一种pf12A基因恢复水稻育性的方法及在调控水稻育性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种pf12A基因恢复水稻育性的方法及在调控水稻育性中的应用。

背景技术

水稻隶属于禾本科(Gramineae)、禾亚科(Pooideae)的稻属(Oryzeae)，包括二十多种野生稻和两种栽培稻。两种栽培稻可分为亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)和非洲栽培稻(Oryza glaberrima)，亚洲栽培稻又分为籼亚种(ssp.xian)和粳亚种(ssp.geng)。种间、亚种间在生理生态和遗传背景等方面存在着明显的差异，这些差异使其相互之间形成了生殖隔离，结果往往表现为杂交后代不育或半不育(Kato S,Kosaka H,Hara S(1928)On theaffinity of rice varieties as shown by fertility of hybrid plants.Bull SciFac Agric Kyushu Univ,3:132-147；Oka HI(1988)Origin of cultivatedrice.Scientific Societies Press,Tokyo,Japan pp 181–209；Yang J,Zhao X,Cheng K(2012)A killer-protector system regulates both hybrid sterility andsegregation distortion in rice.Science,337(6100):1336-1340.)。多年来水稻育种实践上主要利用的是亚种内的杂种优势，而亚种间、种间具有更大的杂种优势潜力，但杂种不育的存在限制了对其杂种优势的利用。目前已经有遗传定位的水稻杂种不育位点大约50个，而成功克隆的只有13个(谢勇尧，汤金涛，杨博文(2019)水稻育性调控的分子遗传研究进展.遗传，41(08):703-715.)。

水稻杂种不育研究关注的表型包括花粉育性、胚囊育性和小穗育性，pf12主要是通过控制花粉育性而影响小穗育性的。Song xiang等人利用一个三交群体(‘02428’/‘Nanjing11’//‘Balilla’)最先扫描到pf12位点，将其定位至分子标记RM19和RM247之间(Song X,Qiu S Q,Xu C G(2005)Genetic dissection of embryo sac fertility,pollenfertility,and their contributions to spikelet fertility of intersubspecifichybrids in rice.Theoretical and Applied Genetics,110(2):205-211.)；随后朱文银等人利用E47-1/广陆矮4号的F

因此，为了进一步拓宽培育籼粳广亲和基因资源，更多的与水稻籼粳杂种不育相关的基因亟待鉴定。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种pf12A基因恢复水稻育性的方法及在调控水稻育性中的应用，所述pf12A基因是控制pf12位点杂种育性的必需基因。

为解决籼粳杂种不育的问题，本发明提供了以下技术方案：

一种蛋白质在调控水稻籼粳亚种间杂种不育中的应用，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，编码上述蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种提高水稻籼粳亚种间杂种育性的方法，敲除或抑制水稻中上述蛋白的表达和/或活性，选择可以提高水稻籼粳亚种间杂种育性的植株。

优选的，所述敲除或抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中的任意一种。

更优选的，所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

更优选的，所述CRISPR/Cas9方法在水稻基因组靶标区域的DNA序列如SEQ IDNO.4-SEQ ID NO.7中任意一个所示。

本发明还提供了一种用于提高水稻籼粳亚种间杂种育性的试剂盒，包括如下任一种：

(1)能够识别上述靶标区域的RNA分子；

(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；

(3)表达(1)所述RNA的载体。

优选的，所述的RNA分子的序列如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.11任意一个所示。

本发明还提供了一种高水稻籼粳亚种间杂种育性的突变基因，所述突变基因序列为SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

本发明还提供了一种高水稻籼粳亚种间杂种育性的突变蛋白，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15所示。

本发明的优点及有益效果如下：

本发明提供了一种pf12A基因在恢复籼粳水稻杂种育性中的应用，通过构建敲除载体，转化近等基因系材料BL(pf12-NJ/NJ)得到了敲除pf12A基因的敲除家系BL(pf12-pf12A

附图说明

图1为本发明基因pf12A的鉴定流程。

图2为CRISPR表达盒与载体框架。

图3为pf12A基因的结构和CRISPR靶点。

图4为pf12A的图位克隆和转基因验证结果，A，通过四次分离群体的定位将pf12位点定位至40kb的区间内；B，重组单株的育性考察和pf12位点候选基因的比较分析；C，pf12A基因的阳性编辑材料与BL杂交F

具体实施方式

一种蛋白质在调控水稻籼粳亚种间杂种不育中的应用，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中，编码上述蛋白质的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。利用本发明所述蛋白质可以调控水稻的育性，从而使水稻亚种间、种间强大的杂种优势得以发挥，进一步提高水稻的生物学产量。

本发明还提供了一种提高水稻籼粳亚种间杂种育性的方法，敲除或抑制水稻中上述蛋白的表达和/或活性，选择可以提高水稻籼粳亚种间杂种育性的植株。

本发明中，所述敲除或抑制蛋白表达和/或活性的方法优选的包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中的任意一种；所述基因编辑优选的采用CRISPR/Cas9方法。本发明中，所述CRISPR/Cas9方法在水稻基因组靶标区域的DNA序列优选的如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.7中任意一个所示。

本发明还提供了一种用于提高水稻籼粳亚种间杂种育性的试剂盒，包括如下任一种：

(1)能够识别上述靶标区域的RNA分子；

(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；

(3)表达(1)所述RNA的载体。

本发明中，所述的RNA分子的序列优选的如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.11任意一个所示。

本发明还提供了一种高水稻籼粳亚种间杂种育性的突变基因，所述突变基因序列为SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。本发明还提供了一种高水稻籼粳亚种间杂种育性的突变蛋白，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15所示。

在本发明的具体实施例中，所述近等基因系材料BL(pf12-NJ/NJ)是以南京11(NJ11，NJ)为供体亲本、巴利拉(Balilla，BL)为轮回亲本，通过多世代的回交和自交构建得到。本发明中，所述南京11(NJ11，NJ)优选为江苏农科院育成的中籼品种，属胜利籼衍生品系；所述巴利拉(Balilla，BL)为引自意大利的粳型品种。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

分离克隆包含有pf12A基因区段的DNA片段

1.利用图位克隆技术鉴定水稻杂种不育基因pf12A

以NJ11为供体亲本、BL为轮回亲本，通过多世代的回交和自交构建了一个近等基因系BL(pf12-NJ/NJ)，使其自交产生了包含791个单株的BC

DNA的抽提按Murray和Thompson的CTAB法进行(Murray M G,Thompson W F(1980)Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucl Acids Res.8:4321-4325)。使用的分子标记包括InDel标记、SSR标记和KASP标记，通过对基因型和表型的联合分析，最终将pf12A基因限定在分子标记KS491和KS561之间40kb的范围，结果如表1所示。

表1pf12A基因的精细定位结果

其中，B：pf12-BL/BL；N：pf12-NJ/NJ；H：pf12-BL/NJ；S：sterility or semi-sterility；F：fertility。

2.遗传转化载体的构建及转基因植株的表现

本发明基因pf12A属于一个典型的籼粳杂合时籼型配子存活、粳型配子败育，从而表现为显著偏分离现象的位点。即由pf12-xian/pf12-xian、pf12-geng/pf12-geng形成的合子育性正常，而由pf12-geng/pf12-xian组成的合子，则表现为不育或半不育。因此，采取敲除pf12A基因的策略，通过考察转基因后代植株的育性表型来验证其功能。

敲除载体的构建方法是：根据籼稻NJ11的基因组序列和华南农大刘耀光老师实验室提供的单子叶植物CRISPR载体系统设计引物：

pf12AU6AF：GCCGATCAGTCGTCCGTTCCAGC(SEQ ID NO.16)；

pf12AU6AR：AAACGCTGGAACGGACGACTGAT(SEQ ID NO.17)；

pf12AU6BF：GTTGAGACCAATACTCGAGTATC(SEQ ID NO.18)；

pf12AU6BR：AAACGATACTCGAGTATTGGTCT(SEQ ID NO.19)。

将各组接头分别组合起来与其对应的gRNA表达盒连接，再将各表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH载体进行连接转化入大肠杆菌，接着将连接成功并测序正确的阳性克隆质粒转入农杆菌，然后用农杆菌转化受体材料获得转基因水稻。所述表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH载体框架见附图2。

将表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH连接成功的载体转化大肠杆菌DH10β(购自Invitrogen公司)，筛选正确阳性克隆。采用农杆菌介导的方法将阳性克隆质粒转化至受体材料即pf12的近等基因系BL(pf12-NJ/NJ)，农杆菌菌株为超毒力菌株EHA105(Sun X,CaoY,Yang Z,Xu C,Li X,Wang S,Zhang Q(2004)Xa26,a gene conferring resistance toXanthomonas oryzae pv.oryzae in rice,encoding aLRR receptor kinase-likeprotein.Plant J 37:517-527)。

本发明使用上述农杆菌进行遗传转化的主要步骤、培养基及其配制方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液[按照10倍浓缩液(10X)配制]

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。

2)N6培养基微量元素母液[按照100倍浓缩液(100X)配制]

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(Fe

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7)2,4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2,4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。其中，第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

4.1愈伤诱导

1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl

2)用灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

4.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4.4农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

4.5农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

4.6愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400毫克/L潮霉素的灭菌水中30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

4.7分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

4.8生根

1)剪掉分化时产生的根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

4.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

CRISPR敲除转化结果：根据步骤2中的载体构建方法和转基因方法，通过PCR扩增Cas9序列，扩增引物为Cas9-F:GGTCGCCTACCACGAGAAGTACC(SEQ ID NO.20)，Cas9-R:GTGAGGTCCTGGTGGTGCTCGTC(SEQ ID NO.21)；然后PCR扩增用于敲除pf12A的CRISPR编辑靶点所在的基因组片段并测序，引物为53SJF:GTTGAAGTTCAGGTCTATGTC(SEQ ID NO.22)，53SJR:CCTCAGGCTTGTGGTAAC(SEQ ID NO.23)，从中选择出Cas9阴性、pf12A敲除阳性的两个家系，家系一BL(pf12-pf12A

转基因结果：敲除了pf12A基因的材料与BL杂交得到的F

3.含有pf12A基因区段的DNA片段的分离克隆

分别使用cDNA末端快速扩增(RACE)和PCR引物延伸的方法获得该基因全长cDNA。使用材料为籼稻南京11的cDNA，液氮冷冻后于-70℃冰箱待用。按照TRIZOL说明书所述步骤提取RNA(注：TRIZOL Reagent，Invitrogen Cat.No.15596-018)，稀释浓度至1μg/μl，-70℃保存待用。

RACE具体步骤：使用Clontech的SMART

5’端RACE引物535RCE 3：CGGCAGCTAGAACAGATGACTGATC(SEQ ID NO.24)；

3’端RACE引物533RCE 3：TCCGGTTGTTGGTTGATGGAGACGG(SEQ ID NO.25)；

UPM：Long(0.4M)：TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ IDNO.26)；

Short(2μM)：CTAATACGACTCACTATAGGGC(SEQ ID NO.27)。

其中UPM由上述试剂盒提供。

获得RACE-Ready-cDNA后快速扩增cDNA末端的PCR反应条件为：

94℃变性30秒，72℃3分钟，5个循环；

94℃变性30秒，70℃退火30秒，72℃延伸3分钟，5个循环；

94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸3分钟，35个循环；

72℃最终延伸7分钟。

5’RACE使用引物UPM+535RCE 3

3’RACE使用引物UPM+533RCE 3

PCR引物延伸扩增法的具体步骤：反转录采用20μL体系，按照DNaseI说明书所述步骤去除RNA中痕量DNA后，按SuperScriptTM II说明书所述步骤操作，产物于-20℃保存待用。(注：Deoxyribonuclease I,Invitrogen Cat.No.18068-015；SuperScript

对RACE产物测序获得所需全长基因。

实施例2

pf12A基因的结构分析

实施例1中的第3部分获得的结果是pf12A基因在南京11中的全长cDNA为2911bp，其结构由四个外显子和三个内含子组成(附图3)，并且籼稻中有而粳稻中无(附图4)。pf12A基因编码一个596个氨基酸的蛋白质，BLASTp分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)发现该蛋白属于RNase H type-1domain-containing蛋白。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。