSC募集到特定部位的生物活性剂的给药在治疗疾病、紊乱、病状或症状方面是有用的，这些疾病、紊乱、病状或症状将受益于MSC能够引发的大量生物反应。将其他类型的干细胞募集到感兴趣的部位同样具有治疗效用。
一种此类生物活性剂是本文所述的MayDay肽。因此，本文特别设想使用本文所述一种或多种蛋白质的检测、诊断、研究和治疗方法、组合物、试剂和试剂盒。
因此，本发明涉及一种用于检测和/或鉴定一种或多种生物活性剂的试剂盒，例如，通过本文所述的方法，其中该试剂盒包括无细胞ECM和任选的一种或多种外源细胞，任选地与本文所述的一种或多种组合物组合。
虽然在本发明中，MayDay或片段、变体、肽类似物或其衍生物的生理效应是募集干细胞，但在软组织再生的更广泛背景下，这也可能引发下游生物过程，包括但不限于以下过程：血管生成、脉管生成、组织重塑、循环干细胞浓缩和肌肉组织再生。
干细胞的募集广泛有利于软组织修复，以及与软组织(包括肌肉)相关的疾病、紊乱或病状的管理或干预。此类损伤、疾病或病状可能包括但不限于心肌梗塞、因外科手术或创伤导致的组织损失、干细胞(包括外周血系统中的祖细胞)的浓缩。
在一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含有效量的通过本文所述方法鉴定的生物活性剂，例如有效量的本文所述多肽或其药学上可接受的盐或溶剂，以及药学可接受的运载体。
药物组合物可包含有效量的两种或多种物质的组合，例如本文所述的两种或多种肽。
本领域已知适于生物活性剂(例如生物活性蛋白)给药的组合物，包括向有此需要的对象治疗性给予包括蛋白质或肽的生物活性剂。
例如，在某些实施方式中，配制生物活性剂，诸如本文所述的多肽，例如所谓的MayDay肽，或其片段、变体、肽类似物或衍生物和药学上可接受的运载体、赋形剂或与其他物质组合以提高生物活性物质的生物利用度，或半衰期或效力，并且向对象给予该组合物。
术语“药学上可接受的运载体”指可与生物活性剂(例如本文所述的MayDay肽)或其药学上可接受的盐或溶剂化物一起给予对象的运载体(佐剂或载剂)。
此类运载体是盐溶液(0.9％氯化钠)，尽管其他运载体也适用。
可用于组合物中的药学上可接受的运载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化药物递送系统(SEDDS)，例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、药物剂型中使用的表面活性剂，例如吐温或其它类似的聚合物递送基质，血清蛋白，例如人血清白蛋白，缓冲物质，例如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电介质，例如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯基吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇以及羊毛脂。
环糊精如α-、β-和γ-环糊精，或化学改性的衍生物如羟烷基环糊精，包括2-和3-羟丙基-3-环糊精，或其它溶液化的衍生物也可有利用于增强递送。油溶液或悬液还可包含长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或类似分散剂，其通常用于配制药学上可接受的剂型，例如乳液和/或悬液。
所述组合物配制成允许通过任何选择的途径给予对象，包括但不限于口服或胃肠外(包括局部、皮下、肌肉内和静脉内)给予。
例如，可使用根据预期给药途径和标准药学实践选择的合适的药学上可接受的运载体(包括赋形剂、稀释剂、助剂及其组合)配制组合物。例如，所述组合物可作为粉末、液体、片剂或胶囊经口给予，或作为软膏、乳膏或乳液局部给予。合适的配方可包含所需的其他试剂，包括乳化剂、抗氧化剂、调味剂或着色剂，并可适用于立即释放、延迟释放、调节释放、持续释放、脉冲释放或受控释放。
在涉及给予如本文所述的多肽的某些实施方式中，给药通常涉及直接注射或沉积到感兴趣部位，例如，注射或沉积到损伤部位的软组织中。
所述组合物可配制成优化生物利用度或活性，或将血浆、血液或组织浓度维持在治疗范围内，包括对于延长期。例如，受控递送制备物也可用于优化作用部位的生物活性剂浓度。
组合物可配制成用于周期性给药，例如提供持续接触。
所述组合物可经由胃肠外途径给药。胃肠外剂型的例子包括水溶液、等渗盐溶液或活性剂的5％葡萄糖或其它已知的药学上可接受的赋形剂。例如，环糊精或本领域技术人员熟知的其他增溶剂可被用作药物赋形剂，用于递送治疗剂。
适于口服给药的剂型的示例包括但不限于片剂、胶囊、锭剂或类似形式，或能够提供治疗有效量的组合物的任何液体形式，例如糖浆、水溶液、乳液等。胶囊可以包含任何标准的药学上可接受的材料，如明胶或纤维素。片剂可以按照常规方法通过压缩固相运载体和润滑剂与活性成分的混合物来配制。固体运载体的示例包括淀粉和糖膨润土。
活性成分也可以硬壳片剂或胶囊的形式给予，其中含有粘合剂，例如乳糖或甘露醇、传统填料和压片剂。口服给药的剂型可配制成具有肠溶包衣的剂型，以防止剂型在胃中溶解或崩解，从而提供药剂的延迟释放和/或允许药剂在胃后(例如在肠的上消化道)释放。
适用于透皮给药的剂型的示例包括但不限于：透皮贴剂，透皮绷带等。
适用于局部给药的组合物剂型的示例是任何洗剂，棒剂，喷雾剂，软膏剂，糊剂，霜剂，凝胶剂等，无论是直接施用于皮肤还是通过中间体例如垫、贴片等施用。
适于栓剂施用组合物的剂型的示例包括插入身体开孔的任何固体剂型，尤其是插入直肠、阴道和尿道的固体剂型。
适用于注射组合物的剂型的示例包括通过推注递送，例如通过静脉内注射，皮下，真皮下和肌内给药或口服给药的单次或多次给药。
适用于组合物贮存给药的剂型的示例，包括肽的团块或固体形式，其中所述肽被包埋在可生物降解聚合物、微乳液、脂质体的基质中或被微胶囊化。
用于组合物输注装置的示例包括用于提供所需剂量数或稳态给药的输注泵，并且包括植入式药泵。
组合物的可植入输注装置的示例包括任何固体形式，其中生物活性剂包封在或分散在整个生物可降解聚合物或合成聚合物如硅氧烷，硅氧烷橡胶，硅橡胶或类似聚合物中。
适用于透粘膜递送组合物的剂型的示例包括用于灌肠剂的储存溶液，阴道栓剂，卫生棉条，乳膏，凝胶，糊剂，泡沫，雾化溶液，粉末和除活性成分之外还含有合适的本领域已知的运载体的类似制剂。此类剂型包括适用于吸入或吹入组合物的剂型，包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物和/或粉末中包含溶液和/或悬液的组合物。组合物的透粘膜给药可利用任何粘膜，但通常利用鼻、颊、阴道和直肠组织。适于经鼻给予组合物的制剂可以液体形式给予，例如，经鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器以气溶胶给予，包括聚合物颗粒的水溶液或油溶液。制剂可制备为水溶液，例如盐溶液，使用苯甲醇或其他合适防腐剂的溶液，用于提高生物利用率的吸收促进剂、氟碳化合物和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂。
适于经颊或舌下给予的剂型的示例包括锭剂、片剂等。适于对组合物进行眼科给药的剂型的示例包括插入物或组合物，其包含在药学上可接受的水性或有机溶剂中的溶液和/或悬液。
组合物的制剂的示例可见例如：Sweetman,S.C.(编).Martindale.《药物参考大全》(The Complete Drug Reference),第33版,医药出版社(Pharmaceutical Press),芝加哥,2002,第2483页；Aulton,M.E.(编)《药剂学——剂型设计科学》(Pharmaceutics.TheScience of Dosage Form Design).丘吉尔利文斯通(Churchill Livingstone),爱丁堡,2000,第734页；和Ansel,H.C,Allen,L.V.和Popovich,N.G.《药物剂型和药物递送系统》(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems),第7版,利平科特(Lippincott)1999,第676页。用于制造药物递送系统的赋形剂在本领域技术人员已知的各种出版物中进行了描述，包括例如，Kibbe，E.H.H.《药物赋形剂手册》(Handbook ofPharmaceutical Excipients),第3版,美国药学协会(American PharmaceuticalAssociation),华盛顿,2000,第665页。USP还提供了改性释放口服剂型的示例，包括配制成片剂或胶囊剂型。参见，例如《美国药典》(The United States Pharmacopeia)23/国家处方集(National Formulary)18,美国药典公约有限公司(The United States PharmacopeialConvention,Inc.),马里兰州罗克韦尔,1995(下文中称为“USP”)，其也描述了确定延长释放和延迟释放片剂和胶囊的药物释放能力的具体测试。美国药典USP对延长释放和延迟释放制品的药物释放试验是基于在经历的试验时间内药物从剂量单位的溶出。各种测试设备和方法的说明可在USP中找到。FDA(食品药品管理局)提供了关于延长缓释剂型分析的进一步指导(参见，“行业指南·延长释放口服剂型：体外/体内相关性的开发、评估和应用”(Guidance for Industry.Extended release oral dosage forms:development,evaluation,and application of in vitro/in vivo correlations).马里兰州洛克维尔:美国食品和药物管理局药物评估和研究中心,1997)。
在给予或使用两种或多种试剂的情况下，可同时、顺序或单独给予或使用两种或多种试剂。
现将参考以下实施例来进一步描述本发明。应当理解的是，如权利要求所述的发明无意以任何方式受到这些实施例的限制。
实施例
实施例1：生物活性剂的代表性分析
本实施例描述了用绵羊前胃基质(OFM)与巨噬细胞
方法
ovAD-MSC的分离
根据Li等(Li，Curley等，2018)，从供体动物的皮下脂肪组织中分离出绵羊脂肪来源的基质细胞(ovAD-MSC)。从成年雌性绵羊肩部无菌切除脂肪组织。将组织标本切成约1x1cm，然后在室温下用Dulbeccós磷酸缓冲盐(DPBS)(吉布可公司(Gibco))(3x，20mL)漂洗10分钟。将组织切碎，然后在37℃下用来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，美国密苏里州圣路易斯)的0.1％胶原酶/DPBS(10mL)消化1小时，以50rpm轻柔振荡。添加等体积的DMEM10，并在100mm细胞培养板(康宁公司(Corning),美国纽约州)上过夜孵育。漂洗贴壁细胞(DMEM2，10mL)并在DMEM2中传代3代。细胞维持在DMEM2(10mL)中，每3天更换一次培养基，并使用TrypLE
ovAD-MSC的分化
将细胞(ovAD-MSC，第3代)分裂并以100,000个细胞/mL(0.5mL)的浓度接种在DMEM2中的24孔板(康宁公司)上，直到单层80％汇合。培养基改为成骨、成软骨或成脂肪分化培养基(1mL)(StemPro
巨噬细胞OFM共培养
将OFM切成约4x4cm样品，并在37℃下在100mm培养板(康宁公司)的DMEM(2mL)中预调理16小时中。DMEM(1mL，100,000个细胞/mL)中的RAW 264.7(ATCC，TIB-71)(Raschke，Baird等，1978)巨噬细胞(Mφ)被接种到OFM(约100000个细胞)上并孵育(30分钟，37℃)使细胞粘附。添加其他DMEM，使每孔最终体积为5mL。样品在37℃下孵育24小时。作为对照，将巨噬细胞以相同浓度接种到空平板上。吸取、收集培养基并添加最终浓度为10μM的苯甲磺酰氟(PMSF)(西格玛奥德里奇公司)。来自每个样品(仅Mφ、仅OFM、Mφ+OFM)的条件培养基样品经无菌过滤(0.22μm)并储存在-20℃备用。
跨孔迁移分析
跨孔迁移分析根据Boyden等(Boyden 1962)的方法进行，使用24孔跨孔系统(6.5mm
结果
图3显示了间充质干细胞(MSC)响应仅OFM、仅巨噬细胞或OFM-巨噬细胞共培养的趋化性的定量。
可以很容易地看出，在ovAD-MSC迁移分析中，与仅培养基的对照相比，
因此，在OFM存在下培养巨噬细胞在募集MSC方面明显优于仅用OFM或仅用巨噬细胞。
发明人不希望受到任何理论的约束，认为从OFM+巨噬细胞共培养中观察到的效力增加与巨噬细胞和OFM的相互作用有关，从而产生一种或多种从dECM释放的生物活性，其中，当分离时，与两种单独组分相比，一种或多种释放的生物活性改善了MSC募集。
实施例2：生物活性多肽的分离
本实施例描述了使用如本文所述的代表性方法分离生物活性多肽。
方法
OFM用荧光标签异硫氰酸荧光素(FITC)标记，以便在纯化和分离各种组分期间追踪OFM衍生的肽。
在DMSO中以10mg/mL的浓度配制FITC储液，并在-20℃在避光容器中等分保存。在0.1M NaHCO
OFM(16mm圆盘或4x4cm正方形)通过在4℃下在轻柔振摇器上的避光盒中与10μg/mL FITC溶液在NaHCO
用凝胶过滤从滤过的培养基中分离任何释放的肽。阴离子交换缓冲液为10mMtris pH 8.4或“DEAE缓冲液”。将二乙基氨乙基(DEAE)珠在10mM tris中溶胀，并使用端部切除的移液管将1mL珠添加到15mL试管中。通过向试管中填充10mM tris，然后以200rpm的转速离心珠10分钟，每次洗涤时更换10mL tris缓冲液，对珠进行三次清洗。
向1mL DEAE珠添加0.5mL含有可能感兴趣的蛋白质的经过滤培养基溶液样品。试管涡旋2分钟，然后在室温下放置5分钟，以允许蛋白质结合。旋转试管2分钟，收集含有未结合蛋白质的上清液。向DEAE-样品混合物中添加相同体积的DEAE缓冲液(0.5mL的10mMtris，pH 8.4)，并涡旋试管1分钟。离心试管2分钟，收集含有洗涤缓冲液和未结合蛋白质的上清液。将含有150mM NaCl的10mM tris的0.4mL溶液添加到珠中，涡旋试管2分钟，然后在室温下放置5分钟以允许蛋白质洗脱。离心珠2分钟，收集含有150mM盐洗脱液的上清液。用含有400mm NaCl的10mm tris溶液重复该步骤，以收集400mM盐洗脱液。对于每个收集的部分，测量荧光，以给出与初始样品和收集部分体积相关的荧光指数。样品通过tricine SDS-PAGE作为未稀释样品分离，并使用快速真空浓缩至原始体积的十分之一。
如上文实施例1中所述，使用琼脂塞(agar-plug)趋化性分析法测定含有感兴趣的OFM衍生肽的荧光标记的组分。
结果
不同数量的部分纯化的多肽生物活性如图4所示。可以看出，与阴性对照相比，10ng部分纯化的蛋白质足以引起MSC趋化性的显著增加。更多量的部分纯化的多肽(25ng和100ng)观察到趋化性进一步增加。
因此，本实施例中所述的方法和分析可用于检测生物活性多肽，并适用于制备样品，从而能够在后续方法中鉴定生物活性多肽。
实施例3：生物活性肽的鉴定
本实施例描述了在上述实施例2中部分纯化的生物活性多肽的进一步鉴定。
方法
条件培养基样品的Tris-甘氨酸SDS-PAGE分离
用4x Laemlie缓冲液(100mM Tris，pH 6.8，8％w/v SDS，40％v/v甘油，20％w/vβ-巯基乙醇，0.2％w/v溴酚蓝)3:1稀释条件培养基(30μL)。样品在100℃水浴中沸腾10分钟。用BioRad凝胶系统制备Tris-甘氨酸凝胶(4％丙烯酰胺堆积凝胶和20％丙烯酰胺分辨凝胶)，并使用甘氨酸跑样缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％w/vSDS，pH8.3)(西格玛奥德里奇公司)跑样。每孔加入15μL总体积的每个样品和8μL的蛋白质标准梯度(PrecisionPlus Protein
结果
从OFM
实施例4：生物活性肽-‘MayDay’的鉴定
本实施例描述了通过质谱(MS)鉴定在上述实施例2和3中部分纯化的生物活性多肽(在本文中称为MayDay)。
方法
样品制备
如上所述，在0.1M碳酸氢钠中用0和10μg/mL FITC标记OFM(4x4cm)。所得的标记和未标记物质(OFM和OFM
根据厂商说明书，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(西格玛奥德里奇公司)进行蛋白质定量。
溶液内胰蛋白酶消化
尺寸排阻层析
冻干样品
Tris-Tricine SDS-PAGE和凝胶内蛋白质消化
按上述方法制备样品(Mφ+OFM、Mφ+OFM
从含有Mφ+OFM、Mφ+OFM
ESI MS/MS分析
对连接至Triple TOF 5600(AB Sciex公司，美国加利福尼亚州红木市)的Eksigent Ultra nanoLC系统(Eksigent公司，美国加利福尼亚州利弗莫尔)进行注射。将经消化的样品(10、20或40μL)注入肽阱(肽Captrap，Michrom Bioresources公司，美国加利福尼亚州奥本)，并用0.1％甲酸水溶液/2％乙腈(ACN)以10μL/分钟脱盐5分钟。然后将肽阱切换至与分析柱(Halo C18，
以信息依赖式采集(IDA)模式对洗脱液进行正离子纳米流电喷雾分析。在IDA模式下，获得TOFMS测量扫描(m/z 350-1500，0.25秒)，测量扫描中10个最强烈的多重电荷离子(计数>150)随后依次进行MS/MS分析。MS/MS谱在m/z 100–1500质量范围内聚集200毫秒，总循环时间为2.3秒。原始数据文件(.wiff)使用AB SCIEX CommandDriver软件(AB SCIEX，美国加利福尼亚州红木市)转换为Mascot通用文件(.mgf)。数据文件被提交到Mascot(MatrixScience，英国)并搜索Swissprot数据库(绵羊(Ovis aries)[sp_sheep_140625])。
结果
获得由
ECM蛋白核心蛋白聚糖(DCN)从MASCOT搜索结果中统一鉴定。数据库搜索鉴定出以下所示的几种独特肽与羊蛋白核心蛋白聚糖(Uniprot:Q9TTE2，也称为骨蛋白多糖II，PG-S2，PG40，质量为39947Da)匹配(emPAI:0.08)。
通过三种不同方法鉴定的肽如图6A所示。溶液中经胰蛋白酶消化的样品产生的蛋白质命中率最高，跨越了大部分DCN序列(“蓝色”，图6A)。这很可能是由于胰蛋白酶消化样品较不纯造成的。通过SEC制备的样品给出了一个序列，该序列与DCN的N-端序列对齐(“黄色”，图6A)，而从Tris-Tricine凝胶制备的样品给出了另一条序列，该序列也与DCN的N-端区域对齐(“绿色”，图6A)。这后两种独特肽的序列如下所示：
1.KISPGAFAPLVKL
2.RVVQCSDLGLEKV
下表1显示了全长核心蛋白聚糖蛋白质的氨基酸序列[SEQ ID No:1]，下划线表示这两条独特肽对应的氨基酸序列。图6A显示了核心蛋白聚糖N-端部分内核心蛋白聚糖序列中其他独特肽的位置，而MMP12蛋白水解切割位点的位置如图6B所示。表1中分别描述了与重组MayDay31-170多肽[SEQ ID No:2]对应的核心蛋白聚糖氨基酸序列，以及与分别终止于MMP12切割位点的MayDay31-177[[SEQ ID No:3]和MayDay31-188[[SEQ ID No:4]的核心蛋白聚糖的两个N端片段对应的核心蛋白聚糖氨基酸序列。同样，下划线表示上述两种独特肽对应的氨基酸序列的位置。
表1.核心蛋白聚糖和MayDay肽
基于与已知人DCN切割位点的序列同源性，使用MERPOS数据库进行计算机分析，以预测绵羊DCN的蛋白水解切割位点。如图6B所示，DCN包含许多预测的蛋白酶位点，包括MMP-2、-3、-7、-12和-13，以及ADAMTs5。值得注意的是，两个MMP-12位点预计出现在残基177-178和188-189之间。
实施例5：通过MMP12消化核心蛋白聚糖来产生和评估生物活性MayDay肽
本实施例描述了实施例4中鉴定的MayDay多肽的产生，以及使用MMP12切割母体蛋白质对其生物活性的评估。
方法
在ROH
经消化的样品(30μL)用4x Laemlie缓冲液3:1稀释，并如上所述变性。将30μL总体积加载到预制的Bis-Tris凝胶上(4-12％Bolt NuPAGE，英杰公司(Invitrogen)，,美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。使用蛋白质标准溶液(5μL)运行Bis-Tris凝胶(SeeBlue蛋白标准品，英杰公司)。100V下，使用Invitrogen Mini Gel系统(Invitrogen
在SDS-page凝胶上对核心蛋白聚糖和MMP12消化的核心蛋白聚糖进行分析，以证明蛋白质的片段化，如图7A所示。
随后，使用核心蛋白聚糖+MMP12将样品添加到跨孔分析中，以确定这些样品的生物活性，使用仅DCN(250ng)和仅MMP12(25ng)作为对照。
对于跨孔迁移分析，样品如下制备：将DCN(0.25mg/mL时为20μL)和MMP-12(0.25mg/mL时为10μL)用消化缓冲液补充到40μL，使蛋白质:酶的比率为2:1，如上文所述。作为对照，用消化缓冲液将仅DCN单独(0.25mg/mL时为20μL)和仅MMP-12(0.25mg/mL时为10μL)补充到40μL，并将仅消化缓冲液的样品(“对照”)孵育相同的时间。样品在37℃下孵育过夜16小时。孵育后，将每种溶液与0.5mL DMEM0.5合并以淬灭酶消化。如上所述，使用ovAD-MSC细胞进行跨孔迁移试验。采集膜的图像，并使用ImageJ对迁移的细胞进行计数。结果表示成相对于仅培养基样品的标准化细胞迁移，并代表三个独立实验的平均值。使用GraphPad Prism(版本8.4.1)进行统计分析(t检验)；‘*’，p<0.05；‘**’，p<0.01；‘***’，p<0.001；‘****’，p<0.0001。
结果
跨孔膜下室中存在的迁移细胞数如图7B所示。可以清楚地看到，当核心蛋白聚糖被MMP12消化时，更多的细胞在核心蛋白聚糖存在的情况下迁移到下室。相比之下，仅培养基的阴性对照样品和未消化的核心蛋白聚糖蛋白观察到的细胞较少。
本实施例证明了酶法产生的MayDay蛋白引发细胞募集的能力，与从OFM+巨噬细胞培养物衍生的MayDay多肽所观察到的能力相当。因此，该实施例确定在如本文所述的分析方法中鉴定的生物活性多肽的生物活性可由合成产生的多肽重现。
实施例6：重组生物活性Mayday肽的制备与评估
本实施例描述本文鉴定的Mayday多肽的重组生产及其生物活性的评估。
方法
Biomatik(加拿大安大略省)按照既定程序表达和纯化重组HIS标记的Mayday(31-170)(rec-HISovMayDay(31-170))。简单说，将N-端融合有6xHis-标签的绵羊DCN序列31-170克隆到pET30a克隆载体中。将表达质粒转化到大肠杆菌BL21细胞中，并在37℃下在补充了50μg/mL卡那霉素(西格玛奥德里奇公司)的Luria肉汤(LB)培养基中培养细胞，直到OD600 nm达到0.6，然后向培养基中添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)(0.2mM)(西格玛奥德里奇公司)，并在15℃下进一步培养16小时。用裂解缓冲液(50mM Tris，pH8.5，300mM NaCl，20mM咪唑)(西格玛奥德里奇公司)超声处理细胞悬液。将上清液加到用裂解缓冲液预平衡的Ni-IDA亲和柱上，离心并收集上清液。用SDS-PAGE分析组分。合并组分并用最终缓冲液(50mM Tris，pH 8.5，150mM NaCl)透析。
如上所述，使用ovAD-MSC在跨孔迁移分析中测试重组His-标记的MayDay(31-171)(rec-HISovMayDay(31-170))。在PBS(0.1mg/mL)中制备rec-HISovMayDay(31-170)，然后在DMEM0.5中稀释至最终浓度0.05、0.50和5.00ng/mL。在PBS(0.1mg/mL)中制备人重组SDF-1(Sigma)，并在DMEM0.5中稀释至50ng/mL的最终浓度。获取膜的图像，并使用ImageJ对迁移的细胞进行计数。结果表示成相对于仅培养基样品的标准化细胞迁移，并代表三个独立实验的平均值。使用GraphPad Prism(版本8.4.1)进行统计分析(t检验)；‘*’，p<0.05；‘**’，p<0.01；‘***’，p<0.001；‘****’，p<0.0001。
结果
跨孔膜下室中存在的迁移细胞数如图8所示。可以清楚地看到，仅仅5ng/mL重组MayDay多肽的存在引发了相当的细胞迁移，与用50ng/mL SDF1所观察的结果相当。相比之下，仅培养基的阴性对照样品观察到的细胞很少。
本实施例证明了重组产生的MayDay蛋白引发细胞募集的能力，与从OFM+巨噬细胞培养物衍生的MayDay多肽所观察到的能力相当。因此，该实施例确定在如本文所述的分析方法中鉴定的生物活性多肽的生物活性可由重组表达的多肽重现。
实施例7：重组MayDay肽生物活性的体内评估
本实施例描述了在MSC募集的体内模型中对重组MayDay多肽的评估。
方法
重组MayDay(31-170)表达
如上所述，使用pSUMO载体在BL21大肠杆菌细胞中表达无标签的蛋白(rec-ovMayDay(31-170))。扩增和表达后，将上清液加到用裂解缓冲液预平衡的QSepharoseTMFast Flow上，离心，并通过SDS-PAGE分析上清液部分。用SDS PAGE确认纯度(>85％)。在-20℃储存冻干蛋白质。
muBM-MSC的荧光标记
muBM-MSC在注射到Balb/c小鼠之前立即使用Cellvue NIR815荧光细胞标记试剂盒(Licor公司，美国林肯市)进行标记。80％汇合度的muBM-MSC平板再悬浮在DMEM(5mL)中，离心并再悬浮在Diluent C(公司，美国林肯市)中，得到最终浓度为2x10
体内MSC趋化性
在0.9％无菌盐水(贝朗公司(Braun)，德国梅尔桑根)中制备供试品、重组MayDay(rec-ovMayDay31-170)和人重组SDF-1(Sigma)。采用5个处理组；rec-ovMayDay(31-170)[1μg/动物，(约0.05μg/kg)；10μg/动物(约0.5mg/kg)和25μg/动物(约1.25mg/kg)]；SDF-1 10μg/动物，(约0.5mg/kg)和0.9％无菌生理盐水。使用异氟醚麻醉Balb/c小鼠，并将其置于腹侧卧位，通过鼻锥给予麻醉气体。用洗必泰(chlorhexidine)湿巾准备注射部位(后肢和尾部)。将供试品通过30μL肌肉内注射给予Balb/c小鼠(每个供试品n＝3)的右后肢肌肉(“经处理”)。
5-10分钟后，将NIR815标记的muBM-MSC(约5x10
使用Pearl Trilogy成像系统，用800nm通道(ex:786nm，em:814nm)对外植的“经处理”和“正常”肌肉组织进行成像，并使用Image studio软件(5.2版，Licor公司)确定每个组织的荧光信号(像素)。对于每个样品，还根据组织样品的等效面积(cm
分离的muBM-MSC的多能性通过三品系分化试验(成骨、成脂肪和成软骨)进行验证(数据未显示)。
结果
注射重组MayDay肽的动物显示供体细胞募集到注射部位，如图9所示。仅载剂的对照组未观察到注射部位有明显的细胞募集。
在测试的所有浓度的rec-ovMayDay(31-170)中，muBM-MSC在注射部位的定位显著增加(“正常”与“经处理”，图9A)，表明muBM-MSC募集到给予rec-ovMayDay(31-170)的位点。接收较高浓度的10和25μg rec-ovMayDay(31-170)的位点(“经处理”，图9A)显示，相对于仅接受载剂对照的位点，局部muBM-MSC募集明显更多。与正常对照相比，在注射rec-ovMayDay(31-170)的动物切下的肌肉组织中观察到由于细胞募集而导致的荧光显著增加，并且在切下的组织中观察到随着rec-ovMayDay(31-170)浓度的增加而增加的荧光(图9A，下图)。
对注射部位的信号强度进行定量，结果如图9B所示，清楚地显示了给予重组MayDay肽后细胞募集的增加，以及给予SDF1后细胞募集的增加，虽然程度稍低。最高25μg剂量的rec-ovMayDay(31-170)比对照(10μg的SDF-1)产生显著更多的muBM-MSC定位。
这些实施例清楚地证明，可使用本文所述方法制备、分离、鉴定和生产(包括通过重组方法)生物活性剂，且可评估和利用此类物质的生物活性以提供具有研究、诊断和治疗价值的生物活性剂。
出版物
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Li,J.,J.L.Curley,Z.E.Floyd,X.Wu,Y.D.C.Halvorsen和J.M.Gimble(2018)."从脂肪组织提取物中分离人脂肪来源的干细胞(Isolation of human adipose-derivedstem cells from lipoaspirates.)"
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如在本说明书中所使用的，词语“包括”，“包含”、“含有”和类似的词语不应以排他性或穷举的意义来解释。换句话说，它们旨在表示“包括但不限于”。在解释本说明书中包含术语“包含”、“包括”或“含有”的每处陈述时，也可以存在除该术语或以该术语开头的特征以外的特征。
以上和以下引用的所有申请、专利和出版物(如有)的全部披露内容通过引用并入本文。
如果在前面的描述中提到了整数或具有已知等价的构成要件，则这些整数在这里被合并，如同单独列出一样。
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仅以示例的方式对本发明的方面进行了说明，并且应当理解的是，在不偏离由权利要求书限定的本发明范围的情况下可以进行改变、修改和添加。此外，如果存在特定特征的已知等价形式，则将此类等价形式合并为本规范中特别提及的等价形式。
序列表
<110> 阿罗阿生物外科有限公司(Aroa Biosurgery Limited)
B·C·H·梅 (May, Barnaby)
S·G·丹普塞 (Dempsey, Sandi)
D·J·戴 (Day, Darren)
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<151> 2020-04-23
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<210> 1
<211> 360
<212> PRT
<213> 绵羊(Ovis aries)
<400> 1
Met Lys Ala Thr Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Gln Val Ser Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Phe Gln Gln Lys Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu
20 25 30
Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Glu Arg Phe His Glu Val Pro Glu Leu
35 40 45
Glu Pro Met Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg
50 55 60
Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Glu Lys Val Pro Lys Asp Leu
65 70 75 80
Pro Pro Asp Thr Ala Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu
85 90 95
Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Thr Leu Ile
100 105 110
Leu Ile Asn Asn Lys Ile Ser Lys Ile Ser Pro Gly Ala Phe Ala Pro
115 120 125
Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu
130 135 140
Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Val His Glu
145 150 155 160
Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Ser Val Phe Asn Gly Leu Asn Gln
165 170 175
Met Ile Val Val Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile
180 185 190
Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile
195 200 205
Ala Asp Thr Asn Ile Thr Thr Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu
210 215 220
Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Thr Lys Val Asp Ala Ala
225 230 235 240
Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn
245 250 255
Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu
260 265 270
Arg Glu Leu His Leu Asn Asn Asn Lys Leu Val Lys Val Pro Gly Gly
275 280 285
Leu Ala Asp His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn
290 295 300
Ile Ser Ala Ile Gly Ser Asn Asp Phe Cys Pro Pro Gly Tyr Asn Thr
305 310 315 320
Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln
325 330 335
Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ala
340 345 350
Ala Val Gln Leu Gly Asn Tyr Lys
355 360
<210> 2
<211> 140
<212> PRT
<213> 合成肽-蛋白酶解和重组产生的
<400> 2
Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Glu Arg Phe His Glu Val Pro
1 5 10 15
Glu Leu Glu Pro Met Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His
20 25 30
Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Glu Lys Val Pro Lys
35 40 45
Asp Leu Pro Pro Asp Thr Ala Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile
50 55 60
Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Thr
65 70 75 80
Leu Ile Leu Ile Asn Asn Lys Ile Ser Lys Ile Ser Pro Gly Ala Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu
100 105 110
Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Val
115 120 125
His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Ser Val
130 135 140
<210> 3
<211> 147
<212> PRT
<213> 绵羊(Ovis aries)
<400> 3
Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Glu Arg Phe His Glu Val Pro
1 5 10 15
Glu Leu Glu Pro Met Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His
20 25 30
Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Glu Lys Val Pro Lys
35 40 45
Asp Leu Pro Pro Asp Thr Ala Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile
50 55 60
Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Thr
65 70 75 80
Leu Ile Leu Ile Asn Asn Lys Ile Ser Lys Ile Ser Pro Gly Ala Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu
100 105 110
Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Val
115 120 125
His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Ser Val Phe Asn Gly Leu
130 135 140
Asn Gln Met
145
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<211> 158
<212> PRT
<213> 绵羊(Ovis aries)
<400> 4
Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Glu Arg Phe His Glu Val Pro
1 5 10 15
Glu Leu Glu Pro Met Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His
20 25 30
Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Glu Lys Val Pro Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu
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130 135 140
Asn Gln Met Ile Val Val Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys
145 150 155