用于在血液中或在富集PBMC中基因修饰淋巴细胞的方法和组合物

本申请案是2018年9月17日提交的国际申请案第PCT/US2018/051392号的部分接续申请案；且要求以下的权利：2018年9月2日提交的美国临时申请案第62/726,293号；2018年9月2日提交的美国临时申请案第62/726,294号；2018年9月6日提交的美国临时申请案第62/728,056号；2018年9月17日提交的美国临时申请案第62/732,528号；2019年3月20日提交的美国临时申请案第62/821,434号；及2019年9月1日提交的美国临时申请案第62/894,853号；且国际申请案第PCT/US2018/051392号是2018年3月3日提交的国际申请案第PCT/US2018/020818号的部分接续申请案；且要求以下的权利：2017年9月18日提交的美国临时申请案第62/560,176号；2017年9月27日提交的美国临时申请案第62/564,253号；2017年9月28日提交的美国临时申请案第62/564,991号；及2018年9月6日提交的美国临时申请案第62/728,056号；国际申请案第PCT/US2018/020818号是2017年3月19日提交的国际申请案第PCT/US2017/023112号的部分接续申请案；2017年7月8日提交的国际申请案第PCT/US2017/041277号的部分接续申请案；2017年3月19日提交的美国申请案第15/462,855号的部分接续申请案；和2017年7月8日提交的美国申请案第15/644,778号的部分接续申请案；且要求以下的权利：2017年3月3日提交的美国临时申请案第62/467,039号；2017年9月18日提交的美国临时申请案第62/560,176号；2017年9月27日提交的美国临时申请案第62/564,253号；和2017年9月28日提交的美国临时申请案第62/564,991号；国际申请案第PCT/US2017/023112号要求以下的权利：2016年3月19日提交的美国临时申请案第62/390,093号；2016年7月8日提交的美国临时申请案第62/360,041号；和2017年3月3日提交的美国临时申请案第62/467,039号；国际申请案第PCT/US2017/041277号要求2017年3月19日提交的国际申请案第PCT/US2017/023112号的权利；2017年3月19日提交的美国专利申请案第15/462,855号；2016年7月8日提交的美国临时申请案第62/360,041号；和2017年3月3日提交的美国临时申请案第62/467,039号；美国申请案第15/462,855号要求以下的权利：2016年3月19日提交的美国临时申请案第62/390,093号；2016年7月8日提交的美国临时申请案第62/360,041号；和2017年3月3日提交的美国临时申请案第62/467,039号；且美国申请案第15/644,778号是2017年3月19日提交的国际申请案第PCT/US2017/023112号的部分接续申请案；和2017年3月19日提交的美国专利申请案第15/462,855号的部分接续申请案；且要求以下的权利：2016年7月8日提交的美国临时申请案第62/360,041号和2017年3月3日提交的美国临时申请案第62/467,039号。这些申请案以全文引用的方式并入本文中。

本申请案在此以引用的方式并入与本申请案一起提交的电子序列表的材料。电子序列表中的材料以于2019年9月2日创建的标题为“F1_001_WO_05_Sequence_Listing_September_02_2019.txt”的文本(.txt)文件(其文件大小是450KB)形式提交且以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本公开涉及免疫学领域或更具体地说，涉及T淋巴细胞或其它免疫细胞的基因修饰，以及控制这类细胞的增殖的方法。

背景技术

自个体(例如，患者)分离的淋巴细胞可在活体外活化且经基因修饰以表达合成蛋白，所述合成蛋白能够基于所并入的基因程序而与其它细胞及环境重新定位结合。这类合成蛋白质的实例包括重组T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)。目前使用的一种CAR是胞外识别域(例如，抗原结合域)、跨膜域及由复制缺陷型重组反转录病毒编码的一个或多个胞内信号传导域的融合物。

尽管重组反转录病毒已在感染非分裂细胞上显示出功效，但静息CD4及CD8淋巴细胞对这些载体的基因转导不敏感。为了克服这些困难，通常在可出现对CAR基因载体的基因修饰之前使用刺激剂在活体外活化这些细胞。在刺激和转导之后，经基因修饰的细胞在活体外扩增且随后再引入到淋巴去除的患者中。在体内抗原接合之后，CAR的细胞内信号传导部分可以在免疫细胞中起始活化相关的反应且释放细胞溶解分子以诱导目标细胞死亡。

这类目前方法需要广泛的操纵及在T细胞再输注至患者中之前在活体外制造增殖性T细胞，以及淋巴去除化学疗法以释放细胞因子及去除竞争性受体以有助于T细胞移植。一旦引入至身体中，这类CAR疗法另外不能控制体内传播速率，也不能安全地定向也在肿瘤外表达的目标。因此，现今CAR疗法一般由使用1×10

由于我们对驱动淋巴细胞的转导、增殖和存活的过程的理解是涉及免疫过程的各种潜在商业用途的核心，因此需要经改善的方法及组合物以用于研究淋巴细胞。举例来说，其将有助于识别可用于更好的表征及理解淋巴细胞可如何经基因方式修饰的方法及组合物以及影响其存活及增殖的因素。此外，其将有助于识别驱动淋巴细胞增殖及存活的组合物。这些组合物可以用于研究对这类过程的调节。除用于研究淋巴细胞的方法及组合物以外，需要经改善的病毒包装细胞系以及其制造和使用方法。举例来说，这些细胞系和方法将适用于分析重组病毒(如重组反转录病毒颗粒)的不同组分，以及用于使用包装细胞系产生重组反转录病毒颗粒的方法。

已经研发可以在不进行预先活化和离体扩增的情况下进行的最新方法。然而，非常需要进一步降低这类方法的复杂性和所需的时间，特别是如果这类方法允许个体例如在输液中心内收集血液且接着在同一天将其重新引入个体中，那么将是非常理想的。此外，单独的更简单且更快速的方法或需要较少的专业仪器的方法可能会使这些目前仅在高度专业化的医疗中心定期进行的细胞疗法过程大众化。

一些小组试图通过静脉内输注病毒颗粒来消除离体转导扩增，以在体内转导细胞来简化离体细胞疗法的处理。然而，这类方法需要大量的载体且所述方法具有反转录病毒颗粒由于凝血因子和/或体内存在的其它酶而失活的风险。最终，这类方法具有非目标细胞/器官的高转导水平的风险。

发明内容

本文中提供帮助克服关于用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(如T细胞和/或NK细胞)的有效性及安全性的方法、组合物及试剂盒。这类方法的某些实施例适用于用这些细胞进行过继性细胞疗法。因此，在一些方面中，本文中提供用于遗传修饰淋巴细胞(尤其T细胞和/或NK细胞)和/或用于调节被转导和/或遗传修饰的T细胞和/或NK细胞的方法、组合物和试剂盒。与当前技术相比，尤其与表达重组T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)和在说明性实施例中，微环境受限生物(“MRB”)CAR的T细胞和/或NK细胞相比，这类方法、组合物和试剂盒提供改善的功效和安全性。在经由反转录病毒(例如，慢病毒)颗粒自反转录病毒(例如，慢病毒)基因组递送的说明性实施例中，由本文中所提供的方法产生和/或用于本文中所提供的方法中的被转导和/或遗传修饰的T细胞和/或NK细胞包括提供这类细胞和利用这类细胞的方法(如研究方法、商业生产方法和过继性细胞疗法)的改善的特征的官能团和官能团的组合。举例来说，这类细胞可离体在较短时间内产生，且所述细胞具有可被更好调节的改善的生长特性。

在一些方面中，提供用于转导和/或遗传修饰淋巴细胞(如T细胞和/或NK细胞)的方法，且在说明性实施例中，提供用于转导和/或遗传修饰静息T细胞和/或NK细胞的离体方法。这些方面中的一些可比先前方法更快速地执行，这可有助于更有效的研究、更有效的商业生产以及改善的患者护理方法。本文中所提供的方法、组合物和试剂盒可以用作研究工具、用于商业生产以及用于由表达TCR或CAR的被转导和/或遗传修饰的T细胞和/或NK细胞进行的过继性细胞疗法中。

关于本文中所提供的与淋巴细胞(如T细胞和/或NK细胞)的转导相关的方法、用途和组合物，本文中提供方法以及相关用途和组合物，其包括被富集的PBMC的转导反应或未进行预先PBMC富集的转导反应，如在全血中，其是用于进行离体细胞处理(例如CAR-T疗法)的简化和更快速的方法。这类方法需要较少的专业仪器和培训。此外，与体内转导方法相比，这类方法降低了非目标细胞转导的风险。此外，本文中提供方法、用途和组合物，其包括上述方法的实施例，所述方法、用途和组合物包括可以任选地与本文中所提供的任何其它方面组合以提供用于体外、离体和体内驱动淋巴细胞(尤其T细胞和/或NK细胞)的扩增的有效方法、用途和组合物的某些目标抑制性RNA、多肽淋巴增生元件和假型化元件。

贯穿本专利申请案提供关于本公开的方面和实施例的其它细节。章节及章节标题是为了易于阅读且并不意图限制整个章节中的本公开的组合，如方法、组合物和试剂盒或其中的功能元件。

附图说明

图1A-1B是非限制性例示性细胞处理工作流程的流程图。图1A是使用在PBMC中的T细胞和NK细胞与反转录病毒颗粒接触之前进行PBMC富集的系统的方法的流程图。图1B是其中在全血中的T细胞和NK细胞与反转录病毒颗粒接触之前不进行血细胞分级分离或富集且在转导之后进行PBMC富集的方法的流程图。

图2是非限制性例示性白细胞耗减过滤器总成(200)的图，所述白细胞去除过滤器总成具有相关血液处理袋、管、阀门和包含白细胞耗减过滤器集合的过滤器壳体(210)。

图3A和3B展示具有不同假型化元件的实验结果的直方图。图3A展示在转导之后第6天每个孔中的活细胞的总数的直方图。图3B展示被转导的CD3+细胞的百分比的直方图，如通过eTAG表达所测量。

图4A和4B展示在形成反应混合物之前不进行PBMC富集的具有转导反应混合物的实验结果的直方图，所述转导反应混合物包括全血、慢病毒颗粒和抗凝剂EDTA或肝素。所述方法是通过使全血与所指示的慢病毒颗粒F1-3-23G或F1-3-23GU接触4小时，接着进行基于密度梯度离心的PBMC富集程序来进行。图4A展示活淋巴细胞群体的以每微升计的绝对细胞数量的直方图。图4B展示在转导后第6天，活淋巴细胞群体中的CD3+eTag+细胞百分比(％)的直方图。

图5是直方图，其展示在MOI为1的情况下，在用不同的重组慢病毒颗粒将未受刺激的PBMC转导所指示的时间段之后的第6天，每微升培养物中的CD3+FLAG+细胞数量。F1-3-253编码抗CD19 CAR且F1-3-451编码除相同CAR以外的CLE。慢病毒颗粒用VSV-G[VSV-G]假型化且任选地显示UCHT1ScFvFc-GPI[VSV-G+U]，如所指示。用达匹韦林(dapivirine)(一种反转录抑制剂(RT inb))或都鲁拉韦(dolutegravir)(一种整合抑制剂(INT Inb))处理样品，如所指示。

图6是非限制性、例示性转基因表达盒的示意图，所述表达盒含有编码CAR的聚核苷酸序列和实例6中分析的库的候选CLE。

如本文中所使用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”或“CARs”是指经工程改造的受体，其将抗原特异性移植至细胞上，例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞和干细胞。本发明的CAR包括至少一个抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域(TM)及胞内活化域(IAD)，且可以包括柄和一个或多个共刺激域(CSD)。在另一实施例中，CAR是对两种不同抗原或抗原决定基具有特异性的双特异性CAR。在ASTR与目标抗原特异性结合之后，IAD活化细胞内信号传导。举例来说，IAD可以非MHC限制的方式将T细胞特异性及反应性重新引导至所选择的目标，从而利用抗体的抗原结合特性。非MHC限制的抗原识别赋予表达CAR的T细胞不依赖于抗原处理而识别抗原的能力，因此绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α链和β链发生二聚。

如本文中所使用，术语“微环境”意谓与其它组织区域或身体区域具有恒定或时间上、物理上或化学上的差异的组织或身体的任何部分或区域。举例来说，如本文中所使用的“肿瘤微环境”是指其中存在肿瘤的环境，所述环境是肿瘤内的非细胞区域和刚好位于肿瘤组织外部，但与癌细胞本身的细胞内腔室无关的区域。肿瘤微环境可以指肿瘤环境的任何和所有条件，所述条件包括为恶化过程创建结构性和/或功能性环境以存活和/或扩增和/或扩散的条件。举例来说，肿瘤微环境可以包括条件的变化，所述条件如(但不限于)：压力、温度、pH值、离子强度、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应激、一种或多种溶质的浓度、电解质的浓度、葡萄糖的浓度、玻尿酸的浓度、乳酸或乳酸盐的浓度、白蛋白的浓度、腺苷的水平、R-2-羟基戊二酸的水平、丙酮酸的浓度、氧的浓度和/或氧化剂、还原剂或辅助因子的存在，以及所属领域的技术人员将理解的其它条件。

如本文中可互换地使用，术语“聚核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，此术语包括(但不限于)：单股、双股或多股的DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤碱基和嘧啶碱基或其它天然、经化学方式或生物化学方式修饰的非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。

如本文中所使用，术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体，所述多克隆抗体和单克隆抗体包括完整的抗体及保留与抗原特异性结合的抗体片段。抗体片段可以是(但不限于)：片段抗原结合片段(Fab)片段、Fab'片段、F(ab')

如本文中所使用，术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')

如本文中可互换地使用，术语“单链Fv”、“scFv”或“sFv”抗体片段包括抗体的V

如本文中所使用，“天然存在”的VH域及VL域是指已从宿主分离而未进一步分子进化以改变其在特殊条件下以scFv形式产生时的亲和力的VH域及VL域，如美国专利案8709755B2及申请案WO/2016/033331A1中所公开的VH域及VL域。

如本文中所使用，术语“亲和力”是指两种试剂的可逆结合的平衡常数，且被表示为解离常数(Kd)。亲和力可比抗体针对不相关氨基酸序列的亲和力高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍或更高。抗体对于目标蛋白质的亲和力可以是例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)，或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更高。如本文中所使用，术语“亲合力(avidity)”是指两种或更多种试剂的复合物在稀释后对解离的抗性。关于抗体和/或抗原结合片段，术语“免疫反应性”及“优先结合”在本文中可互换地使用。

如本文中所使用，术语“结合(binding)”是指归因于(例如)共价相互作用、静电相互作用、疏水性相互作用及离子相互作用和/或氢键相互作用(包括如盐桥键及水桥键的相互作用)而在两个分子之间的直接缔合。非特异性结合是指亲和力小于约10

如本文中所使用，提及“细胞表面表达系统(cell surface expression system)”或“细胞表面呈现系统(cell surface display system)”是指蛋白质或其部分在细胞表面上的呈现或表达。通常，产生表达与细胞表面蛋白质融合的相关蛋白质的细胞。举例来说，蛋白质表达为具有跨膜域的融合蛋白质。

如本文中所使用，术语“元件”包括多肽(包括多肽的融合物、多肽的区及其功能性突变体或片段)及聚核苷酸(包括微型RNA及shRNA，以及其功能性突变体或片段)。

如本文中所使用，术语“区”是多肽或聚核苷酸的任何区段。

如本文中所使用，“域”是具有功能性和/或结构性特性的多肽或聚核苷酸的区。

如本文中所使用，术语“柄”或“柄域”是指提供结构性柔性且与侧接多肽区间隔的灵活的多肽连接区，且可由天然或合成的多肽组成。柄可衍生自免疫球蛋白(例如，IgGl)的铰链或铰链区，其一般被定义为自人类IgGl的Glu216拉伸至Pro230(Burton(1985)《分子免疫学(Molec.Immunol.)》,22:161-206)。可以通过使第一个半胱氨酸残基与最后一个半胱氨酸残基在相同位置形成重链间二硫键(S-S)来将其它IgG同型的铰链区与IgG1序列进行比对。柄可以是天然存在或非天然存在的，其包括(但不限于)经改变的铰链区，如美国专利胺第5,677,425号所公开。柄可包括衍生自任何类别或子类别的抗体的完整铰链区。柄还可以包括衍生自CD8、CD28或在提供柔性且与侧接区间隔上提供类似功能的其它受体的区。

如本文中所使用，术语“(经)分离”意谓材料是自其原始环境(例如，当其为天然存在时，则是自天然环境)移出。举例来说，存在于活体动物中的天然存在的聚核苷酸或多肽是未经分离的，但自天然系统中的共存材料的一些或全部分离的相同聚核苷酸或多肽则是经分离的。这类聚核苷酸可以是载体的部分，和/或这类聚核苷酸或多肽可以是组合物的部分，且仍是经分离的，这是因为载体或组合物并非其天然环境的部分。

如本文中所使用，“多肽”是由肽键连接的单链氨基酸残基。多肽既不折叠成固定结构，也不具有任何翻译后修饰。“蛋白质”是折叠成固定结构的多肽。“多肽”及“蛋白质”在本文中可互换地使用。

如本文中所使用，多肽可经“纯化”以去除多肽的天然环境的杂质组分，例如，将干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，如酶、激素及其它蛋白质或非蛋白质溶质。可以将多肽纯化达到(1)按劳里法(Lowry method)测定的以抗体重量计的大于90％、大于95％或大于98％，例如超过99重量％，(2)使用旋转杯测序仪足以获得至少15个N末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)使用考马斯蓝(Coomassie blue)或银染色，在还原或非还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)达到均质。

如本文中所使用，术语“免疫细胞”一般包括衍生自骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)。“免疫细胞”包括例如淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)及骨髓衍生的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。

如本文中所使用，“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括辅助T细胞(CD4

如本文中所使用，“细胞毒性细胞”包括CD8

如本文中所使用，术语“干细胞”一般包括分化多能或多潜能干细胞。“干细胞”包括例如胚胎干细胞(ES)；间充质干细胞(MSC)；诱导型分化多能性干细胞(iPS)；和定型祖细胞(造血干细胞(HSC)、骨髓衍生细胞等)。

如本文中所使用，术语“治疗(treatment/treating)”等是指获得所需药理学和/或生理学作用。所述作用就完全或部分地预防疾病或其症状来说可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良影响来说可以是治疗性的。如本文中所使用的“治疗”涵盖哺乳动物中的(例如，人类中的)疾病的任何治疗，且包括：(a)预防在易患疾病但尚未被诊断为患有疾病的个体中发生疾病；(b)抑制疾病，即遏止其发展；和(c)减轻疾病，即引起疾病消退。

如本文中互换地使用，术语“个体”、“受试者”、“宿主”及“患者”是指哺乳动物，包括(但不限于)人类、鼠类(例如，大鼠、小鼠)、兔类(例如，兔)、非人类灵长类动物、人类、犬、猫、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)等。

如本文中所使用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指在向哺乳动物或其它个体给予以用于治疗疾病时足以影响疾病的这类治疗的试剂的量或两种试剂的组合量。“治疗有效量”将视试剂、疾病及其严重程度以及所治疗的个体的年龄、体重等而变化。

如本文中所使用，术语“进化(evolution/evolving)”是指使用一种或多种突变方法以产生编码不同多肽的不同聚核苷酸，所述多肽本身是经改善生物分子和/或有助于产生另一经改善生物分子。“生理学”或“正常”或“正常生理学”条件是如(但不限于)以下的条件：压力、温度、pH值、离子强度、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应激、一种或多种溶质的浓度、电解质的浓度、葡萄糖的浓度、玻尿酸的浓度、乳酸或乳酸盐的浓度、白蛋白的浓度、腺苷的水平、R-2-羟基戊二酸的水平、丙酮酸的浓度、氧的浓度和/或氧化剂、还原剂或辅助因子的存在，以及将被视为在施用部位处或在作用部位处的组织或器官处对于个体是在正常范围内的其它条件。

如本文中所使用，“基因修饰的细胞”是含有外源核酸的细胞，而与是否将外源核酸整合到细胞的基因组中无关。如本文中所使用，“转导的细胞”是含有整合到细胞基因组中的外源核酸的细胞。

如本文中所使用的“多肽”可以包括蛋白质分子的部分或完整蛋白质分子以及任何翻译后或其它修饰。

如本文中所使用的假型化元件可以包括“结合多肽”，其包括识别且结合目标宿主细胞的一种或多种多肽(通常糖蛋白)，和一种或多种“促融合多肽”，其介导反转录病毒与目标宿主细胞膜融合，从而使反转录病毒基因组进入目标宿主细胞。如本文中所使用的“结合多肽”也可以被称为“T细胞和/或NK细胞结合多肽”或“目标接合元件”，且“促融合多肽”也可以被称为“促融合元件”。

“静息”淋巴细胞(例如，静息T细胞)为细胞周期的不表达活化标记物(如Ki-67)的G0阶段中的淋巴细胞。静息淋巴细胞可以包括从未接触特异性抗原的原生T细胞及已由与抗原的先前接触而更改的记忆T细胞。“静息”淋巴细胞也可以被称为“静态”淋巴细胞。

如本文中所使用，“淋巴细胞耗减”涉及(例如通过给予淋巴细胞耗减试剂)减少个体中的淋巴细胞的数目的方法。部分身体或全身分级放射疗法也可以引起淋巴细胞耗减。淋巴细胞耗减试剂可以是能够在将其向哺乳动物给予时减少所述哺乳动物中的功能性淋巴细胞的数目的化学化合物或组合物。这类试剂的一个实例是一种或多种化疗剂。这类试剂及剂量是已知的，且可由治疗医师视所治疗的个体来选择。淋巴细胞耗减试剂的实例包括(但不限于)氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺、克拉屈滨(cladribine)、地尼介白素迪夫托斯(denileukin diftitox)或其组合。

RNA干扰(RNAi)是一种生物学过程，其中RNA分子通过中和目标RNA分子来抑制基因表达或翻译。RNA目标可以是mRNA，或其可以是对RNAi的功能性抑制敏感的任何其它RNA。如本文中所使用，“抑制性RNA分子”是指其存在于细胞内产生RNAi且引起抑制性RNA分子所靶向的转录物的表达降低的RNA分子。如本文中所使用的抑制性RNA分子具有能够形成RNA双螺旋的5'茎及3'茎。抑制性RNA分子可为例如miRNA(内源性或人工的)或shRNA、miRNA的前体(即Pri-miRNA或Pre-miRNA)或shRNA，或作为经分离核酸直接转录或引入细胞或个体的dsRNA。

如本文中所使用，“双股RNA”或“dsRNA”或“RNA双螺旋”是指包含两个股的RNA分子。双股分子包括由杂交以形成双螺旋RNA结构的两个RNA股组成的分子，或其自身折叠以形成双螺旋结构的单RNA股。双螺旋区中的大多数但未必所有碱基是碱基配对的。双螺旋区包含与目标RNA互补的序列。与目标RNA互补的序列为反义序列，且通常为18至29、19至29、19至21或25至28个核苷酸长，或在一些实施例中在作为低端的18、19、20、21、22、23、24、25个与作为高端的21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个之间，其中给定范围通常具有低于高端的低端。这类结构通常包括5'茎、环及由与各茎相邻的环(其并非双螺旋的部分)连接的3'茎。在某些实施例中，环包含至少3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在其它实施例中，环包含2至40、3至40、3至21或19至21个核苷酸，或在一些实施例中，在作为低端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与作为高端的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40个之间，其中给定范围通常具有低于高端的低端。

如本文中所使用的术语“微型RNA侧接序列”是指包括微型RNA处理元件的核苷酸序列。微型RNA处理元件为有助于由前体微型RNA产生成熟微型RNA的最小核酸序列。这些元件通常位于侧接微型RNA茎-环结构的40个核苷酸序列之内。在一些情况下，在侧接微型RNA茎-环结构的长度在5与4,000个核苷酸之间的核苷酸序列的延伸内发现微型RNA处理元件。

术语“连接子”在用于提及多重抑制性RNA分子时是指加入两个抑制性RNA分子的连接构件。

如本文中所使用，除非将其明确地指出为可复制反转录病毒，否则“重组反转录病毒”是指不可复制的或“复制缺陷型”反转录病毒。术语“重组反转录病毒”及“重组反转录病毒颗粒”在本文中可互换地使用。这类反转录病毒/反转录病毒颗粒可以是任何类型的反转录病毒颗粒，包括例如γ反转录病毒及(在说明性实施例中)慢病毒。众所周知，这类反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)通常是在包装细胞中通过用质体(其包括如Gag、Pol及Rev等包装组分)及包膜或假型化质体(其编码假型化元件)及转移的、基因组的或反转录病毒(例如慢病毒)表达载体(其通常为在其上编码基因或其它相关编码序列的质体)转染所述包装细胞来形成。因此，反转录病毒(例如慢病毒)表达载体包括在转染至细胞中后促进表达及包装的序列(例如，侧接例如psi包装元件及目标异源编码序列的5'LTR及3'LTR)。术语“慢病毒”及“慢病毒颗粒”在本文中可互换地使用。

miRNA的“构架”由围绕miRNA的“5'微型RNA侧接序列”和/或“3'微型RNA侧接序列”及(在一些情况下)将miRNA中的茎-环结构的茎隔开的环序列组成。在一些实例中，“构架”来源于天然存在的miRNA，例如miR-155。术语“5'微型RNA侧接序列”及“5'臂”在本文中可互换地使用。术语“3'微型RNA侧接序列”及“3'臂”在本文中可互换地使用。

如本文中所使用，术语“miRNA前体”是指可以酶促方式加工成miRNA的任何长度的RNA分子，如初级RNA转录物、pri-miRNA或pre-miRNA。

如本文中所使用，术语“构筑体”是指经分离多肽或编码多肽的经分离聚核苷酸。聚核苷酸构筑体可以编码多肽，例如淋巴增生性元件。所属领域的技术人员将理解，视上下文而定，构筑体是指经分离聚核苷酸或经分离多肽。

如本文中所使用，“MOI”是指感染倍率，其中MOI等于用于感染的病毒颗粒的数目与细胞数目的比率。可以使用FACS和报导子表达来进行病毒颗粒的数目的功能性滴定。

“周边血液单核细胞”(PBMC)包括具有圆形细胞核的末梢血液细胞且包括淋巴细胞(例如T细胞、NK细胞和B细胞)和单核细胞。一些不是PBMC的血细胞类型包括红血球、血小板和粒细胞(即，嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。

应理解，本公开和本文提供的方面和实施例并不限于所公开的具体实例，因此当然可能有变化。亦应理解，本文中所使用的术语仅是出于公开具体实例及实施例的目的，且并不意图为限制性的，这是由于本公开的范围将仅由随附权利要求书所限定。

当提供值的范围时，应理解，在所述范围的上限与下限之间的各中间值(除非上下文另外明确指示，否则为下限单位的十分之一)与所述陈述范围中的任何其它值或中间值皆涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括于较小范围中并且也涵盖于本发明内，在所述范围内受到任何特定排他性限制。在所陈述的范围包括一个或两个限值时，排除了那些被包括的限值的任一个或两个的范围也被包括在本发明之内。当针对范围给定重叠的多个低值及多个高值时，所属领域的技术人员应认识到，所选择范围将包括低于高值的低值。本说明书中的所有标题皆为易于阅读起见，且并非为限制性的。

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语皆具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中还可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文中提及的所有公开案皆以引用的方式并入本文中，以公开和描述与所列公开案相关的方法和/或材料。

必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所使用的单数形式“一(a/an)”和“所述”包括多个指示物。因此，举例来说，提及“嵌合抗原受体”包括多个这类嵌合抗原受体和所属领域的技术人员已知的其等效物等。应进一步注意，权利要求书可经起草而排除任何任选的要素。因此，此陈述意图充当使用与权利要求书要素的引用相关的如“单独”、“仅”等排他性术语或使用“阴性”限制的前提基础。

应了解，为了清楚起见而在分开的实施例的情况下描述的本发明的某些特征还可以组合形式提供于单个实施例中。相反地，为简洁起见而在一个单一实施例的背景下所描述的本发明的不同特征还可以分开地或以任何适合的子组合形式提供。属于本发明的实施例的所有组合皆特异性地包涵在本发明中，且正如各组合及每一组合单独及清楚地公开一样公开于本文中。此外，各种实施例及其要素的所有子组合也都特异性地包涵在本发明中，且正如各子组合及每一这类子组合单独及清楚地公开一样公开于本文中。

具体实施方式

本公开通过提供用于基因修饰淋巴细胞(例如NK细胞，且在说明性实施例中，T细胞)的经改善方法及组合物来克服先前技术挑战。本文中的一些方法和组合物提供简化的和更快速的用于转导淋巴细胞的方法，其避免一些需要特殊装置的步骤。此外，所述方法提供对转导后处理的更好的控制，因为任何这类处理是离体进行的，因此其实现去除各种不合需要的细胞的选择方案。因此，所述方法提供实现细胞疗法方法的大众化的重要步骤。

与先前方法相比，以更少的时间进行用于基因修饰淋巴细胞(例如NK细胞且在说明性实施例中，T细胞)的说明性方法和组合物。此外，提供具有许多用途(包括其在这些经改善方法中的用途)的组合物。这些组合物中的一些是基因修饰的淋巴细胞，其具有经改善的增殖及存活质量，包括在体外培养时，例如在缺失生长因子的情况下。这类基因修饰的淋巴细胞将具有例如以下的用途：作为研究工具，以更好的理解影响T细胞增殖及存活的因素；及商业生产，例如可经采集及测试或用于商业产品的某些因子(如生长因子及免疫调节剂)的生产。

用于转导和/或基因修饰淋巴细胞的方法

在某些方面中，本文中提供用于转导和/或基因修饰淋巴细胞的方法，所述淋巴细胞是如末梢血液单核细胞(PBMC)，通常T细胞和/或NK细胞且在某些说明性实施例中，静息T细胞和/或静息NK细胞(通常是所述细胞的群体)，所述方法包括使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(通常是其群体)接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒通常在其表面上包含假型化元件，其中所述接触(和在接触条件下培育)有助于膜缔合、膜融合和任选地通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒来转导静息T细胞和/或NK细胞，由此制备基因修饰的T细胞和/或NK细胞。在说明性实施例中，无需T细胞和/或NK细胞的预先活化且用于进行接触的反应混合物中存在活化元件，其可以是本文中所提供的任何活化元件。在其它说明性实施例中，活化元件存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在说明性实施例中，活化元件是抗CD3，如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。

在一些实施例中，本文中所提供的用于转导和/或基因修饰PBMC或淋巴细胞，通常T细胞和/或NK细胞的方法中的接触步骤和随后任选的培育(其包括用于去除未与细胞缔合的反转录病毒颗粒的步骤)可以进行(或可以发生)72、48或24小时或更短的时间或持续本文中所提供的任何接触时间范围。然而，在说明性实施例中，接触进行小于2小时、小于1小时、小于30分钟或小于15分钟，但在每种情况下，至少存在初始接触步骤，其中使反转录病毒颗粒和细胞在转导反应混合物中的悬浮液中接触。此接触通常包括将未与反应混合物的细胞缔合的反转录病毒颗粒与细胞分离的初始步骤，接着进一步处理所述反转录病毒颗粒。这类悬浮液可以包括使细胞和反转录病毒颗粒沉降，或通过向容器或腔室的底部施加力(如离心力)来引起这类沉降。在说明性实施例中，这类g力低于在离心接种程序中成功使用的g力。本文中进一步论述其它接触时间以及关于接触和任选的培育的论述。在其它说明性实施例中，接触是在仅进行初始接触步骤(不在包括悬浮液中的游离反转录病毒颗粒和悬浮液中的细胞的反应混合物中进行任何进一步培育)而不在反应混合物中进行任何进一步培育，或在反应混合物中进行5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或1小时培育(其可以是将反应混合物中的游离反转录病毒颗粒从与细胞缔合的反转录病毒颗粒分离的步骤)之间的范围内进行。

本文中详细公开这一方法的各种实施例以及其它方面，如用途和通过这类方法制备的NK细胞和T细胞。此外，本文中提供用于转导和/或基因修饰PBMC、淋巴细胞、T细胞和/或NK细胞的这类方法方面的各种元素或步骤，例如在此章节和例示性实施例章节中，且这类方法包括在本说明书通篇中提供的实施例，如本文进一步论述。举例来说，例如此章节和例示性实施例章节中提供的用于转导和/或基因修饰PBMC或淋巴细胞，例如NK细胞或在说明性实施例中，T细胞的任何方面的实施例可以包括本文中所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例，包括有包含一种或多种淋巴增生性元件、CAR、假型化元件、核糖开关、活化元件、膜结合细胞因子、miRNA、克扎克类序列(Kozak-type sequence)、WPRE元件、三终止密码子和/或本文中所公开的其它元件的实施例，并且可以与本文中的方法组合以使用包装细胞来产生反转录病毒颗粒。在某些说明性实施例中，反转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。这类用于基因修饰和/或转导PBMC或淋巴细胞(如T细胞和/或NK细胞)的方法可以体外或离体进行。所属领域的技术人员将认识到，本文中所提供的用于转导和/或基因方式修饰PBMC或淋巴细胞(如T细胞和/或NK细胞)的细节可以应用于包括这类步骤的任何方面。

在某些说明性实施例中，在无需预先体内、体外或离体活化或刺激的情况下，基因修饰和/或转导细胞。在某些说明性实施例中，细胞在接触期间活化，且在接触之前完全不活化或活化超过15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时或8小时。在某些说明性实施例中，通过不存在于反转录病毒颗粒表面上的元件进行的活化不需要基因修饰和/或转导细胞。因此，在接触之前、期间或之后，除了在反转录病毒颗粒上以外，不需要这类活化或刺激元件。因此，如本文中更详细地论述，不需要预先活化或刺激的这些说明性实施例提供快速进行旨在更好地理解T细胞及其中的生物机制的体外实验的能力。此外，这类方法提供对使用PBMC、淋巴细胞、T细胞或NK细胞所生产的生物产品的更有效的商业生产及这类商业生产方法的发展。最终，这类方法提供用于过继性细胞疗法的PBMC的更快速离体处理，例如通过提供护理点方法来基本简化这类疗法的递送。

用于在全血中在全血淋巴细胞中转导淋巴细胞的组合物和方法

在某些方面中，本文中提供用于在包含血液或其组分和/或抗凝血剂的反应混合物中转导和/或基因修饰周边血液单核细胞(PBMC)或淋巴细胞，通常T细胞和/或NK细胞且在某些说明性实施例中，静息T细胞和/或静息NK细胞的方法，其包括使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在反应混合物中接触，所述反应混合物本身代表本文中所提供的单独方面。在说明性实施例中，所述反应混合物包含淋巴细胞和复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、T细胞活化元件和下文中阐述的一种或多种其它血液组分(其在说明性实施例中存在，因为反应混合物包含至少10％全血)，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒通常在其表面上包含假型化元件。在这类中，接触(和在接触条件下培育)有助于淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的缔合，其中重组反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导淋巴细胞。此方面的反应混合物包含至少10％全血(例如至少10％、20％、25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％全血)和任选的有效量的抗凝血剂，或反应混合物进一步包含至少一种其它血液或血液制剂组分，其不是PBMC，例如反应混合物包含有效量的抗凝血剂和一种或多种非PBMC型血液制剂组分。在说明性实施例中，这类非PBMC型血液或血液制剂组分是以下其它组分中的一种或多种(例如至少一种、两种、三种、四种或五种)或全部：

a)红细胞，其中红细胞占反应混合物的体积的1％至60％；

b)嗜中性粒细胞，其中嗜中性粒细胞占反应混合物中的白细胞的至少10％，或其中反应混合物包含至少10％的嗜中性粒细胞和相同量的T细胞；

c)嗜碱性粒细胞，其中嗜碱性粒细胞占反应混合物中的白细胞的至少0.05％；

d)嗜酸性粒细胞，其中反应混合物占反应混合物中的白细胞的至少0.1％；

e)血浆，其中血浆占反应混合物的体积的至少1％；和

f)抗凝血剂

(以上这类血液或血液制剂组分a-f在本文中称为(“值得注意的非PBMC血液或血液制剂组分”))。

在反应混合物的某些说明性实施例中存在一种或多种其它血液组分(包括本文中提供的相关用途、基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞方面的方法)，因为在这些说明性实施例中，反应混合物包含至少10％全血且在某些说明性实施例中，至少25％、50％、75％、90％或95％全血，或例如25％至95％全血。在这些说明性实施例中，这类反应混合物是通过组合全血与抗凝血剂(例如通过将全血收集至包含抗凝血剂的血液收集管中)且向具有抗凝血剂的血液中添加重组反转录病毒的溶液而形成。因此，在说明性实施例中，反应混合物包含抗凝血剂，如本文中更详细阐述。在一些实施例中，全血不是或不包含脐带血。

在形成转导反应混合物之前，这些方面中的反应混合物通常不包括PBMC富集程序。因此，这类反应混合物通常包括以上a)-f)中列出的其它组分，其不是PBMC。此外，在说明性实施例中，反应混合物包含以上a)至e)中列出的所有其它组分，因为反应混合物包含基本上全血或全血。“基本上全血”是从个体分离、尚未经历PBMC富集程序且用其它溶液稀释小于50％的血液。举例来说，此稀释可以通过添加抗凝血剂以及添加一定体积的包含反转录病毒颗粒的液体来进行。本文中提供与转导全血中的淋巴细胞相关的方法和组合物的其它反应混合物实施例。

在另一方面中，本文中提供通过以上用于转导和/或基因修饰全血中的淋巴细胞的方法制备的基因修饰的淋巴细胞，在说明性实施例中，基因修饰的T细胞和/或NK细胞。在另一方面中，本文中提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于基因修饰个体的淋巴细胞，在说明性实施例中，T细胞和/或NK细胞的试剂盒的用途，其中试剂盒的用途包含以上用于转导和/或基因修饰全血中的淋巴细胞的方法。在另一方面中，本文中提供用于向个体给予基因修饰的淋巴细胞的方法，其中所述基因修饰的淋巴细胞是通过以上用于转导和/或基因修饰全血中的淋巴细胞的方法产生。本文中所提供的各方面在本文中称为“用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面”，所述方面包括这类用于转导和/或基因修饰全血中的淋巴细胞的方法、这类方法在制造试剂盒中的用途、这类方法中形成的反应混合物、通过这类方法制备的基因修饰的淋巴细胞和用于给予通过这类方法制备的基因修饰的淋巴细胞的方法。应注意，尽管这类方面的说明性实施例涉及使T细胞和/或NK细胞与反转录病毒颗粒在全血中接触，但这类方面也包括其它实施例，其中以上其它组分a-f中的一种或多种以比PBMC富集程序之后的典型浓度更高的浓度存在于转导反应混合物中。

本文中提供用于转导全血中的淋巴细胞的这类方法方面的各种元素或步骤，例如在此章节和例示性实施例章节中，且这类方法包括在本说明书通篇中提供的实施例，如本文进一步论述。所属领域的技术人员将认识到，本文在本说明书中的任何地方提供的许多实施例可以应用于用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面的任何方面。举例来说，例如在此章节和/或例示性实施例章节中提供的用于转导全血中的淋巴细胞的任何组合物和方法方面的实施例可以包括本文中所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例，包括有包含一种或多种多肽淋巴增生性元件、抑制性RNA、CAR、假型化元件、核糖开关、活化元件、膜结合细胞因子、miRNA、克扎克类序列、WPRE元件、三终止密码子和/或本文中所公开的其它元件的实施例，并且可以与本文中的方法组合以使用包装细胞来产生反转录病毒颗粒。

作为本文中的许多方面中可以使用的实施例的非限制性实例，如本文中更详细论述，假型化元件通常是能够结合淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)，在说明性实施例中，静息T细胞和/或静息NK细胞且促进膜本身或结合复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的其它蛋白质的融合。在某些说明性实施例中，反转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。这类用于基因修饰全血中的淋巴细胞，如T细胞和/或NK细胞的方法可以体外或离体进行。

对于本文中所提供的用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面的某些实施例，反应混合物中包括抗凝血剂。在一些说明性实施例中，用具有抗凝血剂的收集容器(例如试管或袋子)收集血液，例如使用所属领域中已知的标准血液收集方案。可以用于本文中所提供的用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面中的抗凝血剂包括阻断或限制凝血酶凝血级联反应的化合物或生物制剂。抗凝血剂包括：金属螯合剂，优选钙离子螯合剂，如柠檬酸盐(例如含有游离柠檬酸根离子)，包括含有一种或多种如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸盐、腺嘌呤和单糖或多糖(例如右旋糖)、草酸盐和EDTA等组分的柠檬酸盐溶液；肝素和肝素类似物，如未被部分分离的肝素、低分子量肝素和其它合成糖；以及维生素K拮抗剂，如香豆素。例示性柠檬酸盐组合物包括：柠檬酸葡萄糖(ACD)(也称为抗凝血剂柠檬酸盐右旋糖溶液A和溶液B(《美国药典(United States Pharmacopeia)》26,2002,第158页))；和柠檬酸盐磷酸右旋糖(CPD)溶液，其也可以制备为CPD-A1，如所属领域中已知。因此，抗凝血剂组合物还可以包括磷酸根离子或磷酸二氢根离子、腺嘌呤和单糖或多糖。

如所属领域中已知，这类抗凝血剂可以按有效防止血液凝结的浓度(即，有效量)或按有效浓度的例如2倍、1.5倍、1.25倍、1.2倍、1.1倍或9/10、4/5、7/10、3/5、1/2、2/5、3/10、1/5或1/10的浓度存在于反应混合物中。已知许多不同的抗凝血剂的有效浓度且可以通过分析不同浓度的防止血液凝结的能力(其可以物理方式观察)来容易地凭经验确定。许多测量凝血的血凝度计是可商购的且可以使用各种传感器技术，例如QCM传感器(参见例如Yao等人,《使用石英晶体微天平耗散方法的凝血测试智能电话平台(Blood CoagulationTesting Smartphone Platform Using Quartz Crystal Microbalance DissipationMethod)》,《传感器(Sensors)》(Basel),2018年9月；18(9):3073)。有效浓度包括在意图用于试管或袋子的体积的血液中稀释抗凝血剂之后，任何可商购的抗凝血剂在可商购的试管或袋子中的浓度。举例来说，在本文中所提供的用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面的某些实施例中，反应混合物中的柠檬酸右旋糖(ACD)的浓度可以是可商购的ACD血液收集管或袋子中的ACD的浓度的0.1至5倍，或0.25至2.5倍、0.5至2倍、0.75至1.5倍、0.8至1.2倍、0.9至1.1倍、约1倍或1倍。举例来说，在标准过程中，可以按9份血液和1份抗凝血剂的比率将血液收集到含有3.2％(109mM)柠檬酸钠(109mM)的试管或袋子中。因此，在某些说明性实施例中，在通过向1份抗凝血剂与9份血液的此混合物中添加1-2份反转录病毒颗粒溶液而制备的反应混合物的情况下，柠檬酸盐浓度可以是例如0.25％至0.4％，或0.30％至0.35％。在说明性标准血液收集实施例中，血液袋中存在15ml ACD溶液A以用于收集100mL血液。在添加血液之前的ACD含有7.3g/L(0.73％)的柠檬酸(无水)、22.0g/L(2.2％)的柠檬酸钠(二水合物)和24.5g/L的右旋糖(单水合物)[USP](2.4％)。在向含有ACD的袋子中添加100mL血液后，添加例如5至20ml的体积的基因修饰的反转录病毒颗粒。因此，在一些实施例中，反应混合物中的ACD组分的浓度可以是0.05％至0.1％，或0.06％至0.08％柠檬酸(无水)；0.17％至0.27％，或0.20％至0.24％柠檬酸钠(二水合物)；0.2％至0.3％，或0.20％至0.28％，或0.22％至0.26％右旋糖(单水合物)。在某些实施例中，反应混合物中使用0.001至0.02M的浓度的柠檬酸钠。

在一些实施例中，肝素以例如可商购的肝素血液收集管中的肝素的浓度的0.1至5倍，或0.25至2.5倍、0.5至2倍、0.75至1.5倍、0.8至1.2倍、0.9至1.1倍、约1倍或1倍的浓度存在于反应混合物中。肝素是葡糖胺聚糖抗凝血剂，其分子量在5,000-30,000道尔顿范围内。在一些实施例中，肝素是以约1.5至45、5至30、10至20或15USP单位/毫升反应混合物的浓度使用。在一些实施例中，本文中的反应混合物中的EDTA，例如K

在一些实施例中，可以在从个体收集血液以用于离体转导之前向个体给予抗凝血剂，使得在收集时至少部分且至少在接触步骤和随后任选的培育期内抑制血液的凝结。在这类实施例中，举例来说，可以按80毫克/千克/天至5毫克/千克/天(毫克是指柠檬酸的毫克数且千克是用于所治疗的哺乳动物)来向个体给予柠檬酸右旋糖。可以按例如5单元/千克/小时至30单元/千克/小时的剂量递送肝素。

除抗凝血剂以外或代替抗凝血剂，本文中所提供的用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面可以包括至少一种选自以下组分中的一种或多种的其它组分：

a)红细胞，其中红细胞占反应混合物的体积的0.1至75％；

b)嗜中性粒细胞，其中嗜中性粒细胞占反应混合物中的白细胞的至少10％，或其中反应混合物包含至少10％的嗜中性粒细胞和相同量的T细胞；

c)嗜碱性粒细胞，其中嗜碱性粒细胞占反应混合物中的白细胞的至少0.05％；

d)嗜酸性粒细胞，其中反应混合物占反应混合物中的白细胞的至少0.1％；

e)血浆，其中血浆占反应混合物的体积的至少1％；和

f)血小板，其中血小板包含至少1×10

关于红细胞，在一些实施例中，红细胞可以占作为范围的低端的反应混合物的体积的0.1、0.5、1、5、10、25、35或40％至作为范围的高端的反应混合物的体积的25、50、60或75％。在说明性实施例中，红细胞占1至60％、10至60％、20至60％、30至60％、40至60％、40至50％、42至48％、44至46％、约45％或45％。

关于嗜中性粒细胞，在一些实施例中，嗜中性粒细胞可以占作为范围的低端的反应混合物中的白细胞的0.1、0.5、1、5、10、20、25、35或40％至作为范围的高端的反应混合物中的白细胞的25、50、60、70、75和80％，例如反应混合物中的白细胞的25％至70％，或30％至60％，或40％至60％。在一些实施例中，在本文中的反应混合物中，与T细胞和/或NK细胞相比，存在更多的嗜中性粒细胞。

关于嗜酸性粒细胞，在一些实施例中，嗜酸性粒细胞可以占作为范围的低端的反应混合物中的白细胞的0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8％至作为范围的高端的反应混合物中的白细胞的2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.5、4、5、6、8和10％。在说明性实施例中，嗜酸性粒细胞占反应混合物中的白细胞的0.05至10.0％、0.1至9％、0.2至8％、0.2至6％、0.5至4％、0.8至4％或1至4％。

关于嗜碱性粒细胞，在一些实施例中，嗜碱性粒细胞可以占作为范围的低端的反应混合物中的白细胞的0.05、0.1、0.2、0.4、0.45和0.5％至作为范围的高端的反应混合物中的白细胞的0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5和2.0％。在说明性实施例中，嗜碱性粒细胞占反应混合物中的白细胞的0.05至1.4％、0.1至1.4％、0.2至1.4％、0.3至1.4％、0.4至1.4％、0.5至1.4％、0.5至1.2％、0.5至1.1％或0.5至1.0％。

关于血浆，在一些实施例中，血浆可以占作为范围的低端的反应混合物的体积的0.1、0.5、1、5、10、25、35或45％至作为范围的高端的反应混合物的体积的25、50、60、70和80％。在说明性实施例中，血浆占反应混合物的0.1至80％、1至80％、5至80％、10至80％、30至80％、40至80％、45至70％、50至60％、52至58％、54至56％、约55％或55％。

关于血小板，在一些实施例中，血小板可以包含作为范围的低端的1×10

用于在存在血液或其组分的情况下基因修饰T细胞和/或NK细胞的说明性细胞处理方法

值得注意的是，本文中所提供的用于基因修饰的方法的一些实施例不包括从个体收集血液的步骤。然而，如图1中所示，本文中所提供的一些方法包括从个体收集血液的步骤(110)。可以通过所属领域中已知的任何合适的方法从个体收集或获得血液，如本文中更详细论述。举例来说，可以通过静脉穿刺或任何其它用于收集血液样品的血液收集方法来收集血液。在一些实施例中，所收集的血液的体积是25ml至250ml，例如25ml至60ml、50ml至90ml、75ml至125ml或90ml至120ml，或95至110ml。

与是否从个体收集血液无关，在本文中所提供的用于基因修饰淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的任何方法方面中，使淋巴细胞与复制缺陷型反转录病毒颗粒在反应混合物中接触。在说明性实施例中，此接触和用于进行接触的反应混合物是在封闭式细胞处理系统内进行，如本文中更详细论述。在涉及离体淋巴细胞基因修饰和/或转导的传统封闭式细胞处理方法中，尤其在用于自体细胞疗法的方法中，许多步骤在数天内进行，如PBMC富集、洗涤、细胞活化、转导、扩增、收集和任选的再引入。在最新的方法中(参见图1A)，已缩减此离体细胞处理涉及的一些步骤和时间(参见例如WO2019/055946)。这些最新的方法(以及本文中所提供的其它改善的细胞处理方法)还使用快速离体转导过程，例如不包括或包括最少量的预活化的过程(例如，在淋巴细胞(如T细胞和/或NK细胞)与反转录病毒颗粒接触之前，使淋巴细胞与活化剂接触小于30、15、10或5分钟)。在这类方法的某些实施例中，T细胞和/或NK细胞活化元件存在于进行接触步骤的反应混合物中。在说明性实施例中，T细胞和/或NK细胞活化元件与反应混合物中存在的反转录病毒颗粒的表面缔合。在说明性实施例中，这类方法用于护理点自体细胞疗法方法中。然而，这类最新的方法仍涉及PBMC富集步骤/程序(120)，其通常在封闭系统内耗费至少约1小时，接着进行细胞计数、转移和培养基添加，其又至少耗费约45分钟，接着使淋巴细胞与反转录病毒颗粒接触以形成转导反应混合物(130A)。在“病毒转导”步骤之后，通常进行如本文中详细论述的接触步骤和培育，通常从悬浮液中留存的反转录病毒颗粒洗去淋巴细胞(140A)，例如使用Sepax，且收集(150A)，其中最终产物通常在用于再输注的输注袋或用于储存的低温保存小瓶中(160A)。如本文中进一步详细论述，传统的PBMC富集程序通常涉及菲科尔(ficoll)密度梯度和离心(例如离心作用)或向心(例如Sepax)力或使用白细胞透入来富集PBMC。

如本文中所提供的实例中表明，意外发现淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)可以在含有抗凝血剂的全血的反应混合物中与复制缺陷型反转录病毒颗粒接触，且可以基因修饰和转导显著百分比的淋巴细胞。因此，发现通过重组反转录病毒颗粒进行的淋巴细胞的有效基因修饰可以在存在除PBMC以外的血液组分和血细胞的情况下进行。此外，基于上文刚刚关于通过反转录病毒颗粒进行的T细胞和任选的NK细胞的有效基因修饰所论述的出人意料的结果(即使在全血中进行接触时)，在说明性实施例中，本文中提供进一步简化的方法，其中通过直接向全血中添加复制缺陷型反转录病毒颗粒以形成反应混合物(130B)且使全血中的细胞与复制缺陷型反转录病毒颗粒接触达到某一接触时间且进行本文中所提供的任选的培育来基因修饰和/或转导淋巴细胞。因此，此说明性实施例中的这类进一步改善的方法不包括在全血中的淋巴细胞(通常含有抗凝血剂)与反转录病毒颗粒接触之前的淋巴细胞富集步骤。此进一步改善的方法，与本文中的其它细胞处理方法一样，通常在封闭式细胞处理系统内进行且在淋巴细胞与反转录病毒颗粒接触之前可以不包括或包括最少量的预活化。在这些进一步简化的方法中，可以在血液袋中使全血中的淋巴细胞直接与反转录病毒颗粒接触。在这类方法中的接触步骤(130B)之后，将与反转录病毒颗粒接触的淋巴细胞洗涤且使用PBMC富集程序(135B)浓缩，所述富集程序还减少嗜中性粒细胞以促进再引入个体中。因此，在这类实施例中，在全血中的细胞(通常包含抗凝血剂)与重组反转录病毒颗粒接触之前，不进行PBMC富集程序且不进行淋巴细胞富集过滤。然而，在图1B的实施例中，在进行接触和任选的培育(130B)之后，例如使用Sepax和菲科尔梯度进行这类PBMC富集方法(135B)。在PBMC富集之后，可以任选地从任何留存的反转录病毒颗粒进一步洗去淋巴细胞(140B)，例如使用Sepax，且收集(150B)，其中最终产物通常在用于再输注的输注袋或用于储存的低温保存小瓶中(160B)。

图2提供细胞处理白细胞耗减过滤总成(200)的非限制性说明性实例，其富集有核细胞，所述有核细胞可以用作图1的方法中的白细胞耗减过滤器。说明性白细胞耗减过滤总成(200)，其在说明性实施例中是单次使用式过滤总成，包含过滤器壳体(210)内的白细胞耗减培养基(例如过滤器集合)，其具有入口(225)和出口(226)，以及袋、阀门和/或通道/管的配置，其提供使用灌注和反灌注来浓缩、富集、洗涤和收集保留的白细胞或有核血细胞的能力(参见例如EP2602315A1，其以全文引用的方式并入本文中)。在说明性实施例中，白细胞耗减过滤总成(200)是可商购的HemaTrate过滤器(Cook Regenetec,Indianapolis,IN)。白细胞耗减过滤总成可以用于浓缩全部有核细胞(TNC)，包括粒细胞，其中在封闭式细胞处理系统中的PBMC富集程序中将所述细胞去除。因为EP2602315A1的包含白细胞耗减培养基的过滤器总成(如HemaTrate过滤器)和图2的说明性白细胞耗减过滤器总成不去除粒细胞，因为其在本文中不被视为PBMC富集总成或过滤器，且合并有其的方法在本文中不被视为PBMC富集程序或步骤。

图2的白细胞耗减过滤器总成(200)是单次使用式无菌总成，其包括各种管和阀门，通常是无针阀门，其实现从全血和包括白细胞的血细胞制剂分离白细胞以及快速洗涤和浓缩白细胞。在此说明性总成中，在反应混合物经历接触步骤和任选的培育之后，在入口导管(255)的第一总成(217)处将血液袋(215)连接至总成(200)，所述血液袋是例如含有约120ml转导/接触反应混合物的500ml PVC袋，所述反应混合物包含全血、抗凝血剂和反转录病毒颗粒，如本文中详细公开。当释放第一入口管(255)上的夹具时，淋巴细胞，包括一些T细胞和/或NK细胞以及相关反转录病毒颗粒，以及一些此时可被基因修饰的细胞，以及全血反应混合物中的其它血细胞和组分以及抗凝血剂借助于重力通过第一总成开口(217)进入入口管(255)。基因修饰的T细胞和/或NK细胞通过入口阀(247)和收集阀(245)，通过过滤器壳体入口(225)进入过滤器壳体(210)，以与过滤器壳体(210)内的白细胞耗减IV过滤器集合(例如SKU J1472A Jorgensen Labs)接触。过滤器保留包括白细胞的有核血细胞，但其它血液组分通过过滤器且离开过滤器壳体出口(226)，进入出口管(256)，接着通过出口阀(247)且在废弃物收集袋(216)中被收集，所述废弃物收集袋例如可以是2L PVC废弃物收集袋。

可以通过将入口阀(247)切换至洗涤位置来进行任选的缓冲液洗涤步骤。在此任选的洗涤步骤中，将缓冲液袋(219)，例如500ml生理盐水洗涤袋，连接至入口管(255)的第二总成开口(218)。当释放入口管(255)上的夹具时，缓冲液借助于重力通过第二总成开口(218)移动到入口管(255)中。缓冲液通过入口阀(247)和收集阀(245)，通过过滤器壳体入口(225)进入过滤器壳体(210)且通过过滤器壳体(210)内的白细胞耗减过滤器集合以冲洗留存在过滤器的淋巴细胞。缓冲液移出过滤器壳体出口(226)，进入出口管(256)，接着通过出口阀(247)且在废弃物收集袋(216)中被收集，所述废弃物收集袋可以与用于收集通过先前步骤中的过滤器的反应混合物组分的废弃物收集袋相同，或是在允许缓冲液进入第二总成开口(218)之前更换的用于代替第一废弃物收集袋的新的废弃物收集袋。可以任选地通过用额外的缓冲液重复以上过程来多次进行任选的洗涤步骤。

在血液袋(215)中的全部或基本上全部体积的反应混合物通过过滤器(210)且任选地进行任选的清洗步骤之后，起始反灌注过程以使液体在总成(200)中沿相反方向移动，以收集留存在过滤器壳体(210)内的过滤器集合上的淋巴细胞。本文中的白细胞耗减过滤器总成的说明性实施例适用于再灌注。在说明性总成(200)中起始反灌注过程之前，将出口阀(247)切换至再灌注位置且将收集阀(245)切换至收集位置。为了起始再灌注，使用注射器(266)通过注射来将注射器(266)中的缓冲液(例如PBS)传送到出口管(256)中，所述注射器可以是例如25ml注射器。接着，缓冲液通过过滤器壳体出口(226)进入过滤器壳体(210)且使留存在过滤器集合上的淋巴细胞通过过滤器壳体入口(225)离开过滤器壳体(210)并且进入入口管(255)。接着，在通过收集阀(245)之后，在细胞样品收集袋(265)中收集淋巴细胞，包括一些T细胞和/或NK细胞和相关反转录病毒颗粒，此时其中一些可被基因修饰和/或转导，所述细胞样品收集袋可以是例如25ml低温保存袋。

在一些方面中，本文中提供用于基因修饰NK细胞和/或在说明性实施例中，T细胞的试剂盒。试剂盒包括白细胞耗减过滤总成和本文中所公开的任何复制缺陷型反转录病毒载体实施例，其通常包含在试管或小瓶中。这类试剂盒中的白细胞耗减过滤总成通常包括白细胞耗减过滤器或白细胞耗减过滤器集合，其通常在过滤器壳体内，如由图2的说明性总成例示，以及被调适成用于单次使用式封闭式血液处理系统中的多个连接的无菌管和与所述无菌管连接的多个阀门。这类试剂盒任选地包括血液收集袋，在说明性实施例中包含抗凝血剂、血液处理缓冲液袋、血液处理废弃物收集袋、血液处理细胞样品收集袋和无菌注射器。在说明性实施例中，试剂盒包括如本文中详细公开的T细胞活化元件，例如抗CD3。这类活化元件可以在含有反转录病毒颗粒的试管或小瓶中的溶液中或在单独的试管或小瓶中提供。在说明性实施例中，活化元件是与复制缺陷型反转录病毒颗粒的表面缔合的抗CD3。在说明性实施例中，试剂盒中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含聚核苷酸，其包含一个或多个以可操作的方式连接到在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码根据本文中所提供的任何实施例的第一多肽，其包含嵌合抗原受体(CAR)和任选的淋巴增生性元件。

用于基因修饰淋巴细胞的方法的步骤和反应物

本文中所提供的任何方面中使用的任何方法(其通常是用于基因修饰淋巴细胞、PBMC且在说明性实施例中，NK细胞和/或在其它说明性实施例中，T细胞的方法)的一些实施例可以包括从个体收集血液的步骤。血液包括可以用于本文中所提供的方法和组合物中的血液组分，包括血细胞，如淋巴细胞(例如T细胞和NK细胞)。在某些说明性实施例中，个体是罹患癌症的人类个体(即，人类癌症个体)。值得注意的是，某些实施例不包括这类步骤。然而，在包括从个体收集血液的实施例中，可以通过所属领域中已知的如本文中更详细论述的任何合适的方法从个体收集或获得血液。举例来说，可以通过静脉穿刺或任何其它用于收集血液样品的血液收集方法来收集血液。在一些实施例中，所收集的血液的体积是50ml至250ml，例如75ml至125ml，或90ml至120ml，或95至110ml。在一些实施例中，所收集的血液的体积可以是作为范围的低端的25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、600、700、800或900ml至作为范围的高端的30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、600、700、800或900ml或1L。在一些实施例中，可以通过单采血液成分术来获得淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)。在一些实施例中，在单采血液成分术期间获取和处理的血液的体积可以是作为范围的低端的个体的总血液体积的0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.25或1.5倍至作为范围的高端的个体的总血液体积的0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25或2.5倍。人类的总血液体积通常在4.5至6L范围内且因此与收集血液且接着基因修饰和/或转导其中的淋巴细胞(如在本文中的说明性实施例中)相比，在单采血液成分术期间获取和处理的血液明显更多。

与是否从个体收集血液无关，在本文中所提供的用于基因修饰淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的任何方法方面中，使淋巴细胞与复制缺陷型反转录病毒颗粒在反应混合物中接触。本文中所提供的任何实施例中的接触可以在例如适用于处理血细胞的封闭系统的腔室中，例如在血液袋内进行，如本文中更详细论述。转导反应混合物可以包括一种或多种缓冲液、离子和培养基。关于本文中所提供的某些例示性反应混合物中的反转录病毒颗粒且在说明性实施例中，慢病毒颗粒，存在0.1至50、0.5至50、0.5至20、0.5至10、1至25、1至15、1至10、1至5、2至15、2至10、2至7、2至3、3至10、3至15或5至15感染倍率(MOI)；或至少1且小于6、11或51MOI；或在一些实施例中，5至10MOI单位的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在一些实施例中，MOI可以是至少0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、10或15。关于用于转导血液中的淋巴细胞的组合物和方法，在某些实施例中，可以使用比其中分离PBMC且用于反应混合物中的方法中更高的MOI。举例来说，用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法的说明性实施例，假设1×10

在说明性实施例中，此接触和用于进行接触的反应混合物是在封闭式细胞处理系统内进行，如本文中更详细论述。包装细胞且在说明性实施例中，包装细胞系，且在具体说明性实施例中，在本文中的某些方面中提供的包装细胞可以用于产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。反应混合物中的淋巴细胞可以是PBMC，或在提供用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法的本文中的各方面中，可以是抗凝血剂和/或其它血液组分，包括其它类型的非PBMC型血细胞，如本文中所论述。实际上，在用于转导全血中的淋巴细胞的这些组合物和方法方面的说明性实施例中，反应混合物可以基本上是全血且通常是抗凝血剂、反转录病毒颗粒和少量溶液，其中反转录病毒颗粒在所述溶液中递送至全血中。

在本文中所提供的一些反应混合物中，T细胞可以占例如作为范围的低端的反应混合物中的淋巴细胞的10、20、30或40％至作为范围的高端的反应混合物中的淋巴细胞的40、50、60、70、80或90％。在说明性实施例中，T细胞占淋巴细胞的10至90％、20至90％、30至90％、40至90％、40至80％、45％至75％。在这类实施例中，举例来说，NK细胞可以占作为范围的低端的反应混合物中的淋巴细胞的1、2、3、4或5％至作为范围的高端的反应混合物中的淋巴细胞的5、6、7、8、9、10、11、12、13或14％。在说明性实施例中，T细胞占反应混合物中的淋巴细胞的1至14％、2至14％、3至14％、4至14％、5至14％、5至13％、5至12％、5至11％或5至10％。

在关于本文中所提供的用于基因修饰全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面的反应混合物中，与涉及在形成反应混合物之前的PBMC富集程序的方法相比，淋巴细胞(包括NK细胞和T细胞)可以按较低的血细胞百分比和较低的白细胞百分比存在于反应混合物中。举例来说，在这些方面的一些实施例中，与NK细胞或甚至T细胞相比，反应混合物中存在更多的粒细胞或嗜中性粒细胞。在本文中的其它章节中详细提供关于用于基因修饰全血中的淋巴细胞的方面的反应混合物中存在的抗凝血剂和一种或多种其它血液组分的组合物的细节。

如本文中所公开，用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面通常不涉及在来自血液样品的淋巴细胞与本文中关于这些方面所公开的反应混合物中的反转录病毒颗粒接触之前的血液样品的PBMC富集步骤。然而，在一些实施例中，在细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，将嗜中性粒细胞/粒细胞与其它血细胞分离。在一些实施例中，在周边血液单核细胞(PBMC)(包括末梢血液淋巴细胞(PBL)，如T细胞和/或NK细胞)与反转录病毒颗粒组合成反应混合物之前，使用例如PBMC富集程序将周边血液单核细胞与血液样品中的其它组分分离。

PBMC富集程序是其中将PBMC从其它血细胞类型富集至少25倍且通常至少50倍的程序。举例来说，相信PBMC占全血中的血细胞的小于1％。在PBMC富集程序之后，PBMC洗脱份中分离的至少30％且在一些实例中，多达70％的细胞是PBMC。甚至有可能使用一些PBMC富集程序实现更高的PBMC富集。所属领域中已知各种不同的PBMC富集程序。举例来说，PBMC富集程序是菲科尔密度梯度离心过程，其在整个密度梯度介质中分离主要细胞群体，如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和红血球。在这类方法中，水性介质包括菲科尔，一种形成高密度溶液的亲水性多糖。全血在密度介质上方或下方分层(在不混合两个层的情况下)，接着进行离心将使细胞根据其密度分散且PBMC洗脱份在血浆与密度梯度介质之间的界面处形成薄的白色层(参见例如Panda和Ravindran(2013),《人类PBMC的分离(Isolation of HumanPBMCs)》,《生物协议(BioProtoc.)》,第3卷(3))。此外，使用Sepax细胞处理系统的旋转力，在菲科尔中可以使用向心力从其它血液组分分离PBMC。

在另一种PBMC富集方法中，使用自动白细胞去除收集系统(如SPECTRA

作为PBMC富集程序的其它非限制性实例，在本文中的转导或基因修饰方法的一些实施例中，使用Sepax或Sepax 2细胞处理系统(BioSafe)分离PBMC。在一些实施例中，使用CliniMACS Prodigy细胞处理器(Miltenyi Biotec)分离PBMC。在一些实施例中，使用自动单采血液成分术分离器，其从个体采集血液，使血液通过挑选出具体细胞类型(如PBMC)的装置，且使剩余部分返回至个体中。密度梯度离心可以在单采血液成分术之后进行。在一些实施例中，使用白细胞耗减过滤器总成分离PBMC。在一些实施例中，接着使用磁珠活化的细胞分选来根据细胞表型从PBMC纯化特异性细胞群体，如PBL或其子集(即，阳性选择)，接着将其用于本文中的反应混合物中。

也可以使用其它纯化方法，例如底物粘附，其利用模拟T细胞在募集期间遇到的环境的底物，以在将T细胞添加至反应混合物中之前纯化T细胞，或可以使用阴性选择，其中在形成用于接触步骤的反应混合物之前，靶向不合需要的细胞以用靶向待去除的不合需要的细胞的抗体复合物去除。在一些实施例中，在形成反应混合物之前，可以使用红血球花结法来去除红血球。在其它实施例中，可以在接触步骤之前去除造血干细胞且因此在这些实施例中，在接触步骤期间不存在造血干细胞。在本文中的一些实施例中，尤其对于用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法，在进行或不进行任选的培育或方法的任何步骤的情况下，在接触之前、在接触期间或在接触之前和在接触期间不存在ABC转运蛋白抑制剂和/或底物(即，不存在于用于进行接触的反应混合物中)。

在本文中所提供的任何方面的某些说明性实施例中，基因修饰和/或转导淋巴细胞是在不进行预先活化或刺激的情况下和/或在不需要预先活化或刺激的情况下进行，无论体内、体外或离体；和/或此外，在一些实施例中，在初始接触(进行或不进行任选的培育)之后，在不进行离体或体外活化或刺激的情况下或在初始接触(进行或不进行任选的培育)之后，在不需要离体或体外活化或刺激的情况下进行。因此，在说明性实施例中，当与反转录病毒颗粒组合以形成反应混合物时，一些、大部分、至少25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、至少95％、至少99％或全部淋巴细胞是静息的，且通常在与反应混合物中的反转录病毒颗粒接触时是静息的。在用于基因修饰血液或其组分中的淋巴细胞(如T细胞和/或NK细胞)的方法中，淋巴细胞可以其在即将收集之前体内存在于所收集的血液时的通常静息状态被接触。在一些实施例中，T细胞和/或NK细胞由95％至100％的静息细胞(Ki-67

T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒之间的接触可以有助于由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进行的T细胞和/或NK细胞的转导。不受理论约束，在接触期间，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒识别且结合于T细胞和/或NK细胞，此时反转录病毒和宿主细胞膜开始融合。接着，作为转导过程中的下一个步骤，来自复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的遗传物质进入T细胞和/或NK细胞，此时T细胞和/或NK细胞被“基因修饰”，如此短语在本文中所使用。值得注意的是，这类过程可以在接触开始之后进行数小时或甚至数天，并且甚至在冲洗掉未缔合的反转录病毒颗粒之后进行。接着，通常将遗传物质整合到T细胞和/或NK细胞的基因组DNA中，此时T细胞和/或NK细胞现被“转导”，如此术语在本文中所使用。因此，在说明性实施例中，本文中的任何用于基因修饰淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的方法是用于转导淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的方法。相信在开始接触之后的第6天(体内或离体)，绝大部分基因修饰的细胞已被转导。慢病毒转导方法是已知的。例示性方法描述于例如Wang等人(2012)《免疫治疗杂志(J.Immunother.)》,35(9):689-701；Cooper等人(2003)《血液(Blood)》,101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》506:97-114；和Cavalieri等人(2003)《血液》,102(2):497-505中。在整个本公开中，转导的T细胞和/或NK细胞包括离体转导的细胞的后代，其保留至少一些在离体转导期间并入细胞基因组中的核酸或聚核苷酸。在引用“再引入”被转导的细胞的本文中的方法中，应理解，这类细胞在其自个体的血液收集时通常并不处于被转导的状态。

本文提供的方法中的许多方法包括T细胞和/或NK细胞的基因修饰和转导。所属领域中已知用于离体用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(如复制缺陷型重组慢病毒颗粒)基因修饰和转导T细胞和/或NK细胞的方法。在说明性实施例中，本文中提供的方法不需要离体刺激或活化。因此，在本发明的方法中可以避免先前方法中的此常规步骤，但在接触和随后任选的培育期间可能存在离体刺激性分子(如抗CD3和/或抗CD28珠粒)。然而，在本文提供的说明性方法的情况下，不需要离体刺激。

在本文中的任何方面的某些说明性实施例中，血细胞，如淋巴细胞且尤其T细胞和/或NK细胞是在接触或随后任选的培育期间活化，且在接触之前完全不活化或活化不超过15分钟、30分钟、1、2、4或8小时。在某些说明性实施例中，基因修饰淋巴细胞不需要通过不存在于反转录病毒颗粒表面上的元件进行的活化。因此，在接触之前、期间或之后，除了在反转录病毒颗粒上以外，不需要这类活化或刺激元件。因此，如本文中更详细地论述，不需要预先活化或刺激的这些说明性实施例提供快速进行旨在更好地理解T细胞及其中的生物机制的体外实验的能力。此外，这类方法提供对使用PBMC、淋巴细胞、T细胞或NK细胞所生产的生物产品的更有效的商业生产及这类商业生产方法的发展。最终，这类方法提供用于过继性细胞疗法的淋巴细胞(例如NK细胞且尤其T细胞)的更快速的离体处理，从根本上简化这类疗法的递送，例如通过提供护理点方法。

尽管在说明性实施例中，在本文中的方法中，T细胞和/或NK细胞在与重组反转录病毒接触之前不被活化，但在说明性实施例中，在进行重组反转录病毒和淋巴细胞的初始接触的反应混合物中存在T细胞活化元件。举例来说，这类T细胞活化元件可以在反应混合物中的溶液中。举例来说，在接触和随后任选的培育期间，可溶性抗CD3抗体可以按25-200、50-150、75-125或100ng/ml存在于反应混合物中。在说明性实施例中，T细胞活化元件与反转录病毒表面缔合。T细胞活化元件可以是本文中所提供的任何T细胞活化元件。在说明性实施例中，T细胞活化元件可以是抗CD3，如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。因此，在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以进一步包括T细胞活化元件，其在其它说明性实例中与反转录病毒的表面的外侧缔合。

本文中所提供的转导方法和/或用于基因修饰全血中的淋巴细胞的方法的接触步骤通常包括初始步骤，其中使反转录病毒颗粒(通常是反转录病毒颗粒群体)与血细胞(通常是血细胞群体，其包括在PBMC富集程序之后不存在的抗凝血剂和/或除PBMC以外的其它血液组分)在液体缓冲液和/或培养基中的悬浮液中接触，以形成转导反应混合物。如在本文中所提供的其它方面中，在此接触之后可以在此反应混合物中进行任选的培育期，所述反应混合物包括悬浮液中的反转录病毒颗粒和包含淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的血细胞。在用于基因修饰血液或其组分中的T细胞和/或NK细胞的方法中，反应混合物可以包括至少一种、两种、三种、四种、五种或所有如本文中所公开的其它血液组分且在说明性实施例中，包括一种或多种抗凝血剂。

在反转录病毒颗粒和淋巴细胞的初始接触之后，本文中所提供的任何方面中的转导反应混合物可以在23至39℃下且在一些说明性实施例中，在37℃下培育。在某些实施例中，转导反应可以在37-39℃下进行以实现更快的融合/转导。当在转导反应混合物中接触时，细胞和反转录病毒颗粒可以被立即处理以从细胞去除在悬浮液中保持游离且不与细胞缔合的反转录病毒颗粒。任选地，将无论在悬浮液中游离或在悬浮液中与细胞缔合的悬浮液中的细胞和反转录病毒颗粒培育不同时间长度，如本文中所提供以用于本文中所提供的方法中的接触步骤中。在其它步骤之前，可以进行洗涤，无论这类细胞将在体外、离体研究或引入个体中。

本文中公开用于基因修饰淋巴细胞，尤其NK细胞且在说明性实施例中，T细胞的说明性方法，其与先前方法相比明显更快且更简单。因此，在一些实施例中，本文中所提供的任何用于转导和/或基因修饰PBMC或淋巴细胞，通常T细胞和/或NK细胞的方法中的接触步骤可以进行(或可以发生)本说明书中提供的任何时间段，包括(但不限于)例示性实施例章节中提供的时间段。举例来说，所述接触可以进行小于24小时，例如小于12小时、小于8小时、小于4小时、小于2小时、小于1小时、小于30分钟或小于15分钟，但在每种情况下，至少存在初始接触步骤，其中使反转录病毒颗粒和细胞在转导反应混合物中的悬浮液中接触，接着将留存于悬浮液中的未与细胞缔合的反转录病毒颗粒与细胞分离且通常丢弃，如本文中进一步详细论述。应注意但不希望受理论约束，相信接触是在反转录病毒颗粒与淋巴细胞组合到一起时开始，通常通过将含有反转录病毒颗粒的溶液添加到含有淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的溶液中。

在这类初始接触之后，在一些实施例中，在悬浮液中培育含有细胞和反转录病毒颗粒的反应混合物指定时间段而不去除在溶液中保持游离且未与细胞缔合的反转录病毒颗粒。此培育在本文中有时被称为任选的培育。因此，在说明性实施例中，所述接触(包括初始接触和任选的培育)可以进行(或可以发生)(其中如本文中一般指示，所选择的范围的低端小于所选择的范围的高端)作为范围的低端的30秒或1、2、5、10、15、30或45分钟，或1、2、3、4、5、6、7或8小时至作为范围的高端的10分钟、15分钟、30分钟，或1、2、4、6、8、10、12、18、24、36、48和72小时。在某些说明性实施例中，接触步骤可以进行作为范围的低端的30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟或30分钟至作为范围的高端的1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时或12小时。在一些实施例中，接触步骤进行作为范围的低端的30秒、1分钟和5分钟至作为范围的高端的10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时或8小时。因此，在一些实施例中，在通过向淋巴细胞中添加反转录病毒颗粒以形成反应混合物之后，可以将反应混合物培育5分钟至12小时、5分钟至10小时、5分钟至8小时、5分钟至6小时、5分钟至4小时、5分钟至2小时、5分钟至1小时、5分钟至30分钟或5分钟至15分钟。在其它实施例中，可以将反应混合物培育15分钟至12小时、15分钟至10小时、15分钟至8小时、15分钟至6小时、15分钟至4小时、15分钟至2小时、15分钟至1小时、15分钟至45分钟或15分钟至30分钟。在其它实施例中，可以将反应混合物培育30分钟至12小时、30分钟至10小时、30分钟至8小时、30分钟至6小时、30分钟至4小时、30分钟至2小时、30分钟至1小时、30分钟至45分钟。在其它实施例中，可以将反应混合物培育1小时至12小时、1小时至8小时、1小时至4小时或1小时至2小时。在另一说明性实施例中，接触是在仅进行初始接触步骤(不在包括在悬浮液中游离的反转录病毒颗粒和悬浮液中的细胞的反应混合物中进行任何进一步培育)而不在反应混合物中进行任何进一步培育，或在反应混合物中进行5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或1小时培育之间的范围内进行。

在用于初始接触和可以是接触步骤的一部分的任选的培育的所指示的时间段之后，将反应混合物中的血细胞或其含有T细胞和/或NK细胞的洗脱份与未与这类细胞缔合的反转录病毒颗粒分离。举例来说，这可以使用PBMC富集程序(例如Sepax单元中的Ficoll梯度)来进行，或在本文中所提供的某些说明性实施例中，通过用白细胞耗减过滤器集合总成过滤反应混合物且接着收集白细胞(其包括T细胞和NK细胞)来进行。在另一实施例中，这可以通过在小于500g，例如400g，或300至490g，或350至450g的相对离心力下离心反应混合物来进行。这类用于从细胞分离反转录病毒颗粒的离心可以进行例如5分钟至15分钟，或5分钟至10分钟。在使用离心力从未与细胞缔合的反转录病毒颗粒分离细胞的说明性实施例中，这类g力通常低于在离心接种程序中成功使用的g力。

在一些说明性实施例中，本文中所提供的方法在任何方面中都不涉及进行离心接种。在一些实施例中，包括离心接种作为接触步骤的一部分。在说明性实施例中，当进行离心接种时，不存在其它培育作为接触的一部分，因为离心接种的时间提供上文所论述的任选的培育的培育时间。在其它实施例中，在离心接种之后进行持续15分钟至4小时，或15分钟至2小时，或15分钟至1小时的额外培育。离心接种可以进行例如30分钟至120分钟，通常至少60分钟，例如60分钟至180分钟，或60分钟至90分钟。离心接种通常在离心机中在至少800g且更通常至少1,200g，例如800g至2400g，或800g至1800g，或1200g至2400g，或1200g至1800g的相对离心力下进行。在离心接种之后，这类方法通常涉及将粒化细胞和反转录病毒颗粒再悬浮且接着根据未进行离心接种时上文所论述的步骤去除未与细胞缔合的反转录病毒颗粒的额外步骤。

在包括离心接种的实施例中，包括任选的培育的接触步骤和离心接种可以在4℃至42℃，或20℃至37℃下进行。在某些说明性实施例中，不进行离心接种且接触和相关任选的培育是在20-25℃下进行4小时或更短、2小时或更短、1小时或更短、30分钟或更短、15分钟或更短，或15分钟至2小时、15分钟至1小时，或15分钟至30分钟。

在本文中所公开的方法和组合物的一些实施例中，5％至85％的从血液收集的全部淋巴细胞被基因修饰。在一些实施例中，被基因修饰和/或转导的淋巴细胞的百分比是作为范围的低端的1、5和10％至作为范围的高端的15、20、25、30、40、50、60、70、80和85％。在一些实施例中，被基因修饰和/或转导的T细胞和NK细胞的百分比是至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。如本文中的实例中所说明，在本文中所提供的用于转导全血中的淋巴细胞的例示性方法中，1％至20％，或1％至15％，或5％至15％，或7％至12％或约10％的淋巴细胞被基因修饰和/或转导。

根据本文中的任何方法提供的基因修饰淋巴细胞的方法通常包括将包含编码CAR或淋巴增生性元件或在说明性实施例中，编码根据本文中所提供的CAR及淋巴增生性元件实施例中的任一个的CAR及淋巴增生性元件两者的一个或多个转录单元的聚核苷酸插入细胞中。可以提供这类CAR和淋巴增生性元件以支持本文中所提供的更短和更简化的方法，其可以支持在接触和任选的培育之后，基因修饰和/或转导的T细胞和/或NK细胞的扩增。因此，在本文中所提供的任何方法的例示性实施例中，可以从被基因修饰和/或转导的T细胞和/或NK细胞的内部的反转录病毒颗粒的基因组递送淋巴增生性元件，使得这些细胞具有本文中的淋巴增生性元件章节中所公开的增加的增殖和/或存活率的特征。在本文中所提供的任何方法的例示性实施例中，被基因修饰的T细胞或NK细胞能够在小鼠中体内移植和/或在小鼠中体内富集至少7、14或28天。所属领域的技术人员将认识到，这类小鼠可以被处理或以其它方式被基因修饰，使得在被基因修饰的T细胞和/或NK细胞之间的任何免疫学差异不会引起小鼠针对通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导的淋巴细胞的任何组分所引发的免疫反应。

接触步骤中(例如当细胞和反转录病毒颗粒最初接触时)或本文中所提供的任何方面中(在任选的随后与反应混合物一起培育期间，所述反应混合物包括培养基中的悬浮液中的反转录病毒颗粒和细胞)可以包括的培养基或可以在细胞培养期间和/或在本文中所提供的任何方面中的各种洗涤步骤期间使用的培养基可以包括碱培养基，如用于离体T细胞和/或NK细胞培养的可商购的培养基。这类培养基的非限制性实例包括X-VIVO

在本文中的任何包括基因修饰淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的步骤的方法的一些实施例中，可以在不进行预先活化的情况下使细胞与反转录病毒颗粒接触。在本文中的任何包括基因修饰T细胞和/或NK细胞的步骤的方法的一些实施例中，在一个实施例中，在转导之前，T细胞和/或NK细胞未在粘附到单核细胞的底物上培育超过4小时，或在另一实施例中，超过6小时或在另一实施例中，超过8小时。在一个说明性实施例中，在转导之前，在粘附性底物上培育T细胞和/或NK细胞过夜以去除单核细胞。在另一实施例中，所述方法可以包括在转导之前，在结合单核细胞的粘附性底物上培育T细胞和/或NK细胞不超过30分钟、1小时或2小时。在另一实施例中，在所述转导步骤之前，T细胞和/或NK细胞不暴露于通过在粘附性底物上培育来去除单核细胞的步骤。在另一实施例中，在接触步骤和/或基因修饰和/或转导步骤之前或期间，T细胞和/或NK细胞未与牛血清(如细胞培养牛血清，例如胎牛血清)一起培育或未暴露于牛血清。

本文中所提供的用于基因修饰的方法中的一些或全部步骤或这类方法的用途是在封闭系统中进行。因此，这类方法中形成的反应混合物以及通过这类方法制备的被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)可以包含在这类封闭系统内。封闭系统是一种细胞处理系统，其通常对系统的用于处理和/或运输细胞的管和腔室外部的环境(如房间内的环境或甚至防护罩内的环境)封闭或完全封闭。对于细胞处理程序中的安全性和调控的一个最大风险是由于频繁暴露于环境而引起的污染风险，如在传统的开放式细胞培养系统中所发现。为了缓和此风险，尤其在不存在抗生素的情况下，已研发出致力于使用一次性(单次使用式)设备的一些商业方法。然而，即使在无菌条件下使用，打开烧瓶以取样或添加其它生长培养基始终存在污染风险。为了解决此问题，通常在封闭系统内进行本文中所提供的方法，其通常是离体方法。设计且可以操作这类方法使得产物不暴露于外部环境。通过无菌连接件(如无菌管和无菌焊接连接件)进行材料转移。用于气体交换的空气可以通过气体可渗透膜，通过0.2μm过滤器出现，以防止环境暴露。在一些说明性实施例中，对T细胞进行所述方法，例如以提供被基因修饰的T细胞。

此类封闭系统方法可以使用可商购的器件来进行。可以在方法中的不同步骤中使用不同的封闭系统器件且可以使用管和连接件(如焊接、鲁尔(luer)、长钉或克拉维(clave)端口)在这些器件之间转移细胞以防止细胞或培养基暴露于环境。举例来说，可以将血液收集到IV袋或注射器中，任选地包括抗凝血剂，且转移到Sepax 2器件(Biosafe)中以用于PBMC富集和分离。在其它实施例中，可以使用白细胞耗减过滤器总成来过滤全血以收集白细胞。可以将被分离的PBMC或被分离的白细胞转移到G-Rex器件的腔室中以进行任选的活化、转导和任选的扩增。或者，可以在血液袋，例如用于收集血液的袋中转导所收集的血液。最终，可以使用Sepax 2器件将细胞采集和收集到另一个袋子中。所述方法可以在任何适用于封闭系统T细胞和/或NK细胞产生的器件或器件组合中进行。这类器件的非限制性实例包括G-Rex器件(Wilson Wolf)、GatheRex(Wilson Wolf)、Sepax 2(Biosafe)、WAVE生物反应器(General Electric)、CultiLife细胞培养袋(Takara)、PermaLife袋(OriGen)、CliniMACS Prodigy(Miltenyi Biotec)和VueLife袋(Saint-Gobain)。在说明性实施例中，任选的活化、转导和任选的扩增可以在封闭系统中的同一个腔室或容器中进行。举例来说，在说明性实施例中，腔室可以是G-Rex器件的腔室且PBMC或白细胞可以在富集和分离之后转移到G-Rex器件的腔室中，且可以保留在G-Rex器件的同一个腔室中直到采集。

本文中所提供的方法可以包括在血液和其中的细胞和/或其洗脱份以及淋巴细胞与反转录病毒颗粒接触之前或之后，在封闭系统内的容器之间转移血液和其中的细胞和/或其洗脱份以及淋巴细胞，因此其未发生环境暴露。封闭系统中使用的容器可以是例如管、袋子、注射器或其它容器。在一些实施例中，容器是用于研究设施的容器。在一些实施例中，容器是用于商业生产的容器。在其它实施例中，容器可以是用于血液收集过程的收集容器。本文中用于基因修饰的方法通常涉及其中淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的接触步骤。在一些实施例中，接触可以在容器中(例如，在血液袋内)进行。可以在封闭系统内将血液和其各种含有淋巴细胞的洗脱份从一个容器转移到另一个容器(例如从第一容器转移到第二容器)以进行接触。第二容器可以是封闭器件(如G-Rex器件)的细胞处理室。在一些实施例中，在接触之后，可以将被基因修饰(例如，转导)的细胞转移到封闭系统内的不同容器中(即，不暴露于环境)。在此转移之前或之后，通常在封闭系统内洗涤细胞以去除基本上所有或所有反转录病毒颗粒。在一些实施例中，本文中所公开的方法(从收集血液到接触(例如转导)、任选的培育和培育后分离和任选的洗涤)进行作为范围的低端的15分钟、30分钟或1、2、3或4小时至作为范围的高端的4、8、10或12小时。

不受理论约束，在非限制性说明性方法中，将编码淋巴增生性元件的聚核苷酸(其可以整合至T细胞和/或NK细胞的基因组中)离体递送至静息T细胞和/或NK细胞提供了具有用于体内扩增的驱动子的细胞而无需使宿主经历淋巴细胞耗减。因此，在说明性实施例中，个体在进行接触的1、2、3、4、5、6、7、10、14、21或28天内或1个月、2个月、3个月或6个月内、在接触期间和/或在将被修饰的T细胞和/或NK细胞再引回至个体后的1、2、3、4、5、6、7、10、14、21或28天内或1个月、2个月、3个月或6个月内不暴露于淋巴细胞耗减剂。此外，在非限制性说明性实施例中，可以进行本文中所提供的方法而不在其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与个体的静息T细胞和/或静息NK细胞接触的步骤期间和/或在整个离体方法期间使个体暴露于淋巴细胞耗减剂。因此，体内扩增个体中的被基因修饰的T细胞和/或NK细胞的方法是本公开的一些实施例的特征。在说明性实施例中，这类方法是离体无传播的或基本上无传播的。

本文中所提供的任何方面的非限制性说明性实施例中的此整个方法/过程(从个体抽血到在离体转导T细胞和/或NK细胞之后将血液再引回到个体中)可以进行小于48小时、小于36小时、小于24小时、小于12小时、小于11小时、小于10小时、小于9小时、小于8小时、小于7小时、小于6小时、小于5小时、小于4小时、小于3小时、2小时或小于2小时的时间段。在其它实施例中，本文中的非限制性说明性实施例中的整个方法/过程(从个体抽血/收集血液到在离体转导T细胞和/或NK细胞之后将血液再引回到个体中)进行1小时至12小时，或2小时至8小时，或1小时至3小时，或2小时至4小时，或2小时至6小时，或4小时至12小时，或4小时至24小时，或8小时至24小时，或8小时至36小时，或8小时至48小时，或12小时至24小时，或12小时至36小时，或12小时至48小时的时间段，或进行作为范围的低端的15、30、60、90、120、180和240分钟至作为范围的高端的120、180和240、300、360、420和480分钟的时间段。在其它实施例中，整个方法/过程(从个体抽血/收集血液到在离体转导T细胞和/或NK细胞之后将血液再引回到个体中)进行作为范围的低端的1、2、3、4、6、8、10和12小时至作为范围的高端的8、9、10、11、12、18、24、36或48小时的时间段。在一些实施例中，被基因修饰的T细胞和/或NK细胞是在进行接触的时间段后从复制缺陷型重组反转录病毒颗粒分离。

因为本文中所提供的用于基因修饰淋巴细胞的方法和用于进行过继性细胞疗法的相关方法与先前方法相比可以在显著更短的时间内进行，因此有可能从根本上改善患者护理和安全性以及产品可制造性。因此，在负责批准在体内进行用于治疗性目的时的这类方法的管理机构看来，这类方法预期是有利的。举例来说，在将被修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至患者中之前，在本文中所提供的任何包括个体的方面的非限制性实例中的个体可以在整个样品处理期间保持在与处理其血液或样品的仪器相同的建筑(例如输注诊所)或房间中。在非限制性说明性实施例中，在从个体进行血液抽取/收集到在离体转导T细胞和/或NK细胞之后将血液再引入至个体的整个方法/过程中，个体保持在位置线内和/或距其正被处理的血液或细胞的100、50、25或12英尺或臂的距离内。在其它非限制性说明性实施例中，在从个体进行血液抽取/收集到在离体转导T细胞和/或NK细胞之后将血液再引入至个体的整个方法/过程中和/或连续地，个体保持清醒和/或至少一个人可以持续监测个体的正被处理的血液或细胞。因为本文中所提供的改善，用于过继性细胞疗法和/或转导静息T细胞和/或NK细胞的从个体进行血液抽取/收集到在离体转导T细胞和/或NK细胞之后将血液再引入至个体的整个方法/过程可以与人类的连续监测一起进行。在其它非限制性说明性实施例中，在从个体进行血液抽取/收集到在离体转导T细胞和/或NK细胞之后将血液再引入至个体的整个方法/过程的任何点处，都不会在无人存在的房间中培育血细胞。在其它非限制性说明性实施例中，从个体进行血液抽取/收集到在离体转导T细胞和/或NK细胞之后将血液再引入至个体的整个方法/过程是紧挨着个体和/或与个体在相同的房间中和/或紧挨着个体的床或椅子上进行。因此，可以避免样品一致性混乱，以及避免超过数天或数周的长且昂贵的培育。本文中所提供的方法容易地适用于封闭和自动化血液处理系统的事实进一步证实此优点，其中将再引入至个体中的血液样品和其组分仅与一次性、单次使用式组分进行接触。

本文中所提供的用于基因修饰和/或转导淋巴细胞(如T细胞和/或NK细胞)的方法可以是用于进行过继性细胞疗法的方法的一部分。通常，用于进行过继性细胞疗法的方法包括从个体收集血液和将被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)返回个体的步骤。本公开提供使用CAR的各种治疗方法。当存在于T淋巴细胞或NK细胞中时，本公开的CAR可以介导针对目标细胞的细胞毒性。本公开的CAR结合于存在于目标细胞上的抗原，由此通过被基因修饰以产生CAR的T淋巴细胞或NK细胞介导目标细胞的杀伤。CAR的ASTR结合于存在于目标细胞的表面上的抗原。本公开提供用于杀伤目标细胞或抑制目标细胞生长的方法，所述方法涉及接触被基因修饰以产生个体CAR的细胞毒性免疫效应细胞(例如细胞毒性T细胞或NK细胞)，使得T淋巴细胞或NK细胞识别存在于目标细胞的表面上的抗原且介导目标细胞的杀伤。举例来说，目标细胞可以是癌细胞且在一些说明性实施例中，本文中的自体细胞疗法方法可以是用于治疗癌症的方法。在这些实施例中，个体可以是怀疑患有癌症的动物或人类，或更典型地，已知患有癌症的个体。

在本文中所提供的任何用于基因修饰淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的方法和涉及使用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒制造用于基因修饰个体的T细胞和/或NK细胞的试剂盒的方面的一些实施例中，将被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)或其群体引入或再引入个体中。可以通过所属领域中已知的任何途径将被基因修饰的淋巴细胞引入或再引入个体中。举例来说，引入或再引入可以是通过输注到个体的血管中来递送。在一些实施例中，被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或其群体在被引入或再引入个体中之前离体经历4次或更少的细胞分裂。在一些实施例中，这类方法中使用的淋巴细胞是静息T细胞和/或静息NK细胞，其与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触1小时至12小时。在一些实施例中，从个体收集血液的时间与将被基因修饰的T细胞和/或NK细胞再引入个体中的时间之间相距不超过12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时或1小时。在一些实施例中，在收集血液之后及再引入血液之前的所有步骤都是在封闭系统中进行，其中在整个处理期间人工监测封闭系统。

在本文中所公开的方法和组合物的一些实施例中，将被基因修饰的T细胞和/或NK细胞引回、再引入或再输注或以其它方式递送至个体中而不进行其它离体操作，如刺激和/或活化T细胞和/或NK。在先前技术方法中，离体操作用于刺激/活化T细胞和/或NK细胞，且用于在将被基因修饰的T细胞和/或NK细胞引入个体中之前扩增被基因修饰的T细胞和/或NK细胞。在先前技术方法中，此通常花费数天或数周，且需要个体在初始抽血之后返回诊所以进行数天或数周的血液输注。在本文中所公开的方法和组合物的一些实施例中，在T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，T细胞和/或NK细胞并不通过暴露于抗CD3/抗CD28固体载体(如，涂有抗CD3/抗CD28的珠粒)而被离体刺激。因此，本文中提供一种离体无传播方法。在其它实施例中，被基因修饰的T细胞和/或NK细胞并不离体扩增，或仅扩增较小数目的细胞分裂(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10轮细胞分裂)，而相反是体内(即在个体内)扩增或主要在体内扩增。在一些实施例中，不添加额外的培养基以允许细胞的进一步扩增。在一些实施例中，在原代血液淋巴细胞(PBL)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触时，不发生PBL的细胞制造。在说明性实施例中，当PBL离体时不发生PBL的细胞制造。在传统的过继性细胞疗法的方法中，个体在再输注被基因修饰的T细胞和/或NK细胞之前经历淋巴细胞耗减。在一些实施例中，患者或个体在抽取血液之前未经历淋巴细胞耗减。在一些实施例中，患者或个体在再输注被基因修饰的T细胞和/或NK细胞之前未经历淋巴细胞耗减。然而，本文中所公开的方法和组合物的实施例也可以用于被预活化或被预刺激的T细胞和/或NK细胞。在一些实施例中，可以通过在使T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前暴露于抗CD3/抗CD28固体载体来离体刺激T细胞和/或NK细胞。在一些实施例中，在T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，可以使T细胞和/或NK细胞暴露于抗CD3/抗CD28固体载体小于1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、或24小时，包括不暴露。在说明性实施例中，在T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，可以使T细胞和/或NK细胞暴露于抗CD3/抗CD28固体载体小于1、2、3、4、6或8小时。

在一些说明性实施例中，通过输注到静脉或动脉中来将细胞引入或再引入个体中。本文中所公开的任何实施例中，待再输注到个体中的T细胞和/或NK细胞的数目可以是作为范围的低端的1×10

经工程改造的信号传导多肽

在一些实施例中，用于接触T细胞和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒具有聚核苷酸或核酸，其具有一个或多个编码一种或多种经工程改造的信号传导多肽的转录单元。在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽包括胞外域(例如，抗原特异性靶向区或ASTR)、柄和跨膜域的任何组合，与一个或多个胞内活化域、任选的一个或多个调节域(如共刺激域)和任选的一个或多个T细胞存活模体组合。在说明性实施例中，经工程改造的信号传导多肽中的至少一个、两个或全部是嵌合抗原受体(CAR)或淋巴增生性元件(LE)，如嵌合淋巴增生性元件(CLE)。在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽中的至少一个、两个或全部是重组T细胞受体(TCR)。在一些实施例中，当利用两个信号传导多肽时，一个编码淋巴增生性元件且另一个编码包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域和胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)。关于本文中所公开的经工程改造的信号传导多肽的任何域，例示性序列可见于WO 2019/055946中，其以全文引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应认识到，这类经工程改造的多肽也可以称为重组多肽。本文中所提供的经工程改造的信号传导多肽(如CAR、重组TCR、LE和CLE)通常相对于使用本文中所提供的方法和组合物工程改造的淋巴细胞，尤其T细胞和NK细胞且最尤其T细胞和/或NK细胞来说是转基因，以表达这类信号传导多肽。

在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽包括胞外域，其为特异性结合对的成员。举例来说，在一些实施例中，胞外域可以是细胞因子受体或其突变体或激素受体或其突变体的胞外域。这类突变型胞外域在一些实施例中经报导在至少一些细胞类型中表达时为组成性活性的。在说明性实施例中，这类胞外域及跨膜域不包括配位体结合区。相信，这类域在存在于经工程改造的信号传导多肽中且表达于B细胞、T细胞和/或NK细胞中时不结合配位体。这类受体突变体中的突变可发生于胞外近膜区中。不受理论约束，本文提供的经工程改造的信号传导多肽的至少一些胞外域(及一些胞外-跨膜域)中的突变通过使通常不在一起的活化链集合在一起而在不存在配位体的情况下负责经工程改造的信号传导多肽的信号传导。关于包含胞外域中的突变的胞外域的另外的实施例可发现于例如本文中的淋巴增生性元件章节中。

在某些说明性实施例中，胞外域包含二聚模体。在说明性实施例中，二聚模体包含亮氨酸拉链。在一些实施例中，亮氨酸拉链是来自jun多肽，例如c-jun。关于包含二聚模体的胞外域的其它实施例可发现于例如本文中的淋巴增生性元件章节中。

在某些实施例中，胞外域为抗原特异性靶向区(ASTR)，有时在本文中称为抗原结合域。特异性结合对包括(但不限于)抗原-抗体结合对；配位体-受体结合对；等。因此，适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的特异性结合对的成员包括ASTR，所述ASTR为抗体、抗原、配位体、配位体的受体结合域、受体、受体的配位体结合域，以及亲和抗体。

适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的ASTR可为任何抗原结合多肽。在某些实施例中，ASTR为抗体，如全长抗体、单链抗体、Fab片段、Fab'片段、(Fab')2片段、Fv片段，以及二价单链抗体或双功能抗体。

在一些实施例中，ASTR为单链Fv(scFv)。在一些实施例中，重链位于经工程改造的信号传导多肽中的轻链的N端。在其它实施例中，轻链位于经工程改造的信号传导多肽中的重链的N端。在任何所公开的实施例中，重链及轻链可由连接子隔开，如本文中更详细论述。在任何所公开的实施例中，重链或轻链可在经工程改造的信号传导多肽的N端且通常为另一域(如信号序列或信号肽)的C端。

其它基于抗体的识别域(cAb VHH(骆驼抗体可变域)及人类化版本，IgNAR VH(鲨鱼抗体可变域)及人类化版本，sdAb VH(单一域抗体可变域)及“骆驼化”抗体可变域)适宜与经工程改造的信号传导多肽一起使用且适用于使用本公开的经工程改造的信号传导多肽的方法中。在一些情况下，基于T细胞受体(TCR)识别域。

本文中的任何包括CAR的方面或实施例的某些实施例包括具有经工程改造以共同选择内源性TCR信号传导复合物和CD3Z信号传导路径的胞外域的CAR。在一个实施例中，嵌合抗原受体ASTR与一个内源性TCR复合物链(例如TCRα、CD3E等)融合以促进并入TCR复合物中和通过内源性CD3Z链进行信号传导。在其它实施例中，CAR含有结合于TCR复合物的第一scFv或蛋白质和结合于目标抗原(例如肿瘤抗原)的第二scFv或蛋白质。在另一实施例中，TCR可以是单链TCR(scTv，含有VαVβ的单链双域TCR)。最终，还可以产生scFv以识别特异性MHC/肽复合物，由此充当替代性TCR。这类肽/MHC scFv结合物可以按与CAR类似的许多构型使用。

在一些实施例中，ASTR可为多特异性的，例如双特异性抗体。多特异性抗体具有针对至少两个不同位点的结合特异性。在某些实施例中，结合特异性中的一种是针对一种目标抗原且另一种是针对另一种目标抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可结合至目标抗原的两个不同的抗原决定基。双特异性抗体也可以用于将细胞毒剂定位至表达目标抗原的细胞中。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。

适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的ASTR可具有多种抗原结合特异性。在一些情况下，抗原结合域对于由目标细胞表达(由其合成)的抗原中存在的抗原决定基具有特异性。在一个实例中，目标细胞为癌细胞相关的抗原。癌细胞相关的抗原可为与以下相关的抗原：例如乳癌细胞、B细胞淋巴瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、黑色素瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、神经管胚细胞瘤、结肠癌细胞等。癌细胞相关抗原也可以由非癌细胞表达。

经工程改造的信号传导多肽的ASTR可结合的抗原的非限制性实施例包括例如CD19、CD20、CD38、CD30、ERBB2、CA125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-Al、IL-13R-a2、GD2、Axl、Ror2等。

在一些实施例中，适用于经工程改造的信号传导多肽中的特异性结合对的成员为受体的配位体的ASTR。配位体包括(但不限于)：激素(例如，红细胞生成素、生长激素、瘦素等)；细胞因子(例如，干扰素、介白素、某些激素等)；生长因子(例如，调节蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)等)；整合素结合肽(例如，包含序列Arg-Gly-Asp(SEQ ID NO:1)的肽)等。

当经工程改造的信号传导多肽中的特异性结合对的成员为配位体时，可在特异性结合对的第二成员的存在下使经工程改造的信号传导多肽活化，其中特异性结合对的第二成员为该配位体的受体。举例来说，当配位体为VEGF时，特异性结合对的第二成员可为包括可溶性VEGF受体的VEGF受体。

如上所述，在一些情况下，包括于经工程改造的信号传导多肽中的特异性结合对的成员是ASTR，其为受体，例如配位体的受体、共受体等。受体可以是受体的配位体结合片段。合适的受体包括(但不限于)：生长因子受体(例如，VEGF受体)；杀伤细胞凝集素样受体子家族K；成员1(NKG2D)多肽(MICA、MICB及ULB6的受体)；细胞因子受体(例如，IL-13受体；IL-2受体等)；CD27；自然细胞毒性受体(NCR)(例如，NKP30(NCR3/CD337)多肽(HLA-B相关的转录物3(BAT3)及B7-H6)的受体等)等。

在包括ASTR的本文中所提供的任何方面的某些实施例中，可将ASTR定位于连接ASTR与表达与目标细胞上的目标分子的中间蛋白质。中间蛋白质可经内源性地表达或外源性地引入，且可为天然地、经工程改造或化学修饰的。在某些实施例中，ASTR可为抗标记ASTR，使得至少一个经标记中间物(通常抗标记结合物)包括于由ASTR识别的标记与目标分子(通常为表达于目标细胞上的蛋白质目标)之间。因此，在这类实施例中，ASTR结合标记且标记结合于针对目标细胞(如癌细胞)上的抗原的抗体。标记的非限制性实例包括异硫氰酸荧光素(FITC)、抗生蛋白链菌素、生物素、组氨酸、二硝基苯酚、多甲藻素叶绿素蛋白复合物、绿色荧光蛋白、藻红蛋白(PE)、辣根过氧化酶、棕榈酰化、亚硝基化、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶以及麦芽糖结合蛋白。因此，ASTR包含结合标记的分子。

在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽包括位于经工程改造的信号传导多肽的部分中的柄，该部分位于细胞外部且插入在ASTR与跨膜域之间。在一些实施例中，柄与野生型CD8柄区(TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFA(SEQ ID NO:2))具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，与野生型CD28柄区(FCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:3))具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，或与野生型免疫球蛋白重链柄区具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在经工程改造的信号传导多肽中，所用柄允许抗原特异性靶向区及通常整个经工程改造的信号传导多肽保持与目标抗原的结合增加。

柄区长度可为约4个氨基酸至约50个氨基酸，例如约4aa至约10aa、约10aa至约15aa、约15aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约40aa，或约40aa至约50aa。

在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽的柄包括至少一个半胱氨酸。举例来说，在一些实施例中，柄可以包括序列Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO:4)。如果存在，第一经工程改造的信号传导多肽的柄中的半胱氨酸可以能够与第二经工程改造的信号传导多肽中的柄形成二硫键。

柄可包括所属领域中已知的免疫球蛋白铰链区氨基酸序列；参见例如Tan等人，(1990)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87:162；和Huck等人(1986)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》,14:1779。作为非限制性实例，免疫球蛋白铰链区可以包括与任何以下氨基酸序列的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列一致性的域：DKTHT(SEQ ID NO:5)；CPPC(SEQID NO:4)；CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO:6)(参见例如Glaser等人(2005),《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》280:41494)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO:7)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO:8)；KCCVDCP(SEQ ID NO:9)；KYGPPCP(SEQ ID NO:10)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:11)(人类IgG1铰链)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:12)(人类IgG2铰链)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ IDNO:13)(人类IgG3铰链)；SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO:14)(人类IgG4铰链)等。柄可以包括具有人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区的氨基酸序列的铰链区。柄与野生型(天然存在的)铰链区相比可包括一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。For example,人类IgG1铰链的His229可被Tyr取代，使得柄包括序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO:15)(参见例如Yan等人(2012)《生物化学杂志》287:5891)。柄可包括来源于人类CD8的氨基酸序列；例如，柄可包括氨基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:16)，或其变体。

本公开的经工程改造的信号传导多肽可包括用于插入至真核细胞膜中的跨膜域。跨膜域可插入在ASTR与共刺激域之间。跨膜域可插入在柄与共刺激域之间，使得嵌合抗原受体自氨基端(N端)至羧基端(C端)依次包括：ASTR、柄、跨膜域以及活化域。

提供将多肽插入至真核(例如，哺乳动物)细胞的细胞膜中的任何跨膜(TM)域适用于本文中所公开的方面及实施例。

适用于本文中所提供的任何方面或实施例的TM域的非限制性实例包括与以下TM域或经组合柄及TM域中的任一个的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：a)CD8αTM(SEQ ID NO:17)；b)CD8βTM(SEQ ID NO:18)；c)CD4柄(SEQ ID NO:19)；d)CD3Z TM(SEQ ID NO:20)；e)CD28 TM(SEQ ID NO:21)；f)CD134(OX40)TM(SEQ ID NO:22)；g)CD7 TM(SEQ ID NO:23)；h)CD8柄及TM(SEQ ID NO:24)；及i)CD28柄及TM(SEQ ID NO:25)。

作为非限制性实例，本发明的方面的跨膜域可与SEQ ID NO:17跨膜域具有至少80％、90％或95％或可具有100％的序列一致性，或可分别与来自以下基因的跨膜域中的任一个具有100％的序列一致性：CD8β跨膜域、CD4跨膜域、CD3ζ跨膜域、CD28跨膜域、CD134跨膜域或CD7跨膜域。

适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的胞内活化域在活化时通常诱导产生一种或多种细胞因子；增加细胞死亡；和/或增加CD8

在一些实施例中，胞内活化域包括如下文所描述的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个等)ITAM模体。在一些实施例中，本发明的方面的胞内活化域可与如下文所描述的CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70域具有至少80％、90％或95％或可具有100％的序列一致性。

适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的胞内活化域包括含有基于免疫受体酪氨酸的活化模体(ITAM)的胞内信号传导多肽。ITAM模体为YX

合适的胞内活化域可为含有ITAM模体的部分，所述部分来源于含有ITAM模体的多肽。举例来说，合适的胞内活化域可为来自任何含有ITAM模体的蛋白质的含有ITAM模体的域。因此，合适的胞内活化域不需要含有其源自的整个蛋白质的整个序列。合适的含有ITAM模体的多肽的实例包括(但不限于)：CD3Z(CD3ζ)；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD79A(抗原受体复合物相关蛋白质α链)；CD79B(抗原受体复合物相关蛋白质β链)DAP12；以及FCERlG(Fcε受体Iγ链)。

在一些实施例中，胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ζ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。举例来说，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列(2个同功异型物)中的任一个的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：

MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI

同样，合适的胞内活化域多肽可包括全长CD3ζ氨基酸序列的含有ITAM模体的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列中的任一个的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQID NO:28)；

RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO:29)；NQL[YNELNLGRREEYDVL]DKR(SEQ ID NO:30)；

EGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMK(SEQ ID NO:31)；或DGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQ(SEQID NO:32)，其中ITAM模体在括号中阐述。

在一些实施例中，胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D、CD3-δ、T3D、CD3抗原、δ子单元、CD3δ、CD3d抗原、δ多肽(TiT3复合物)、OKT3、δ链、T细胞受体T3δ链、T细胞表面糖蛋白CD3δ链等)。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列中的任一个的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：

MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK(SEQ ID NO:33)或MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK(SEQ ID NO:34)，其中ITAM模体在括号中阐述。

同样，合适的胞内活化域多肽可以包含全长CD3δ氨基酸序列的含有ITAM模体的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：DQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGN(SEQ ID NO:35)，其中ITAM模体在括号中阐述。

在一些实施例中，胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：

MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQRRI(SEQ ID NO:36)，其中ITAM模体在括号中阐述。

同样，合适的胞内活化域多肽可包含全长CD3ε氨基酸序列的含有ITAM模体的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：NPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQR(SEQ ID NO:37)，其中ITAM模体在括号中阐述。

在一些实施例中，胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G、T细胞受体T3γ链、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3复合物)等)。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：

MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGNQLRRN(SEQ ID NO:38)，其中ITAM模体在括号中阐述。

同样，合适的胞内活化域多肽可以包含全长CD3γ氨基酸序列的含有ITAM模体的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：DQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGN(SEQ ID NO:39)，其中ITAM模体在括号中阐述。

在一些实施例中，胞内活化域来源于CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关蛋白质α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；Ig-α；膜结合的免疫球蛋白相关蛋白质；表面IgM相关蛋白质等)。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列中的任一个的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：

MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO:40)或MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO:41)，其中ITAM模体在括号中阐述。

同样，合适的胞内活化域多肽可以包含全长CD79A氨基酸序列的含有ITAM模体的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：ENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRG(SEQ ID NO:42)，其中ITAM模体在括号中阐述。

在一些实施例中，胞内活化域来源于DAP12(也称为TYROBP；TYRO蛋白质酪氨酸激酶结合蛋白质；KARAP；PLOSL；DNAX活化蛋白质12；KAR相关蛋白质；TYRO蛋白质酪氨酸激酶结合蛋白质；杀伤活化受体相关蛋白质；杀伤活化受体相关蛋白质等)。举例来说，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列(4个同功异型物)中的任一个的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：

MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO:43)、

MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ(SEQ ID NO:44)、MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO:45)或MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO:46)，其中ITAM模体在括号中阐述。

同样，合适的胞内活化域多肽可以包含全长DAP12氨基酸序列的含有ITAM模体的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：ESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ(SEQ ID NO:47)，其中ITAM模体在括号中阐述。

在一些实施例中，胞内活化域来源于FCERlG(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRIγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体子单元γ；免疫球蛋白E受体、高亲和力链等)。举例来说，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约50个氨基酸至约60个氨基酸(aa)、约60aa至约70aa、约70aa至约80aa或约80aa至约88aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGV[YTGLSTRNQETYETL]KHEKPPQ(SEQID NO:48)，其中ITAM模体在括号中阐述。

同样，合适的胞内活化域多肽可以包含全长FCER1G氨基酸序列的含有ITAM模体的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：DGV[YTGLSTRNQETYETL]KHE(SEQ ID NO:49)，其中ITAM模体在括号中阐述。

适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的胞内活化域包括DAP10/CD28型信号传导链。DAP10信号传导链的实例为氨基酸SEQ ID NO:50。在一些实施例中，合适的胞内活化域可包括与SEQ ID NO:50中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。

CD28信号传导链的实例为氨基酸序列SEQ ID NO:51。在一些实施例中，合适的胞内活化域可包括与SEQ ID NO:51中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。

适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的胞内活化域包括ZAP70多肽，例如，合适的胞内活化域可包括与SEQ ID NO:52中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约300个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸或约500个氨基酸至约619个氨基酸的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。

调节域可改变经工程改造的信号传导多肽中的胞内活化域的作用，包括增强或抑制活化域的下游作用或改变反应的性质。适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的调节域包括共刺激域。适合于包含在经工程改造的信号传导多肽中的调节域的长度可为约30个氨基酸至约70个氨基酸(aa)，例如，调节域的长度可为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。在其它情况下，调节域的长度可为约70aa至约100aa、约100aa至约200aa，或大于200aa。

共刺激域通常增强和/或改变活化域的反应的性质。适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的共刺激域通常为衍生自受体的多肽。在一些实施例中，共刺激域同源二聚。个体共刺激域可为跨膜蛋白质的胞内部分(即，共刺激域可衍生自跨膜蛋白质)。合适的共刺激多肽的非限制性实例包括(但不限于)4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR和HVEM。举例来说，本发明的方面的共刺激域可与4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR或HVEM的共刺激域具有至少80％、90％或95％序列一致性。举例来说，本发明的方面的共刺激域可与合适的共刺激多肽的非限制性实例的共刺激域具有至少80％、90％或95％序列一致性，所述实例包括(但不限于)4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR和HVEM。举例来说，本发明的方面的共刺激域可与4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR或HVEM的共刺激域具有至少80％、90％或95％序列一致性。

适合于包含在经工程改造的信号传导多肽中的共刺激域的长度可为约30个氨基酸至约70个氨基酸(aa)，例如，共刺激域的长度可为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。在其它情况下，共刺激域的长度可为约70aa至约100aa、约100aa至约200aa，或大于200aa。

在一些实施例中，共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD137(也称为TNFRSF9；CD137；4-lBB；CDwl37；ILA等)的胞内部分。举例来说，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:53中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。

在一些实施例中，共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD28(也称为Tp44)的胞内部分。举例来说，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:54中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。

在一些实施例中，共刺激域衍生自为用于Lck结合(ICΔ)所缺失的跨膜蛋白质CD28的胞内部分。举例来说，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:55中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。

在一些实施例中，共刺激域衍生自跨膜蛋白质ICOS(也称为AILIM、CD278及CVIDl)的胞内部分。举例来说，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:56中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。

在一些实施例中，共刺激域衍生自跨膜蛋白质OX40(也称为TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX-40、TXGPlL)的胞内部分。OX40在(表1的)SEQ ID NO:296中的每一个的残基34-57处含有p85 PI3K结合模体，且在残基76-102处含有TRAF结合模体。在一些实施例中，共刺激域可包括OX40的p85 PI3K结合模体。在一些实施例中，共刺激域可包括OX40的TRAF结合模体。对应于SEQ ID NO:296的氨基酸17及41的赖氨酸为充当泛素靶向模体的部分的潜在负性调节位点。在一些实施例中，OX40的共刺激域中的这些赖氨酸中的一个或两个为突变精氨酸或另一种氨基酸。在一些实施例中，合适的共刺激域可包括与SEQID NO:57中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa。在说明性实施例中，共刺激域的长度为约20aa至约50aa，例如20aa至45aa或20aa至42aa。

在一些实施例中，共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD27(也称为S 152、T 14、TNFRSF7及Tp55)的细胞内部分。举例来说，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:58中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa。

在一些实施例中，共刺激域衍生自跨膜蛋白质BTLA(也称为BTLAl和CD272)的胞内部分。举例来说，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:59中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。

在一些实施例中，共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD30(也称为TNFRSF8、DlS166E及Ki-1)的胞内部分。举例来说，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:60中的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa、约150aa至约160aa或约160aa至约185aa的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。

在一些实施例中，共刺激域衍生自跨膜蛋白质GITR(也称为TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357及GITR-D)的胞内部分。举例来说，合适的共刺激域可包括与SEQ IDNO:61中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。

在一些实施例中，共刺激域衍生自跨膜蛋白质HVEM(也称为TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR及TR2)的胞内部分。举例来说，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:62中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，第一多肽及第二多肽的共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。

在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽包括在任何两个相邻域之间的连接子。举例而言，连接子可在跨膜域与第一刺激域之间。作为另一实例，ASTR可为抗体，且连接子可在重链与轻链之间。作为另一实例，连接子可在ASTR与跨膜域及共刺激域之间。作为另一实例，连接子可在第二多肽的共刺激域与胞内活化域之间。作为另一实例，连接子可在ASTR与胞内信号传导域之间。

连接肽可具有多种氨基酸序列中的任一个。蛋白质可通过通常具有柔性的间隔肽连接，但不排除其它化学键。连接子可为长度在约1个与约100个氨基酸之间，或长度在约1个与约25个氨基酸之间的肽。这些连接子可通过使用合成的编码连接子的寡核苷酸偶合所述蛋白质来产生。可使用具有一定程度柔性的肽连接子。连接肽可实际上具有任何氨基酸序列，考虑到合适的连接子将具有产生通常柔性肽的序列。使用如甘氨酸和丙氨酸等小型氨基酸在产生柔性肽方面是有用的。这类序列的创建对于所属领域的技术人员来说是常规的。

合适的连接子可易于选择且可为合适的不同长度中的任一个，如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，且可为1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸。

例示性柔性连接子包括甘氨酸聚合物(G)

在一些实施例中，通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒提供的聚核苷酸具有编码一种或多种经工程改造的信号传导多肽的某些组合的一个或多个转录单元。在本文所提供的一些方法及组合物中，在通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转录T细胞之后，被基因修饰的T细胞包括一种或多种经工程改造的信号传导多肽的组合。将理解，第一多肽、第二多肽、第三多肽等的参考是出于方便性，且“第一多肽”上的元件及“第二多肽”上的那些意谓，所述元件在不同多肽上，所述多肽称为第一或第二以通常在特异性多肽的其它元件或步骤中仅供参考及方便性。

在一些实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽包括能够结合抗原的胞外抗原结合域，及胞内信号传导域。在其它实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽还包括T细胞存活模体和/或跨膜域。在一些实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽不包括共刺激域，而在其它实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽的确包括共刺激域。

在一些实施例中，第二经工程改造的信号传导多肽包括淋巴增生性基因产物及任选的胞外抗原结合域。在一些实施例中，第二经工程改造的信号传导多肽还包括以下中的一种或多种：T细胞存活模体、胞内信号传导域和一个或多个共刺激域。在其它实施例中，当使用两种经工程改造的信号传导多肽时，至少一种为CAR。

在一个实施例中，一种或多种经工程改造的信号传导多肽在相同转录物下在T细胞特异性启动子或一般启动子下表达，其中在所述转录物中，编码经工程改造的信号传导多肽的核酸由编码一种或多种内部核糖体进入位点(IRE)或一种或多种蛋白酶裂解肽的核酸分隔开。

在某些实施例中，聚核苷酸编码两种经工程改造的信号传导多肽，其中第一经工程改造的信号传导多肽包括能够结合第一抗原的第一胞外抗原结合域，及第一胞内信号传导域而非共刺激域，且第二经工程改造的信号传导多肽包括能够结合VEGF的第二胞外抗原结合域，及第二胞内信号传导域，如共刺激分子的信号传导域。在某一实施例中，第一抗原为PSCA、PSMA或BCMA。在某一实施例中，第一胞外抗原结合域包含抗体或其片段(例如scFv)，例如对PSCA、PSMA或BCMA具有特异性的抗体或其片段。在某一实施例中，结合VEGF的第二胞外抗原结合域为VEGF的受体，即VEGFR。在某些实施例中，VEGFR为VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3。在某一实施例中，VEGFR为VEGFR2。

在某些实施例中，聚核苷酸编码两种经工程改造的信号传导多肽，其中第一经工程改造的信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合域及CD3ζ信号传导域，且第二经工程改造的信号传导多肽包括抗原结合域(其中所述抗原为血管生成或血管原性因子)，及一个或多个共刺激分子信号传导域。血管生成因子可为例如VEGF。一个或多个共刺激分子信号传导模体可包含例如来自CD27、CD28、OX40、ICOS及4-1BB中的每一个的共刺激信号传导域。

在某些实施例中，聚核苷酸编码两种经工程改造的信号传导多肽，其中第一经工程改造的信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合域及CD3ζ信号传导域，第二多肽包含能够结合VEGF的抗原结合域的抗原结合域，及来自CD27、CD28、OX40、ICOS及4-1BB中的每一个的共刺激信号传导域。在另一实施例中，第一信号传导多肽或第二信号传导多肽还具有T细胞存活模体。在一些实施例中，T细胞存活模体为IL-7受体(IL-7R)的胞内信号传导域、IL-12受体的胞内信号传导域、IL-15受体的胞内信号传导域、IL-21受体的胞内信号传导域，或转型生长因子β(TGFβ)受体或TGFβ诱饵受体(TGF-β-显性-阴性受体II(DNRII))的胞内信号传导域或由以上各者衍生。

在某些实施例中，聚核苷酸编码两种经工程改造的信号传导多肽，其中第一经工程改造的信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合域及CD3ζ信号传导域，且第二经工程改造的信号传导多肽包含能够结合VEGF的抗原结合域、IL-7受体胞内T细胞存活模体、及来自CD27、CD28、OX40、ICOS及4-1BB中的每一个的共刺激信号传导域。

在一些实施例中，由聚核苷酸编码超过两种信号传导多肽。在某些实施例中，仅经工程改造的信号传导多肽中的一个包括结合至肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合域；所述经工程改造的信号传导多肽中的剩余者的每一个包含结合至非肿瘤相关的抗原或非肿瘤特异性抗原的抗原结合域。在其它实施例中，经工程改造的信号传导多肽中的两个或更多个包括结合至一种或多种肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合域，其中这些经工程改造的信号传导多肽中的至少一个包含未结合至肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合域。

在一些实施例中，肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、B细胞成熟抗原(BCMA)、α-胎蛋白(AFP)、癌胚性抗原(CEA)、癌症抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、总胆囊疾病液蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、黑色素蛋白-A(被T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2的二聚形式(肿瘤M2-PK)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、EphA2、CSPG4、CD138，FAP(成纤维细胞活化蛋白质)、CD171、κ、λ、5T4、αvβ6整合素、整合素ανβ3(CD61)、半乳糖苷，K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒性致癌基因)、Ral-B、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD20、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、EGFR、EGP2、EGP40、EpCAM、胚胎AchR、FRα、GD3、HLA-A1+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lewis-Y、Muc16、NCAM、NKG2D配位体、NY-ESO-1、PRAME、ROR1、存活素、TAG72、TEM、VEGFR2、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、精子蛋白17(Sp17)、间皮素、PAP(前列腺酸磷酸酶)、前列腺素、TARP(T细胞受体γ交替阅读框架蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺1的六次跨膜上皮抗原)、异常ras蛋白或异常p53蛋白。

在一些实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽包括结合第一抗原的第一胞外抗原结合域，及第一胞内信号传导域；且第二经工程改造的信号传导多肽包括结合第二抗原或结合第二抗原的受体的第二胞外抗原结合域，及第二胞内信号传导域，其中所述第二经工程改造的信号传导多肽不包含共刺激域。在某一实施例中，第一抗原结合域及第二抗原结合域独立地为受体的抗原结合部分或抗体的抗原结合部分。在某一实施例中，第一抗原结合域或第二抗原结合域中的一个或两个为scFv抗体片段。在某些实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽和/或第二经工程改造的信号传导多肽额外包含跨膜域。在某一实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽或第二经工程改造的信号传导多肽包含T细胞存活模体，例如本文所描述的T细胞存活模体中的任一个。

在另一实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽包括结合HER2的第一胞外抗原结合域，且第二经工程改造的信号传导多肽包括结合MUC-1的第二胞外抗原结合域。

在另一实施例中，第二经工程改造的信号传导多肽的第二胞外抗原结合域结合介白素。

在另一实施例中，第二经工程改造的信号传导多肽的第二胞外抗原结合域结合损伤相关的分子模式分子(DAMP；也称为警报素(alarmin))。在其它实施例中，DAMP为热休克蛋白质、染色质相关的蛋白质高迁移率组盒1(HMGB1)、S100A8(也称为MRP8或钙粒蛋白A)、S100A9(也称为MRP14或钙粒蛋白B)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷、尿酸或硫酸肝素。

在某些实施例中，所述第二抗原为抗体上的抗原，所述抗体结合由肿瘤细胞呈现的抗原。

在一些实施例中，经由第二经工程改造的信号传导多肽的信号转导活化为非抗原性的，但与低氧有关。在某些实施例中，低氧是通过低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β的活化诱导的。

在一些实施例中，一种或多种经工程改造的信号传导多肽的表达是由在本文中更详细地公开的控制组件调节的。

经工程改造的信号传导多肽(如CAR)可进一步包括一种或多种额外的多肽域，其中这类域包括(但不限于)信号序列、抗原决定基标记、亲和域，及可例如通过抗体分析法或由于其为产生可检测信号的多肽而检测(可检测标记)其存在或活性的多肽。对于本文所提供的任何方面或实施例中的额外域的非限制性实例包括与如下文所描述的以下序列中的任一个具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：信号序列、抗原决定基标记、亲和域或产生可检测信号的多肽。

适用于个体CAR，例如个体CAR的第一多肽的信号序列包括任何真核信号序列，包括天然存在的信号序列、合成(例如人造)信号序列等。在一些实施例中，举例来说，信号序列可以是CD8信号序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:72)。

合适的抗原决定基标记包括(但不限于)红血球凝集素(HA；例如YPYDVPDYA；SEQID NO:73)、FLAG(例如DYKDDDDK；SEQ ID NO:74)、c-myc(例如EQKLISEEDL；SEQ ID NO:75)等。

亲和域包括可与结合搭配物(例如在固体载体上固定的结合搭配物)相互作用的适用于识别或纯化的肽序列。编码多个连续的单一氨基酸(例如组氨酸)的DNA序列当与所表达蛋白质融合时，可用于通过高亲和力结合至树脂柱(如琼脂糖凝胶)的重组蛋白质的一步纯化。例示性亲和域包括His5(HHHHH；SEQ ID NO:76)、HisX6(HHHHHH；SEQ ID NO:77)、c-myc(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:75)、Flag(DYKDDDDK；SEQ ID NO:74)、链球菌标记(WSHPQFEK；SEQ ID NO:78)、红血球凝集素，例如HA标记(YPYDVPDYA；SEQ ID NO:73)、GST、硫氧还蛋白、纤维素结合域、RYIRS(SEQ ID NO:79)、Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO:80)、甲壳素结合域、S-肽、T7肽、SH2域、C端RNA标记、WEAAAREACCRECCARA(SEQ ID NO:81)、金属结合域，例如锌结合域或钙结合域(如来自钙结合蛋白(例如钙调蛋白、肌钙蛋白C、钙调神经磷酸酶B、肌球蛋白轻链、恢复蛋白、S-调节蛋白、视锥蛋白、VILIP、神经钙蛋白、河马钙蛋白、频青霉菌素、钙蛋白、钙蛋白酶大型子单元、S100蛋白、小白蛋白、钙结合蛋白D9K、钙结合蛋白D28K和钙网蛋白、内含蛋白、生物素、抗生蛋白链菌素、MyoD、Id、亮氨酸拉链序列和麦芽糖结合蛋白)的结合结构域)。

合适的可检测信号产生蛋白质包括例如荧光蛋白质、催化产生可检测信号作为产物的反应的酶等。

合适的荧光蛋白质包括(但不限于)绿色荧光蛋白(GFP)或其变体、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、翡翠、黄宝石(TYFP)、金星、黄水晶、mCitrine、GFPuv、去稳定的EGFP(dEGFP)、去稳定的ECFP(dECFP)、去稳定的EYFP(dEYFP)、mCFPm、天蓝、T-蓝宝石、CyPet、YPet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、DsRed-单体、J-Red、dimer2、t-dimer2(12)、mRFPl、杯型珊瑚色、Renilla GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白质和点燃蛋白、藻胆蛋白和藻胆蛋白结合物，包括B-藻红蛋白、R-藻红蛋白和别藻蓝蛋白。荧光蛋白质的其他实例包括mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrapel、mRaspberry、mGrape2、mPlum(Shaner等人(2005)《自然方法(Nat.Methods)》2:905-909)等。适宜使用来自珊瑚虫物种的多种荧光及有色蛋白质中的任一个，如例如Matz等人(1999)《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》17:969-973中所描述。

合适的酶包括(但不限于)辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸去氢酶、β-N-乙酰胺基葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)等。

本文所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的任一个可包括编码识别域或消除域的核酸，所述识别域或消除域作为编码本文所提供的经工程改造的信号传导多肽中的任一个的核酸的部分或与其隔开。因此，本文所提供的经工程改造的信号传导多肽中的任一个可包括识别域或消除域。举例来说，本文中所公开的CAR中的任一个可包括识别域或消除域。此外，识别域或消除域可与本文中所公开的淋巴增生性元件中的任一个一起表达，或甚至与其融合。识别域或消除域在T细胞和/或NK细胞上表达，但不在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒上表达。

在一些实施例中，识别域或消除域可来源于单纯疱疹病毒衍生的酶胸苷激酶(HSV-tk)或诱导型半胱天冬酶-9。在一些实施例中，识别域或消除域可包括被修饰的内源细胞表面分子，例如美国专利案8,802,374中所公开。被修饰的内源细胞表面分子可为任何细胞表面相关的受体、配位体、糖蛋白、细胞粘附分子、抗原、整合素或被修饰的分化簇(CD)。在一些实施例中，被修饰的内源细胞表面分子为经截短的酪氨酸激酶受体。在一个方面中，经截短的酪氨酸激酶受体为表皮生长因子受体(EGFR)家族中的成员(例如ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4)。在一些实施例中，识别域可为由抗体识别的多肽，所述抗体识别EGFR成员的胞外域。在一些实施例中，识别域可为EGFR家族成员的至少20个连续氨基酸，或在例如EGFR家族成员的20个与50个连续氨基酸之间。举例而言，SEQ ID NO:82为由识别EGFR成员的胞外域的抗体结合且在适当条件下识别的例示性多肽。这类胞外EGFR抗原决定基有时在本文中称为eTag。在说明性实施例中，这类抗原决定基由可商购的抗EGFR单克隆抗体识别。

也称为EGFR、ErbB1及HER1的表皮生长因子受体为胞外配位体的表皮生长因子家族的成员的细胞表面受体。EGFR活性的改变已涉及某些癌症。在一些实施例中，编码包括人类表皮生长因子受体(EGFR)的EGFR多肽的基因是由去除编码包括膜远程EGF结合域及细胞质信号传导尾的多肽但保留由抗EGFR抗体识别的胞外膜近端抗原决定基的核酸序列来构筑的。优选地，抗体为已知可商购的抗EGFR单克隆抗体，如西妥昔单抗(cetuximab)、马妥珠单抗(matuzumab)、尼西珠单抗(necitumumab)或帕尼单抗(panitumumab)。

其它已展示，生物素标记的西妥昔单抗结合抗生物素微珠应用于免疫磁选择成功地丰富T细胞，所述T细胞已用含有EGFRt的构筑体自低至2％的群体慢病毒转导至大于90％的纯度，而对细胞制剂无可观测毒性。此外，其它已展示，此惰性EGFR分子的组成性表达不影响T细胞表型或如由协调表达的嵌合抗原受体(CAR)，CD19R引导的效应功能。此外，其它已展示，经由流式细胞术分析，EGFR成功地用作小鼠中的T细胞移植的体内的追踪标记物。此外，已通过

在本文所提供的一些实施例中，EGFR表达为还包括CAR的单一多肽的部分或表达为包括淋巴增生性元件的单一多肽的部分。在一些实施例中，可通过裂解信号和/或核糖体跳跃序列将编码EGFR识别域的氨基酸序列与编码嵌合抗原受体的氨基酸序列隔开。核糖体跳跃和/或裂解信号可为所属领域中已知的任何核糖体跳跃和/或裂解信号。不受理论约束，核糖体跳跃序列可为例如具有氨基酸序列所述(SEQ ID NO:83)的T2A(本文中也称为2A-1)。不受理论约束，裂解信号及核糖体跳跃序列的其它实例包括FMDV 2A(F2A)、马A型鼻病毒2A(简称E2A)、猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1 2A(P2A)及扁刺蛾属(Thoseaasigna)病毒2A(T2A)。在一些实施例中，编码识别域的聚核苷酸序列可与CAR或淋巴增生性元件在相同的转录物上，但通过内部核糖体进入位点与编码CAR或淋巴增生性元件的聚核苷酸序列隔开。

在如本文中例示性列举的其它实施例中，识别域可表达为与淋巴增生性元件融合的融合多肽的部分。这类构筑体与单独的多肽相比提供，尤其结合本文中提供的其它“空间节省”元件，在RNA基因组上占用更少的基因组空间的优势。在一个说明性实施例中，eTag表达为与IL7Rα突变体融合的融合多肽，如在本文中实验地论证。

在本发明的一些方面中，经工程改造的信号传导多肽是嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的聚核苷酸，为简单起见，其在本文中称为“CAR”。本公开的CAR包括：a)至少一个抗原特异性靶向区(ASTR)；b)跨膜域；和c)胞内活化域。在说明性实施例中，CAR的抗原特异性靶向区为抗体针对目标抗原的scFv部分。在说明性实施例中，胞内活化域来自CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70，且在一些其它说明性实施例中，来自CD3z。在说明性实施例中，CAR进一步包含共刺激域，例如上文在调节域章节中所提供的共刺激域中的任一个，且在其它说明性实施例中，共刺激域为4-1BB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR及HVEM的胞内共刺激域。在一些实施例中，CAR包括上文列于跨膜域章节中的跨膜域中的任一个。

本公开的CAR可存在于真核细胞(例如，哺乳动物细胞)的质膜中，其中合适的哺乳动物细胞包括(但不限于)细胞毒性细胞、T淋巴细胞、干细胞、干细胞的子代、祖细胞、祖细胞的子代及NK细胞、NK-T细胞及巨噬细胞。当存在于真核细胞的质膜中时，本公开的CAR在存在一个或多个目标抗原(在某些条件下，结合ASTR)下经活化。目标抗原为特异性结合对的第二成员。特异性结合对的目标抗原可为可溶性(例如，未结合至细胞)因子；存在于如目标细胞的细胞的表面上的因子；存在于实体表面上的因子；存在于脂质双层上的因子等。当ASTR为抗体，且特异性结合对的第二成员为抗原时，抗原可为可溶性(例如，未结合至细胞)抗原；存在于如目标细胞的细胞的表面上的抗原；存在于实体表面上的抗原；存在于脂质双层上的抗原等。

在一些情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，使细胞中的至少一个核酸的表达增加。举例来说，在一些情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，与在不存在一种或多种目标抗原下的核酸的转录水平相比，使细胞中的至少一个核酸的表达增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。

作为实例，本公开的CAR可包括含有基于免疫受体酪氨酸的活化模体(ITAM)的胞内信号传导多肽。

在一些情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，可使得细胞产生一种或多种细胞因子增加。举例来说，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，与在不存在一种或多种目标抗原下细胞所产生的细胞因子量相比，可使得细胞产生细胞因子增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。其产量可增加的细胞因子包括(但不限于)干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-a)、IL-2、IL-15、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10；趋化因子；生长因子等。

在一些实施例中，当存在于真核细胞的质膜中时且当由一种或多种目标抗原活化时，本公开的CAR可引起细胞中核酸的转录增加和由细胞产生的细胞因子增加。

在一些情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，产生细胞朝向目标细胞的细胞毒性活性，所述目标细胞在其细胞表面上表达抗原，所述抗原与CAR的第一多肽的抗原结合域结合。举例来说，当真核细胞为细胞毒性细胞(例如，NK细胞或细胞毒性T淋巴细胞)时，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，使细胞朝向目标细胞的细胞毒性活性增加，所述目标细胞在其细胞表面上表达一种或多种目标抗原。举例来说，当真核细胞为NK细胞或T淋巴细胞时，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，与在不存在一种或多种目标抗原下的细胞的细胞毒性活性相比，使得细胞的细胞毒性活性增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。

在一些实施例中，当存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，本公开的CAR可引起其它CAR活化相关事件，如增殖和扩增(归因于细胞分裂增加或抗细胞凋亡反应)。

在一些实施例中，当存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，本公开的CAR可引起其它CAR活化相关事件，如胞内信号传导调节、细胞分化或细胞死亡。

在一些实施例中，本公开的CAR受微环境限制。此特性通常为CAR的ASTR域的受微环境限制性质的结果。因此，本公开的CAR可具有较低结合亲和力或在说明性实施例中，在微环境的条件下比在正常生理环境的条件下可具有针对一种或多种目标抗原的更高结合亲和力。

在某些说明性实施例中，除胞内活化域以外，本文中所提供的CAR包含共刺激域，其中共刺激域是本文中所提供的用于淋巴增生元件(LE)的胞内信号传导域中的任一个，例如CLE的胞内域。在某些说明性实施例中，本文中的CAR的共刺激域是本文中关于CLE鉴别的第一胞内域(P3域)或P4域，其作为在不存在P3域的情况下本文中的CLE的有效胞内信号传导域展示。此外，在某些说明性实施例中，CAR的共刺激域可以包含本文中关于CLE鉴别的P3和P4胞内信号传导域。某些说明性子实施例尤其包括如本文中关于CLE鉴别的有效P3和P4搭配物胞内信号传导域。在说明性实施例中，共刺激域不是CAR的含有ITAM的胞内域，其作为共刺激域的一部分或在其它说明性实施例中，作为唯一的共刺激域。

在这些包括CAR的实施例中，所述CAR具有本文中鉴别的共刺激域作为LE的有效胞内域，CAR的共刺激域可以是本文中所提供的表1中的任何胞内信号传导域。表1中的任何胞内域的活性片段可以是CAR的共刺激域。在说明性实施例中，CAR的ASTR包含scFV。在说明性实施例中，除CLE的c-刺激性胞内域以外，这些CAR包含胞内活化域，其在说明性实施例中是CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C。DAP10/CD28，或ZAP70胞内活化域，或在其它说明性实施例中是CD3z胞内活化域。

在这些说明性实施例中，CAR的共刺激域可以包含胞内域或其功能性信号传导片段，所述胞内域或其功能性信号传导片段包括来自以下的信号传导域：CSF2RB、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MyD88、OSMR或PRLR。在一些实施例中，CAR的共刺激域可以包括胞内域或其功能性信号传导片段，所述胞内域或其功能性信号传导片段包括来自以下的信号传导域：CSF2RB、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MyD88、OSMR或PRLR。在一些实施例中，CAR的共刺激域可以包括胞内域或其功能性片段，所述胞内域或其功能性片段包括来自以下的信号传导域：CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL5RA、IL6R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA2、IL15RA、IL17RD、IL21R、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、MyD88或OSMR。在一些实施例中，CAR的共刺激域可以包括胞内域或其片段，所述胞内域或其片段包括来自以下的信号传导域：CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL5RA、IL6R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RD、IL31RA、LEPR、MPL、MyD88或OSMR。在一些实施例中，CAR的共刺激域可以包括胞内域或其功能性信号传导片段，所述胞内域或其功能性信号传导片段包括来自以下的信号传导域：CSF2RB、CSF3R、IFNAR1、IFNGR1、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL10RA、IL12RB2、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL27RA、IL31RA、MPL、MyD88、OSMR或PRLR。在一些实施例中，CAR的共刺激域可以包括胞内域或其功能性信号传导片段，所述胞内域或其功能性信号传导片段包括来自以下的信号传导域：CSF2RB、CSF3R、IFNGR1、IL2RB、IL2RG、IL6ST、IL10RA、IL17RE、IL31RA、MPL或MyD88。

在一些实施例中，CAR的共刺激域可以包括胞内域或其片段，所述胞内域或其片段包括来自以下的信号传导域：CSF3R、IL6ST、IL27RA、MPL和MyD88。在某些说明性子实施例中，CAR的胞内活化域是来源于CD3z。

T细胞受体(TCR)识别来源于胞内和胞外蛋白的特异性蛋白质片段。当蛋白质分解成肽片段时，其与另一种称为主要组织相容复合物或MHC的蛋白质一起呈现于细胞表面上，所述蛋白质在人类中被称为HLA(人类白细胞抗原)复合物。脊椎动物中的三种不同的T细胞抗原受体组合是αβTCR、γδTCR和pre-TCR。这类组合是由二聚亚型的成员(如TCR子单元和βTCR子单元、γTCR子单元和δTCR子单元以及对于pre-TCR，pTα子单元和βTCR子单元)之间的二聚作用形成。TCR子单元的集合二聚合且识别在MHC情形下呈现的目标肽片段。pre-TCR仅在未成熟的αβT细胞的表面上表达，而αβTCR在成熟αβT细胞和NKT细胞的表面上表达，且γδTCR在γδT细胞的表面上表达。T细胞表面上的αβTCR识别由MHCI或MHCII呈现的肽且NK T细胞表面上的αβTCR识别由CD1呈现的脂质抗原。γδTCRs可以识别MHC和MHC样分子，且也可以识别非MHC分子，如病毒性糖蛋白。在配位体识别后，αβTCR和γδTCR通过CD3zeta链传输activation信号，其刺激T细胞增殖和细胞因子分泌。

TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区中，其中CDR3与CDR1和CDR2相比具有更高的可变性，直接决定TCR的抗原结合特异性。当MHC-抗原肽复合物由TCR识别时，CDRl和CDR2识别且结合MHC分子抗原结合通道的侧壁，且CDR3直接结合于抗原肽。因此，重组TCR可被工程改造，其识别呈现于MHC上的肿瘤特异性蛋白质片段。

因此，可产生具有针对肿瘤特异性蛋白质的特异性的重组TCR，如来源于识别具有通用HLA的特异性肽人类TCRα和TCRβ对的TCR(Schmitt,TM等人,2009)。重组TCR的目标可以是来源于本文中所提供的CAR ASTR的任何抗原目标的肽，但更通常是来源于胞内肿瘤特异性蛋白质，如癌胚抗原，或正常胞内蛋白质的突变型变体或其它癌症特异性新抗原决定基。可以针对TCR子单元对目标抗原的选择性来筛选TCR子单元的库。天然和/或重组TCR子单元的筛选可以识别对目标抗原具有高亲和力和/或反应性的TCR子单元的集合。可以选择和克隆TCR子单元的这类集合的成员以产生一种或多种编码TCR子单元的聚核苷酸。

复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中可以包括编码TCR子单元的这类集合的聚核苷酸以基因修饰淋巴细胞或在说明性实施例中，T细胞或NK细胞，使得淋巴细胞表达重组TCR。因此，在本文中所提供的包括经工程改造的信号传导多肽的任何方面或实施例中，如包括一个或多个CAR和/或淋巴增生元件的实施例中，经工程改造的信号传导多肽可以包括或可以是重组γδTCR链或在说明性实施例中，αβTCR链的一个或多个集合。形成集合的Tcr链可以使用多种不同技术来共表达，以共表达如本文中公开的两个TCR链以用于表达两种或更多种其它经工程改造的信号传导多肽，如CAR和淋巴增生性元件。举例来说，可以使用蛋白酶裂解抗原决定基(如2A蛋白酶)、内部核糖体进入位点(IRES)和单独的启动子。

已使用若干策略以降低混合TCR二聚体形成的可能性。通常，这涉及TCRα和TCRβ链的恒定(C)域的修饰以促进所引入的TCR链的彼此的优先配对，同时使其不大可能与内源性TCR链成功配对。一种展示一些前景的体外方法涉及用小鼠对应物置换人类TCRα和TCRβ链的C域。另一种方法涉及人类TCRα公共域和TCRβ链公共区的突变以促进自身配对，或病毒性基因构筑体内的内源性TCRα和TCRβmiRNA的表达。因此，在本文中所提供的包括TCR链的一个或多个集合作为经工程改造的信号传导多肽的一些实施例中，TCR链，在说明性实施例中，αβTCR链的集合中的每个成员包含被修饰的恒定域，其促进彼此的优先配对。在一些子实施例中，TCR链，在说明性实施例中，αβTCR链的集合中的每个成员包含来自相同TCR链类型的小鼠恒定域，或来自相同的TCR链亚型的具有足够的来源于小鼠恒定域的序列的恒定域，所述小鼠恒定域是来自相同的TCR链亚型，使得TCR链的集合的彼此的二聚作用优先于与人类TCR链的二聚作用或以排除与人类TCR链的二聚作用的方式进行。在其它子实施例中，TCR链，在说明性实施例中，αβTCR链的集合中的每个成员包含其恒定域中的相应突变，使得TCR链的集合的彼此的二聚作用优先于与具有人类恒定域的TCR链的二聚作用或以排除与具有人类恒定域的TCR链的二聚作用的方式进行。在说明性实施例中，这类优选或排他性二聚作用是在生理条件下进行的。

在整个成年期，由于从胸腺的渗出和响应于抗原相遇的增殖以及由在抗原清除之后去除抗原特异性效应子引起的细胞损失，周边T淋巴细胞数目保持显著稳定的水平，与细胞的持续添加无关(Marrak,P.等人2000.《自然免疫学(Nat Immunol)》1:107-111；Freitas,A.A.等人2000.《免疫学年鉴(Annu Rev Immunol)》18:83-111)。周边T细胞区室的尺寸由影响增殖及存活两者的多个因素来调节。然而，在淋巴细胞减少的环境下，T淋巴细胞独立于同源抗原分裂，这是由于维持周边T细胞区室的尺寸的“急性恒定增殖”机制。已通过体外增殖T细胞且将其等引入至淋巴细胞耗减的个体中而在过继细胞疗法期间的个体或患者中建立淋巴细胞减少症的条件，从而导致经转移T细胞的植入及抗肿瘤功能增强。然而，个体的淋巴细胞耗减是不希望的，这是由于其可引起严重的副作用，包括免疫紊乱及死亡。

研究已展示，淋巴细胞耗减去除作为稳细胞因子的细胞槽的内源性淋巴细胞，从而释放细胞因子以诱导过继转移的细胞的存活及增殖。已知例如IL-7及IL-15等一些细胞因子介导T细胞的抗原非依赖性增殖且因此能够在非淋巴细胞减少的环境中诱发稳定增殖。然而，这些细胞因子及其受体具有在稳态下防止淋巴增生性疾病的固有控制机制。

本文中所提供的许多实施例包括淋巴增生性元件，或编码其的核酸，通常作为经工程改造的信号传导多肽的一部分。因此，在本发明的一些方面中，经工程改造的信号传导多肽为淋巴增生性元件(LE)，如嵌合淋巴增生性元件(CLE)。通常，LE包含胞外域、跨膜域及驱动增殖的至少一个胞内信号传导域，且在说明性实施例中，包含第二胞内信号传导域。

在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括第一和/或第二胞内信号传导域。在一些实施例中，第一和/或第二胞内信号传导域可以包括CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD4、CD8A、CD8B、CD27、突变的δLck CD28、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2C、FCGRA2、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18，或其功能性突变体和/或片段。在说明性实施例中，第一胞内信号传导域可以包括MyD88或其功能性突变体和/或片段。在其它说明性实施例中，第一胞内信号传导域可以包括MyD88或其功能性突变体和/或片段，且第二胞内信号传导域可以包括ICOS、TNFRSF4或TNSFR18或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，第一胞内域是MyD88且第二胞内域是含有ITAM的胞内域，例如来自CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70的胞内域。在一些实施例中，第二胞内信号传导域可以包括TNFRSF18或其功能性突变体和/或片段。

在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括胞外域与跨膜域的融合物。在一些实施例中，胞外域与跨膜域的融合物可以包括eTAG IL7RA Ins PPCL(介白素7受体)、MycLMP1、LMP1、eTAG CRLF2、eTAG CSF2RB、eTAG CSF3R、eTAG EPOR、eTAG GHR、在Fn F523CIL27RA之后截短的eTAG或在Fn S505N MPL之后截短的eTAG，或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括胞外域。在一些实施例中，胞外域可以包括在羧基端具有0、1、2、3或4个额外丙氨酸的eTag。在一些实施例中，胞外域可以包括在羧基端具有0、1、2、3或4个额外丙氨酸的Myc或其功能性突变体和/或片段。

在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括跨膜域。在一些实施例中，跨膜域可以包括CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD3Z CD247、CD4、CD8A、CD8B、CD27、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CRLF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2C、FCGRA2、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL7RA Ins PPCL、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18，或其功能性突变体和/或片段。

用于本文中的任何方面或实施例的CLE可以包括WO2019/055946中公开的任何CLE(其以全文引用的方式并入本文中)，其绝大部分被设计成且被认为具有组成性活性。如其中所说明，当存在CLE的第一和第二胞内信号传导域时，第一胞内信号传导域位于膜相关模体与第二胞内域之间。

在另一实施例中，LE提供、能够提供和/或具有以下特性(或用LE基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、拥有以下特性和/或被修饰以用于)：体内驱动T细胞扩增。用于进行这类体内测试的方法提供于实例6中。举例来说，如实例6中所说明，体内测试可以利用小鼠模型且在T细胞与引入小鼠中的编码LE的慢病毒载体接触之后，在体内在第15至25天，或在体内在第19至21天，或在体内在约第21天测量T细胞扩增。

在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括表1中列出的任何序列(SEQ ID NO:84-302)。表1展示在CLE中测试的域的部分、名称(包括基因名称)和氨基酸序列。通常，CLE包括胞外域(表示为P1)、跨膜域(表示为P2)、第一胞内域(表示为P3)和第二胞内域(表示为P4)。通常，淋巴增生性元件包括第一胞内域。在说明性实施例中，第一胞内域可以包括表1中列举为S036至S0216的部分中的任一个或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括第二胞内域。在说明性实施例中，第二胞内域可以包括表1中列举为S036至S0216的部分中的任一个或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括胞外域。在说明性实施例中，胞外域可以包括表1中列举为M001至M049或E006至E015的部分的序列中的任一个或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括跨膜域。在说明性实施例中，跨膜域可以包括表1中列举为M001至M049或T001至T082的部分中的任一个或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，淋巴增生元件可以是细胞外/跨膜域(表1中的M001至M049)、第一胞内域(表1中的S036至S0216)和第二胞内域(表1中的S036至S216)的融合物。在一些实施例中，淋巴增生元件可以是胞外域(表1中的E006至E015)、跨膜域(表1中的T001至T082)、第一胞内域(表1中的S036至S0216)和第二胞内域(表1中的S036至S0216)的融合物。举例来说，淋巴增生性元件可以是E006、T001、S036和S216的融合物，也写成E006-T001-S036-S216。在说明性实施例中，淋巴增生性元件可以是融合物E010-T072-S192-S212、E007-T054-S197-S212、E006-T006-S194-S211、E009-T073-S062-S053、E008-T001-S121-S212、E006-T044-S186-S053或E006-T016-S186-S050。

在说明性实施例中，LE的胞内域或具有两个或更多个胞内域的LE中的第一胞内域不是来自含有ITAM的胞内域的功能性胞内活化域，例如来自CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70且在其它说明性实施例中，CD3z的胞内域。在说明性实施例中，LE的第二胞内域不是4-1BB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR及HVEM的共刺激域。在说明性实施例中，LE胞外域不包含单链可变片段(scFv)。在其它说明性实施例中，在与结合搭配物结合时活化LE的LE胞外域不包含单链可变片段(scFv)。

CLE不包含ASTR及来自以下的活化域：CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70。不受理论约束，相信胞外域及跨膜域在LE中起支持作用，确保胞内信号传导域在有效构形/定向/定位中以供驱动增殖。因此，相信LE驱动增殖的能力由LE的胞内域提供，且相信胞外域及跨膜域相对于胞内域起次要作用。淋巴增生性元件包括作为信号传导多肽的胞内域，所述信号传导多肽能够经由膜相关模体(例如跨膜域)驱动与膜相关联的T细胞或NK细胞的增殖，且定向于活性构形中或能够定向至活性构形中。在说明性实施例中，LE的ASTR不包括scFv。本文中提供用于使胞内域与膜缔合的策略，如通过包含跨膜域、GPI锚、豆蔻酰化区、棕榈酰化区和/或异戊烯化区。在一些实施例中，淋巴增生性元件不包括胞外域。

LE的胞外域、跨膜域及胞内域可改变其各别氨基酸长度。举例来说，对于包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的实施例，存在对可包装至反转录病毒颗粒中以使具有较短氨基酸序列的LE可在某些说明性实施例中有利的聚核苷酸的长度的限制。在一些实施例中，LE的总长度可在3个与4000个氨基酸之间，例如在10个与3000个氨基酸、10个与2000个氨基酸、50个与2000个氨基酸、250个与2000个氨基酸之间，且在说明性实施例中，在50个与1000个氨基酸、100个与1000个氨基酸或250个与1000个氨基酸之间。当存在以形成胞外域及跨膜域时，胞外域可在1个与1000个氨基酸之间，且通常在4个与400个氨基酸之间，在4个与200个氨基酸之间，在4个与100个氨基酸之间，在4个与50个氨基酸之间，在4个与25个氨基酸之间或在4个与20个氨基酸之间。在一个实施例中，胞外区为针对本发明的此方面的胞外域及跨膜域的GGGS。跨膜域或胞外域及跨膜域的跨膜区可在10个与250个氨基酸之间，且更通常长度为至少15个氨基酸，且长度可例如在15个与100个氨基酸、15个与75个氨基酸、15个与50个氨基酸、15个与40个氨基酸、15个与30个氨基酸之间。胞内信号传导域可例如在10个与1000个氨基酸、10个与750个氨基酸、10个与500个氨基酸、10个与250个氨基酸或10个与100个氨基酸之间。在说明性实施例中，胞内信号传导域可为至少30个氨基酸，或在30个与500个氨基酸、30个与250个氨基酸、30个与150个氨基酸、30个与100个氨基酸、50个与500个氨基酸、50个与250个氨基酸、50个与150个氨基酸或50个与100个氨基酸之间。在一些实施例中，具体基因的胞内信号传导域与来自所述胞内信号传导域的序列(如本文中所提供的所述胞内域的序列)的至少10、25、30、40或50个氨基酸(最多整个胞内域序列的尺寸)至少90％、95％、98％、99％或100％一致，且可以包括例如最多额外1、2、3、4、5、10、20或25个氨基酸，限制条件是这类序列仍能够提供本文中所公开的LE的任何特性。

在一些实施例中，淋巴增生性元件为嵌合细胞因子受体，如(但不限于)连接至其受体的细胞因子，所述受体通常组成性活化与对应经活化野生型细胞因子受体(如STAT3、STAT4，以及在说明性实施例中，STAT5)相同的STAT路径。在一些实施例中，嵌合细胞因子受体为介白素或其片段，所述介白素或其片段经由连接子连接至或共价连接至其同源受体。在一些实施例中，嵌合细胞因子受体是连接至IL7Rα的IL7(也称为IL7RA)。在其它实施例中，嵌合细胞因子受体是连接至IL-7Rα域的IL-7，如IL-7Rα的胞外域和/或IL-7Rα的跨膜域。在一些实施例中，淋巴增生元件为未连接至细胞因子的细胞因子受体，且实际上在一些实施例中，本文所提供的淋巴增生性元件为未连接至细胞因子的组成性活性的细胞因子受体。这些嵌合IL-7受体在表达时通常组成性活化STAT5。

在本文提供的包括淋巴增生性元件的方法及组合物中的任一个的说明性实施例中，其中淋巴增生性元件为细胞因子或细胞因子受体多肽或其包含信号传导域的片段，淋巴增生性元件可包含经由接头共价连接至其同源介白素受体多肽的部分。通常，同源介白素受体的此部分包括能够结合介白素细胞因子的胞外域及跨膜域的功能性部分。在一些实施例中，胞内域为同源介白素受体的胞内部分。在一些实施例中，胞内域为能够促进淋巴细胞增殖的不同细胞因子受体的胞内部分。在一些实施例中，淋巴增生性元件为经由连接子共价连接至其全长同源介白素受体多肽的介白素多肽。

在本文中所提供的包括淋巴增生性元件的方法及组合物中任一个的说明性实施例中，胞内域可来源于蛋白质IL7RA的一部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IL7RA的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IL7RA多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。IL7RA蛋白质具有富含丝氨酸残基的S区(全长IL7RA的359-394，对应于SEQ ID NO:248的残基96-133)、具有三个酪氨酸残基的T区(全长IL7RA的残基Y401、Y449和Y456，对应于SEQ ID NO:248的残基Y138、Y18和Y193)和可结合信号传导激酶Jak1的Box1模体(全长IL7RA的残基272-280，对应于SEQ IDNO:248和249的残基9-17)(Jiang,Qiong等人《分子和细胞生物学(Mol.and Cell.Biol.)》,第24卷(14):6501-13(2004))。在一些实施例中，本文中的淋巴增生性元件可以包括本文中所公开的或以其它方式已知诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IL7RA的一个或多个，例如全部域和模体。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:248或249中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于IL7RA的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa或约175aa至约200aa的长度。在说明性实施例中，来源于IL7RA的胞内域具有约30aa至约200aa的长度。在包括来源于IL7RA的第一胞内域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第二胞内域可以来源于TNFRSF8。

在本文中所提供的包括淋巴增生性元件的任何方法及组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于蛋白质IL12RB的一部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IL12RB的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IL12RB多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长IL12RB含有至少一个Box1模体PXXP(SEQ ID NO:306)，其中每个X可以是任何氨基酸(SEQ ID NO:254和255的残基10-12；和SEQ ID NO:256的残基107-110和139-142)(Presky DH等人《美国国家科学院院刊》,1996年11月26日；93(24))。在一些实施例中，包括IL12RB胞内域的淋巴增生性元件可以包括以上Box1模体或IL12RB的已知诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的其它模体、域或突变中的一个或多个。IL12RB的Box1模体是所属领域中已知的且所属领域的技术人员可以识别IL12RB多肽中的相应模体。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:254-256中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于IL12RB的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa或约200aa至约219aa的长度。在说明性实施例中，来源于IL12RB的胞内域具有约30aa至约219aa，例如30aa至92aa或30aa至90aa的长度。

在本文中所提供的包括淋巴增生性元件的方法及组合物中任一个的说明性实施例中，胞内域可来源于蛋白质IL31RA的一部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IL31RA的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IL31RA多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长IL31RA含有Box1模体PXXP(SEQ ID NO:306)，其中每个X可以是任何氨基酸(对应于SEQ ID NO:275和276的残基12-15)(Cornelissen C等人《欧洲细胞生物学杂志(Eur J Cell Biol.)》2012年6月-7月；91(6-7):552-66)。在一些实施例中，包括IL31RA胞内域的淋巴增生性元件可以包括Box1模体。全长IL31RA还含有对于下游信号传导来说重要的三个可磷酸化酪氨酸残基：Y652、Y683和Y721(对应于SEQ ID NO:275的残基Y96、Y237和Y165；这些酪氨酸残基不存在于SEQ IDNO:276中)(Cornelissen C等人《欧洲细胞生物学杂志》2012年6月-7月；91(6-7):552-66)。所有三个酪氨酸残基促进STAT1的活化，而Y652是STAT5活化所需的且Y721募集STAT3。在一些实施例中，具有IL31RA胞内域的淋巴增生性元件包括Box1模体和/或本文中所公开的已知的磷酸化位点。IL31RA的Box1模体及可磷酸化酪氨酸是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员将能够在类似IL31RA多肽中识别相应模体及可磷酸化酪氨酸。在其它实施例中，具有IL31RA胞内域的淋巴增生性元件不包括本文中所公开的已知的磷酸化位点。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:275或276中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于IL31RA的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa或约175aa至约189aa的长度。在说明性实施例中，来源于IL31RA的胞内域具有约30aa至约200aa，例如30aa至189aa、30aa至106aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于跨膜蛋白质CD40的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的CD40的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别CD40多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。CD40蛋白含有TRAF蛋白的若干结合位点。不受理论约束，TRAF1、TRAF2及TRAF3的结合位点位于CD40的胞内部分的膜远端域且包括氨基酸序列PXQXT(SEQ ID NO:303)，其中每个X可以是任何氨基酸(对应于SEQ ID NO:208的氨基酸35-39)(Elgueta等人,《免疫学综述(Immunol Rev.)》2009年5月；229(1):152-72)。还证实TRAF2结合于共同序列SXXE(SEQ ID NO:304)，其中每个X可以是任何氨基酸(对应于SEQ ID NO:208的氨基酸57-60)(Elgueta等人,《免疫学综述》2009年5月；229(1):152-72)。TRAF6的不同结合位点位于CD40的胞内部分的膜近端域且包括共同序列QXPXEX(SEQID NO:305)，其中每个X可以是任何氨基酸(对应于SEQ ID NO:208的氨基酸16-21)(Lu等人,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》2003年11月14日；278(46):45414-8)。在说明性实施例中，跨膜蛋白CD40的胞内部分可包括TRAF蛋白的所有结合位点。TRAF结合位点是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员将能够在类似CD40多肽中识别相应TRAF结合位点。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:209中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于CD40的胞内域具有约30个氨基酸(aa)至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa或约60aa至约65aa的长度。在说明性实施例中，来源于CD40的胞内域具有约30aa至约66aa，例如30aa至65aa或50aa至66aa的长度。在包括来源于CD40的第一胞内域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第二胞内域可以不是来源于以下的胞内域：MyD88、CD28家族成员(例如，CD28、ICOS)、模式识别受体、C反应性蛋白受体(即，Nodi、Nod2、PtX3-R)、TNF受体、CD40、RANK/TRANCE-R、OX40、4-1BB、HSP受体(Lox-1及CD91)或CD28。模式识别受体包括(但不限于)内吞模式识别受体(即，甘露糖受体、清除剂受体(即，Mac-1、LRP、肽聚醣、肌酸、毒素、CD11c/CR4))；外部信号模式识别受体(Toll样受体(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10)、肽聚醣识别蛋白质(PGRP结合细菌肽聚醣，和CD14)；内部信号模式识别受体(即，NOD-受体1和2)和RIG1。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于CD27的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的CD27的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别CD27多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长CD27的氨基酸219处的丝氨酸(对应于SEQID NO:205的氨基酸6处的丝氨酸)经展示为经磷酸化。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:205中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于CD27的胞内域具有约30个氨基酸(aa)至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa或约45aa至约50aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于CSF2RB的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的CSF2RB的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别CSF2RB多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长CSF2RB含有氨基酸474-482(对应于SEQ ID NO:213的氨基酸14-22)处的Box1模体。全长CSF2RB的氨基酸766处的酪氨酸(对应于SEQ ID NO:213的氨基酸306处的酪氨酸)展示为经磷酸化。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:213中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于CSF2RB的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa、约200aa至约250aa、约250aa至300aa、约300aa至350aa、约350aa至约400aa或约400aa至约450aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于IL2RB的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IL2RB的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IL2RB多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长IL2RB含有氨基酸278-286(对应于SEQID NO:240的氨基酸13-21)处的Box1模体。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ IDNO:240中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于IL2RB的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa、约200aa至约250aa或约250aa至300aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于IL6ST的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IL6ST的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IL6ST多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长IL6ST含有氨基酸651-659(对应于SEQID NO:247的氨基酸10-18)处的Box1模体。全长IL6ST的氨基酸661、氨基酸667、氨基酸782、氨基酸789、氨基酸829及氨基酸839处的丝氨酸(分别对应于SEQ ID NO:247的氨基酸20、氨基酸26、氨基酸141、氨基酸148、氨基酸188及氨基酸198处的丝氨酸)展示为经磷酸化。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:246或SEQ ID NO:247中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于IL6ST的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa、约200aa至约250aa或约250aa至300aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于IL17RE的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IL17RE的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IL17RE多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长IL17RE含有氨基酸372-495(对应于SEQ ID NO:265的氨基酸13-136)处的TIR域。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQID NO:265中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于IL17RE的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa或约175aa至约200aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于IL2RG的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IL2RG的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IL2RG多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长IL2RG含有氨基酸286-294(对应于SEQID NO:241的氨基酸3-11)处的Box1模体。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ IDNO:241中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于IL2RG的胞内域具有约30个氨基酸(aa)至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa或约70aa至约100aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于IL18R1的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IL18R1的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IL18R1多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长IL18R1含有氨基酸222-364(对应于SEQ ID NO:266的氨基酸28-170)处的TIR域。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQID NO:266中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于IL18R1的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa或约70aa至约100aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于IL27RA的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IL27RA的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IL27RA多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长IL27RA含有氨基酸554-562(对应于SEQ ID NO:273的氨基酸17-25)处的Box1模体。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:273或SEQ ID NO:274中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于IL27RA的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa或约70aa至约100aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于IFNGR2的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IFNGR2的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IFNGR2多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长IFNGR2含有氨基酸276-277(对应于SEQ ID NO:230的氨基酸8-9)处的双亮氨酸内化模体。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:230中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于IFNGR2的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于蛋白质MyD88的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的MyD88的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别MyD88多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。MyD88蛋白具有介导与其它含死亡域的蛋白相互作用的N端死亡域(对应于SEQ ID NO:284的氨基酸29-106)、与IL-1R相关激酶相互作用的中间域(对应于SEQ ID NO:284的氨基酸107-156)及与TLR-TIR域相关联的C端TIR域(对应于SEQ ID NO:284的氨基酸160-304)(《生物学研究(Biol Res.)》2007；40(2):97-112)。MyD88还具有典范的核定位及输出模体。点突变已在MyD88中识别出，且包括功能缺失突变L93P及R193C(对应于SEQ ID NO:284中的L93P及R196C)及功能获得突变L265P(对应于SEQ ID NO:284中的L260P)(Deguine及Barton.,《F1000Prime报告(F1000Prime Rep.)》,2014年11月4日；6:97)。在一些实施例中，本文中的淋巴增生性元件可以包括本文中所公开的MyD88的域和模体中的一个或多个，例如全部。在一些实施例中，合适的胞内域可以包括与SEQ ID NO:284-293中的至少10、15、20或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域且在说明性实施例中，包括以下MyD88域/模体中的一个或多个，在说明性实施例中，全部：死亡域、中间域、TIR域、核定位和输出模体、对应于位置L93、R193的氨基酸以及L265或P265。在一些实施例中，来源于MyD88的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa、约200aa至约250aa、约250aa至300aa或约300aa至350aa的长度。在说明性实施例中，来源于MyD88的胞内域具有约30aa至约350aa的长度，例如50aa至350aa，或100aa至350aa、100aa至304aa、100aa至296aa、100aa至251aa、100aa至191aa、100aa至172aa、100aa至146aa或100aa至127aa的长度。在包括来源于MyD88的第一胞内域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第二胞内域可以来源于TNFRSF4或TNFRSF8。在包括来源于MyD88的第一胞内域的淋巴增生性元件的其它说明性实施例中，第二胞内域可以不是来源于以下的胞内域：CD28家族成员(例如，CD28、ICOS)、模式识别受体、C反应性蛋白受体(即，Nodi、Nod2、PtX3-R)、TNF受体(即，CD40、RANK/TRANCE-R、OX40、4-1BB)、HSP受体(Lox-1及CD91)或CD28。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于跨膜蛋白质MPL的一部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的MPL的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别MPL多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。跨膜MPL蛋白含有Box1模体PXXP(SEQ IDNO:306)及Box2模体，其为具有增加的丝氨酸及谷氨酸含量(对应于SEQ ID NO:283中的氨基酸46-64)的区域，在PXXP中，每个X可为任何氨基酸(对应于SEQ ID NO:283中的氨基酸17-20)(Drachman及Kaushansky.,《美国国家科学院院刊》,1997年3月18日；94(6):2350-5)。Box1和Box2模体涉及与JAK的结合和信号转导，但增殖信号并非始终需要存在Box2模体(Murakami等人,《美国国家科学院院刊》,1991年12月15日；88(24):11349-53；Fukunaga等人《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》,1991年10月；10(10):2855-65；以及O'Neal和Lee.,《淋巴因子细胞因子研究(Lymphokine Cytokine Res.)》1993Oct；12(5):309-12)。许多细胞因子受体相对于Box1模体在位置-1、-2和-6处具有疏水性残基(分别对应于SEQ ID NO:283的氨基酸16、15和11)，其形成细胞因子诱导的JAK2活化但非JAK2结合所需的“开关模体”(Constantinescu等人,《分子细胞(Mol Cell.)》,2001年2月；7(2):377-85；和Huang等人,《分子细胞》,2001年12月；8(6):1327-38)。缺失涵盖SEQ ID NO:283中的氨基酸70至95的区域经展示以支持v-mpl的情形中的病毒转化(Benit等人,《病毒学杂志(J Virol.)》1994年8月；68(8):5270-4)，因此指示此区域于此情形中并非mpl的功能所必需。Morello等人,《血液(Blood)》,1995年7月；86(8):557-71使用相同缺失以展示此区域并非刺激红细胞生成素受体反应性CAT报导基因构筑体的转录所需的且进一步发现此缺失引起关于去除此区域中的非必需和阴性元件所预期的略微增强的转录，如由Drachman和Kaushansky提出。因此，在一些实施例中，MPL胞内信号传导域不含包含SEQ ID NO:283中的氨基酸70至95的区域。在全长MPL中，赖氨酸K553(对应于SEQ ID NO:283的K40)及K573(对应于SEQ ID NO:283的K60)经展示为充当泛素化靶向模体的部分的阴性调节位点(Saur等人,《血液》2010年2月11日；115(6):1254-63)。因此，在本文中的一些实施例中，MPL胞内信号传导域不包含这些泛素化靶向模体残基。在全长MPL中，已证实酪氨酸Y521(对应于SEQ ID NO:283的Y8)、Y542(对应于SEQ ID NO:283的Y29)、Y591(对应于SEQ ID NO:283的Y78)、Y626(对应于SEQID NO:283的Y113)和Y631(对应于SEQ ID NO:283的Y118)被磷酸化(Varghese等人,《前沿内分泌学(Front Endocrinol)》(Lausanne).2017年3月31日；8:59)。全长MPL的Y521和Y591是阴性调节性位点，其充当溶酶体靶向模体(Y521)的一部分或通过与接附蛋白AP2(Y591)的相互作用来发挥作用(Drachman和Kaushansky.《美国国家科学院院刊》,1997年3月18日；94(6):2350-5；和Hitchcock等人《血液》,2008年9月15日；112(6):2222-31)。全长MPL的Y626和Y631是阳性调节性位点(Drachman和Kaushansky.《美国国家科学院院刊》,1997年3月18日；94(6):2350-5)且Y626的鼠类同系物为Shc的细胞分化及磷酸化所需的(Alexander等人,《欧洲分子生物学杂志》,1996年12月2日；15(23):6531-40)且Y626也是在MPL中用下文所描述的W515A突变进行组成性信号传导所需的(Pecquet等人,《血液》,2010年2月4日；115(5):1037-48)。MPL含有Shc磷酸化酪氨酸结合结合模体NXXY(SEQ ID NO:307)，其中每个X可以是任何氨基酸(对应于SEQ ID NO:283的氨基酸110-113)，且此酪氨酸被磷酸化且对Shc、SHIP和STAT3的TPO依赖性磷酸化是重要的(Laminet等人,《生物化学杂志》,1996年1月5日；271(1):264-9；和van der Geer等人,《美国国家科学院院刊》,1996年2月6日；93(3):963-8)。MPL还含有STAT3共有结合序列YXXQ(SEQ ID NO:308)，其中每个X可为任何氨基酸(对应于SEQ ID NO:283的氨基酸118至121)(Stahl等人,《科学(Science)》,1995年3月3日；267(5202):1349-53)。此序列的酪氨酸可以被磷酸化且MPL能够进行部分STAT3募集(Drachman和Kaushansky.《美国国家科学院院刊》,1997年3月18日；94(6):2350-5)。MPL还含有序列YLPL(SEQ ID NO:309)(对应于SEQ ID NO:283的氨基酸113-116)，其与STAT5募集pYLXL(SEQ ID NO:310)的共有结合位点类似，其中pY是磷酸酪氨酸且X可以是任何氨基酸(May等人,《欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett.)》,1996年9月30日；394(2):221-6)。使用计算机模拟，Lee等人发现，MPL的跨膜域的临床相关突变应按以下次序的活化效果活化MPL：W515K(对应于SEQ ID NO:283的氨基酸取代W2K)>S505A(对应于SEQ ID NO:187的氨基酸取代S14A)>W515I(对应于SEQ ID NO:283的氨基酸取代W2I)>S505N(对应于SEQ IDNO:187的氨基酸取代S14N，其在实例12中经测试为T075(SEQ ID NO:188))(《科学公共图书馆综合卷(PLoS One.)》,2011；6(8):e23396)。预测这些突变的模拟可能造成JAK2(MPL的激酶搭配物)的组成性活化。在一些实施例中，MPL的胞内部分可以包括SEQ ID NO:283中存在的本文中所描述的域和模体中的一个或多个或全部。在一些实施例中，MPL的跨膜部分可以包括SEQ ID NO:187中存在的本文中所描述的域和模体中的一个或多个或全部。本文中所提供的MPL的域、模体及点突变为所属领域中已知的，且所属领域的技术人员将认识到，本文中的MPL胞内信号传导域在说明性实施例中将包括经展示促进增殖活性的对应域、模体及点突变，且将不包括经展示抑制MPL增殖活性的那些。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:283中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于MPL的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa、约200aa至约250aa、约250aa至300aa、约300aa至350aa、约350aa至约400aa、约400aa至约450aa、约450aa至约500aa、约500aa至约550aa、约550aa至约600aa或约600aa至约635aa的长度。在说明性实施例中，来源于MPL的胞内域具有约30aa至约200aa的长度，例如30aa至150aa、30aa至119aa、30aa至121aa、30aa至122aa或50aa至125aa的长度。在包括来源于MPL的第一胞内域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第二胞内域可以来源于CD79B。

在本文中所提供的包括淋巴增生性元件的任何方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于跨膜蛋白CD79B的一部分，所述跨膜蛋白也称为B29；IGB；AGM6。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的CD79B的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别CD79B多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。CD79B含有残基193至212(对应于SEQ ID NO:211的氨基酸16至30)处的ITAM模体。CD79B具有已知经磷酸化的两个酪氨酸Y196及Y207(对应于SEQ ID NO:211的Y16及Y27)。在一些实施例中，跨膜蛋白CD79B的胞内部分可包括本文中所公开的ITAM模体和/或已知的磷酸化位点。CD79B的模体及可磷酸化酪氨酸是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员将能够在类似CD79B多肽中识别相应模体及可磷酸化酪氨酸。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:211中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，源自CD79B的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa或约45aa至约50aa的长度。在说明性实施例中，来源于CD79B的胞内域具有约30aa至约50aa的长度。举例来说，合适的CD79B胞内活化域可包括与以下序列的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：LDKDDSKAGMEEDHT[YEGLDIDQTATYEDI]VTLRTGEVKWSVGEHPGQE(SEQ ID NO:211)，其中ITAM模体阐述于括号中。在包括来源于CD79B的第二胞内域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第一胞内域可以来源于CSF3R。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于跨膜蛋白质OSMR的一部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的OSMR的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别OSMR多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。OSMR含有同功异型物3的氨基酸771至779(对应于SEQ ID NO:294的氨基酸16至30)处的Box1模体。OSMR具有已知经磷酸化的同功异型物3的氨基酸829及890处的两个丝氨酸(SEQ ID NO:294的氨基酸65及128处的丝氨酸)。在一些实施例中，蛋白质OSMR的胞内部分可包括本文中所公开的Box1模体及已知的磷酸化位点。OSMR的模体及可磷酸化酪氨酸是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员将能够在类似OSMR多肽中识别相应模体及可磷酸化酪氨酸。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:294中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于OSMR的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa或约200aa至约250aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于跨膜蛋白质PRLR的一部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的PRLR的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别PRLR多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。PRLR含有同功异型物6的氨基酸185至261(对应于SEQ ID NO:295的氨基酸28至104)处的生长激素受体结合域。PRLR的生长激素受体结合域是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员将能够在类似PRLR多肽中识别相应的域。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:295中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于PRLR的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa、约200aa至约250aa、约250aa至300aa、约300aa至350aa或约350aa至约400aa的长度。

在一些实施例中，淋巴增生性元件的胞内域是来源于跨膜蛋白质CD30的胞内部分(也称为TNFRSF8、DlS166E和Ki-1)。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于蛋白质CD28的一部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的CD28的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别CD28多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长CD28含有PI3-K和Grb2结合模体，其对应于SEQ ID NO:206和207{1的残基12-15(Harada等人,《实验医学杂志(J Exp Med.)》2003年1月20日；197(2):257-62)。在一些实施例中，包括CD28胞内域的淋巴增生性元件可以包括PI3-K和Grb2结合模体。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:206或207中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于CD28的胞内域具有约5aa至约10aa、约10aa至约15aa、约15aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约35aa或约35aa至约42aa的长度。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内域可来源于蛋白质ICOS的一部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的ICOS的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别ICOS多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。与CD28不同，ICOS结合PI3-K且不结合Grb2。全长ICOS的PI3-K结合模体对应于SEQ ID NO:225的残基19-22。此模体中的单氨基酸取代可以引起Grb2与ICOS结合和增加的IL-2产生(Harada等人,《实验医学杂志》,2003年1月20日；197(2):257-62)。此突变对应于SEQ ID NO:225的苯丙氨酸21突变成天冬酰胺。所属领域的技术人员将理解如何使SEQ ID NO:225中的此残基突变和产生除PI3-K以外，与Grb2结合的ICOS胞内域。在一些实施例中，包括ICOS胞内域的淋巴增生性元件可以包括PI3-K结合模体。在一些实施例中，包括ICOS胞内域的淋巴增生性元件可以包括突变成还结合Grb2的PI3-K结合模体。ICOS还在细胞质尾区中含有膜近端模体，其是ICOS辅助的钙信号传导所必需的(Leconte等人,《分子免疫学(Mol Immunol.)》,2016年11月；79:38-46)。此钙信号传导模体对应于SEQ ID NO:225的残基5-8。在一些实施例中，包括ICOS胞内域的淋巴增生性元件可以包括钙信号传导模体。已在全长ICOS中鉴别两种其它保守性模体。残基170-179(对应于SEQ ID NO:225的残基9-18)处的第一保守性模体和残基185-191(对应于SEQ ID NO:225的残基24-30)处的第二保守性模体(Pedros等人,《自然免疫学》,2016年7月；17(7):825-33)。这两种保守性模体可能在介导下游ICOS信号传导中具有重要功能。在一些实施例中，包括ICOS胞内域的淋巴增生性元件可以包括第一或第二保守性模体中的至少一个。在一些实施例中，包括ICOS胞内域的淋巴增生性元件不包括第一保守性模体、不包括第二保守性模体或不包括第一和第二保守性模体。在一些实施例中，合适的胞内域可包括与SEQ ID NO:225中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些实施例中，来源于ICOS的胞内域具有约5aa至约10aa、约10aa至约15aa、约15aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约35aa或约35aa至约38aa的长度。

在一些实施例中，嵌合淋巴增生性元件的胞内域是来源于跨膜蛋白质OX40(也称为TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX-40、TXGPlL)的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的OX40的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别OX40多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。OX40含有全长OX40的残基256-263(对应于SEQ ID NO:296的残基20-27)处的TRAF结合模体，其对于结合TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5来说是重要的(Kawamata,S等人,《生物化学杂志》,1998年3月6日；273(10):5808-14；Hori,T.《国际血液学杂志(Int J Hematol.)》,2006年1月；83(1):17-22)。全长OX40还含有残基34-57处的p85 PI3K结合模体。在一些实施例中，当存在OX40作为淋巴增生性元件的胞内域时，其包括OX40的p85 PI3K结合模体。在一些实施例中，OX40的胞内域可以包括OX40的TRAF结合模体。在一些实施例中，OX40的胞内域可以结合TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5。对应于SEQ ID NO:296的氨基酸17及41的赖氨酸为充当泛素靶向模体的部分的潜在负性调节位点。在一些实施例中，OX40的胞内域中的这些赖氨酸中的一个或两个为突变型精氨酸或另一种氨基酸。在一些实施例中，淋巴增生性元件的合适的胞内域可以包括与SEQ ID NO:57中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些这些实施例中，OX40的胞内域具有约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa或约45aa至约50aa的长度。在说明性实施例中，OX40的胞内域具有约20aa至约50aa，例如20aa至45aa或20aa至42aa的长度。

在一些实施例中，嵌合淋巴增生性元件的胞内域是来源于跨膜蛋白质IFNAR2的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的IFNAR2的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别IFNAR2多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长IFNAR2含有Box1模体和两个Box2模体(称为Box2A和Box2B)。(Usacheva A等人《生物化学杂志》2002年12月13日；277(50):48220-6)。在一些实施例中，包括IFNAR2胞内域的淋巴增生性元件可以包括Box1或Box2模体中的一个或多个。在说明性实施例中，IFNAR2胞内域可以包括Box1、Box2A或Box2B模体中的一个或多个。IFNAR2含有JAK1结合位点(Gauzzi等人,《美国国家科学院院刊》,1997年10月28日；94(22):11839-44；Schindler等人《生物化学杂志》,2007年7月13日；282(28):20059-63)。在一些实施例中，包括IFNAR2胞内域的淋巴增生性元件可以包括JAK1结合位点。在一些实施例中，淋巴增生性元件的合适的胞内域可以包括与SEQ ID NO:227或228中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些这些实施例中，IFNAR2的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa或约200aa至约251aa的长度。在说明性实施例中，OX40的胞内域具有约30aa至约251aa，例如30aa至67aa的长度。

在一些实施例中，嵌合淋巴增生性元件的胞内域是来源于跨膜蛋白质CSF3R的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的CSF3R的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别CSF3R多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。全长CSF3R含有Box1和Box2模体以及Box3模体(Nguyen-Jackson HT等人,《G-CSF受体结构、功能和胞内信号转导(G-CSF Receptor Structure,Function,andIntracellular Signal Transduction)》,《G-CSF的二十年(Twenty Years of G-CSF)》,(2011)83-105)。在一些实施例中，包括CSF3R胞内域的淋巴增生性元件可以包括Box1、Box2或Box3模体中的一个或多个。CSF3R含有四个酪氨酸残基，全长CSF3R中的Y704、Y729、Y744和Y764，其对于结合STAT3(Y704和Y744)、SOCS3(Y729)以及Grb2和p21Ras(Y764)来说是重要的。在一些实施例中，包括CSF3R胞内域的淋巴增生性元件可以包括对应于全长CSF3R的Y704、Y729、Y744和Y764的酪氨酸残基中的一个、两个、三个或全部。CSF3R含有两个苏氨酸残基，全长CSF3R中的T615和T618，其在分别突变成丙氨酸和异亮氨酸时(T615A和T618I)可以增加受体二聚作用和活性(Maxson等人,《生物化学杂志》2014年2月28日；289(9):5820-7)。在一些实施例中，包括CSF3R胞内域的淋巴增生性元件可以包括对应于T615A和T618I的突变中的一个或多个。在一些实施例中，淋巴增生性元件的合适的胞内域可以包括与SEQID NO:216、217或218中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些这些实施例中，CSF3R的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa或约200aa至约213aa的长度。在说明性实施例中，CSF3R的胞内域具有约30aa至约213aa，例如约30aa至约186或约30aa至约133aa的长度。

在一些实施例中，嵌合淋巴增生性元件的胞内域是来源于跨膜蛋白质EPOR的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的EPOR的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别EPOR多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。EPOR含有Box1(全长EPOR的残基257-264)和Box2(全长EPOR的残基303-313)模体(Constantinescu SN.,《内分泌代谢趋势(Trends Endocrinol Metab.)》,1999年12月；10(1):18-23)。EPOR还含有延伸的Box2模体(残基329-372)，其对于结合酪氨酸激酶受体KIT来说是重要的(Constantinescu SN.,《内分泌代谢趋势》,1999年12月；10(1):18-23)。在一些实施例中，包括EPOR胞内域的淋巴增生性元件可以包括Box1、Box2或延伸的Box2模体中的一个或多个。EPOR还含有对于EPOR内化来说重要的短区段(全长EPOR的残基267-276)。在一些实施例中，包括EPOR胞内域的淋巴增生性元件不包括内化区段。在一些实施例中，淋巴增生性元件的合适的胞内域可以包括与SEQ ID NO:219或220中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些这些实施例中，EPOR的胞内域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa或约200aa至约235aa的长度。在说明性实施例中，EPOR的胞内域具有约30aa至约235aa的长度。

在一些实施例中，嵌合淋巴增生性元件的胞内域是来源于跨膜蛋白质CD3G的胞内部分。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的CD3G的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别CD3G多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。已证实全长CD3G的两个丝氨酸残基，S123和S126响应于离子霉素而在T细胞中磷酸化(Davies等人,《生物化学杂志》,1987年8月15日；262(23):10918-21)。在一些实施例中，包括CD3G胞内域的淋巴增生性元件可以包括对应于全长S123和S126的丝氨酸残基中的一个或多个。此外，证实S126而非S123处的磷酸化是PKC介导的下调所需的(Dietrich J等人,《欧洲分子生物学杂志》,1994年5月1日；13(9):2156-66)。在一些实施例中，包括CD3G胞内域的淋巴增生性元件可以包括对应于全长S123的丝氨酸残基且不包括对应于全长S126的丝氨酸残基。在一些实施例中，包括CD3G胞内域的淋巴增生性元件可以包括对应于全长S126的丝氨酸残基处的非可磷酸化氨基酸取代。在说明性实施例中，氨基酸取代可以是丝氨酸突变成丙氨酸。此外，证实二-亮氨酸模体中的任一个亮氨酸，全长CD3G中的L131和L132的亮氨酸到丙氨酸突变可以阻止PKC介导的下调(Dietrich J等人,《欧洲分子生物学杂志》,1994年5月1日；13(9):2156-66)。在一些实施例中，包括CD3G胞内域的淋巴增生性元件可以包括对应于全长CD3G的L131或L132的亮氨酸残基处的至少一个氨基酸取代。在说明性实施例中，氨基酸取代可以是亮氨酸突变成丙氨酸。在一些实施例中，淋巴增生性元件的合适的胞内域可以包括与SEQ ID NO:199中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在一些这些实施例中，CD3G的胞内域具有约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约35aa、约35aa至约40aa或约40aa至约45aa的长度。在说明性实施例中，CD3D的胞内域具有约30aa至约45aa的长度。

TNF受体(TNFR)的细胞质域，其在说明性实施例中可以是TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18，可以募集信号传导分子，包括TRAF(TNF受体相关因子)和/或“死亡域”(DD)分子。诱导T细胞和/或NK细胞的增殖和/或存活的TNFR的域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别TNFR多肽中相应的域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。在哺乳动物中，存在至少六种TRAF分子和多种非受体DD分子。结合于TRAF的受体和接附蛋白共有所属领域中已知的短共同TRAF结合模体(Meads等人,《免疫学杂志》,2010年8月1日；185(3):1606-15)。DD结合模体是具有6个保守性α螺旋的约60个氨基酸球状束，其也是所属领域中已知的(Locksley RM等人,《细胞》,2001年2月23日；104(4):487-501)。所属领域的技术人员将能够使用例如与已知的结合模体的序列比对来识别不同TNFR家族中的TRAF和/或DD结合模体。TNFR可以募集TRADD和TRAF2，引起NF-κB、MAPK和JNK的活化(Sedger和McDermott.《细胞因子生长因子综述(Cytokine GrowthFactor Rev.)》,2014年8月；25(4):453-72)。在一些实施例中，包括TNFR胞内域的淋巴增生性元件可以包括一个或多个TRAF结合模体。在一些实施例中，包括TNFR胞内域的淋巴增生性元件不包括DD结合模体，或具有在胞内域内缺失或突变的一个或多个DD结合模体。在一些实施例中，包括TNFR胞内域的淋巴增生性元件可以募集TRADD和/或TRAF2。TNFR还包括富含半胱氨酸的域(CRD)，其对于配位体结合来说是重要的(Locksley RM等人,《细胞》,2001年2月23日；104(4):487-501)。在一些实施例中，包括TNFR胞内域的淋巴增生性元件不包括TNFR CRD。

可以包括在本文中所公开的任何方面中的淋巴增生性元件和CLE可以是WO2019/055946中所公开的任何LE或CLE。其中公开CLE，所述CLE促进用编码CLE慢病毒颗粒转导的PBMC在转导之后第7天至第21、28、35和/或42天的细胞培养物中的增殖。此外，其中鉴别CLE，其在存在或不存在由CAR识别的抗原的情况下促进小鼠中的体内增殖，其中将表达CLE和CAR中的一个的T细胞引入小鼠中。如其中例示，实例提供测试和/或标准可用于识别任何测试多肽，包括LE或LE的测试域，如第一胞内域或第二胞内域或第一及第二胞内域两者是否确实为LE或LE的有效胞内域，或特别有效的LE或LE的胞内域。因此，在某些实施例中，本文中所提供的包括LE或编码LE的聚核苷酸或核酸的任何方面或其它实施例可以证明LE符合关于用于识别本文中所提供的LE的所识别的测试或准则中的任一个或多个，或提供所述测试或准则的特性，或能够提供和/或具有所述测试或准则的特性，或用反转录病毒颗粒(如编码LE的慢病毒颗粒)基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、具有和/或被修饰以实现所述测试中的一个或多个的结果。在一个实施例中，与对照性反转录病毒颗粒(例如在相同条件下的慢病毒颗粒)相比，LE提供、能够提供和/或具有以下的特性(或用编码LE的反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于)：在不存在外源添加的细胞因子的情况下，在体外转导后培养的第7天至第21、28、35和/或42天，改善的针对用包含编码LE的核酸的慢病毒和包含CD3ζ胞内活化域(但不包含共刺激域)的抗CD19 CAR转导的预先活化的PBMC的扩增。在一些实施例中，针对用反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)转导的细胞的改善或增强的存活率、扩增和/或增殖的淋巴增生性元件测试可以基于与对照细胞比较来进行，所述反转录病毒颗粒具有编码测试构筑体的基因组，所述测试构筑体编码假设的LE(测试细胞)，所述对照细胞可以是例如未被转导的细胞或用对照性反转录病毒(例如慢病毒)颗粒转导的细胞，所述对照性反转录病毒颗粒与包含编码淋巴增生性元件的核酸的慢病毒颗粒相同，但不具有淋巴增生性元件，或不具有测试多肽构筑体的一个或多个胞内域，但包含相同的胞外域(如果存在)，以及相应测试多肽构筑体的相同跨膜区或膜靶向区。在一些实施例中，用具有编码本文中如例示淋巴增生性元件所识别的淋巴增生性元件或其胞内域的基因组的反转录病毒颗粒(例如，慢病毒颗粒)转导对照细胞。在这类实施例中，测试标准可包括：当使用具有相对于编码对照淋巴增生性元件编码测试构筑体的基因组的反转录病毒颗粒(例如，慢病毒颗粒)，通常通过分析经其转导的细胞进行测试时，存在至少足够多的富集、存活和/或扩增，或不存在富集、存活和/或扩增的统计差异。在一些实施例中，本文中的淋巴增生性元件的例示性或说明性实施例为针对这类测试的对照淋巴增生性元件的说明性实施例。

在一些实施例中，通过进行复制和/或进行统计测试来进行针对推定或测试淋巴增生性元件的经改善特性的此测试。所属领域的技术人员将认识到，许多统计测试可用于这类淋巴增生性元件测试。涵盖这些实施例中的这类测试将为所属领域中已知的任何这类测试。在一些实施例中，统计测试可为T测试或曼-惠特尼-威尔科克森测试(Mann-Whitney-Wilcoxon test)。在一些实施例中，测试构筑体的标准化富集水平在小于0.1或小于0.05或小于0.01的p值下为显著的。

在另一实施例中，当与包含CD3ζ胞内活化域但不包含共刺激域的抗CD19 CAR一起转导时，在不存在外源添加的细胞因子的情况下的体外培养的第7天至第21、28、35和/或42天，LE提供以下、能够提供以下和/或具有以下特性(或用LE基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于)：用编码LE的核酸转导的预先活化的PBMC的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍扩增，或1.5倍至25倍扩增，或2倍至20倍扩增，或2倍至15倍扩增，或5倍至25倍扩增，或5倍至20倍扩增，或5倍至15倍扩增。在一些实施例中，于PBMC的存在下，例如以经转导细胞与PBMC(其可例如来自经匹配供体)的1:1比率进行测试，且在一些实施例中，所述测试不存在PBMC的情况下进行。在一些实施例中，如WO2019/055946中所说明进行这些测试中的任一个的扩增的分析。在一些实施例中，测试可包括其它统计测试及截止值，如低于0.1、0.05或0.01的P值，其中测试多肽或编码所述测试多肽的核酸需要满足一个或两个临限值(即倍数扩增及统计截止值)。

对于本文中所提供的淋巴增生性元件测试中的任一个，在转导后的第7天与第14天、第21天、第28天、第35天、第42天或第60天之间，将测试细胞的数目与对照细胞的数目进行比较。在一些实施例中，可通过对DNA进行测序及对存在于各构筑体中的标识符进行计数来测定测试及对照细胞的数目。在一些实施例中，可例如用血细胞计数器或细胞计数器直接地计数测试及对照细胞的数目。在一些实施例中，所有测试细胞及对照细胞可生长于相同容器、孔或烧瓶内。在一些实施例中，可将测试细胞接种于一个或多个孔、烧瓶或容器中，且可将对照细胞接种于一个或多个烧瓶或容器中。在一些实施例中，可将测试及对照细胞可单独接种至孔或烧瓶中，例如每孔一个细胞。在一些实施例中，可使用富集水平将测试细胞与对照细胞的数目进行比较。在一些实施例中，可通过各构筑体将稍后时间点处(第14天、第21天、28天、35天或第45天)的细胞数除以第7天的细胞数来计算测试或对照构筑体的富集水平。在一些实施例中，可通过针对未经转导的细胞将一个时间点处(第14天、第21天、28天、35天或第45天)的细胞数除以在所述时间点处的细胞数来计算测试或对照构筑体的富集水平。在一些实施例中，可将各测试构筑体的富集水平标准化为各别对照构筑体的富集水平以产生经标准化的富集水平。在一些实施例中，在测试构筑体中编码的LE提供(或用具有编码LE的基因组的反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于)至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍标准化富集水平，或1.5倍至25倍标准化富集水平，或3倍至20倍标准化富集水平，或5倍至25倍标准化富集水平，或5倍至20倍标准化富集水平，或5倍至15倍标准化富集水平。可例如通过直接细胞计数来测量富集。截止值可以基于单次测试，或两次、三次、四次或五次重复，或基于许多次重复。当淋巴增生性元件符合一个或多个重复测试时，或符合或超过全部重复的截止值时，可以符合截止值。在一些实施例中，富集经测量为log

如WO2019/055946中所说明，CLE经识别来自包括编码测试嵌合多肽(被设计成包含相信诱导淋巴或骨髓细胞的增殖和/或存活的胞内域)及抗CD19 CAR(包含胞内活化域但不包含共刺激域)的构筑体的构筑体库。在包含PBMC、淋巴细胞的市售培养基(完全OpTmizer

如WO2019/055946中所说明，将测试构筑体识别为CLE，这是因为CLE在这些馈入或未馈入培养物中诱导增殖/扩增，而无需在第7天与第21天、第28天、35天和/或42天之间添加细胞因子，如IL-2。举例来说，如WO2019/055946中所说明，相较于不包括任何胞内域的对照构筑体，在转导后第7天与第21天、第28天、第35天和/或第42天之间，通过识别提供这些体外培养物的经增加扩增的测试CLE来识别有效CLE，而不论是否馈入或未馈入未被转导的PBMC。WO2019/055946公开至少一种且通常超过一种测试CLE，其包括来自测试基因的胞内域，所述胞内域与存在于转导后第7天的不包括胞内域的每种对照构筑体相比提供更多的扩增。WO2019/055946还提供提供统计方法，所述统计方法用于识别关于第一胞内域以及来自这些基因的一个或多个例示性胞内域的特别有效的基因。所述方法使用曼-惠特尼-威尔科克森测试及小于0.1或小于0.05的假发现截止率。WO2019/055946识别第一胞内域或第二胞内域的尤其有效的基因，例如通过分析以所有具有所述基因的构筑体的组合分数形式计算的基因的分数。这类分析可以使用大于1的截止值，或大于无任何胞内域的阴性对照构筑体，或大于2，如WO2019/055946中所公开的一些测试所展示。

在另一实施例中，LE提供、能够提供和/或具有以下特性(或用LE基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、拥有以下特性和/或被修饰以用于)：体内驱动T细胞扩增。举例来说，体内测试可以利用小鼠模型且在T细胞与引入小鼠中的编码LE的慢病毒载体接触之后，在第15至25天体内，或在第19至21天体内，或在约第21天体内测量T细胞扩增，如WO2019/055946中所公开。

在包括LE(其通常包括CAR)的例示性方面和实施例中，如本文中所提供的用于基因修饰的方法、被基因修饰和/或转导的细胞和其用途中，被基因修饰的细胞被修饰以便具有在基因修饰和/或转导之前细胞不预先具有的新特性。这类特性可由使用编码CAR或LE(且在说明性实施例中，CAR及LE两者)的核酸的基因修饰来提供。举例来说，在某些实施例中，被基因修饰和/或转导的细胞能够、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于：在不存在所添加的IL-2的情况下或在不存在所添加的如IL-2、IL-15或IL-7等细胞因子情况下且在某些说明性实施例中，在存在由CAR识别的抗原情况下，在转导后至少7、14、21、28、35、42或60天或第7天至第14、21、28、35、42或60天的离体培养物中的存活和/或增殖，其中所述方法包含使用在表面上具有假型化元件和任选的单独或稠合的活化域的反转录病毒颗粒进行基因修饰且通常无需预先活化。

在某些实施例中，能够增强存活和/或增殖是指被基因修饰和/或转导的细胞呈现、能够、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于：与对照细胞(其与基因修饰和/或转导之前的被基因修饰和/或转导的细胞相同)或用与测试中的反转录病毒颗粒相同的反转录病毒颗粒(其包含LE或假设的LE，但不包含LE或LE的胞内域)转导的对照细胞相比，在不存在一种或多种所添加的细胞因子(如IL-2、IL-15或IL-7)或所添加的淋巴细胞促有丝分裂剂的情况下，培养基中离体或体外培养中改善的存活或扩增，其中所述对照细胞的所述存活或增殖是由向培养基中添加所述一种或多种细胞因子(如IL-2、IL-15或IL-7)或所述淋巴细胞促有丝分裂剂而促进。通过所添加细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂，意谓将细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂自外源添加至培养基，使得相较于初始培养基，在培养细胞期间，所述细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂的浓度在培养基中增加，且在一些实施例中，在所述添加之前可不存在初始培养基。“添加”或“外源添加”是指将这类细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂添加到用于在基因修饰后培养被基因修饰和/或转导的细胞的淋巴细胞培养基中，其中培养基可以具有或可以不具有细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂。在无外源性添加的细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂的情况下，包括多种培养基组分的混合物的所有或部分培养基通常经储存，且在说明性实施例中，运送至培养发生的位点。在一些实施例中，淋巴细胞培养基是从供应商处购买的，并且未由供应商雇用并且不在供应商设施内的用户(如技术人员)将外源添加的细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂添加到淋巴细胞培养基中，且接着在存在或不存在这类外源添加的细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂的情况下培养被基因修饰和/或转导的细胞。

在一些实施例中，改善的或增强的存活、扩增和/或增殖可以展示为通过对来自用具有编码CLE的基因组的反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)转导的细胞的DNA进行测序并且对每个CLE的唯一标识符中存在的序列的发生进行计数来确定的细胞数目的增加。在一些实施例中，可通过于每一时间点处用血细胞计数器或细胞计数器直接对细胞计数来测定经提高的存活和/或经提高的扩增。在一些实施例中，可通过针对各构筑体将稍后时间点处(第21天、第28天、第35天和/或第45天)的细胞数除以第7天的细胞数来计算经改善的存活和/或经改善的扩增和/或富集。在一些实施例中，可通过血细胞计数器或细胞计数器来对细胞进行计数。在一些实施例中，可使用各特定测试构筑体的核酸计数或细胞计数所测定的富集水平标准化为各别对照构筑体(即，具有相同胞外域及跨膜域但缺少存在于测试构筑体中的胞内域的构筑体)的富集水平。在这些实施例中，在测试构筑体中编码的LE提供(或用具有编码LE的基因组的反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于)至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍标准化富集水平，或1.5倍至25倍标准化富集水平，或3倍至20倍标准化富集水平，或5倍至25倍标准化富集水平，或5倍至20倍标准化富集水平，或5倍至15倍标准化富集水平。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法、用途、被基因修饰的T细胞和/或NK细胞和其它组合物方面的说明性实施例中，淋巴增生性元件可以包括胞内域或其片段，所述胞内域或其片段在本文中的表4至8中识别的CLE中包括来自任何具有P3信号传导域的(具有或不具有P4域)基因或来自任何具有P4域的基因(其中P3域是连接子)的胞内信号传导域，其促进体内T细胞(例如CAR-T细胞)扩增。在本文中所提供的任何包括具有P3和P4域的淋巴增生性元件的方法、用途和组合物方面的说明性实施例中，所述淋巴增生性元件可以在P4位置包括胞内域或其片段，所述胞内域或其片段在本文中的表4至8中识别的CLE中包括来自任何在具有P3和P4信号传导域的构筑体中具有P4信号传导域的基因的信号传导域，其促进体内T细胞(例如CAR-T细胞)扩增。在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法、用途和组合物方面的说明性实施例中，所述淋巴增生性元件可以包括胞内域或其片段，所述胞内域或其片段在本文中的表4至8中识别的任何CLE中包括来自任何具有P3信号传导域的基因的信号传导域和来自相同的CLE中的任何具有P4域的基因的信号传导域(在说明性实施例中，分别在P3和P4位置中)，其促进体内T细胞(例如CAR-T细胞)扩增。在此段落中提供的实施例的任何CLE中，P2域可来自任何识别为在本文中的表4至8中发现的CLE中具有P2部分的基因。此外，在一些说明性实施例中，CLE可以包括来自表4至8的P1域。

在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法、用途、被基因修饰的T细胞和/或NK细胞和其它组合物方面的说明性实施例中，所述淋巴增生性元件可以包括来自本文中的表4至8中识别的任何CLE的P3信号传导域，其促进体内T细胞(例如CAR-T细胞)扩增，或来自本文中的表4至8中识别的任何CLE的不具有P3信号传导域的构筑体中的P4信号传导域，其促进体内T细胞(例如CAR-T细胞)扩增。在本文中所提供的任何包括具有P3和P4域的淋巴增生性元件的方法、用途和组合物方面的说明性实施例中，淋巴增生性元件可以在P4位置处包括具有本文中的表4至8中识别的CLE中的P3和P4信号传导域的构筑体中的P4信号传导域，其促进体内T细胞(例如CAR-T细胞)扩增。在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法、用途和组合物方面的说明性实施例中，淋巴增生性元件可以分别在P3和P4位置包括来自本文中的表4至8中识别的CLE中的任一个的P3信号传导域和P4信号传导域，其促进体内T细胞(例如CAR-T细胞)扩增。此外，在一些说明性实施例中，CLE可以包括来自表4至8的P1域。在此段落中提供实施例的任何CLE中，P2域可以包含或可以是来自在本文中的表4至8中发现的CLE的任何P2域，或在说明性实施例中，淋巴增生性元件可以包括P2域、P3域和P4域以及任选的P1域，其皆来自本文中的表4至8中识别的相同CLE。在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法、用途、被基因修饰的T细胞和/或NK细胞以及其它组合物方面的某些说明性实施例中，淋巴增生性元件可具有P3和P4域S121-S212或S186-S053，或P2、P3和P4域T001-S121-S212或T044-S186-S053，任选地具有P1域E008或E006。

在一些实施例中，淋巴增生性元件可包括细胞因子受体或片段，所述细胞因子受体或片段包括其信号传导域。在一些实施例中，细胞因子受体可为CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2R、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7R、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13R、IL13RA1、IL13RA2、IL15R、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27R、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、MPL、OSMR、PRLR、TGFβR、TGFβ诱饵受体、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18。在一些实施例中，细胞因子受体可为CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL22RA1、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18。

在说明性实施例中淋巴增生性元件可以包含来自以下细胞因子受体的胞内域：CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RB、IL18R1、IL18RAP、IL20RB、IL22RA1、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18。在说明性实施例中，淋巴增生性元件中的胞内域包含来自以下的域：CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、MYD88、TNFRSF14或TNFRSF18，其存在于如WO2019/055946中所公开的在初始筛检及重复筛检中显示尤其值得注意的富集的构筑体中。

在说明性实施例中，淋巴增生性元件可包含来自CD27、CD28、OX40(也称为TNFRSF4)、GITR(也称为TNFRSF18)或HVEM(也称为TNFRSF14)的共刺激域。在一些实施例中，包含来自OX40的共刺激域的淋巴增生性元件不包含来自CD3Z、CD28、4-1BB、ICOS、CD27、BTLA、CD30、GITR或HVEM的胞内域。在一些实施例中，包含来自GITR的共刺激域的淋巴增生性元件不包含来自CD3Z、CD28、4-1BB、ICOS、CD27、BTLA、CD30或HVEM的胞内域。在一些实施例中，包含来自CD28的共刺激域的淋巴增生性元件不包含来自CD3Z、4-1BB、ICOS、CD27、BTLA、CD30或HVEM的胞内域。在一些实施例中，包含来自OX40、CD3Z、CD28、4-1BB、ICOS、CD27、BTLA、CD30、GITR或HVEM的共刺激域的淋巴增生性元件不包含跨膜域的卷曲螺旋间隔子域。在一些实施例中，包含来自GITR的共刺激域的淋巴增生性元件不包含来自CD3Z的胞内域，所述CD3Z为GITR的共刺激域的N端。

在某些说明性实施例中，淋巴增生性元件包含CD40、MPL和IL2Rb的胞内域。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以不是细胞因子受体。在一些实施例中，除细胞因子受体以外的淋巴增生性元件可包括来自以下的胞内信号传导域：CD2、CD3D、CD3G、CD3Z、CD4、CD8RA、CD8RB、CD28、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C或ICOS。

在一些实施例中，包括CLE的淋巴增生性元件包含如上文所公开的胞内活化域。在一些说明性实施例中，淋巴增生性元件是包含胞内活化域的CLE，所述胞内活化域包含含有ITAM的域，因此，CLE可以包含与本文中所提供的CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70域具有至少80％、90％、95％、98％或100％序列一致性的胞内活化域，其中CLE不包含ASTR。在某些说明性实施例中，胞内活化域为来自以下的含有ITAM的域：CD3D、CD3G、CD3Z、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A或FCGR2C。包含这些胞内活化域的CLE说明于WO2019/055946中，其在不存在外源性细胞因子(如外源性IL-2)的情况下有效促进离体培养物中PBMC的增殖。在一些实施例中，本文提供包含来自以下的胞内域的CLE：CD3D、CD3G、CD3Z、CD79A、FCER1G。

在一些实施例中，淋巴增生性元件的一个或多个域与CAR的调节域(如共刺激域)和/或胞内活化域融合。在用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面的一些实施例中，淋巴增生性元件的一个或多个胞内域可以是与CAR相同的多肽的一部分或可以与CAR的一些组件稠合和任选地功能性连接。在其它实施例中，经工程改造的信号传导多肽可包括ASTR、胞内活化域(如CD3ζ信号传导域)、共刺激域及淋巴增生域。关于共刺激域、胞内活化域、ASTR及其它CAR域的其它细节公开于本文中的其它地方中。

在一些实施例中，淋巴增生性元件不为多肽，相反包含抑制性RNA。在一些实施例中，根据本文中的任何方面的过程的方法、用途、组合物及产物包括包含抑制性RNA的淋巴增生性元件和为经工程改造的信号传导多肽的淋巴增生性元件。在其中淋巴增生性元件是或包含抑制性RNA或多重抑制性RNA的实施例中，所述抑制性RNA或多重抑制性RNA可具有本文中其它地方，例如在本文中的抑制性RNA分子部分中识别的任何结构。在一些实施例中，抑制性RNA可以是通常通过增强STAT5的活化来刺激STAT5路径的miRNA，所述增强活化是通过SOCS路径中的阴性调节剂的下调或引起所述下调来进行。抑制性RNA淋巴增生性元件可靶向本文中的抑制性RNA分子部分或本文中的其它地方识别的任何mRNA。

在说明性实施例中，如本文中例示，这类抑制性RNA(例如miRNA)可以位于包装细胞和/或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒基因组和/或反转录病毒载体中的内含子中，通常具有由在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子驱动的表达。不受理论约束，认为转录单元中包含内含子会引起转录物的更高表达和/或稳定性。因此，将miRNA置放于反转录病毒基因组的内含子中的能力增加了本公开的教示，所述教示克服了先前技术中试图使最大活性达到反转录病毒(如慢病毒基因组)的大小限制的挑战。在一些实施例中，重组反转录病毒基因组中可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个miRNA，在说明性实施例中，2至5个，例如4个miRNA(其中的一个或多个各自结合编码本文中所公开的目标中的一个或多个的核酸)且使用本文中所提供的方法递送至目标细胞，例如T细胞和/或NK细胞。实际上，如本文所提供，1个、2个、3个或4个miRNA可在单个内含子(如EF1a内含子)中递送。

在一些实施例中，淋巴增生元件包含MPL或是MPL，或其变体和/或片段，包括有包括MPL的至少75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％的胞内域(具有或不具有MPL的跨膜和/或胞外域)和/或与MPL的胞内域具有至少75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列一致性(具有或不具有MPL的跨膜和/或胞外域)的变体和/或片段，其中所述变体和/或片段保持促进PBMC且在一些实施例中，T细胞的细胞增殖的能力。在说明性实施例中，淋巴增生性元件包含MPL的胞内域或其变体或片段，所述变体或片段包括MPL的胞内域的至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，且淋巴增生性元件不包含MPL的跨膜域。在一些实施例中，淋巴增生性元件包含MPL的胞内域或其变体或片段，所述变体或片段包括MPL的胞内域的至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，且淋巴增生性元件包含MPL的跨膜域。在一些实施例中，表达包含MPL的胞内和跨膜域的淋巴增生性元件的细胞可以与艾曲波帕(eltrombopag)接触、暴露于艾曲波帕或用艾曲波帕处理。不受理论约束，艾曲波帕结合于MPL的跨膜域且诱导MPL的胞内域的活化。在一些实施例中，包括于本文中的组合物及方法中的MPL片段具有和/或保留JAK-2结合域。在一些实施例中，包括于本文中的MPL片段具有或保留活化STAT的能力。MPL的完全胞内域是SEQ ID NO:283(如WO2019/055946中所说明的部分S186)。MPL是血小板生成素的受体。如血小板生成素和EPO等若干细胞因子在文献及本文中称为激素或细胞因子。

在一些实施例中(其提供本公开的单独方面)，本文提供嵌合多肽，所述嵌合多肽是嵌合淋巴增生性元件(CLE)，以及经分离的聚核苷酸及编码其的核酸序列。CLE可包括所述域中的任一个和/或来源于该章节中所论述的特定基因的域。类似地，经分离的聚核苷酸及编码CLE的核酸序列可编码所述域中的任一个和/或来源于此章节中所论述的特定基因的域作为CLE的部分。

本文中所提供的淋巴增生性元件通常包括跨膜域。举例来说，跨膜域可以与来自WO2019/055946中所公开的以下基因和代表性序列的跨膜结构域中的任一个具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列一致性：CD8β、CD4、CD3ζ、CD28、CD134、CD7、CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD8A CD8B、CD27、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CRLF2、CRLF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF2RB、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2C、FCGRA2、GHR、GHR、ICOS、IFNAR、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14和TNFRSF18。适用于任何经工程改造的信号传导多肽中的TM域包括(但不限于)组成性活性细胞因子受体、来自LMP1的TM域及来自包含二聚化模体的1型TM蛋白的TM域，如本文中更详细地论述。在本文中所公开的任何含有来自I型跨膜蛋白质的跨膜域的方面中，跨膜域可为I型生长因子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。

艾曲波帕是血小板生成素受体MPL(也称为TPOR)的小分子活化因子。在一些方面中，表达包含MPL跨膜域的LE的细胞可以暴露于艾曲波帕或与艾曲波帕接触，或可用艾曲波帕治疗已输注这类细胞的患者或个体。在所述接触或治疗之后，活化勒的增生和/或存活特性且提供给细胞，由此与不存在艾曲波帕的情况下相比增加细胞的存活和/或增殖。不受理论约束，艾曲波帕的结合在跨膜域中进行且可以活化作为相同多肽的一部分的一个或多个胞内域。所属领域的技术人员将理解用于活化包含MPL跨膜域的CLE的艾曲波帕的量。

在一些实施例中，CLE包括来自相同蛋白质(在说明性实施例中，相同受体)的胞外部分及跨膜部分，其中的任一个在说明性实施例中为突变体，因此形成胞外域及跨膜域。这些域可来自细胞因子受体或其突变体，或激素受体或其突变体，在一些实施例中，当在至少一些细胞类型中表达时，其经报导为组成性活性的。在说明性实施例中，这类胞外域及跨膜域不包括配位体结合区。相信，这类域在存在于CLE中且表达于B细胞、T细胞和/或NK细胞中时不结合配位体。这些受体突变体中的突变可发生于跨膜区中或胞外近膜区中。不受理论约束，本文提供的CLE的至少一些胞外-跨膜域中的突变通过使通常不在一起的活化链集合在一起或通过改变经连接跨膜域和/或胞内域的确认而在不存在配位体的情况下负责CLE的信号传导。

包括这些域(在说明性实施例中，胞外域)的实施例的CLE的例示性胞外域及跨膜域通常少于来自经报导为组成性的突变体受体的膜近端胞外域连同跨膜域的30个氨基酸，其不需要用于活化相关胞内域的配位体结合。在说明性实施例中，这些胞外域及跨膜域包括IL7RA Ins PPCL、CRLF2 F232C、CSF2RB V449E、CSF3R T640N、EPOR L251C I252C、GHRE260C I270C、IL27RA F523C以及MPL S505N。在一些实施例中，胞外域及跨膜域不包含在序列中与IL7RA或其突变体的胞外域和/或跨膜域的部分相同的多于10、20、25、30或50个组成性氨基酸。在一些实施例中，胞外域及跨膜域不为IL7RA Ins PPCL。在一些实施例中，胞外域及跨膜域不包含在序列中与IL15R的胞外域和/或跨膜域的部分相同的多于10、20、25、30或50个组成性氨基酸。

在此方面的一个实施例中，本文中所提供的LE包含胞外域且在说明性实施例中，胞外域包含二聚化模体。在此方面的说明性实施例中，胞外域包含亮氨酸拉链。在一些实施例中，亮氨酸拉链是来自jun多肽，例如c-jun。在某些实施例中，c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。

在其中跨膜域为类型I跨膜蛋白的这些方面中的任一个的实施例中，跨膜域可为类型I生长因子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。在其中嵌合多肽包含胞外域且其中胞外域包含二聚模体的方面及实施例中的任一个的实施例中，跨膜域可为I型细胞因子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。

例示性跨膜结构域包括WO2019/055946中说明的任何跨膜域。在一些实施例中，跨膜域来自CD4、CD8RB、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6ST、IL7RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL22RA1、IL31RA、LEPR、PRLR及TNFRSF8或其突变体，已知在这类突变体存在于WO2019/055946中提供的构筑体中时促进某些细胞类型中的信号传导活性。在一些实施例中，跨膜域来自CD40、ICOS、FCGR2C、PRLR、IL3RA或IL6ST。

在一些实施例中，胞外域及跨膜域为病毒蛋白LMP1或其突变体和/或片段。LMP1为已知在靶向脂质筏时或在融合至CD40时独立于配位体活化细胞信号传导的多跨跨膜蛋白(Kaykas等人,《欧洲分子生物学杂志》,20:2641(2001))。LMP1的片段通常足够长以跨越质膜且活化所连接的胞内域。举例而言，LMP1可在15个氨基酸与386个氨基酸之间、15个氨基酸与200个氨基酸之间、15个氨基酸与150个氨基酸之间、15个氨基酸与100个氨基酸之间、18个氨基酸与50个氨基酸之间、18个氨基酸与30个氨基酸之间、20个氨基酸与200个氨基酸之间、20个氨基酸与150个氨基酸之间、20个氨基酸与50个氨基酸之间、20个氨基酸与30个氨基酸之间、20个氨基酸与100个氨基酸之间、20个氨基酸与40个氨基酸之间或20个氨基酸与25个氨基酸之间。LMP1的突变体和/或片段在包括于本文提供的CLE中时保留其活化胞内域的能力。此外，如果存在，胞外域包括至少1个，但通常至少4个氨基酸且其通常连接至另一个功能性多肽，如间隙域，例如eTag。在一些实施例中，淋巴增生性元件包含LMP1跨膜域。在说明性实施例中，淋巴增生元件包含LMP1跨膜域且一个或多个胞内域不包含来自以下的胞内域：TNFRSF蛋白质(即，CD40、4-IBB、RANK、TACI、OX40、CD27、GITR、LTR和BAFFR)、TLR1至TLR13、整合素、FcyRIII、Dectinl、Dectin2、NOD1、NOD2、CD16、IL-2R、I型II干扰素受体、趋化介素受体(如CCR5和CCR7)、G蛋白偶合受体、TREM1、CD79A、CD79B、Ig-α、IPS-1、MyD88、RIG-1、MDA5、CD3Z、MyD88ΔTIR、TRIF、TRAM、TIRAP、MAL、BTK、RTK、RAC1、SYK、NALP3(NLRP3)、NALP3ΔLRR、NALP1、CARD9、DAI、IPAG、STING、Zap70或LAT。

在本文提供的CLE的其它实施例中，胞外域包括二聚部分。本文中所公开的许多不同二聚部分可用于这些实施例中。在说明性实施例中，二聚部分能够同源二聚。不受理论约束，二聚部分可对经由跨膜域连接至其的胞内域提供活化功能。这类活化可在例如二聚部分的二聚作用之后提供，其可使得改变经由跨膜域连接至其的胞内域的定向，或其可使得胞内域接近。具有二聚部分的胞外域还可以充当将识别标记连接至表达CLE的细胞的功能。在一些实施例中，二聚剂可位于胞内而非胞外。在一些实施例中，可使用多于一个或多个二聚域。

其中胞外域具有二聚模体的实施例的胞外域足够长以形成二聚物，如亮氨酸拉链二聚物。因此，包括二聚部分的胞外域可为15个氨基酸至100个氨基酸、20个氨基酸至50个氨基酸、30个氨基酸至45个氨基酸或35个氨基酸至40个氨基酸，在说明性实施例中为c-Jun胞外域的c-Jun部分。包括二聚部分的多肽的胞外域可不保留其它功能性。举例来说，对于亮氨酸拉链二聚物，这些亮氨酸拉链能够形成二聚物，这是由于其保留沿着α隔开7个残基的亮氨酸的模体。然而，本文提供的CLE的某些实施例的亮氨酸拉链部分可或可不保留其的DNA结合功能。

1个丙氨酸残基与4个丙氨酸残基之间的间隔子可包括于具有二聚部分的胞外域与跨膜域之间的CLE中。不受理论约束，相信丙氨酸间隔子通过改变胞内域的定向来影响经由跨膜域连接至亮氨酸拉链胞外区的胞内域的信号传导。

本文提供的CLE的第一胞内域和任选的第二胞内域为已知在至少一些细胞类型中的基因的胞内信号传导域，以促进增殖、存活(抗细胞凋亡)和/或提供增强增殖潜能或对细胞死亡的抗性的共刺激信号。因此，这些胞内域可为来自淋巴增生性元件的胞内域及本文提供的共刺激域。已知候选嵌合多肽的胞内域中的一些可活化JAK1/JAK2、JAK3、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5及STAT6信号传导。已知在负责此信号传导的细胞因子受体的胞内域中发现的保守性模体(参见例如Morris等人,《通过JAK/STAT路径进行的细胞因子信号传导的分子细节(The molecular details of cytokine signaling via the JAK/STATpathway)》,《蛋白质科学(Protein Science)》(2018)27:1984-2009)。Box1和Box2模体涉及与JAK的结合和信号转导，但增殖信号并非始终需要存在Box2模体(Murakami等人,《美国国家科学院院刊》,1991年12月15日；88(24):11349-53；Fukunaga等人《欧洲分子生物学杂志》,1991年10月；10(10):2855-65；以及O'Neal和Lee.《淋巴因子细胞因子研究(Lymphokine Cytokine Res.)》1993Oct；12(5):309-12)。因此，在一些实施例中，本文中的淋巴增生性元件是含有转基因BOX1的细胞因子受体，其包括细胞因子受体的胞内域，所述胞内域包含Box1 Janus激酶(JAK)结合模体、任选的Box2 JAK结合模体和包含酪氨酸残基的信号转导子和转录激活子(STAT)结合模体。许多细胞因子受体在相对于Box1模体的位置-1、-2和-6处具有疏水性残基，其形成细胞因子诱导的JAK2活化但非JAK2结合所需的“开关模体”(Constantinescu等人,《分子细胞》,2001年2月；7(2):377-85；和Huang等人,《分子细胞》,2001年12月；8(6):1327-38)。因此，在含有转基因BOX1的细胞因子受体的某些实施例中，淋巴增生性元件具有开关模体，其在说明性实施例中具有相对于Box1模体的位置-1、-2和-6处的一个或多个且优选全部疏水性残基。在某些实施例中，Box1模体，淋巴增生性元件的ICD相对于Box2模体位于跨膜(TM)域的近侧(例如TM结构域下游的5至15个或约10个残基)，所述Box2模体相对于STAT结合模体位于跨膜域的近侧(例如TM结构域下游的10至50个残基)。STAT结合模体通常包含酪氨酸残基，其磷酸化影响STAT与淋巴增生性元件的STAT结合模体的结合。在一些实施例中，ICD包含多个STAT结合模体，其中多个STAT结合模体存在于原生ICD中(例如，EPO受体和IL-6受体信号传导链(gp130))。

来自IFNAR1、IFNGR1、IFNLR1、IL2RB、IL4R、IL5RB、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL21R、IL27R、IL31RA、LIFR及OSMR的胞内域在所属领域中已知用于活化JAK1信号传导。来自CRLF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、GHR、IFNGR2、IL3RA、IL5RA、IL6ST、IL20RA、IL20RB、IL23R、IL27R、LEPR、MPL及PRLR的胞内域在所属领域中已知用于活化JAK2。来自IL2RG的胞内域在所属领域中已知用于活化JAK3。来自GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IL2RB、IL2RG、IL4R、IL5RA、IL5RB、IL7RA、IL9R、IL21R、IL22RA1、IL31RA、LIFR、MPL及OSMR的胞内域在所属领域中已知用于活化STAT1。来自IFNAR1及IFNAR2的胞内域在所属领域中已知用于活化STAT2。来自GHR、IL2RB、IL2RG、IL6R、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27R、IL31RA、LEPR、LIFR、MPL及OSMR的胞内域在所属领域中已知用于活化STAT3。来自IL12RB1的胞内域在所属领域中已知用于活化STAT4。来自CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、GHR、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL5RB、IL7RA、IL9R、IL15RA、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL31RA、LIFR、MPL、OSMR及PRLR的胞内域在所属领域中已知用于活化STAT5。来自IL4R及OSMR的胞内域在所属领域中已知用于活化STAT6。发现于第一胞内域中的基因及其胞内域与任选的第二胞内域相同，除如果第一胞内域及第二胞内域相同，那么至少一个且通常跨膜域及胞外域皆不来自相同基因以外。

在一些实施例中，CLE的所有域不为IL-7受体或其突变体，和/或具有IL-7受体的至少10个、15个、20个或25个连续氨基酸的其片段，或不为IL-15受体或其突变体，和/或具有IL-15受体的至少10个、15个、20个或25个连续氨基酸的其片段。在一些实施例中，CLE不包含CD40及MyD88的第一胞内域及第二胞内域的组合。

在说明性实施例中，CLE包括识别域和/或消除域。关于识别域和/或消除域的细节提供于本文中的其它章节中。本文提供的识别域和/或消除域中的任一个可为CLE的部分。通常，识别域连接至胞外域的N端。不受理论约束，在一些实施例中，胞外域包括提供连接子(在说明性实施例中，柔性连接子)的功能，从而将识别域连接至表达CLE的细胞。

此外，包括编码本文提供的CLE的核酸序列的聚核苷酸通常还包含信号序列以直接表达质膜。例示性信号序列通常提供在本文中提供于其它章节中。可在转录物上提供组件，使得CAR及CLE两者自相同转录物表达。

在其中CLE的胞外域包含二聚模体的任何方面或实施例中，二聚模体可选自由以下组成的组：含亮氨酸拉链模体的多肽、CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324，以及其保留二聚能力的突变体和/或活性片段。在本文中的CLE的胞外域包含二聚模体的任何方面或实施例中，二聚模体可需要二聚剂，且二聚模体及相关二聚剂可选自由以下组成的组：FKBP及雷帕霉素(rapamycin)或其类似物、GyrB及库马霉素(coumermycin)或其类似物、DHFR及甲氨蝶呤或其类似物，或DmrB及AP20187或其类似物，以及保留二聚能力的所述二聚蛋白质的突变体和/或活性片段。在一些方面和说明性实施例中，淋巴增生性元件具有组成性活性且不是需要二聚剂以进行活化的淋巴增生性元件。

在本文中的CLE的胞外域包含二聚模体的任何方面或实施例的说明性实施例中，胞外域可包含亮氨酸拉链模体。在一些实施例中，亮氨酸拉链模体是来自jun多肽，例如c-jun。在某些实施例中，c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。

一个实施例中的内部二聚和/或多聚淋巴增生性元件为使用脂质可渗透二聚免疫抑制剂药物FK506的类似物的系统的整体部分，其损失其正常生物活性，同时获得交联以基因方式融合至FK506结合蛋白FKBP12的分子的能力。通过将一个或多个FKBP及豆蔻酰化序列融合至目标受体的胞质信号传导域，可以二聚物药物依赖型但配位体及胞外域独立型方式刺激信号传导。此为系统提供时间控制、使用单体药物类似物的可逆性，且增强特异性。第三代AP20187/AP1903二聚物药物对于其结合域FKBP12的高亲和力允许活体内特异性活化重组受体，且无需经由内源性FKBP12诱导非特异性副作用。还可使用与二聚物药物结合的具有氨基酸取代及缺失的FKBP12变体(如FKBP12V36)。此外，合成配位体对蛋白酶分解具有抗性，使得其在活体内活化受体时比大多数所递送蛋白剂更有效。

假型化元件

本文所提供的许多方法及组合物包括假型化元件。具有异源包膜糖蛋白的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的假型化通常改变病毒的向性且有助于宿主细胞的转导。如本文中所使用的假型化元件可以包括“结合多肽”，其包括识别且结合目标宿主细胞的一种或多种多肽(通常糖蛋白)，和一种或多种“促融合多肽”，其介导反转录病毒与目标宿主细胞膜融合，从而使反转录病毒基因组进入目标宿主细胞。在本文所提供的一些实施例中，假型化元件提供为多肽/蛋白质，或提供为编码多肽/蛋白质的核酸序列。

在一些实施例中，假型化元件是猫内源性病毒(RD114)包膜蛋白、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白、肿瘤反转录病毒单嗜性包膜蛋白、水泡性口炎病毒包膜蛋白(VSV-G)(SEQID NO:336)、狒狒反转录病毒包膜糖蛋白(BaEV)(SEQ ID NO:337)、鼠类白血病包膜蛋白(MuLV)(SEQ ID NO:338)、流感糖蛋白HA表面糖蛋白(HA)、流感糖蛋白神经氨酸酶(NA)、副粘病毒麻疹包膜蛋白H、副粘病毒麻疹包膜蛋白F和/或这些包膜蛋白中的任一种的功能变体或片段。

在一些实施例中，假型化元件可为野生型BaEV。不受理论约束，BaEV含有被证实抑制转导的R肽。在一些实施例中，BaEV可含有R肽的缺失。在一些实施例中，在核苷酸编码氨基酸序列HA(本文中称为BaEVΔR(HA))(SEQ ID NO:339)之后，BaEV可含有抑制性R肽的缺失。在一些实施例中，在核苷酸编码氨基酸序列HAM(本文中称为BaEVΔR(HAM))(SEQ IDNO:340)之后，BaEV可含有抑制性R肽的缺失。

在一些实施例中，假型化元件可为野生型MuLV。在一些实施例中，MuLV可含有一个或多个突变以去除位于包膜糖蛋白的跨膜(TM)与表面(SU)子单元之间的弗林蛋白酶介导的裂解位点。在一些实施例中，MuLV含有SUx突变(MuLVSUx)(SEQ ID NO:453)，其抑制包装细胞中的MuLV包膜蛋白的弗林蛋白酶介导的裂解。在某些实施例中，MuLV或MuLVSUx蛋白质的细胞质尾区的C端被截短4至31个氨基酸。在某些实施例中，MuLV或MuLVSUx蛋白质的细胞质尾区的C端被截短4、8、12、16、20、24、28或31个氨基酸。

在一些实施例中，假型化元件包括结合多肽及来源于不同蛋白质的融合多肽。举例来说，本文中所公开的方法及组合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可通过麻疹病毒(MV)的融合(F)多肽和/或凝血素(H)多肽来假型化，作为非限制性实例，MV的临床野生型菌株，及包括埃德蒙斯顿菌株(Edmonston strain；MV-Edm)(GenBank；AF266288.2)或其片段的疫苗菌株。不受理论约束，认为凝血素(H)及融合(F)多肽两者都可在进入宿主细胞中发挥作用，其中所述H蛋白质在目标细胞上将MV与受体CD46、SLAM及Nectin-4结合，且F介导反转录病毒及宿主细胞膜的融合。在说明性实施例中，尤其在目标细胞是T细胞和/或NK细胞时，结合多肽为麻疹病毒H多肽，且融合多肽为麻疹病毒F多肽。

在一些研究中，由截短型F和H多肽假型化的慢病毒颗粒具有显著增加的效价和转导效率(Funke等人2008.《分子疗法(Molecular Therapy)》,16(8):1427-1436)，(Frecha等人2008.《血液》,112(13):4843-4852)。在F胞质尾区截短30个残基(也称为MV(Ed)-FΔ30(SEQ ID NO:313))时获得最高效价。对于H变体，在缺失18个或19个残基(MV(Ed)-HΔ18(SEQ ID NO:314)或(MV(Ed)-HΔ19))时出现最佳截短，但具有24个残基的截短的变体在缺失残基经丙氨酸置换下及未置换下(MV(Ed)-HΔ24(SEQ ID NO:315)及MV(Ed)-HΔ24+A)也产生最佳效价。在一些实施例中，包括针对转导T细胞和/或NK细胞的那些，本文中所公开的方法及组合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒经麻疹病毒融合(F)多肽及凝血素(H)多肽的突变或变异版本(在说明性实例中，麻疹病毒F及H多肽的胞质域缺失变体)假型化。在一些实施例中，经突变F及H多肽为“经截短H”或“经截短F”多肽，其的胞质部分已经截短，即，氨基酸残基(或编码蛋白质的对应核酸分子的编码核酸)已经缺失。“HΔY”及“FΔX”分别表示这类经截短H及F多肽，其中“Y”是指已自氨基端缺失的1个至34个残基，且“X”是指已自胞质域的羧基端缺失的1个至35个残基。在另一实施例中，“经截短F多肽”为FΔ24或FΔ30和/或“经截短H蛋白质”选自由以下组成的组：HΔ14、HΔ15、HΔ16、HΔ17、HΔ18、HΔ19、HΔ20、HΔ21+A、HΔ24及HΔ24+4A，更优选是HΔ18或HΔ24。在说明性实施例中，经截短F多肽为MV(Ed)-FΔ30，且经截短H多肽为MV(Ed)-HΔ18。

在一些实施例中，假型化元件包括来源于不同蛋白质的多肽。举例来说，假型化元件可以包含流感蛋白质红血球凝集素HA和/或神经氨酸酶(NA)。在某些实施例中，HA是来自A型流感病毒亚型H1N1。在说明性实施例中，HA是来自H1N1 PR8 1934，其中一价胰蛋白酶依赖性裂解位点已突变成更混杂的多价序列(SEQ ID NO:311)。在某些实施例中，NA是来自A型流感病毒亚型H10N7。在说明性实施例中，NA是来自H10N7-HKWF446C-07(SEQ ID NO:312)。

在一些实施例中，病毒性颗粒由具有来自2种或更多种异源病毒的包膜糖蛋白共假型化。在一些实施例中，病毒性颗粒由VSV-G或其功能性变异体或片段以及来自RD114、BaEV、MuLV、流感病毒、麻疹病毒和/或其功能性变异体或片段的包膜蛋白共假型化。在一些实施例中，病毒性颗粒由VSV-G和MV(Ed)-H糖蛋白或MV(Ed)-H糖蛋白和被截短的细胞质域共假型化。在说明性实施例中，病毒性颗粒由VSV-G和MV(Ed)-HΔ24共假型化。在某些实施例中，VSV-G由MuLV或具有截短的细胞质域的MuLV共假型化。在其它实施例中，VSV-G由MuLVSUx或具有截短的细胞质域的MuLVSUx共假型化。在其它说明性实施例中，VSV-G由抗CD3scFv与MuLV的融合物共假型化。

在一些实施例中，融合多肽包括表达为一种多肽的多种元件。在一些实施例中，结合多肽及融合多肽自相同的转录物但自单独的核糖体结合位点翻译；在其它实施例中，结合多肽及融合多肽由裂解肽位点(其不受理论约束，在翻译之后裂解，如文献中常见)或核糖体跳跃序列隔开。在一些实施例中，结合多肽及融合多肽自分离的核糖体结合位点的翻译产生比结合多肽更高量的融合多肽。在一些实施例中，融合多肽与结合多肽的比率为至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1，或至少8:1。在一些实施例中，融合多肽与结合多肽的比率是作为范围的低端的1.5:1、2:1或3:1至作为范围的高端的3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

本公开的许多方法及组合物方面包括活化元件(在本文中也称为T细胞活化元件)，或编码活化元件的核酸。与慢病毒(LV)转导至静息T细胞中相关联的限制是归因于一系列进入前和进入后障壁以及细胞限制因子(Strebel等人2009.《BMC医学(BMCMedicine)》7:48)。一个限制为包膜假型化LV颗粒不能识别潜在受体并介导与细胞膜融合。然而，在某些条件下，由基于HIV-1的慢病毒载体进行的静息T细胞的转导可能大部分是在T细胞受体(TCR)CD3复合物和CD28共刺激之后(Korin和Zack.1998.《病毒学杂志(Journalof Virology.)》,72:3161-8，Maurice等人2002.《血液》99:2342-50)，以及通过暴露于细胞因子发生(Cavalieri等人2003)。

免疫系统的细胞(如T淋巴细胞)经由受体或受体复合物识别特异性抗原并与其相互作用，在识别或与这类抗原相互作用时，使得细胞在体内活化并扩增。这类受体的实例为抗原特异性T淋巴细胞受体复合物(TCR/CD3)。T细胞受体(TCR)在T淋巴细胞的表面上表达。一种组分(CD3)负责在TCR由配位体占据之后的胞内信号传导。针对抗原CD3复合物(TCR/CD3)的T淋巴细胞受体识别通过主要组织兼容性复合物(MHC)的蛋白质呈递至其的抗原性肽。MHC及肽的复合物在抗原呈现细胞及其它T淋巴细胞目标的表面上表达。TCR/CD3复合物的刺激导致T淋巴细胞的活化及随后的抗原特异性免疫反应。TCR/CD3复合物在免疫系统的效应功能及调节上发挥重要作用。因此，本文提供的活化组件通过与T细胞受体相关复合物的一种或多种组分结合，例如通过与CD3结合来活化T细胞。在一些实施例中，活化元件可单独活化。在其它情况下，活化需要经由TCR受体复合物活化，以便进一步活化细胞。

T淋巴细胞还需要第二、共刺激信号以于体内变得完全活性。在无此信号的情况下，T淋巴细胞对结合至TCR的抗原无反应，或变得无变应性。然而，T细胞的转导及扩增不需要第二共刺激信号。这类共刺激信号例如由CD28、在产生抗原细胞上与CD80及CD86相互作用的T淋巴细胞蛋白质提供。如本文所使用，CD80的功能性胞外片段保留其与CD28相互作用的能力。OX40、4-1BB和ICOS(诱导性共刺激分子)、其它T淋巴细胞蛋白质且在结合于其相应配位体中的一个或多个时提供共刺激信号：OX40L、4-1BBL和ICOSLG。

T细胞受体(TCR)CD3复合物的活化及经CD28的共刺激可通过离体暴露于用抗CD3及抗CD28涂布的固体表面(例如，珠粒)上来发生。在本文中所公开的方法及组合物中的一些实施例中，静息T细胞通过暴露于用抗CD3及抗CD28离体涂布的固体表面上来活化。在其它实施例中，静息T细胞或NK细胞(说明性实施例中，T细胞)通过暴露于可溶性抗CD3抗体(例如，在50ng/ml至150ng/ml，或75ng/ml至125ng/ml，或100ng/ml下)来活化。在这类实施例中，其可以是用于基因修饰或转导的方法的一部分，在不进行预先活化的说明性实施例中，这类活化和/或接触可以通过在转导反应混合物中包括抗CD3且进行本文中所提供的接触和任选的培育任何时间来进行。此外，这类由可溶性抗CD3进行的活化可以通过在与反转录病毒颗粒在含有抗CD3的培养基中接触之后培育淋巴细胞，如PBMC且在说明性实施例中，NK细胞且在说明性更高的实施例中，T细胞来进行。这类培育可以例如持续作为范围的低端的5、10、15、30、45、60或120分钟至作为范围的高端的15、30、45、60、120、180或240分钟，例如15分钟至1小时或2小时。

在本文中所提供的方法和组合物的某些说明性实施例中，能够结合于活化T细胞表面蛋白的多肽是作为本文中所公开的方法和组合物的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的“活化元件”呈现，其也是本发明的方面。在说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化元件可以包括一种或多种能够结合CD3的多肽。在说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化元件可以包括一种或多种能够结合CD3的ε链(CD3ε)的多肽。在其它实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化元件可以包括一种或多种能够结合CD28、OX40、4-1BB、ICOS、CD9、CD53、CD63、CD81和/或CD82的多肽以及任选的一种或多种能够结合CD3的多肽。在说明性实施例中，活化元件可以是T细胞表面蛋白促效剂。活化元件可以包括充当T细胞表面蛋白质的配位体的多肽。在一些实施例中，充当T细胞表面蛋白质的配位体的多肽是或包括OX40L、4-1BBL或ICOSLG中的一个或多个。

在一些实施例中，这些活化元件中的一个或通常多个拷贝可在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上表达为与假型化元件隔开且不同的多肽。在一些实施例中，活化元件可在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒上表达为融合多肽。在说明性实施例中，融合多肽包括一个或多个活化元件及一个或多个假型化元件。在其它说明性实施例中，融合多肽包括抗CD3，例如抗CD3scFv，或抗CD3scFvFc，和病毒包膜蛋白质。在一个实例中，融合多肽是与病毒包膜蛋白质(如MuLV包膜蛋白)的氨基端融合的OKT-3scFv，如Maurice等人(2002)中所示。在一些实施例中，融合多肽是与病毒包膜蛋白质融合的UCHT1scFv，所述病毒包膜蛋白质是例如MuLV包膜蛋白(SEQ ID NO:341)、MuLVSUx包膜蛋白(SEQ ID NO:454)、VSV-G(SEQ ID NO:455或SEQ ID NO:456)或其功能变体或片段，包括本文中所提供的任何膜蛋白截短物。在这类融合构筑体和任何其它其中活化元件连接至反转录病毒颗粒的表面的构筑体中，说明性实施例(尤其对于本文中的用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法)不包括存在于反转录病毒颗粒外部的融合蛋白质的部分中的任何血液蛋白质(例如血液因子(例如因子X))裂解位点。在一些实施例中，融合构筑体不包括任何弗林蛋白酶裂解位点。弗林蛋白酶是在所检验的全部哺乳动物细胞中表达的膜结合蛋白酶，其中一些在血浆中分泌且具有活性(参见例如C.Fernandez等人《国际药学杂志(J.Internal.Medicine)》(2018)284；377-387)。可以使用已知的方法使融合构筑体进行突变以去除这类蛋白酶裂解位点。

因为其活化静息T细胞的能力，所以结合CD3、CD28、OX40、4-1BB或ICOS的多肽被称为活化元件。在某些实施例中，编码这类活化元件的核酸发现于在其表面上含有活化元件的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组中。在其它实施例中，编码活化元件的核酸未发现于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒基因组中。在其它实施例中，编码活化元件的核酸发现于病毒包装细胞的基因组中。

在一些实施例中，活化元件为能够结合于CD3的多肽。在某些实施例中，能够结合于CD3的多肽结合于CD3D、CD3E、CD3G或CD3Z。在说明性实施例中，活化元件是能够结合于CD3E的多肽。在一些实施例中，能够与CD3结合的多肽为抗CD3抗体或其保留与CD3结合的能力的片段。在说明性实施例中，抗CD3抗体或其片段为单链抗CD3抗体，如(但不限于)抗CD3scFv。在另一说明性实施例中，能够结合于CD3的多肽为抗CD3scFvFc。

大量抗人类CD3单克隆抗体及其抗体片段为可用的，且可用于本发明，包括(但不限于)UCHT1、OKT-3、HIT3A、TRX4、X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW24B6、OKT3D、M-T301、SMC2及F101.01。

在一些实施例中，活化元件为能够结合于CD28的多肽。在一些实施例中，能够结合于CD28的多肽为抗CD28抗体，或其保留结合于CD28的能力的片段。在其它实施例中，能够结合于CD28的多肽为CD80、CD86，或其能够结合CD28且诱导CD28介导的Akt的活化的片段，如CD80的外部片段。在本文中的一些方面中，CD80的外部片段意谓通常存在于保留结合于CD28的能力的CD80的标准细胞位置中的细胞外部的片段。在说明性实施例中，抗CD28抗体或其片段为单链抗CD28抗体，如(但不限于)抗CD28 scFv。在另一说明性实施例中，能够结合于CD28的多肽为CD80，或CD80的片段，如CD80的外部片段。

抗CD28抗体是所属领域中已知的且可包括作为非限制性实例的单克隆抗体9.3、IgG2a抗体(Dr.Jeffery Ledbetter,Bristol Myers Squibb Corporation,Seattle,Wash.)、单克隆抗体KOLT-2(IgG1抗体)、15E8(IgG1抗体)、248.23.2(IgM抗体)及EX5.3D10(IgG2a抗体)。

在说明性实施例中，活化元件包括两种多肽，能够结合于CD3的多肽及能够结合于CD28的多肽。

在某些实施例中，能够结合于CD3或CD28的多肽为抗体(单链单株抗体)或抗体片段(例如单链抗体片段)。因此，抗体片段可为例如单链片段可变区(scFv)、抗体的抗体结合(Fab)片段、单链抗原结合片段(scFab)、无半胱氨酸的单链抗原结合片段(scFabΔC)、片段可变区(Fv)、对抗原的相邻抗原决定基具有特异性的结构(CRAb)或单域抗体(VH或VL)。

本文中所公开的实施例中的任一个中，活化元件或编码其的核酸可包括二聚或更高级多聚模体。二聚或多聚模体在所属领域中是众所周知的且所属领域的技术人员将理解如何将其并入多肽中以供有效二聚或多聚。举例来说，在一些实施例中，包括二聚模体的活化元件可为能够与CD3和/或CD28结合的一个或多个多肽。在一些实施例中，能够与CD3结合的多肽为抗CD3抗体或其保留与CD3结合的能力的片段。在说明性实施例中，抗CD3抗体或其片段为单链抗CD3抗体，如(但不限于)抗CD3 scFv。在另一说明性实施例中，能够与CD3结合的多肽为抗CD3scFvFc，其在一些实施例中被视为具有二聚模体但不具有任何额外二聚模体的抗CD3，这是由于已知抗CD3scFvFc构筑体能够在不需要单独二聚模体的情况下二聚。

在一些实施例中，二聚或多聚模体或编码其的核酸序列可为来自作为同源二聚物或多聚物天然地存在的跨膜多肽的氨基酸序列。在一些实施例中，二聚或多聚模体或编码其的核酸序列可为来自天然蛋白质或经工程改造的蛋白质的片段的氨基酸序列。在一个实施例中，同源二聚多肽为含亮氨酸拉链模体的多肽(亮氨酸拉链多肽)。举例来说，亮氨酸拉链来源于c-JUN，其非限制性实例经公开与本文中的嵌合淋巴增生性元件(CLE)有关。

在一些实施例中，这些跨膜同源二聚多肽可包括早期活化抗原CD69(CD69)、转移受体蛋白1(CD71)、B细胞分化抗原(CD72)、T细胞表面蛋白触觉(CD96)、内皮因子(Cd105)、杀伤细胞凝集素样受体子族B成员1(Cd161)、P-选凝素糖蛋白配位体1(Cd162)、谷氨酰基氨基肽酶(Cd249)、肿瘤坏死因子受体超家族成员16(CD271)、钙粘蛋白-1(上皮钙粘蛋白)(Cd324)或其活性片段。在一些实施例中，二聚模体及编码其的核酸可包括来自在配位体(在本文中也称为二聚物或二聚剂)结合后二聚的跨膜蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，二聚模体及二聚物可包括(其中二聚物在二聚物结合对后的圆括号里)：FKBP及FKBP(雷帕霉素)；GyrB及GyrB(香豆霉素)；DHFR及DHFR(甲氨蝶呤)；或DmrB及DmrB(AP20187)。如上文所提及，雷帕霉素可用作二聚物。替代地，可使用雷帕霉素衍生物或类似物(参见例如WO96/41865、WO 99/36553、WO 01/14387；及Ye等人(1999)《科学(Science)》283:88-91)。举例来说，类似物、同源物、衍生物及结构上与雷帕霉素相关的其它化合物(“雷帕霉素类似物”)除此之外包括具有一个或多个与雷帕霉素相关的以下修饰的雷帕霉素的变体：在C7、C42和/或C29处去甲基化、消除或替换甲氧基；在C13、C43和/或C28处消除、衍生或替换羟基；在C14、C24和/或C30处还原、消除或衍生酮；用5员脯氨酰基环替换6员甲基呱啶环；且对环己基环进行替代取代或用经取代环戊基环替换环己基环。额外信息呈现于例如美国专利案第5,525,610号、第5,310,903号、第5,362,718号及第5,527,907号中。描述了C-28羟基的选择性差向异构(参见例如WO 01/14387)。适用作雷帕霉素的替代物的额外合成二聚剂包括描述于美国专利公开案第2012/0130076号中的那些。如以上所提及，香豆霉素可用作二聚剂。替代地，可使用香豆霉素类似物(参见例如Farrar等人(1996)《自然(Nature)》383:178-181；及美国专利案第6,916,846号)。如以上所提及，在一些情况中，二聚剂为甲氨蝶呤，例如无细胞毒性、同源双功能性甲氨蝶呤二聚物(参见例如美国专利案第8,236,925号)。尽管淋巴增生性元件的一些实施例包括二聚剂，但在一些方面和说明性实施例中，淋巴增生性元件具有组成性活性且不是需要二聚剂以进行活化的淋巴增生性元件。

在一些实施例中，当存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上时，包括二聚模体的活化元件可在不存在二聚剂的情况下为活性的。举例来说，包括来自跨膜同源二聚多肽的二聚模体的活化元件可在不存在二聚剂的情况下为活性的，所述跨膜同源二聚多肽包括CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突变体和/或其活性片段。在一些实施例中，活化元件可为抗CD3单链片段且包括选自由以下组成的组的二聚模体：CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突变体和/或其活性片段。

在一些实施例中，当存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上时，包括二聚模体的活化元件可在二聚剂的存在下为活性的。举例来说，包括来自FKBP、GyrB、DHFR或DmrB的二聚模体的活化元件可分别在个别二聚剂或其类似物(例如，雷帕霉素、香豆霉素、甲氨蝶呤及AP20187)的存在下为活性的。在一些实施例中，活化元件可为针对抗CD3或抗CD28的单链抗体片段或结合CD3或CD28的另一分子，且二聚模体及二聚剂可选自由以下组成的组：FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、DHFR及甲胺蝶呤或其类似物，或DmrB及AP20187或其类似物。

在一些实施例中，活化元件与异源信号序列和/或异源膜连接序列或膜结合蛋白融合，其都帮助将活化元件引导至膜上。异源信号序列将活化元件靶向内质网，其中异源膜粘附序列共价连接至一种或多种脂肪酸(也称为翻译后脂质修饰)使得与异源膜粘附序列融合的活化元件锚定在质膜的脂质筏中。在一些实施例中，翻译后脂质修饰可经由豆蔻酰化、棕榈酰化或GPI锚定来发生。豆蔻酰化为对应于14-碳饱和脂肪酸(肉豆蔻酸)与真核或病毒蛋白质的N端甘氨酸的共价连接的翻译后蛋白质修饰。棕榈酰化为对应于C16酰基链与半胱氨酸，且较少地与蛋白质的丝氨酸及苏氨酸残基的共价连接的翻译后蛋白质修饰。GPI锚定是指在翻译后修饰期间糖基磷脂酰肌醇或GPI与蛋白质C端的连接。

在一些实施例中，异源膜连接序列为GPI锚定连接序列。异源GPI锚连接序列可来源于任何已知的GPI锚定蛋白质(评述于Ferguson MAJ,Kinoshita T,Hart GW.《糖基磷脂酰肌醇锚(Glycosylphosphatidylinositol Anchors.)》Varki A,Cummings RD,Esko JD等人编,《糖生物学的要点(Essentials of Glycobiology.)》,第2版.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press；2009.第11章中)。在一些实施例中，异源GPI锚定连接序列为来自CD14、CD16、CD48、CD55(DAF)、CD59、CD80及CD87的GPI锚定连接序列。在一些实施例中，异源GPI锚定连接序列来源于CD16。在说明性实施例中，异源GPI锚定连接序列来源于Fc受体FcγRIIIb(CD16b)或衰变加速因子(DAF)，另外称为补体衰变加速因子或CD55。

在一些实施例中，活化元件中的一个或两个包括帮助将活化元件引导至细胞膜的表达的异源信号序列。可使用在包装细胞系中具有活性的任何信号序列。在一些实施例中，信号序列为DAF信号序列。在说明性实施例中，活化元件与在其N端的DAF循环序列及在其C端的GPI锚定连接序列融合。

在说明性实施例中，活化元件包括与来源于CD14的GPI锚定连接序列融合的抗-CD3scFvFc，及与来源于CD16b的GPI锚定连接序列融合的CD80；且两者表达于本文所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在一些实施例中，抗CD3 scFvFc与其N端的DAF信号序列及其C端的来源于CD14的GPI锚定连接序列融合，且CD80与其N端的DAF信号序列及其C端的来源于CD16b的GPI锚定连接序列融合；且两者皆表达于本文所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在一些实施例中，DAF信号序列包括DAF蛋白质的氨基酸残基1-30。

膜结合细胞因子

本文所提供的方法及组合物方面中的一些实施例包括膜结合细胞因子，或编码膜结合细胞因子的聚核苷酸。细胞因子通常但不总为分泌性蛋白质。天然分泌的细胞因子可经工程改造为膜结合的融合蛋白质。膜结合细胞因子融合多肽包括在本文所公开的方法及组合物中，且也是本发明的方面。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒具有在其表面上的能够结合T细胞和/或NK细胞且促进其增殖和/或存活的膜结合细胞因子融合多肽。通常地，将膜结合多肽并入复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的膜中，且在细胞通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导时，反转录病毒及宿主细胞膜的融合产生结合至经转导细胞的膜的多肽。

在一些实施例中，细胞因子融合多肽包括IL-2、IL-7、IL-15或其活性片段。膜结合细胞因子融合多肽通常为与异源信号序列和/或异源膜连接序列融合的细胞因子。在一些实施例中，异源膜连接序列为GPI锚定连接序列。异源GPI锚连接序列可来源于任何已知的GPI锚定蛋白质(评述于Ferguson MAJ,Kinoshita T,Hart GW.《糖基磷脂酰肌醇锚》VarkiA,Cummings RD,Esko JD等人编,《糖生物学的要点》,第2版.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press；2009.第11章中)。在一些实施例中，异源GPI锚定连接序列为来自CD14、CD16、CD48、CD55(DAF)、CD59、CD80及CD87的GPI锚定连接序列。在一些实施例中，异源GPI锚定连接序列来源于CD16。在一些实施例中，异源GPI锚定连接序列来源于Fc受体FcγRIIIb(CD16b)。在一些实施例中，GPI锚定为DAF的GPI锚定。

在说明性实施例中，膜结合细胞因子为与DAF融合的细胞因子的融合多肽。已知DAF积聚在并入至自包装细胞萌芽的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的膜中的脂质筏中。因此，不受理论约束，认为DAF融合蛋白质优选靶向包装细胞的膜的部分，所述包装细胞将变成重组反转录病毒膜的部分。

在非限制说明性实施例中，细胞因子融合多肽为IL-7，或其与DAF融合的活性片段。在特定非限制说明性实施例中，融合细胞因子多肽依次包括：DAF信号序列(DAF的残基1-31)、无其信号序列的IL-7，及DAF的残基36-525。

制备重组反转录病毒颗粒的包装细胞系/方法

本公开提供产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的哺乳动物包装细胞及包装细胞系。产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的所述细胞系在本文中也称为包装细胞系。这类方法的非限制性实例说明于WO2019/055946中。本文中提供用于制备反转录病毒颗粒的其它例示性方法，例如在本文中的实例部分中。当包括编码其它膜结合蛋白的核酸(如不与病毒包膜融合的T细胞活化元件，如GPI连接的抗CD3)时，这类方法包括例如4质体系统或5质体系统(参见WO2019/05546)。在说明性实施例中，本文中提供4质体系统，其中T细胞活化元件，如GPI-连接的抗CD3在一个包装质体(如编码病毒包膜的质体或编码REV的质体)上编码且任选地，可在另一包装质体上编码第二病毒膜相关转基因，如膜结合细胞因子。在每种情况下，编码病毒蛋白质的核酸通过IRES或核糖体跨越序列(如P2A或T2A)与转基因分离。这类4质体系统和相关聚核苷酸陈述于实例中，在短暂转染中与5载体系统相比提供增加的效价，且因此提供本文中的说明性实施例。本公开提供包装细胞及为包装细胞系的哺乳动物细胞系，其产生基因修饰目标哺乳动物细胞及目标哺乳动物细胞系本身的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在说明性实施例中，包装细胞包含核酸序列，其编码复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白、gag多肽、pol多肽及假型化元件。

包装细胞系的细胞可为粘着细胞或悬浮细胞。下文提供例示性细胞类型。在说明性实施例中，包装细胞系可为悬浮细胞系，即在生长期间不黏着至表面的细胞系。所述细胞可在化学上定义的培养基和/或无血清培养基中生长。在一些实施例中，包装细胞系可为来源于粘着细胞系的悬浮细胞系，例如HEK293可在根据所属领域中已知的方法产生适应悬浮的HEK293细胞系的条件下生长。包装细胞系通常在化学上定义的培养基中生长。在一些实施例中，包装细胞系培养基可包括血清。在一些实施例中，包装细胞系培养基可包括血清替代物，如所属领域中已知。在说明性实施例中，包装细胞系培养基可为无血清培养基。此培养基可为按照美国食品及药物管理局(US Food and Drug Administration；FDA)的现行药品优良制造实践(Current Good Manufacturing Practice；CGMP)条例制造的化学上定义的无血清调配物。包装细胞系培养基可为无异源的及完整的。在一些实施例中，包装细胞系培养基由管理机构清除以用于离体细胞处理，如FDA 510(k)清除装置。

因此，在一个方面中，本文中提供用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法，其包括：A.在无血清培养基中在悬浮液中培养包装细胞，其中包装细胞包含编码复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组的核酸序列、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽和假型化元件；和B.从无血清培养基收集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在另一方面中，本文中提供用于用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法，其包含：A.在无血清培养基中在悬浮液中培养包装细胞，其中包装细胞包含编码复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组的核酸序列、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽和假型化元件；B.从无血清培养基收集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒；和C.使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中接触进行小于24小时、20小时、18小时、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时、30分钟或15分钟(或在作为范围的低端的接触且不培育或培育15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时或4小时与作为范围的高端的培育1、2、3、4、6、8、12、18、20或24小时之间)，由此转导淋巴细胞。

在一些说明性实施例中，可包装RNA基因组经设计以表达一种或多种目标多肽，作为非限制性实例包括本文中所公开的经工程改造的信号传导多肽中的任一个和/或一种或多种(例如两种或更多种)与如gag及pol等反转录病毒组分相反定向(例如，在相反链上且在相反方向上编码)的抑制性RNA分子。举例来说，从5'至3'，可包装RNA基因组可以包括：5'长末端重复序列或其活性截短片段；编码反转录病毒顺式作用RNA包装元件的核酸序列；编码第一和任选的第二目标多肽的核酸序列，所述目标多肽如(但不限于)相反方向的经工程改造的信号多肽，其可以相对于5'长末端重复序列和顺式作用RNA包装元件以此相反方向被启动子驱除，其在一些实施例中仅出于方便起见被称为“第四”启动子(且有时在本文中称为在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子)，其在目标细胞(如T细胞和/或NK细胞)中具有活性，但在说明性实例中在包装细胞中不具有活性，或仅在包装细胞中具有诱导性或最低程度的活性；以及3'长末端重复序列或其活性截短片段。在一些实施例中，可包装RNA基因组可包括中枢聚嘌呤区域(cPPT)/中枢终止序列(CTS)元件。在一些实施例中，反转录病毒顺式作用RNA包装元件可为HIV Psi。在一些实施例中，反转录病毒顺式作用RNA包装元件可为Rev反应元件。在例示性实施例中，由与5'长末端重复相反定向的启动子驱动的经工程改造的信号传导多肽为本文所公开的一种或多种经工程改造的信号传导多肽，且可任选地表达如本文及在WO2017/165245A2、WO2018/009923A1及WO2018/161064A1中更详细公开的一种或多种抑制性RNA分子。

应理解，如第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子等的启动子编号仅出于方便起见。除非明确地叙述其它启动子，否则称为“第四”启动子的启动子不应被视为暗示存在任何其它启动子，如第一启动子、第二启动子或第三启动子。应注意，所述启动子中的每一个能够驱动转录物以适当细胞类型表达，且这类转录物形成转录单元。

在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽可包括第一淋巴增生性元件。适合的淋巴增生性元件公开于本文中的其它部分中。作为非限制性实例，淋巴增生性元件可表达为具有识别域的融合物，如eTag，如本文所公开。在一些实施例中，可包装RNA基因组可进一步包括编码第二经工程改造的多肽的核酸序列，包括编码本文所提供的任何CAR实施例的嵌合抗原受体。举例来说，第二经工程改造的多肽可包括第一抗原特异性靶向区、第一跨膜域，及第一胞内活化域。抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域的实例公开于本文其它处。在目标细胞为T细胞的一些实施例中，在目标细胞中具有活性的启动子在T细胞中具有活性，如本文其它处所公开。

在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽可包括CAR，且核酸序列可编码本文所提供的任何CAR实施例。举例来说，经工程改造的多肽可包括第一抗原特异性靶向区、第一跨膜域及第一胞内活化域。抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域的实例公开于本文其它处。在一些实施例中，可包装RNA基因组可进一步包括编码第二经工程改造的多肽的核酸序列。在一些实施例中，第二经工程改造的多肽可为淋巴增生性元件。在其中目标细胞为T细胞或NK细胞的一些实施例中，在目标细胞中具有活性的启动子在T细胞或NK细胞中具有活性，如本文其它处所公开。

在一些实施例中，本文中所提供的任何方面中所包括的可包装RNA基因组可以进一步包括核糖开关，如WO2017/165245A2、WO2018/009923A1和WO2018/161064A1中所论述。在一些实施例中，编码经工程改造的信号传导多肽的核酸序列可以相对于由5'LTR及3'LTR建立的5'至3'定向来反向定向。在其它实施例中，可包装RNA基因组可进一步包括核糖开关，且任选地该核糖开关可呈反向定向。在本文所公开的实施例中的任一个中，包括所述元件中的任一个的聚核苷酸可包括引物结合位点。在说明性实施例中，隔离子和/或聚腺苷酸化序列可位于基因之前、之后、之间或附近以防止或减少不受调节的转录。在一些实施例中，隔离子可以是所属领域中已知的鸡HS4隔离子、Kaiso隔离子、SAR/MAR元件、嵌合鸡隔离子-SAR元件、CTCF隔离子、gypsy隔离子或β-球蛋白隔离子或其片段。在一些实施例中，隔离子和/或聚腺苷酸化序列可以是hGH polyA(SEQ ID NO:316)、SPA1(SEQ ID NO:317)、SPA2(SEQ ID NO:318)、b-血球蛋白polyA间隔子B(SEQ ID NO:319)、b-血球蛋白polyA间隔子A(SEQ ID NO:320)、250cHS4隔离子v1(SEQ ID NO:321)、250cHS4隔离子v2(SEQ ID NO:322)、650cHS4隔离子(SEQ ID NO:323)、400cHS4隔离子(SEQ ID NO:324)、650cHS4隔离子和b-血球蛋白polyA间隔子B(SEQ ID NO:325)或b-血球蛋白polyA间隔子B和650cHS4隔离子(SEQ ID NO:326)。

在本文所公开的实施例中的任一个中，编码Vpx的核酸序列可位于第二转录单元上或任选地存在的第三转录单元上，或位于可操作地连接至第一可诱导启动子的额外转录单元上。

本公开的一些方面包括细胞或为细胞，在说明性实例中为用作包装细胞以制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的哺乳动物细胞，如用于转导T细胞和/或NK细胞的慢病毒颗粒。

可选择广泛多种细胞中的任一个来在体外产生病毒或病毒颗粒，如根据本发明的复位向重组反转录病毒颗粒。通常使用真核细胞，尤其哺乳动物细胞，包括人类细胞，猿类细胞，犬类细胞，猫类细胞，马类细胞及啮齿动物细胞。在说明性实例中，细胞为人类细胞。在其它说明性实施例中，细胞无限地增殖，且因此永生。可有利地用于本发明的细胞的实例包括NIH 3T3细胞、COS细胞、Madin-Darby犬肾细胞、人类胚胎293T细胞及衍生自这类细胞的任何细胞，如gpnlslacZ

适合的哺乳动物细胞包括原代细胞及永生化细胞系。适合的哺乳动物细胞系包括人类细胞系、非人类灵长类细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括(但不限于)HeLa细胞(例如，美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection；ATCC)编号CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC编号CRL9618，CCL61，CRL9096)、293细胞(例如，ATCC编号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC编号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC编号CCLlO)、PC12细胞(ATCC编号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)、RATl细胞、小鼠L细胞(ATCC编号CCLI.3)、人胚肾(HEK)细胞(ATCC编号CRL1573)、HLHepG2细胞、Hut-78、Jurkat、HL-60等。

反转录病毒基因组大小

在本文提供的方法及组合物中，重组反转录病毒基因组(在非限制性说明性实例中为慢病毒基因组)对可包装至病毒颗粒中的聚核苷酸的数量具有限制。在本文提供的一些实施例中，由聚核苷酸编码区编码的多肽可为保留功能活性的截短或其它缺失，使得聚核苷酸编码区由比野生型多肽的聚核苷酸编码区更少的核苷酸编码。在一些实施例中，由聚核苷酸编码区编码的多肽可为可由一个启动子表达的融合多肽。在一些实施例中，融合多肽可具有裂解信号以由一个融合多肽及一个启动子产生两个或更多个功能性多肽。此外，在初始离体转导之后不需要的一些功能不包括于反转录病毒基因组中，而经由包装细胞膜存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。这些不同策略在本文用于使包装于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒内的功能性元件最大化。

在一些实施例中，待包装的重组反转录病毒基因组可在作为范围的低端的1,000个、2,000个、3,000个、4,000个、5,000个、6,000个、7,000个及8,000个核苷酸与作为范围的高端的2,000个、3,000个、4,000个、5,000个、6,000个、7,000个、8,000个、9,000个、10,000个及11,000个核苷酸之间。待包装的反转录病毒基因组包括编码如本文所详细公开的第一及第二工程改造信号传导多肽的一个或多个聚核苷酸区。在一些实施例中，待包装的反转录病毒基因组可少于5,000个、6,000个、7,000个、8,000个、9,000个、10,000个，或11,000个核苷酸。本文其它处所论述的可包装的功能包括用于反转录病毒组装及包装所需的反转录病毒序列，如反转录病毒rev、gag及pol编码区，以及5'LTR及3'LTR或其活性截短片段，编码反转录病毒顺式作用RNA包装元件的核酸序列及cPPT/CTS元件。此外，在说明性实施例中，本文中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以包括以下的任一种或多种或全部，在一些实施例中，相对于由反转录病毒5'LTR和3'LTR建立的5'至3'定向以反向定向(如作为非限制性实例的WO2019/055946中所说明)：一个或多个编码第一及第二工程改造信号传导多肽的聚核苷酸区，其中至少一个包括至少一个淋巴增生性元件；第二经工程改造的信号传导多肽，其可以包括嵌合抗原受体；miRNA、控制元件，如核糖开关，其通常调节第一和/或第二工程改造信号传导多肽的表达；识别域、内含子、启动子(其在目标细胞，如T细胞中具有活性)、2A裂解信号和/或IRES。

重组反转录病毒颗粒

重组反转录病毒颗粒公开于本文提供的方法及组合物中，例如用以转导T细胞和/或NK细胞以制备基因修饰的T细胞和/或NK细胞。重组反转录病毒颗粒自身为本发明的方面。通常，包括于本文提供的方面中的重组反转录病毒颗粒为复制缺陷型的，意谓重组反转录病毒颗粒在其离开包装细胞时即无法复制。在说明性实施例中，重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。

在一些方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以用于转导细胞，通常淋巴细胞且在说明性实施例中T细胞和/或NK细胞。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括本文其它处论述的假型化元件中的任一个。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括本文其它处论述的活化元件中的任一个。在一个方面中，本文中提供包括聚核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，所述聚核苷酸包括：A.一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体(CAR)；和B.假型化元件和其表面上的T细胞活化元件，其中所述T细胞活化元件不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的聚核苷酸编码。在一些实施例中，T细胞活化元件可为本文其它处论述的活化元件中的任一个。在说明性实施例中，T细胞活化元件可为抗CD3 scFvFc。在另一方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包括聚核苷酸，所述聚核苷酸包括可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包括嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包括淋巴增生性元件的第二多肽。在一些实施例中，淋巴增生性元件可为嵌合淋巴增生性元件。在说明性实施例中，淋巴增生性元件不包含连接至IL-7受体α链或其片段的IL-7。在一些实施例中，淋巴增生性元件不包含连接至IL-2/IL-15受体β链的IL-15。

在一些方面中，本文中提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和包含嵌合淋巴增生性元件(例如组成性活性嵌合淋巴增生性元件)的第二多肽。在说明性实施例中，嵌合淋巴增生性元件不包含连接至其同源受体或连接至其同源受体的片段的细胞因子。

在一些方面中，本文中提供重组反转录病毒颗粒，其包括(i)假型化元件，其能够结合于T细胞和/或NK细胞且促进重组反转录病毒颗粒与其的膜融合；(ii)聚核苷酸，其具有一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞具有活性的启动子的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码具有嵌合抗原受体的第一经工程改造的信号传导多肽和第二经工程改造的信号传导多肽，所述第一经工程改造的信号传导多肽包括抗原特异性靶向区、跨膜域和胞内活化域且所述第二经工程改造的信号传导多肽包括至少一个淋巴增生性元件；其中第一经工程改造的信号传导多肽和/或第二经工程改造的信号传导多肽的表达由体内控制元件调节；和(iii)其表面上的活化元件，其中活化元件能够结合于T细胞和/或NK细胞且不由重组反转录病毒颗粒中的聚核苷酸编码。在一些实施例中，在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子在包装细胞系中不具有活性，或仅以可诱导的方式在包装细胞系中具有活性。在本文公开的实施例中的任一个中，第一及第二经工程改造的信号传导多肽中的一个可具有嵌合抗原受体且另一经工程改造的信号传导多肽可具有至少一种淋巴增生性元件。

贯穿本公开提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中所包括的各种元件和元件组合，例如假型化元件、活化元件和膜结合细胞因子，以及复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组中所包括的核酸序列，如(但不限于)编码CAR的核酸；编码淋巴增生性元件的核酸；编码控制元件(如核糖开关)的核酸；启动子，尤其在T细胞中具有组成性活性或可诱导的启动子；和编码抑制性RNA分子的核酸。此外，本文提供的各种方面(如制备重组反转录病毒颗粒的方法、执行过继细胞治疗的方法，以及转导T细胞的方法)产生和/或包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。这类方法中产生和/或包括的复制缺陷型重组反转录病毒自身形成作为本发明的独立方面的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒组合物，所述组合物可呈分离形式。这类组合物可呈干燥(例如冻干)形式，或者可呈所属领域中已知的适合的溶液或介质形式以用于储存且使用反转录病毒颗粒。

因此，作为非限制性实例，在另一方面中，本文中提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其在其基因组中具有聚核苷酸，所述聚核苷酸具有一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其在一些情况下包括编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个RNA目标的抑制性RNA分子的第一核酸序列和编码如本文中所描述的嵌合抗原受体或CAR的第二核酸序列。在其它实施例中，存在编码本文先前所描述的不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增生性元件的第三核酸序列。在某些实施例中，聚核苷酸包括如本文所提及的一个或多个核糖开关，所述核糖开关可操作地连接至第一核酸序列、第二核酸序列和/或第三核酸序列(如果存在)。在此构筑体中，一种或多种抑制性RNA、CAR和/或不为抑制性RNA的一种或多种淋巴增生性元件的表达由核糖开关控制。在一些实施例中，两种至10种抑制性RNA分子由第一核酸序列编码。在其它实施例中，两种至六种抑制性RNA分子由第一核酸序列编码。在说明性实施例中，4种抑制性RNA分子由第一核酸序列编码。在一些实施例中，第一核酸序列编码一种或多种抑制性RNA分子且位于内含子内。在某些实施例中，内含子包括启动子的全部或部分。启动子可为Pol I、Pol II或Pol III启动子。在一些说明性实施例中，启动子为Pol II启动子。在一些实施例中，内含子邻近在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子且位于所述启动子的下游。在一些实施例中，内含子为EF1-α内含子A。

本文的重组反转录病毒颗粒实施例包括其中反转录病毒颗粒包含基因组的那些，所述基因组包括编码一种或多种抑制性RNA分子的一种或多种核酸。编码可包括于反转录病毒颗粒的基因组中的抑制性RNA分子的这类核酸的各种替代实施例(包括这类核酸与编码除抑制性RNA分子的外的CAR或淋巴增生性元件的其它核酸的组合)包括于例如本文提供的抑制性RNA部分以及包括于组合这些实施例的各种其它段落中。此外，这类复制缺陷型重组反转录病毒的各种替代物可通过在本文中所公开的包装细胞系方面内公开的例示性核酸识别。所属领域的技术人员将认识到，包括编码一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子的基因组的重组反转录病毒颗粒的此部分的公开内容可与本文其它部分所提供的编码抑制性RNA分子的这类核酸的各种替代物组合。此外，所属领域的技术人员将认识到，编码一种或多种抑制性RNA分子的这类核酸可与本文所提供的各种其它功能性核酸元件组合，如例如本文中侧重于抑制性RNA分子及编码这些分子的核酸的部分所公开。此外，在本文其它部分中提供的特异性抑制性RNA分子的各种实施例可用于本公开的重组反转录病毒颗粒方面中。

如慢病毒载体等重组反转录病毒载体的必需元件为是所属领域中已知的。这些元件包括于包装细胞系部分中，及在实例部分中所提供的用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的细节中且如WO2019/055946中所说明。举例来说，慢病毒颗粒通常包括包装元件REV、GAG及POL，其可经由一种或多种包装质体递送至包装细胞系；假型化元件，本文提供的各种实施例，其可经由假型化质体递送至包装细胞系；及基因组，其由经由转移质体递送至宿主细胞的聚核苷酸产生。此聚核苷酸通常包括病毒LTR及psi包装信号。5'LTR可为与异源启动子融合的嵌合5'LTR，其包括不依赖于Tat反式活化的5”LTR。转移质体可自失活，例如通过去除3'LTR的U3区。在一些非限制性实施例中，对于包括反转录病毒颗粒的本文提供的任何组合物或方法方面及实施例，将包括(但不限于)Src-FLAG-Vpu的Vpu(如包含Vpu的多肽(本文中有时称为“Vpu多肽”))包装于反转录病毒颗粒内。在一些非限制性实施例中，将Vpx(如Src-FLAG-Vpx)包装于反转录病毒颗粒内。不受理论约束，在转导T细胞后，Vpx进入细胞的胞液且促进SAMHD1的降解，从而使得可用于反向转录胞质dNTP库增加。在一些非限制性实施例中，对于包括本文提供的反转录病毒颗粒的任何组合物或方法方面及实施例，将Vpu及Vpx包装于反转录病毒颗粒内。

包括于本发明的各种方面中的反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)在说明性实施例中为非复制型，尤其出于对于包括将用这类反转录病毒颗粒转导的细胞引入个体的实施例的安全原因。当复制缺陷型反转录病毒颗粒用于转导细胞时，反转录病毒颗粒并非由转导的细胞产生。对反转录病毒基因组的修饰为所属领域中已知的，以确保包括该基因组的反转录病毒颗粒为复制缺陷型的。然而，应理解，在一些实施例中，针对本文所提供的方面中的任一个，可使用复制胜任型重组反转录病毒颗粒。

所属领域的技术人员将认识到，可使用不同类型的载体(如表达载体)将本文所论述的功能元件递送至包装细胞和/或至T细胞。本发明的说明性方面利用反转录病毒载体，及(在一些特定说明性实施例中)慢病毒载体。其它适合的表达载体可用于实现本文的某些实施例。这类表达载体包括(但不限于)病毒载体(例如基于痘疮病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒的病毒载体(参见例如Li等人,《眼科与视觉科学研究(Invest Opthalmol Vis Sci)》35:2543 2549,1994；Borras等人,《基因疗法(Gene Ther)》6:515 524,1999；Li和Davidson,《美国国家科学院院刊(PNAS)》92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,《人类基因疗法(H Gene Ther)》5:1088 1097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见例如Ali等人,《人类基因疗法(HumGene Ther)》9:8186,1998，Flannery等人,《美国国家科学院院刊》94:6916 6921,1997；Bennett等人,《眼科与视觉科学研究》38:2857 2863,1997；Jomary等人,《基因疗法》4:683690,1997，Rolling等人,《人类基因疗法》10:641 648,1999；Ali等人,《人类分子遗传学(Hum Mol Genet)》5:591 594,1996；Srivastava,WO 93/09239，Samulski等人,《病毒学杂志(J.Vir.)》(1989)63:3822-3828；Mendelson等人,《病毒学(Virol.)》(1988)166:154-165；和Flotte等人,《美国国家科学院院刊》(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；或反转录病毒载体(例如，鼠类白血病病毒、脾坏死病毒及衍生自如劳氏肉瘤病毒(RousSarcoma Virus)、哈维肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺肿瘤病毒的反转录病毒的载体)，例如γ反转录病毒；或人类免疫缺陷病毒(参见例如Miyoshi等人,《美国国家科学院院刊》94:10319 23,1997；Takahashi等人,《病毒学杂志》73:7812 7816,1999)等。

如本文所公开，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为用于基因递送的常用工具(Miller，《自然》(1992)357:455-460)。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒将未经排列的核酸序列递送至广泛范围的啮齿动物、灵长类动物及人类体细胞中的能力使得复制缺陷型重组反转录病毒颗粒较适用于将基因转移至细胞。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生自α反转录病毒属(Alpharetrovirus genus)、β反转录病毒属(Betaretrovirus genus)、γ反转录病毒属(Gammaretrovirus genus)、δ反转录病毒属(Deltaretrovirus genus)、ε反转录病毒属(Epsilonretrovirus genus)、慢病毒属或泡沫病毒属。存在许多种适用于本文中所公开的方法的反转录病毒。举例来说，可使用鼠白血病病毒(MLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、马感染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、富士纳肉瘤病毒(FuSV)、莫罗尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫罗尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾贝森鼠白血病病毒(Abelsonmurine leukemia virus)(A-MLV)、禽骨髓细胞病变病毒-29(MC29)及禽红细胞增生病毒(AEV)。反转录病毒的详细列表可见于Coffin等人(《反转录病毒(Retroviruses)》，1997，Cold Spring Harbor Laboratory Press版：J MCoffin,S M Hughes,H E Varmus，第758-763页)。可在所属领域中找到关于一些反转录病毒的基因组结构的细节。举例来说，可从NCBI Genbank(即Genome Accession第AF033819号)中找到关于HIV的细节。

在说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生自慢病毒属。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生HIV、SIV或FIV。在其它说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生自慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒(HIV)。慢病毒为复杂的反转录病毒，除常见的反转录病毒基因gag、pol及env外，还含有具有调节或结构功能的其它基因。较高复杂性使得慢病毒能够在潜伏感染过程中调节其生命周期。典型的慢病毒为人类免疫缺陷病毒(HIV)，AIDS的病原体。在体内，HIV可感染极少分裂的终末分化的细胞，如淋巴细胞及巨噬细胞。

在说明性实施例中，本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒含有Vpx多肽。

在一些实施例中，本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含和/或含有Vpu多肽。

在说明性实施例中，反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。这类反转录病毒颗粒通常包括位于病毒包膜内的衣壳内的反转录病毒基因组。

在一些实施例中，利用含DNA的病毒颗粒代替重组反转录病毒颗粒。这类病毒颗粒可为腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、痘病毒、牛痘病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒(VSV)，或辛德毕斯病毒(Sindbis virus)。所属领域的技术人员将理解如何修改本文公开的用于不同病毒及反转录病毒或反转录病毒颗粒的方法。在使用包括DNA基因组的病毒颗粒时，所属领域的技术人员将理解，这些基因组中可包括功能单元以诱导将病毒颗粒的全部或部分DNA基因组整合至用这类病毒转导的T细胞的基因组中。

在一些实施例中，HIV RRE及编码HIV Rev的聚核苷酸区可由N端RGG盒RNA结合模体及编码ICP27的聚核苷酸区替代。在一些实施例中，编码HIV Rev的聚核苷酸区可由编码腺病毒E1B 55-kDa及E4 Orf6的一个或多个聚核苷酸区替代。

在一个方面中，本发明提供容器(如商业容器或包装)或包含其的试剂盒，包含根据本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面中的任一个的经分离复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。此外，在另一方面中，本文提供容器(如商业容器或包装)或包含其的试剂盒，包含根据本文提供的包装细胞和/或包装细胞系方面中的任一个的经分离包装细胞，在说明性实施例中，来自包装细胞系的经分离包装细胞。在一些实施例中，试剂盒包括额外容器，所述额外容器包括额外试剂，如用于本文提供的方法中的缓冲液或试剂。此外，在某些方面中，本文提供任何方面中的本文提供的任何复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于基因修饰根据本文提供的任何方面的T细胞或NK的试剂盒中的用途。此外，在某些方面中，本文提供任何方面中的本文提供的任何包装细胞和/或包装细胞系在制造用于产生根据本文提供的任何方面的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的试剂盒中的用途。

在一个方面中，本文提供含有复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的商用容器及使用来治疗个体的肿瘤生长的说明书，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列。在一些实施例中，一个或多个核酸序列的核酸序列可编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在一些实施例中，一个或多个核酸序列的核酸序列可编码针对一个或多个RNA目标的一个或多个抑制性RNA分子。

含有重组反转录病毒颗粒的容器可为用于储存重组反转录病毒颗粒的管、小瓶，孔盘，或其它容器。试剂盒可包括两个或更多个容器，其中第二或其它容器可包括例如用于转导T细胞和/或NK细胞的溶液或培养基，和/或第二或其它容器可包括pH值调节药用试剂。这些容器中的任一个可具有工业强度及等级。包括试剂盒及编码抑制性RNA分子的核酸的这类方面中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可为本文所提供的这类复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的实施例中的任一个，其包括本文所提供的抑制性RNA的实施例中的任一个。

在另一方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的试剂盒中的用途，其中试剂盒的用途包括：使T细胞或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括表面上的假型化元件及表面上的T细胞活化元件，其中所述接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导T细胞或NK细胞，由此产生基因修饰的T细胞或NK细胞。在一些实施例中，T细胞或NK细胞可来自个体。在一些实施例中，T细胞活化元件可经膜结合。在一些实施例中，所述接触可进行作为范围的低端的1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时至作为范围的高端的4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、15小时、18小时、21小时及24小时，例如1小时至12小时。用于制造试剂盒的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括本文其它处论述的方面、实施例或子实施例中的任一个。

在另一方面中，本文中提供一种用于治疗或预防包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒作为活性成分的癌症或肿瘤生长的医药组合物。在另一方面中，本文中提供一种用于治疗或预防包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的癌症或肿瘤生长的输注组合物或其它递送溶液。医药组合物或输注组合物的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括上文或本文中其它地方所论述的方面、实施例或子实施例中的任一个。

被基因修饰的T细胞和NK细胞

在本文的方法及组合物的实施例中，产生本身为本发明的单独方面的被基因修饰的淋巴细胞。这类被基因修饰的淋巴细胞可以是被基因修饰和/或转导的淋巴细胞。在一个方面中，本文中提供被基因修饰的T细胞或NK细胞，其是使用根据本文中所提供的任何用于基因修饰血液或其组分中的T细胞和/或NK细胞的方面的方法制备。举例来说，在一些实施例中，T细胞或NK细胞被基因修饰以表达第一经工程改造的信号传导多肽。在说明性实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽可以是淋巴增生性元件或CAR，其包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域和胞内活化域。在一些实施例中，T细胞或NK细胞可进一步包括可为CAR或淋巴增生性元件的第二经工程改造的信号传导多肽。在一些实施例中，淋巴增生性元件可为嵌合淋巴增生性元件。在一些实施例中，T细胞或NK细胞可进一步包括表面上的假型化元件。在一些实施例中，T细胞或NK细胞可以进一步包括表面上的活化元件。被基因修饰的T细胞或NK细胞的CAR、淋巴增生性元件、假型化元件及活化元件可包括本文公开的方面、实施例或子实施例中的任一个。在说明性实施例中，活化元件可以是抗CD3抗体，如抗CD3scFvFc。

在一些实施例中，被基因修饰的淋巴细胞为已被基因修饰以表达包含至少一种淋巴增生性元件的第一经工程改造的信号传导多肽和/或包含嵌合抗原受体的第二经工程改造的信号传导多肽的淋巴细胞，如T细胞或NK细胞，所述嵌合抗原受体包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在本文方面中的任一个的一些实施例中，NK细胞为NKT细胞。NKT细胞为表达CD3且通常共表达αβT细胞受体且还表达通常与NK细胞相关的多种分子标记物(NK1.1或CD56)的子组。

本公开的被基因修饰的淋巴细胞具有已通过重组DNA方法引入淋巴细胞中的异源核酸序列。举例来说，在用于转导本文所提供的淋巴细胞的方法期间将说明性实施例中的异源序列插入淋巴细胞中。异源核酸发现于淋巴细胞内，且在一些实施例中经整合或未整合至被基因修饰的淋巴细胞的基因组中。

在说明性实施例中，将异源核酸整合至被基因修饰的淋巴细胞的基因组中。在说明性实施例中，使用利用重组反转录病毒颗粒的本文所提供的用于转导淋巴细胞的方法来产生这类淋巴细胞。这类重组反转录病毒颗粒可包括编码嵌合抗原受体的聚核苷酸，所述嵌合抗原受体通常包括至少一个抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在本公开的其它部分中，本文提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及在复制缺陷型反转录病毒颗粒的基因组中编码的聚核苷酸的各种实施例，所述复制缺陷型反转录病毒颗粒可用以产生本身形成本公开的另一方面的被基因修饰的淋巴细胞。

本公开的被基因修饰的淋巴细胞可在体外分离。举例来说，这类淋巴细胞可发现于如本文所提供的用于离体转导的培养基及其它溶液中。淋巴细胞可以未被基因修饰的形式存在于以本文所提供的方法自个体收集的血液中，接着在转导方法期间被基因修饰。被基因修饰的淋巴细胞可在其被基因修饰之后在其经引入或再引入个体之后发现于个体内部。被基因修饰的淋巴细胞可为静息T细胞或静息NK细胞，或被基因修饰的T细胞或NK细胞可以主动分裂，尤其在其表达在如本文所公开的转导之后经插入T细胞或NK细胞中的核酸中所提供的功能元件中的一些之后。

在一个方面中，本文中提供被转导和/或基因修饰的T细胞或NK细胞，其包含重组聚核苷酸，所述重组聚核苷酸在其基因组中包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的转录单元。

在一些实施例中，本文中提供被基因修饰的淋巴细胞，在说明性实施例中，T细胞和/或NK细胞，其涉及用于转导血液或其组分中的T细胞和/或NK细胞的方面，所述淋巴细胞包括编码一种、两种或更多种(例如1-10、2-10、4-10、1-6、2-6、3-6、4-6、1-4、2-4、3-4种)抑制性RNA分子的转录单元。在一些实施例中，这类抑制性RNA分子是淋巴增生性元件且因此可以包括于本文中所公开的作为淋巴增生性元件的任何方面或实施例中，只要其诱导T细胞和/或NK细胞的增殖或以其它方式满足本文中所提供的淋巴增生元件的测试即可。

可以在本文中所提供的任何方面的实施例中使用针对各种目标RNA的抑制性RNA分子。举例来说，一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子中的一种、大部分或全部减少内源性TCR的表达。在一些实施例中，RNA目标是由选自由以下组成的组的基因转录的mRNA：PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS、SMAD2、miR-155目标、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A和ABCG1。在此方面的一些实施例中，所述一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子中的至少一种为miR-155。

在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中，CAR的ASTR为MRB ASTR和/或CAR的ASTR结合至与肿瘤相关的抗原。此外，在以上方面的一些实施例中，第一核酸序列可操作地连接至核糖开关，所述核糖开关例如能够结合核苷类似物，且在说明性实施例中为抗病毒药物，例如阿昔洛韦(acyclovir)。

在本文公开的方法及组合物中，经工程改造的信号传导多肽的表达由控制元件调节，且在一些实施例中，所述控制元件为包含核糖开关的聚核苷酸。在某些实施例中，核糖开关能够结合核苷类似物，且当核苷类似物存在时，表达经工程改造的信号传导多肽中的一个或两个。

核酸

本公开提供编码本公开的多肽的核酸。在一些实施例中，核酸将为DNA，包括例如重组表达载体。在一些实施例中，核酸将为RNA，例如体外合成的RNA。

在一些实施例中，提供用于产生本公开的多肽(例如在哺乳动物细胞中)的核酸。在其它情况下，个体核酸提供编码本公开的多肽的核酸的扩增。

编码本公开的多肽的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件，例如启动子及增强子等。

适合的启动子及增强子元件为所属领域中已知的。为在细菌细胞中表达，适合的启动子包括(但不限于)lacl、lacZ、T3、T7、gpt、λP及trc。为在真核细胞中表达，适合的启动子包括(但不限于)轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子及增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期及晚期SV40启动子；反转录病毒的长末端重复中存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；及所属领域中已知的各种组织特异性启动子。

合适的可逆启动子，包括可逆诱导型启动子是所属领域中已知的。这类可逆启动子可以从许多生物体，例如真核生物和原核生物分离和衍生。对用于第二生物中的衍生自第一生物(例如第一原核生物及第二真核生物、第一真核生物及第二原核生物等)的可逆启动子的修饰为所属领域中已知的。这类可逆启动子和基于这类可逆启动子但还包含其它对照蛋白质的系统包括(但不限于)乙醇调节的启动子(例如醇脱氢酶I(alcA)基因启动子、对乙醇反式活化因子蛋白质(AlcR)起反应的启动子等)、四环素调节的启动子(例如包括TetActivators、TetON、TetOFF等的启动子)、类固醇调节的启动子(例如大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人类雌激素受体启动子系统、类视黄醇启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮(mifepristone)启动子系统等)、金属调节的启动子(例如金属硫蛋白启动子系统等)、相关发病机制调节的启动子(例如水杨酸调节的启动子、乙烯调节的启动子、苯并噻二唑调节的启动子等)、温度调节的启动子(例如热休克诱导型启动子(例如HSP-70、HSP-90、大豆热休克启动子等)、光调节的启动子、合成诱导型启动子等。

在一些情况下，含有适合的启动子的基因座或构筑体或转基因经由对可诱导系统的诱导来进行不可逆转换。用于诱导不可逆转换的合适的系统为所属领域中众所周知的，例如，不可逆转换的诱导可使用Cre-lox介导的重组(参见例如Fuhrmann-Benzakein等人，《美国国家科学院院刊》(2000)28:e99，其公开内容以引用的方式并入本文中)。所属领域中已知的重组酶、内切核酸酶、连接酶、重组位点等的任何适合的组合可用于产生不可逆转换的启动子。本文中其它地方描述的用于进行位点特异性重组的方法、机制及要求用于产生不可逆转换的启动子且为所属领域中众所周知的，参见例如Grindley等人(2006)《生物化学年报(Annual Review of Biochemistry)》,567-605及Tropp(2012)《分子生物学(Molecular Biology)》(Jones&Bartlett Publishers,Sudbury,MA)，其公开内容以引用的方式并入本文中。

在一些情况下，启动子为CD8细胞特异性启动子、CD4细胞特异性启动子、嗜中性粒细胞特异性启动子或NK特异性启动子。举例来说，可使用CD4基因启动子，参见例如Salmon等人(1993)《美国国家科学院院刊》90:7739及Marodon等人(2003)《血液》101:3416。作为另一实例，可使用CD8基因启动子。NK细胞特异性表达可通过使用Neri(p46)启动子来实现；参见例如Eckelhart等人(2011)《血液》117:1565。

在一些实施例中，例如对于在酵母细胞中表达，合适的启动子为组成性启动子，如ADHl启动子、PGKl启动子、ENO启动子、PYKl启动子等；或可调节启动子，如GALI启动子、GALlO启动子、ADH2启动子、PH05启动子、CUPl启动子、GAL7启动子、MET25启动子、MET3启动子、CYCl启动子、HIS3启动子、ADHl启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADCl启动子、TRPl启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TPl启动子及AOXl(例如用于毕赤酵母(Pichia)中)。对合适的载体及启动子的选择在所属领域的一般技术人员的水平内。

适用于原核宿主细胞中的启动子包括(但不限于)细菌噬菌体T7 RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂交启动子，例如lac/tac杂交启动子、tac/trc杂交启动子、trp/lac启动子、T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等；araBAD启动子；体内调节的启动子，如ssaG启动子或相关启动子(参见例如美国专利公开案第20040131637号)、pagC启动子(Pulkkinen和Miller,《细菌学杂志(J.Bacterial.)》,1991:173(1):86-93；Alpuche-Aranda等人,《美国国家科学院院刊》,1992；89(21):10079-83)、nirB启动子(Harborne等人(1992)《微观分子学(Mal.Micro.)》6:2805-2813)等(参见例如Dunstan等人(1999)《感染免疫学(Infect.Immun.)》67:5133-5141；McKelvie等人(2004)《疫苗(Vaccine)》22:3243-3255；和Chatfield等人(1992)《生物科技(Biotechnol.)》10:888-892)；σ70启动子，例如共同σ70启动子(参见例如Genome Accession第AX798980号、第AX798961号及第AX798183号)；固定相启动子，例如dps启动子、spv启动子等；来源于致病岛SPI-2的启动子(参见例如WO96/17951)；actA启动子(参见例如Shetron-Rama等人(2002)《感染免疫学》70:1087-1096)；rpsM启动子(参见例如Valdivia和Falkow(1996).《微观分子学》22:367)；tet启动子(参见例如Hillen,W.和Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.和Heinemann,U.(编),《分子和结构生物学，蛋白质，核酸相互作用中的话题(Topics in Molecular and StructuralBiology,Protein-Nucleic Acid Interaction.)》Macmillan,London,UK,第10卷,第143-162页)；SP6启动子(参见例如Melton等人(1984)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》12:7035)等。用于如大肠杆菌等原核生物的合适的强启动子包括(但不限于)Trc、Tac、T5、T7及Pλ。用于细菌性宿主细胞中的操纵子的非限制性实例包括乳糖启动子操纵子(Laci抑制子蛋白质在与乳糖接触时改变构形，由此阻止Laci抑制子蛋白质结合于操纵子)、色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸复合时，TrpR抑制子蛋白质具有结合操纵子的构形；在不存在色氨酸的情况下，TrpR抑制子蛋白质具有不结合于操纵子的构形)和tac启动子操纵子(参见例如deBoer等人(1983)《美国国家科学院院刊》80:21-25)。

编码本公开的多肽的核苷酸序列可存在于表达载体和/或克隆载体中。编码两个单独多肽的核苷酸序列可在相同或不同的载体中克隆。表达载体可包括选择性标记、复制源及提供载体的复制和/或维持的其它部件。合适的表达载体包括例如质体、病毒载体，及类似者。

大量合适的载体及启动子为所属领域的技术人员已知；许多在商业上可用于产生个体重组构筑体。借助于实例提供以下细菌载体：pBs、phagescript、PsiXl74、pBluescriptSK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,CA,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540，及pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。借助于实例提供以下真核生物载体：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXRl、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG，及pSVL(Pharmacia)。

表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便限制位点，以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。可存在于表达宿主中操作的可选择标记。

如上所述，在一些实施例中，编码本公开的多肽的核酸在一些实施例中将为RNA，例如体外合成的RNA。体外合成RNA的方法为所属领域中已知的；可使用任何已知的方法来合成包括编码本公开的多肽的核苷酸序列的RNA。用于将RNA引入宿主细胞中的方法是所属领域中已知的。参见例如Zhao等人(2010)《癌症研究(Cancer Res.)》15:9053。将包括编码本公开的多肽的核苷酸序列的RNA引入宿主细胞中可在体外或离体或体内进行。举例来说，可通过包含编码本公开的多肽的核苷酸序列的RNA对宿主细胞(例如，NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)进行体外或离体电穿孔。

包括聚核苷酸、核酸序列和/或转录单元的各种方面和实施例和/或包括其的载体进一步包括以下中的一个或多个：Kozak类序列(在本文中也称为Kozak相关序列)、土拔鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)和双重终止密码子或三重终止密码子，其中双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子定义由一个或多个转录单元中的至少一个的读取的终止。在某些实施例中，聚核苷酸、核酸序列和/或转录单元和/或包括其的载体进一步包括在一个或多个转录单元中的至少一个的起始密码子上游的10个核苷内具有5'核苷酸的Kozak类型序列。Kozak确定699种脊椎动物mRNA的Kozak共同序列(GCC)GCCRCCATG(SEQ ID NO:327)，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak.《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》1987年10月26日；15(20):8125-48)。在一个实施例中，Kozak类型序列为或包括CCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO:328)、CCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO:329)、GCCGCCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO:330)或GCCGCCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO:331)(其中圆括号中的核苷酸表示任选的核苷酸及指示所述位置处的不同可能的核苷酸的由斜线隔开的核苷酸，例如视核酸是否为DNA或RNA而定)。在包括AU/TG起始密码子的这些实施例中，可将A视为位置0。在某些说明性实施例中，-3和+4处的核苷酸是相同的，例如-3和+4核苷酸可以是G。在另一实施例中，Kozak类序列在ATG上游的第3位置中包括A或G，其中ATG是起始密码子。在另一实施例中，Kozak类型序列包括AUG上游的第3位置中的A或G，其中AUG为起始密码子。在说明性实施例中，Kozak类型序列为(GCC)GCCRCCATG(SEQ ID NO:327)，其中R为嘌呤(A或G)。在说明性实施例中，Kozak类型序列为GCCGCCACCAUG(SEQ ID NO:332)。在另一实施例中，其可与包括Kozak类型序列的前述实施例和/或包括三重密码子的以下实施例组合，聚核苷酸包括WPRE元件。所属领域中已表征WPRE(参见例如Higashimoto等人,《基因疗法》2007；14:1298)且如WO2019/055946中所说明。在一些实施例中，WPRE元件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3'及聚核苷酸的3'LTR的5'处。在另一实施例中，其可与前述实施例(即，其中聚核苷酸包括Kozak类序列的实施例和/或其中聚核苷酸包括WPRE的实施例)中的任一个或两个组合，所述一个或多个转录单元通过双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子终止，其中双重终止密码子包括第一阅读框架中的第一终止密码子和第二阅读框架中的第二终止密码子，或与第二终止密码子同框的第一终止密码子，且其中三重终止密码子包括第一阅读框架中的第一终止密码子、第二阅读框架中的第二终止密码子和第三阅读框架中的第三终止密码子，或与第二终止密码子和第三终止密码子同框的第一终止密码子。

本文的三重终止密码子包括三个终止密码子，一个在各读取框中，在彼此的10个核苷酸内，且优选具有重叠序列，或在相同读取框中的三个终止密码子，优选在连续密码子处。二重终止密码子意谓两个终止密码子，各自在不同读取框中，在彼此的10个核苷酸内，且优选具有重叠序列，或在相同读取框中的两个终止密码子，优选在连续密码子处。

在本文公开的方法及组合物中的一些中，使用不利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法执行DNA至PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞中的引入及任选的DNA至宿主细胞基因组中的并入。举例来说，可利用其它病毒载体，如来源于腺病毒、腺病毒相关病毒或1型单纯疱疹病毒的那些，作为非限制实例。

在一些实施例中，本文提供的方法可包括用非病毒载体转染目标细胞。在利用非病毒载体转染目标细胞的本文中所公开的任何实施例中，可使用包括电穿孔、核转染、脂质配制物、脂质、树状体、阳离子聚合物(如聚(乙烯亚胺)(PEI)及聚(l-赖氨酸)(PLL))、纳米粒子、细胞穿透肽、微注射和/或未整合慢病毒载体的方法将非病毒载体(包括裸DNA)引入目标细胞(如PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞)中。在一些实施例中，可将DNA引入具有脂质体及鱼精蛋白的复合物中的目标细胞(如PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞)中。本文中所提供的方法的实施例中可以使用的其它用于离体转染T细胞和/或NK细胞的方法是所属领域中已知的(参见例如Morgan和Boyerinas,《生物医药(Biomedicines.)》2016年4月20日；4(2).pii:E9，以全文引用的方式并入本文中)。

在本文中所提供的方法的一些实施例中，可以使用基于转座子的载体系统，通过目标DNA(作为含有相关基因的5'和3'端中的转座子ITR片段的质体)和转座酶载体系统(作为DNA或mRNA或蛋白质或位点特异性丝氨酸重组酶，如整合人类基因组中的伪attP位点中的相关基因的phiC31)的共转染、共核转染或共电穿孔来将DNA整合到基因组中，在此实例中，DNA载体含有34至40bp attB位点，其是重组酶的识别序列(Bhaskar Thyagarajan等人,《由噬菌体

抑制性RNA分子

本文中所提供的任何方面的实施例可以包括重组反转录病毒颗粒，其基因组被构造成在整合至宿主细胞(如淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞))中之后诱导一个或多个且在说明性实施例中，两个或更多个抑制性RNA分子(如miRNA或shRNA)的表达。这类抑制性RNA分子可以在内含子(包括例如EF1-a内含子)内编码。此利用本发明的方法教示以使可包括于可包装反转录病毒基因组中的功能元件最大化，以克服先前教示的缺点，且使这类重组反转录病毒颗粒在过继性T细胞疗法中的有效性最大化。

在一些实施例中，抑制性RNA分子包括与彼此部分或完全互补的5'链及3'链(在一些实例中，有义链及反义链)，使得所述两个链能够在细胞环境内形成18至25个核苷酸的RNA双螺旋。5'链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，且3'链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。5'链及3'链可为相同或不同的长度，且RNA双螺旋可包括一个或多个错配。替代地，RNA双螺旋不具有错配。

包括于本文所提供的组合物及方法中的抑制性RNA分子在某些说明性实施例中不存在于和/或不天然表达在其插入其基因组的T细胞中。在一些实施例中，抑制性RNA分子为miRNA或shRNA。在一些实施例中，当在本文或优先权申请中提及编码siRNA的核酸，尤其在核酸为基因组的一部分的上下文中，将理解，这类核酸能够在由DICER处理的细胞中形成如miRNA或shRNA等siRNA前体，以形成通常与RISK复合物相互作用或成为RISK复合物的一部分的双链RNA。在一些实施例中，本公开的实施例中的抑制性分子可为miRNA的前体(如Pri-miRNA或Pre-miRNA)，或shRNA的前体。在一些实施例中，miRNA或shRNA为人工衍生的(即，人工miRNA或siRNA)。在其它实施例中，抑制性RNA分子为经处理成siRNA的dsRNA(经转录或人工引入)或siRNA本身。在一些实施例中，miRNA或shRNA具有在自然界中未发现的序列，或具有在自然界中未发现的至少一个功能区段，或具有在自然界中未发现的功能区段的组合。

在一些实施例中，抑制性RNA分子以一连串或多重排列方式置于第一核酸分子中，使得多个miRNA序列同时自单个多顺反子miRNA转录物表达。在一些实施例中，抑制性RNA分子可利用非功能性连接子序列直接地或间接地与彼此邻接。在一些实施例中，连接子序列长度可在5个核苷酸与120个核苷酸之间，且在一些实施例中，长度可在10个核苷酸与40个核苷酸之间，作为非限制性实例。在说明性实施例中，编码一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA的第一核酸序列及编码CAR(例如MRB-CAR)的第二核酸序列可操作地连接至具有组成性活性或可在T细胞或NK细胞中诱导的启动子。因此，所述抑制性RNA分子(例如miRNA)以及CAR以多顺反子的方式表达。另外，功能性序列可自同一转录物表达。举例来说，本文所提供的并非抑制性RNA分子的淋巴增生性元件中的任一个可自与CAR及一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子相同的转录物表达。

在一些实施例中，抑制性RNA分子为天然存在的miRNA，如(但不限于)miR-155。替代地，可产生人造miRNA，其中能够形成杂交/互补的茎结构且针对目标RNA的序列置于包括用于微型RNA处理的微型RNA侧接序列及环的miRNA框架中，且可任选地衍生自与茎序列之间的侧接序列相同的天然存在的miRNA。因此，在一些实施例中，抑制性RNA分子自5'至3'定向包括：5'微型RNA侧接序列、5'茎、环、与所述5'茎部分或完全互补的3'茎，及3'微型RNA侧接序列。在一些实施例中，5'茎(在本文中也称为5'臂)长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，3'茎(在本文中也称为3'臂)长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，环的长度为3至40、10至40、20至40或20至30个核苷酸，且在说明性实施例中，环的长度可为18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，一个茎比另一茎长两个核苷酸。较长的茎可为5'茎或3'茎。

在一些实施例中，5'微型RNA侧接序列、3'微型RNA侧接序列或两者皆衍生自天然存在的miRNA，如(但不限于)miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在某些实施例中，5'微型RNA侧接序列、3'微型RNA侧接序列或两者皆衍生自miR-155，例如来自小家鼠或智人的miR-155。将合成miRNA茎-环插入miR-155构架(即，5'微型RNA侧接序列、3'微型RNA侧接序列和miRNA 5'和3'茎之间的环)是所属领域的一般技术人员已知的(Chung,K.等人2006.《核酸研究》34(7):e53；US 7,387,896)。SIBR(合成抑制性BIC衍生的RNA)序列(Chung等人.2006，见上文)例如具有由小家鼠BIC非编码mRNA(Genbank ID AY096003.1)的核苷酸134至161(SEQ ID NO:333)组成的5'微型RNA侧接序列及由小家鼠BIC非编码mRNA(GenbankID AY096003.1)的核苷酸223至283组成的3'微型RNA侧接序列。在一项研究中，SIBR序列被修饰(eSIBR)以增强miRNA的表达(Fowler，D.K.等人.2015.《核酸研究》44(5):e48)。在本公开的一些实施例中，miRNA可置于SIBR或eSIBR miR-155框架中。在本文的说明性实施例中，miRNA置于miR-155框架中，其包括由SEQ ID NO:333展示的miR-155的5'微型RNA侧接序列，由SEQ ID NO:334展示的3'微型RNA侧接序列(小家鼠BIC非编码mRNA的核苷酸221至265)；及被修饰的miR-155环(SEQ ID NO:335)。因此，在一些实施例中，miR-155的5'微型RNA侧接序列是SEQ ID NO:333或其功能性变体，例如与SEQ ID NO:333长度相同的序列，或长度是SEQ ID NO:333的长度的95％、90％、85％、80％、75％或50％的序列，或长度是100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少或25个核苷酸或更少的序列；且与SEQ ID NO:333至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致。在一些实施例中，miR-155的3'微型RNA侧接序列是SEQ ID NO:334或其功能性变体，例如与SEQ ID NO:334长度相同的序列，或长度是SEQ ID NO:334的长度的95％、90％、85％、80％、75％或50％的序列，或长度是100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少或25个核苷酸或更少的序列；且与SEQ ID NO:334至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致。然而，作用以在插入其中的miRNA的细胞内提供适当处理以形成能够抑制其结合的目标mRNA的表达的成熟miRNA的任何已知的微型RNA框架涵盖于本公开中。

在一些实施例中，由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的聚核苷酸中的核酸序列编码的抑制性RNA分子中的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个具有呈5'至3'定向的以下排列：5'微型RNA侧接序列、5'茎、环、与所述5'茎部分或完全互补的3'茎，及3'微型RNA侧接序列。在一些实施例中，所有抑制性RNA分子具有呈5'至3'定向的以下排列：5'微型RNA侧接序列、5'茎、环、与所述5'茎部分或完全互补的3'茎，及3'微型RNA侧接序列。如本文所公开，抑制性RNA分子可由一个或多个连接子序列分隔开，其在一些实施例中没有除在所述抑制性RNA分子之间作为间隔子以外的功能。

在一些实施例中，当包括两个或更多个抑制性RNA分子(在一些实例中，包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个抑制性RNA分子)时，这些抑制性RNA分子针对相同或不同的RNA目标(如自相关基因转录的mRNA)。在说明性实施例中，第一核酸序列中包括2至10个、2至8个、2至6个、2至5个、3至5个或3至6个或4个抑制性RNA分子。在说明性实施例中，第一核酸序列中包括四个抑制性RNA分子。

在一些实施例中，一个或多个抑制剂RNA分子是一个或多个淋巴增生性元件，因此，在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方面或实施例中，除非与其不相容(例如多肽淋巴增生性元件)或其中已陈述。在一些实施例中，RNA目标为自由T细胞表达的基因转录的mRNA，所述mRNA如(但不限于)：PD-1(防止失活)；CTLA4(防止失活)；TCRa(安全地防止自体免疫)；TCRb(安全-防止自体免疫)；CD3Z(安全-防止自体免疫)；SOCS1(防止失活)；SMAD2(防止失活)；miR-155目标(促进活化)；IFNγ(减少CRS)；cCBL(延长信号传导)；TRAIL2(防止死亡)；PP2A(延长信号传导)；ABCG1(通过限制胆固醇的清除来增加胆固醇微含量)。在说明性实例中，在本文提供的方法中插入T细胞至基因组中的miRNA针对目标，使得T细胞的增殖被诱导和/或增强和/或凋亡被抑制。

在一些实施例中，RNA目标包括编码T细胞受体(TCR)复合物的组分的mRNA。这类组分可包括用于产生和/或形成T细胞受体复合物的组分和/或用于T细胞受体复合物的恰当功能的组分。因此，在一个实施例中，两种或更多种抑制性RNA分子中的至少一个使得TCR复合物(在说明性实施例中，T细胞的一种或多种内源性TCR复合物)的形成和/或功能降低。T细胞受体复合物包括TCRa、TCRb、CD3d、CD3e、CD3g和CD3z。众所周知，存在这些组分的复合度相互依存，使得任一个子单元的表达的减少将引起复合物的表达和功能的减少。因此，在一个实施例中，RNA目标为表达与经转导T细胞内源性的TCRa、TCRb、CD3d、CD3e、CD3g及CD3z中的一个或多个的mRNA。在某些实施例中，RNA目标为自T细胞的内源性TCRα或TCRβ基因转录的mRNA，所述T细胞的基因组包含编码一个或多个miRNA的第一核酸序列。在说明性实施例中，RNA目标为自TCRα基因转录的mRNA。在某些实施例中，可将针对自具有相似预期效用的靶基因转录的mRNA的抑制性RNA分子组合。在其它实施例中，可将针对自具有互补效用的目标基因转录的目标mRNA的抑制性RNA分子组合。在一些实施例中，两种或更多种抑制性RNA分子针对自目标基因CD3Z、PD1、SOCS1和/或IFNγ转录的mRNA。

在一些实施例中，抑制性RNA，例如miRNA靶向编码以下的mRNA：Cbl原癌基因(RNF55)(也称为cCBL和RNF55)(HGNC：1541，Entrez Gene：867，OMIM：165360)、T细胞受体T3ζ链(CD3z)(HGNC：1677，Entrez Gene：919，OMIM：186780)、PD1、CTLA4、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM3)(也称为肝炎A病毒细胞受体2)(HGNC：18437，Entrez Gene：84868，OMIM：606652)、淋巴细胞活化3(LAG3)(HGNC：6476，Entrez Gene：3902，OMIM：153337)、SMAD2、TNF受体超家族成员10b(TNFRSF10B)(HGNC：11905，Entrez Gene：8795，OMIM：603612)、蛋白磷酸酶2催化子单元α(PPP2CA)(HGNC：9299，Entrez Gene：5515，OMIM：176915)、肿瘤坏死因子受体超家族成员6(TNFRSF6)(也称为Fas细胞表面死亡受体(FAS))(HGNC：11920，EntrezGene：355，OMIM：134637)、相关B和T淋巴细胞(BTLA)(HGNC：21087，Entrez Gene：151888，OMIM：607925)、具有Ig和ITIM域的T细胞免疫受体(TIGIT)(HGNC：26838，Entrez Gene：201633，OMIM：612859)、腺苷A2a受体(ADORA2A或A2AR)(HGNC：263，Entrez Gene：135，OMIM：102776)、芳基烃受体(AHR)(HGNC：348，Entrez Gene：196，OMIM：600253)、脱中胚蛋白(EOMES)(HGNC：3372，Entrez Gene：8320，OMIM：604615)、SMAD家族成员3(SMAD3)(HGNC：6769，Entrez Gene：4088，OMIM：603109)、SMAD家族成员4(SMAD4)(GNC：6770，Entrez Gene：4089，OMIM：600993)、TGFBR2、蛋白磷酸酶2调节子单元Bδ(PPP2R2D)(HGNC：23732，EntrezGene：55844，OMIM：613992)、肿瘤坏死因子配位体超家族成员6(TNFSF6)(也称为FASL)(HGNC：11936，Entrez Gene：356，OMIM：134638)、胱天蛋白酶3(CASP3)(HGNC：1504，EntrezGene：836，OMIM：600636)、细胞因子信号传导抑制因子2(SOCS2)(HGNC：19382，EntrezGene：8835，OMIM：605117)、Kruppel样因子10(KLF10)(也称为TGFB可诱导早期生长反应蛋白质1(TIEG1))(HGNC：11810，Entrez Gene：7071，OMIM：601878)、JunB原癌基因、AP-1转录因子子单元(JunB)(HGNC：6205，Entrez Gene：3726，OMIM：165161)、Cbx3、Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(Tet2)(HGNC：25941，Entrez Gene：54790，OMIM：612839)、己糖激酶2(HK2)(HGNC：4923，Entrez Gene：3099，OMIM：601125)、含有Src同源性区2域的磷酸酶-1(SHP1)(HGNC：9658，Entrez Gene：5777，OMIM：176883)、含有Src同源性区2域的磷酸酶-2(SHP2)(HGNC：9644，Entrez Gene：5781，OMIM：176876)；或在一些实施例中，编码TIM3、LAG3、TNFRSF10B、PPP2CA、TNFRSF6(FAS)、BTLA、TIGIT、A2AR、AHR、EOMES、SMAD3、SMAD4、PPP2R2D、TNFSF6(FASL)、CASP3、SOCS2、TIEG1、JunB、Cbx3、Tet2、HK2、SHP1或SHP2的mRNA。在一些说明性实施例中，抑制性RNA，例如miRNA靶向编码以下的mRNA：FAS、AHR、CD3z、cCBL、Chromobox 1(Cbx)(HGNC：1551，Entrez Gene：10951，OMIM：604511)、HK2、FASL、SMAD4或EOMES；或在一些说明性实施例中，抑制性RNA，例如miRNA靶向编码以下的mRNA：FAS、AHR、Cbx3、HK2、FASL、SMAD4或EOMES；或在一些说明性实施例中，抑制性RNA，例如miRNA靶向编码以下的mRNA：AHR、Cbx3、HK2、SMAD4或EOMES。

在一些其它说明性实施例中，本文中的载体或基因组包括本文中，例如在以上段落中识别的抑制性RNA(例如miRNA)中的2个或更多个、2-10个、2-8个、2-6个、3-5个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。在一些其它说明性实施例中，本文中的载体或基因组包括2种或更多种、2-10种、2-8种、2-6种、3-5种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种靶向编码FAS、cCBL、AHR、CD3z、Cbx、EOMES或HK2的mRNA的抑制性RNA(例如miRNA)，或靶向这类mRNA的1种或更多种抑制性RNA的组合。在一些其它说明性实施例中，本文中的载体或基因组2种或更多种、2-10种、2-8种、2-6种、3-5种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种靶向编码AHR、Cbx3、EOMES或HK2的mRNA的抑制性RNA(例如miRNA)，或靶向这类mRNA的1种或更多种抑制性RNA的组合。

在本文提供的一些实施例中，两种或更多种抑制性RNA分子可在单个内含子中递送，如(但不限于)EF1-a内含子A。可用于携带本公开的miRNA的内含子序列包括在T细胞内处理的任何内含子。如本文所示，这类排列的一个优势在于，此有助于以本文提供的方法使miRNA序列包括于用于将这类序列递送至T细胞的反转录病毒基因组的大小内的能力最大化。当第一核酸序列的内含子包括用于以多顺反子方式表达内含子、CAR序列及本文所提供的其它功能性序列的启动子序列的全部或部分(如并非抑制性RNA分子的淋巴增生性元件)时，此尤其为真。内含子的序列要求为所属领域中已知的。在一些实施例中，这类内含子处理可操作地连接至核糖开关，如本文所公开的任何核糖开关。因此，核糖开关可提供用于控制第一核酸序列上的一个或多个miRNA序列的表达的调节元件。因此，本文所提供的说明性实施例为针对内源性T细胞受体子单元的miRNA的组合，其中miRNA的表达由核糖开关调节，所述核糖开关可为本文所论述的核糖开关中的任一个。

在一些实施例中，抑制性RNA分子可提供于可包括于相同或不同转录单元上的多个核酸序列上。举例来说，第一核酸序列可编码一种或多种抑制性RNA分子，且自第一启动子表达，且第二核酸序列可编码一种或多种抑制性RNA分子且自第二启动子表达。在说明性实施例中，两种或更多种抑制性RNA分子位于自单个启动子表达的第一核酸序列上。用于表达这类miRNA的启动子通常为在用于表达反转录病毒颗粒的包装细胞中无活性的启动子，所述反转录病毒颗粒将其基因组中的miRNA递送至目标T细胞，但这类启动子在T细胞内为组成性活性或呈可诱导的方式的活性。启动子可为Pol I、Pol II或Pol III启动子。在一些说明性实施例中，启动子为Pol II启动子。

特征及商业生产方法

本公开提供多种方法及组合物，可用作科学实验中的研究试剂及用于商业生产。此科学实验可包括使用用于基因修饰(例如转导)本文提供的淋巴细胞的方法表征淋巴细胞(如NK细胞，且在说明性实施例中，T细胞)的方法。这些方法例如可用于研究淋巴细胞的活化及通过其活化使得这些细胞可转导的详述分子机制。此外，本文提供将用于例如作为研究工具以更好理解影响T细胞增生及存活的因素的被基因修饰的淋巴细胞。这些被基因修饰的淋巴细胞(如NK细胞，且在说明性实施例中，T细胞)可此外用于商业生产，例如用于产生可经采集或测试或用于产生商业产物的某些因子，如生长因子及免疫调节剂。

淋巴细胞的科学实验和/或特征可包括用于分析或比较淋巴细胞的本文提供的方面、实施例或子实施例中的任一个。在一些实施例中，可用包括聚核苷酸的本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞。在一些实施例中，转导T细胞和/或NK细胞可包括聚核苷酸，所述聚核苷酸包括编码本公开的多肽的聚核苷酸，例如CAR、淋巴增生性元件和/或活化元件。在一些实施例中，聚核苷酸可包括如本文其它地方论述的抑制性RNA分子。在一些实施例中，淋巴增生性元件可为嵌合淋巴增生性元件。

例示性实施例

此例示性实施例章节提供本文中提供的例示性方面及实施例且贯穿此说明书进一步论述。出于简洁及方便起见，所有所公开方面及实施例及所公开方面及实施例的所有可能的组合不列于此章节中。应理解，所提供的实施例为针对许多方面的特定实施例，如此整个公开内容所论述。意图鉴于本文的完整公开内容，以下所述或此完整公开内容中的任何个别实施例可与以下所述或此完整公开内容中的任何方面组合，其中其为可添加至方面的额外元素或因为其为针对已呈现于方面中的元素的更窄元素。此组合在此详细描述的其它章节中具体地论述。

对于本文中所提供的任何用于基因修饰和/或转导淋巴细胞(例如PBMC，或T细胞和/或NK细胞)的方法，或包括这类方法的用途，或使用这类方法产生的被基因修饰的细胞以及任何其它方法或过程产物，包括(但不限于)在包括使反转录病毒颗粒与淋巴细胞(例如PBMC，或T细胞和/或NK细胞)接触的接触步骤的此例示性实施例部分中，除非与方面或实施例不相容或已在方面或实施例中陈述，否则在某些实施例中，接触步骤可以进行(或可以发生)30秒至72小时，例如1分钟至12小时，或5分钟至12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时、1小时、30分钟或15分钟。在一些实施例中，接触可进行小于24小时，例如小于12小时、小于8小时、小于4小时且在说明性实施例中，小于2小时、小于1小时、小于30分钟或小于15分钟，但在每种情况下，至少存在一个初始接触步骤，其中使反转录病毒颗粒与细胞在转导反应混合物中的悬浮液中接触。这类悬浮液可包括使细胞及反转录病毒颗粒沉降，或经由施加如离心力等力的造成容器或腔室底部的这类沉降。然而，在某些说明性实施例中，这类力小于用于离心接种的力，如本文中更详细论述。在这类初始接触之后，可在不去除在溶液中保持游离且不与细胞相关联的反转录病毒颗粒的情况下，存在于反应混合物(在反应混合物中悬浮液中含有细胞及反转录病毒颗粒)中进行额外任选地选用的培育。在说明性实施例中，接触可进行(或发生)作为范围的低端的30秒或1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或45分钟，或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时至作为范围的高端的10分钟、15分钟、30分钟，或1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时及72小时。在某些说明性实施例中，接触步骤可以进行作为范围的低端的30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟或30分钟至作为范围的高端的1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时或12小时。在一些实施例中，接触步骤进行作为范围的低端的30秒、1分钟和5分钟至作为范围的高端的10分钟、15分钟、30分钟、45分钟或60分钟。在另一说明性实施例中，接触是在仅进行初始接触步骤(不在包括在悬浮液中游离的反转录病毒颗粒和悬浮液中的细胞的反应混合物中进行任何进一步培育)而不在反应混合物中进行任何进一步培育，或在反应混合物中进行5分钟或更短、10分钟或更短、15分钟或更短、30分钟或更短或1小时或更短的培育之间的范围内进行。在一些实施例中，在添加待基因修饰和/或转导的细胞之后，可立即洗涤复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，使得接触时间实施持续洗涤复制缺陷型重组反转录病毒颗粒所花费的时间长度。因此，通常，接触至少包括初始接触步骤，其中在转导反应混合物中的悬浮液中使反转录病毒颗粒与细胞接触。可在不预先活化的情况下进行这类方法。

在本文中所提供的任何包括或任选地包括编码抑制性RNA分子的核酸序列第方面和实施例，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的方面和实施例中，除非其中已陈述或与其不相容，否则包括这类核酸序列且在某些实施例中，这类抑制性RNA分子靶向例如在本文中的抑制性RNA分子部分中识别的任何基因(例如mRNAs编码)目标；或在某些实施例中，靶向TCRa、TCRb、SOCS1、miR155目标、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A、ABCG1、cCBL、CD3z、CD3z、PD1、CTLA4、TIM3、LAG3、SMAD2、TNFRSF10B、PPP2CA、TNFRSF6(FAS)、BTLA、TIGIT、A2AR、AHR、EOMES、SMAD3、SMAD4、TGFBR2、PPP2R2D、TNFSF6(FASL)、CASP3、SOCS2、TIEG1、JunB、Cbx3、Tet2、HK2、SHP1或SHP2；或在某些实施例中，靶向cCBL、CD3z、CD3z、PD1、CTLA4、TIM3、LAG3、SMAD2、TNFRSF10B、PPP2CA、TNFRSF6(FAS)、BTLA、TIGIT、A2AR、AHR、EOMES、SMAD3、SMAD4、TGFBR2、PPP2R2D、TNFSF6(FASL)、CASP3、SOCS2、TIEG1、JunB、Cbx3、Tet2、HK2、SHP1或SHP2；或在某些实施例中，靶向编码以下的mRNA：TIM3、LAG3、TNFRSF10B、PPP2CA、TNFRSF6(FAS)、BTLA、TIGIT、A2AR、AHR、EOMES、SMAD3、SMAD4、PPP2R2D、TNFSF6(FASL)、CASP3、SOCS2、TIEG1、JunB、Cbx3、Tet2、HK2、SHP1或SHP2；或在某些说明性实施例中，靶向编码以下的mRNA：FAS、AHR、CD3z、cCBL、Cbx、HK2、FASL、SMAD4或EOMES；或在某些说明性实施例中，靶向编码以下的mRNA：FAS、AHR、Cbx3、HK2、FASL、SMAD4或EOMES；或在其它说明性实施例中，靶向编码以下的mRNA：AHR、Cbx3、HK2、SMAD4或EOMES。在一些实施例中，抑制性RNA分子包括SEQID NO:342-449的序列中的至少一个。在一些实施例中，抑制性RNA分子包括SEQ ID NO:394-401、406-409、438-441或446-449的序列中的至少一个。

在本文中所提供的任何包括或任选地包括编码抑制性RNA分子的核酸序列第方面和实施例，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的方面和实施例中，除非其中已陈述或与其不相容，否则包括这类核酸序列且在某些实施例中，这类抑制性RNA分子包括2种或更多种、2-10种、2-8种、2-6种、3-5种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种抑制性RNA或本文中(例如以上段落中)识别的目标抑制性RNA(例如miRNA)；或在某些实施例中这类聚核苷酸包括2种或更多种、2-10种、2-8种、2-6种、3-5种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种靶向编码以下的mRNA的抑制性RNA(例如miRNA)：FAS、cCBL、AHR、CD3z、Cbx、EOMES或HK2，或靶向这类mRNA的1种或更多种抑制性RNA的组合；或在某些其它说明性实施例中，这类聚核苷酸2种或更多种、2-10种、2-8种、2-6种、3-5种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种靶向编码以下的mRNA的抑制性RNA(例如miRNA)：FAS、AHR、Cbx3、EOMES或HK2，或靶向这类mRNA的1种或更多种抑制性RNA的组合。本文中所提供的包括编码抑制性RNA分子的核酸的这类方面和实施例包括(但不限于)本文中所提供的涉及聚核苷酸或载体(例如复制缺陷型反转录病毒颗粒)的方面和实施例，或包含基因组的方面，如被分离动细胞或复制缺陷型反转录病毒颗粒。

在一个方面中，本文中提供用于基因修饰和/或转导淋巴细胞(例如T细胞或NK细胞)或其群体的方法，其包含以离体方式使包含淋巴细胞(例如T细胞或NK细胞)或其群体的血细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)中具有活性的启动子的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域和胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，且任选地所述一个或多个核酸序列中的另一个编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个RNA目标的抑制性RNA分子，并且此外任选地所述一个或多个核酸序列中的另一个编码多肽淋巴增生性元件，其中所述接触通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒促进淋巴细胞(例如T细胞或NK细胞)或至少一些淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的基因修饰和/或转导，由此产生被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)。在这类方法中，接触通常在反应混合物(在本文中有时称为转导反应混合物)中进行，所述反应混合物包含淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的群体且与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的群体接触。本文中提供各种接触时间，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，可用于此方面中以促进膜缔合和淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的最终膜融合的接触时间。在说明性实施例中，接触进行小于15分钟。

在一个方面中，本文中提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的用途，其用于制造用以基因修饰个体的淋巴细胞(例如T细胞或NK细胞)的试剂盒，其中所述试剂盒的用途包含：以离体方式使包含淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的血细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在反应混合物中接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个核酸序列，通常是以可操作的方式连接至在淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)中具有活性的启动子的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽、包含淋巴增生性元件(LE)的第一多肽或包含LE的第一多肽和包含CAR的第二多肽，由此产生被基因修饰的淋巴细胞(例如被基因修饰的T细胞和/或被基因修饰的NK细胞)。本文中提供各种接触时间，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，可用于此方面中以促进膜缔合和淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的最终膜融合的接触时间。在说明性实施例中，接触进行小于15分钟。

在另一方面中，本文中提供根据一种方法通过基因修饰淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)而制备的被基因修饰的淋巴细胞(例如T细胞或NK细胞)，其中所述方法包含以离体方式使包含T细胞和/或NK细胞的血细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在反应混合物中接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个核酸序列，通常是以可操作的方式连接至在淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)中具有活性的启动子的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽、包含淋巴增生性元件(LE)的第一多肽或包含LE的第一多肽和包含CAR的第二多肽，由此产生被基因修饰的淋巴细胞(例如T细胞和/或被基因修饰的NK细胞)。本文中提供各种接触时间，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，可用于此方面中以促进膜缔合和淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的最终膜融合的接触时间。在说明性实施例中，接触进行小于15分钟。

在另一方面中，本文中提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其用于基因修饰淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的方法中，其中所述方法包含以离体方式使包含淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的血细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在反应混合物中接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含一个或多个聚核苷酸，所述一个或多个聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域和胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，且任选地所述一个或多个核酸序列中的另一个编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个RNA目标的抑制性RNA分子，且此外任选地所述一个或多个核酸序列中的另一个编码多肽淋巴增生性元件，其中所述接触促进由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进行的至少一些静息T细胞和/或NK细胞的转导，由此产生被基因修饰的T细胞和/或NK细胞。本文中提供各种接触时间，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，可用于此方面中以促进膜缔合和淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的最终膜融合的接触时间。在说明性实施例中，接触进行小于15分钟。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括将被基因修饰的T细胞和/或NK细胞引入个体中。在说明性实施例中，包含淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的血细胞是来自个体且因此所述引入是再引入。在此方面中，在一些实施例中，淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的群体是在接触步骤中接触，被基因修饰和/或转导以及在引入步骤中被引入个体中。

在另一方面中，本文中提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的用途，其用于制造用以基因修饰个体的淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的试剂盒，其中所述试剂盒的用途包含以离体方式使个体的包含淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的血细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在反应混合物中接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含一个或多个聚核苷酸，所述一个或多个聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域和胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，且任选地所述一个或多个核酸序列中的另一个编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个RNA目标的抑制性RNA分子，且此外任选地所述一个或多个核酸序列中的另一个编码多肽淋巴增生性元件，其中所述接触促进由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进行的至少一些静息T细胞和/或NK细胞的转导，由此产生被基因修饰的T细胞和/或NK细胞。如本文中所指示，本文中提供各种接触时间，其可用于此方面中以促进膜缔合和淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的最终膜融合。在说明性实施例中，接触进行小于15分钟。在说明性实施例中，包含淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的血细胞是来自个体且因此所述引入是再引入。在此方面中，在一些实施例中，T细胞和/或NK细胞的群体是在接触步骤中接触，被基因修饰和/或转导以及在引入步骤中被引入个体中。

在另一方面中，本文中提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的用途，其用于制造用以基因修饰个体的淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的药剂，其中所述药剂的用途包含：

A)以离体方式使个体的包含T细胞和/或NK细胞的血细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在反应混合物中接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域和胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，且任选地所述一个或多个核酸序列中的另一个编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个RNA目标的抑制性RNA分子，且此外任选地所述一个或多个核酸序列中的另一个编码多肽淋巴增生性元件，其中所述接触促进由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进行的至少一些淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的基因修饰，由此产生被基因修饰的T细胞和/或NK细胞；和任选地

B)将被基因修饰的T细胞和/或NK细胞引入个体中，由此基因修饰个体的淋巴细胞，例如T细胞和/或NK细胞。

在以上段落中的此类方面中，如本文中所指示，本文中提供各种接触时间，其可用于此方面中以促进膜缔合和淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的最终膜融合。在说明性实施例中，接触进行小于15分钟。在这类方法的一些实施例中，血细胞、淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)是来自个体，通常在这类实施例中，来自从个体收集的血液。在此段落提供的方法方面的一些实施例中，将被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)或其群体引入或再引入个体中。

在本文中的任何用途方面、本文中的被基因修饰的淋巴细胞(例如T细胞或NK细胞)方面或根据本文中的任何实施例的用于基因修饰和/或转导淋巴细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法方面，包括(但不限于)此例示性实施例部分中的任何实施例(包括以上实施例)中，除非不相容或已陈述，否则反应混合物包含至少10％、20％、25％、50％、75％、80％、90％、95％或99％全血和任选的有效量的抗凝血剂，或反应混合物进一步包含至少一种除PBMC以外的其它血液或血液制剂组分，且在其它说明性实施例中，这类血液或血液制剂组分是本文中所提供的值得注意的非PBMC型血液或血液制剂组分中的一种或多种。

在另一方面中，本文中提供反应混合物，其包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、T细胞活化元件和血细胞，其中重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中血细胞包含T细胞和/或NK细胞，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个核酸序列，通常是以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的转录单元，其中一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽、包含淋巴增生性元件(LE)的第一多肽和/或一个或多个抑制性RNA分子，且其中反应混合物包含至少10％、20％、25％、50％、75％、80％、90％、95％或99％全血。一个或多个抑制性RNA分子可针对本文中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中所提供的任何目标。

在一个方面中，本文中提供反应混合物，其包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒和血细胞，其中重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中血细胞包含T细胞和/或NK细胞，且其中反应混合物包含至少10％、20％、25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％全血和任选的有效量的抗凝血剂，或其中反应混合物进一步包含至少一种除PBMC以外的其它血液或血液制剂组分，且在说明性实施例中，这类血液或血液制剂组分是本文中所提供的值得注意的非PBMC型血液或血液制剂组分中的一种或多种。

在另一方面中，本文中提供反应混合物，其包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、T细胞活化元件和血细胞，其中重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中血细胞包含T细胞和/或NK细胞，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个核酸序列，通常是以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的转录单元，其中一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽、包含淋巴增生性元件(LE)的第一多肽和/或一个或多个抑制性RNA分子，且其中反应混合物包含至少10％、20％、25％、50％、75％、80％、90％、95％或99％全血和任选的有效量的抗凝血剂，或其中反应混合物进一步包含至少一种除PBMC以外的其它血液或血液制剂组分，且在说明性实施例中，这类血液或血液制剂组分是本文中所提供的值得注意的非PBMC型血液或血液制剂组分中的一种或多种。一个或多个抑制性RNA分子可针对本文中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中所提供的任何目标。

在另一方面中，本文中提供用于基因修饰血液或其组分中的T细胞和/或NK细胞的方法，其包含以离体方式使包含T细胞和/或NK细胞的血细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在反应混合物中接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中所述接触促进T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的缔合，其中重组反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导T细胞和/或NK细胞，且其中反应混合物包含至少10％10％、20％、25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％全血和任选的有效量的抗凝血剂，或其中反应混合物进一步包含至少一种除PBMC以外的其它血液或血液制剂组分，且在说明性实施例中，这类血液或血液制剂组分是本文中所提供的值得注意的非PBMC型血液或血液制剂组分中的一种或多种。

在另一方面中，本文中提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的用途，其用于制造用以基因修饰个体的T细胞和/或NK细胞的试剂盒，其中所述试剂盒的用途包含：以离体方式使包含T细胞和/或NK细胞的血细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在反应混合物中接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中所述接触促进T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的缔合，其中重组反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导T细胞和/或NK细胞，且其中血细胞包含T细胞、NK细胞，且其中反应混合物包含至少10％、20％、25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％全血和任选的有效量的抗凝血剂，或其中反应混合物进一步包含至少一种除PBMC以外的其它血液或血液制剂组分，且在说明性实施例中，这类血液或血液制剂组分是本文中所提供的值得注意的非PBMC型血液或血液制剂组分中的一种或多种。

在另一方面中，本文中提供根据一种方法通过基因修饰T细胞和/或NK细胞而制备的被基因修饰的T细胞或NK细胞，所述方法包含以离体方式使包含T细胞和/或NK细胞的血细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在反应混合物中接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中所述接触促进T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的缔合，其中重组反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导T细胞和/或NK细胞，且其中反应混合物包含至少10％、20％、25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％全血和任选的有效量的抗凝血剂，或其中反应混合物进一步包含至少一种除PBMC以外的其它血液或血液制剂组分，且在说明性实施例中，这类血液或血液制剂组分是本文中所提供的值得注意的非PBMC型血液或血液制剂组分中的一种或多种。

所述一种或多种值得注意的非PBMC型血液或血液制剂组分存在于本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些说明性实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，因为在这些某些说明性实施例中，反应混合物包含至少10％全血。在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则反应混合物包含作为范围的低端的10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％和75％至作为范围的高端的80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％的全血，或至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％全血。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则反应混合物中的血细胞包含至少10％嗜中性粒细胞和至少0.5％嗜酸性粒细胞，以反应混合物中的白细胞的百分比计。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则以反应混合物中的白细胞的百分比计，反应混合物包含至少20％、25％、30％或40％嗜中性粒细胞，或以反应混合物中的白细胞的百分比计，20％至80％、25％至75％或40％至60％嗜中性粒细胞。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则以反应混合物中的白细胞的百分比计，反应混合物包含至少0.1％嗜酸性粒细胞，或0.25％至8％，或0.5％至4％嗜酸性粒细胞。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则反应混合物中的血细胞在接触之前不经历PBMC富集程序。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则通过向全血中添加重组反转录病毒颗粒来形成反应混合物。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则通过向包含有效量的抗凝血剂的基本上全血中添加重组反转录病毒颗粒来形成反应混合物。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则反应混合物是在封闭式细胞处理系统中。在这类反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，反应混合物中的血细胞是PBMC且反应混合物在封闭式细胞处理系统中与白细胞耗减过滤器总成接触，且在任选的其它实施例中，白细胞耗减过滤器总成包含HemaTrate过滤器。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则反应混合物包含抗凝血剂。举例来说，在某些实施例中，抗凝血剂是选自由以下组成的组：柠檬酸右旋糖、EDTA或肝素。在某些实施例中，抗凝血剂不是柠檬酸右旋糖。在某些实施例中，抗凝血剂包含有效量的肝素。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则在接触期间，反应混合物是在血液袋中。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则在接触之前，反应混合物在封闭式细胞处理系统中与T淋巴细胞和/或NK细胞富集过滤器接触，且其中反应混合物包含粒细胞，其中粒细胞占反应混合物中的白细胞的至少10％，或其中反应混合物包含至少10％的粒细胞和相同数量的T细胞，其中被基因修饰的淋巴细胞(例如T细胞或NK细胞)在接触之后经历PBMC富集过程。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则反应混合物中的血细胞是PBMC且其中反应混合物在包含任选的在反应混合物中的培育的接触之后，在封闭式细胞处理系统中与白细胞耗减过滤器总成接触。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则全血不是脐带血。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法的某些实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则在接触之前、在重组反转录病毒颗粒与血细胞接触时、在包含任选的在反应混合物中培育的接触期间和/或在包含任选的在反应混合物中培育的接触之后，反应混合物在封闭式细胞处理系统中与白细胞耗减过滤器总成接触，其中T细胞和/或NK细胞或被基因修饰的T细胞和/或NK细胞进一步经历PBMC富集程序。

在一个方面中，本文中提供一种在基因组中包含聚核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，所述聚核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个核酸序列，其中：

a.一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA目标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，及

b.所述一个或多个核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。一个或多个抑制性RNA分子可针对本文中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中所提供的任何目标。

在本文中的另一方面中提供一种包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组的哺乳动物包装细胞系，其中所述可包装RNA基因组包含：

a.5'长末端重复或其活化片段；

b.核酸序列，其编码反转录病毒顺式作用RNA包装元件；

c.聚核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中一种或多种核酸中的第一核酸序列编码针对一种或多种RNA目标的一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域；及

d.3'长末端重复序列或其活性片段。一个或多个抑制性RNA分子可针对本文中包括(但不限于)此例示性实施例部分中所提供的任何目标。在另一方面中，本文中提供反转录病毒载体，其包含用于复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装的RNA基因组，其中所述可包装的RNA基因组包含：

a.5'长末端重复或其活化片段；

b.核酸序列，其编码反转录病毒顺式作用RNA包装元件；

c.聚核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中一种或多种核酸中的第一核酸序列编码针对一种或多种RNA目标的一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域；及

3'长末端重复或其活化片段。一个或多个抑制性RNA分子可针对本文中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中所提供的任何目标。

在反转录病毒载体方面或哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中，(c)的聚核苷酸可以相对于编码反转录病毒顺式作用RNA包装元件的核酸序列(b)、5'长末端重复序列(a)和/或3'长末端重复序列(d)反向定向。

在反转录病毒载体方面或哺乳动物包装细胞系方面一些实施例中，可包装的RNA基因组的表达是通过在哺乳动物包装细胞系中具有活性的可诱导启动子驱动。

在反转录病毒载体方面或哺乳动物包装细胞系方面一些实施例中，反转录病毒顺式作用RNA包装元件可包含中央聚嘌呤段(cPPT)/中央终止序列、HIV Psi或其组合。反转录病毒载体可任选地包括抗生素抗性基因和/或可检测标记。

在另一方面中，本文中提供一种被基因修饰的T细胞和/或NK细胞，其包含：

a.针对一个或多个RNA目标一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子；及

b.嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，其中所述一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子及CAR是由T细胞和/或NK细胞的基因修饰的核酸序列编码。一个或多个抑制性RNA分子可针对本文中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中所提供的任何目标。

在被基因修饰的T细胞和/或NK细胞方面一些实施例中，被基因修饰的T细胞和/或NK细胞还包含至少一个淋巴增生性元件，其不是抑制性RNA分子，通常是多肽淋巴增生性元件，其中所述淋巴增生性元件是由作为T细胞和/或NK细胞的基因修饰的核酸编码。在一些实施例中，抑制性RNA分子、CAR和/或至少一个淋巴增生性元件在多顺反子物质中表达。在说明性实施例中，抑制性RNA分子由单个多顺反子转录物表达。

在另一方面中，本文中提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个RNA目标的RNA分子且所述一个或多个核酸序列的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域和胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述方法包含以离体方式使个体的T细胞和/或NK细胞接触，且所述接触促进由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进行的至少一些静息T细胞和/或NK细胞的转导，由此产生被基因修饰的T细胞和/或NK细胞。一个或多个抑制性RNA分子可针对本文中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中所提供的任何目标。

在另一方面中，本文中提供市售容器，其含有复制缺陷型重组反转录病毒颗粒和任选的用于使用其以治疗个体中的肿瘤生长的说明书，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个RNA目标的RNA分子且所述一个或多个核酸序列的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域和胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)。一个或多个抑制性RNA分子可针对本文中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中所提供的任何目标。

在以上提供的任何包括聚核苷酸的方面中，其中所述聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个RNA目标的RNA分子且所述一个或多个核酸序列的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域和胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，所述聚核苷酸可以进一步包括编码至少一个不是抑制性RNA分子的淋巴增生性元件的第三核酸序列，且在说明性实施例中，是多肽，例如本文中所公开的任何多肽淋巴增生性元件。

在以上提供的任何包括聚核苷酸的方面中，其中所述聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个RNA目标的RNA分子，所述抑制性RNA分子可具有本文在抑制性RNA分子部分中所提供的任何结构和/或是其中的任何实施例。举例来说，在一些实施例中，抑制性RNA可以包括5'链和3'链，其彼此部分或完全互补，其中所述5'链和所述3'链能够形成18-25个核苷酸的RNA双螺旋。此外，抑制性RNA分子可以是miRNA或shRNA且在某些实施例中，至少一个或全部抑制性RNA分子包含来源于天然存在的miRNA的5'臂、3'臂或其两者。举例来说，这类天然存在的miRNA可选自由以下组成的组miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122和miR-21，且在说明性实施例中，miR-155。

在以上提供的任何包括聚核苷酸的方面中，其中所述聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码两个或更多个针对一个或多个RNA目标的RNA分子，在一些实施例中，第一核酸序列编码两个至四个抑制性RNA分子。在说明性实施例中，第一核酸序列中包括2个与10个之间、2个与8个之间、2个与6个之间、2个与5个之间、2个与4个之间、3个与5个之间或3个与6个之间的抑制性RNA分子。在说明性实施例中，第一核酸序列中包括四个抑制性RNA分子。

在以上提供的任何包括聚核苷酸的方面中，其中所述聚核苷酸包含一个或多个以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个RNA目标的RNA分子，所述一个或多个(例如两个或更多个)抑制性RNA分子可在内含子中。在一些实施例中，内含子在启动子中。在说明性实施例中，内含子是EF-1α内含子A。在一些实施例中，内含子与启动子相邻且在启动子的下游，所述启动子在说明性实施例中在用于产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的包装细胞中无活性。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法方面和实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的方面和实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、大部分、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的T细胞是静息T细胞，或所述量的NK细胞是静息NK细胞(当其与复制缺陷型反转录病毒颗粒组合以形成反应混合物时)。

在本文中所提供的任何用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法方面和实施例中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的方面和实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则一个或多个细胞不经历离心接种程序，例如不经历持续至少30分钟的在至少800g下进行的离心接种。

在本文中所提供的任何用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法方面和实施例的一些实施例中，中，包括(但不限于)此例示性实施例部分中提供的实施例，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则所述方法进一步包含向个体给予被基因修饰的T细胞和/或NK细胞，任选地其中所述个体是血细胞的来源。在这些的一些子实施例和本文中的任何方法和用途的实施例中，包括此例示性实施例部分中提供的实施例，限制条件是其不会不相容或已陈述，被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)或其群体在被引入或再引入个体中之前经历4次或更少的离体细胞分裂。在一些实施例中，从个体收集血液的时间与将被基因修饰的T细胞和/或NK细胞再引入个体中的时间之间相距不超过8小时、6小时、4小时、2小时或1小时。在一些实施例中，在收集血液之后及再引入血液之前的所有步骤都是在封闭系统中进行，任选地其中在整个处理期间人工监测封闭系统。

在本文中所提供的任何复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法方面和实施例中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，除非不相容或以其它方式陈述，否则复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上包含膜结合T细胞活化元件。在这些的一些子实施例和本文中所提供的任何方面的实施例中，包括在此例示性实施例部分中的实施例中，限制条件是其不会不相容或已陈述，T细胞活化元件可以是抗CD3抗体或抗CD28抗体中的一种或多种。在这些的一些实施例和本文中所提供的任何方面的实施例中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，除非不相容或以其它方式陈述，否则T细胞活化元件一种或多种多肽，在说明性实施例中，能够结合CD28、OX40、4-1BB、ICOS、CD9、CD53、CD63、CD81和/或CD82的膜结合多肽。在一些实施例中，能够与CD3结合的膜结合多肽与异源性GPI锚定连接序列融合，和/或能够与CD28结合的膜结合多肽与异源性GPI锚定连接序列融合。在说明性实施例中，能够与CD28结合的膜结合多肽为CD80，或与CD16B GPI锚定连接序列结合的其胞外细胞域。在一些实施例中，T细胞活化元件进一步包括一种或多种能够结合CD3的多肽。在这些的一些子实施例和本文中所提供的任何方面的实施例中，包括在此例示性实施例部分中的实施例中，限制条件是其不会不相容或已陈述，T细胞活化元件是膜结合抗CD3抗体，其中抗CD3抗体结合于重组反转录病毒颗粒的膜。在一些实施例中，膜结合抗CD3抗体是抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。在一些实施例中，膜结合抗CD3抗体通过异源GPI锚结合于膜。在一些实施例中，抗CD3抗体是具有病毒包膜蛋白质的重组融合蛋白质。在一些实施例中，抗CD3抗体是具有来自MuLV的病毒包膜蛋白质的重组融合蛋白质。在一些实施例中，抗CD3是具有在弗林蛋白酶裂解位点处突变的MulV的病毒包膜蛋白质的重组融合蛋白质。

在本文中所提供的任何用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法方面和实施例中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，除非不相容或以其它方式陈述，否则在基因修饰和/或转导之前、期间或在基因修饰和/或转导之前和期间，不存在ABC转运蛋白抑制剂和/或底物，在其它子实施例中，外源性ABC转运蛋白抑制剂和/或底物。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法方面和实施例中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，除非不相容或以其它方式陈述，否则重组反转录病毒颗粒是以MOI为0.1至50、0.5至50、0.5至20、0.5至10、1至25、1至15、1至10、1至5、2至15、2至10、2至7、2至3、3至10、3至15或5至15或至少0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、10或15存在于反应混合物中或以MOI为至少0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、10或15存在于反应混合物中。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法方面和实施例中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，除非不相容或以其它方式陈述，否则至少5％、至少10％、至少15％或至少20％或作为范围的低端的5％、10％、15％、20％或25％至作为范围的高端的20％、25％、50％、60％、70％、80％或85％的T细胞和/或NK细胞被基因修饰。

在本文中所提供的任何聚核苷酸、复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法方面和实施例中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，除非不相容或以其它方式陈述，否则一个或多个转录单元可编码包含淋巴增生性元件(LE)的多肽。本文中所公开的任何多肽淋巴增生性元件，例如(但不限于)在本文中的“淋巴增生性元件”部分中公开的淋巴增生性元件或其功能性突变体和/或片段都可被编码。在一些实施例中，LE包含来自以下的胞内域CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD4、CD8A、CD8B、CD27、突变型δLck CD28、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CRLF2、CSF2RB、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2C、FCGRA2、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL31RA、LEPR、LIFR、LMP1、MPL、MYD88、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18，或其功能性突变体和/或片段。

在本文中所提供的任何复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法方面和实施例中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，除非不相容或以其它方式陈述，否则复制缺陷型重组反转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。在其它说明性实施例中，被基因修饰的细胞是被基因修饰的T细胞或被基因修饰的NKT细胞。

在本文中所提供的任何聚核苷酸、复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞的方法方面和实施例中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，除非不相容或以其它方式陈述，否则一个或多个转录单元可编码包含CAR的多肽。在一些实施例中，CAR为受微环境限制的生物(MRB)-CAR。在其它实施例中，CAR的ASTR与肿瘤相关的抗原结合。在其它实施例中，CAR的ASTR为微环境受限的生物(MRB)-ASTR。

在某些实施例中，本文中所提供的任何包括聚核苷酸的方面和实施例，在一些情况下，在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组或被基因修饰的T细胞和/或NK细胞中，其包含以可操作的方式连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的核酸序列，所述核酸序列编码至少一个多肽淋巴增生性元件。在说明性实施例中，多肽淋巴增生性元件是本文中所公开的任何多肽淋巴增生性元件。在一些实施例中，本文中所提供的任何和所有核酸序列可以可操作地连接至核糖开关。在一些实施例中，核糖开关能够结合核苷类似物。在一些实施例中，核苷类似物为抗病毒药物。

在本文中所提供的任何包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方面和实施例，包括(但不限于)此例示性实施例部分中的方面和实施例中，除非不相容或已在方面或实施例中陈述，否则在说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，所述假型化元件能够结合于T细胞和/或NK细胞且促进复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合。在一些实施例中，假型化元件为病毒包膜蛋白。在一些实施例中，病毒包膜蛋白是以下中的一个或多个：猫内源性病毒(RD114)包膜蛋白、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白、肿瘤反转录病毒单嗜性包膜蛋白、水泡性口炎病毒包膜蛋白(VSV-G)、狒狒反转录病毒包膜糖蛋白(BaEV)、鼠类白血病包膜蛋白(MuLV)和/或副粘病毒麻疹包膜蛋白H和F，或其任何保留结合于静息T细胞和/或静息NK细胞的能力的片段。在说明性实施例中，假型化元件为VSV-G。如本文中其它地方所论述，假型化元件可以包括与T细胞活化元件的融合物，其在说明性实施例中可以是与任何包膜蛋白假型化元件(例如MuLV或VSV-G)和抗CD3抗体的融合物。在其它说明性实施例中，假型化元件包括VSV-G和抗CD3scFv与MuLV的融合物。

在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方面中的任一个中，在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上包含核酸，所述核酸编码由经生物验证的单克隆抗体识别的域。

在本文中所提供的任何反应混合物、用途、被基因修饰的T细胞或NK细胞或用于基因修饰T细胞和/或NK细胞方面和实施例的某些说明性实施例中，包括(但不限于)在此例示性实施例部分中，除非不相容或以其它方式陈述，否则反应混合物中的血细胞是由PBMC富集程序产生的血细胞且包含PBMC，或在说明性实施例中，血细胞是PBMC。在说明性实施例中，这类包括PMBC富集的实施例不与其中反应混合物包括至少10％全血的实施例组合。因此，在本文中的某些说明性实施例中，反应混合物中的血细胞是来自PBMC富集程序的PBMC细胞洗脱份，向其中添加反转录病毒颗粒以形成反应混合物，且在其它说明性实施例中，反应混合物中的血细胞是来自全血，向所述全血中添加反转录病毒颗粒以形成反应混合物。

以下非限制性实例仅借助于说明例示性实施例而提供，且绝不限制本公开的范围及精神。此外，应理解，本文所公开或主张的任何发明涵盖本文所描述的任何一个或多个特征的所有变体、组合及排列。任何一个或多个特征可明确地自权利要求排除，即使未在本文中明确地阐述特定排除。还应理解，除非所属领域的一般技术人员将理解，否则根据本文公开的特定方法或所属领域中已知的其它方法，用于方法中的试剂的公开内容意图与(及为其提供支持)涉及试剂的用途的方法同义。另外，除非所属领域的一般技术人员将理解，否则说明书和/或权利要求公开一种方法，本文所公开的试剂中的任一或多个可用于所述方法。

实例

实例1.用于转导实验的材料和方法

本实例提供用于本文中的后续实例中所公开的实验中的材料和方法。

通过短暂转染产生重组慢病毒颗粒。

除非另有说明，否则293T细胞(Lenti-X

应注意，典型的4载体包装系统包括3个包装质体，其编码(i)gag/pol，(ii)rev，和(iii)假型化元件，如VSV-G。此包装系统的第4载体是基因组质体，编码1种或更多种相关基因的第三代慢病毒表达载体(在3'LTR中含有引起自失活的缺失)。对于使用4种质体的转染，所使用的总DNA(1μg/mL的培养体积)是4种质体按以下摩尔比的混合物：1x含有gag/pol的质体、1x含有Rev的质体、1x含有病毒包膜的质体(VSV-G，除非另有说明)和2x基因组质体，除非另有说明。应注意，使用典型5载体包装系统，其中将编码例如T细胞活化元件(如抗CD3-scFvFc-GPI)的第5载体添加至其它4载体包装系统中。对于使用5种质体的转染，所使用的总DNA(1μg/mL的培养体积)是5种质体按以下摩尔比的混合物：1x含有gag/pol的质体、1x含有Rev的质体、1x含有VSV-G的质体、2x基因组质体和1x第5载体，除非另有说明。

对于每30mL含有包装细胞的培养物，将质体DNA溶解于1.5mlGibco

在72小时后，采集上清液且通过以1,200g离心10分钟来澄清。将经澄清上清液倒入新试管中。通过离心、聚乙二醇(PEG)沉淀或深度过滤从澄清上清液纯化病毒。对于通过离心进行的纯化，通过在4℃下，在3,300g离心过夜使慢病毒颗粒沉淀。丢弃上清液且将慢病毒颗粒丸以1:100的初始体积再悬浮于包装细胞培养物中。对于通过PEG沉淀进行的纯化，向澄清上清液中添加1/4体积PEG且在4℃下培育过夜。接着，混合物在1600g下离心1小时(对于50ml锥形管)或在1800g下离心1.5小时(对于500ml锥形管)。丢弃上清液且将慢病毒颗粒丸以1:100的初始体积再悬浮于包装细胞培养物中。对于通过深度过滤进行的纯化，通过切向流动过滤(TFF)来浓缩澄清上清液且进行核酸酶消化。接着，纯化病毒且通过透滤至最终配制物(具有2％乳糖的PBS)中来更换缓冲液。

通过连续稀释来滴定慢病毒颗粒且通过转导至293T和/或Jurkat细胞中来分析转基因表达，且使用Lenti-X

实例中使用的基因组质体。

以下慢病毒基因组载体编码如所指示的相关基因和特征：

F1-3-23编码包含抗CD19scFv、CD8柄和跨膜区以及来自CD3z的胞内域和随后的T2A和eTag的CD19 CAR(aCD19:CD8:CD3z-T2A-eTag)。

其它慢病毒基因组载体描述于特定实例中。

实例2.暴露于反转录病毒颗粒假型化VSV-G或流感HA和NA4小时且任选地用来源于VSV-G、MV或MuLV的包膜和此外任选的其表面上的抗CD3 scFv共假型化的未受刺激的PBMC的转导效率。

在此实例中，使由各种不同的包膜蛋白假型化或共假型化且任选地显示T细胞活化元件的慢病毒颗粒暴露于未受刺激的人类PBMC 4小时且评估转导效率。

在F1XT细胞中产生重组慢病毒颗粒。使用具有基因组质体及编码gag/pol、rev的单独的包装质体及包膜质体的PEI短暂转染细胞。对于某些样品，转染反应混合物还包括编码UCHT1scFvFc-GPI的质体、共假型化包膜或与抗CD3scFv融合的共假型化包膜。在此实例中，用于样品的基因组质体是如本文中的其它实例中所公开的F1-0-03。在此实例中，用于样品的假型化和共假型化质体编码来自VSV-G(SEQ ID NO:336)、U-VSV-G(SEQ ID NO:455)的包膜蛋白，其中来自UCHT1的抗CD3 scFv与VSV-G包膜的氨基端、来自H1N1 PR8 1934(SEQID NO:311)的流感HA和来自H10N7-HKWF446C-07(SEQ ID NO:312)、U-MuLV(SEQ ID NO:341)的NA融合，其中来自UCHT1的抗CD3 scFv与MuLV包膜的氨基端、其中自细胞质尾区缺失8至31个C端氨基酸的U-MuLV变体、其中U-MuLV中的弗林蛋白酶介导的裂解位点Lys-Tyr-Lys-Arg由Ile-Glu-Gly-Arg肽置换的U-MuLVSUx(SEQ ID NO:454)或其中去除麻疹病毒H蛋白质的C端24个氨基酸的MVHΔ24(SEQ ID NO:315)融合。

在某些样品中，以格式U-MuLV-IRES2-rev(MuLVIR)或格式U-MuLV-T2A-rev(MuLV2R)，以串联形式在包装质体上编码U-MuLV包膜蛋白。通过在包装载体(如rev)上安置共假型化元件，使用4种而非5种单独质体转染包装细胞。在本文中观察到，用4种而非5种质体进行转染抗引起更高的病毒效价。

在第0天，在不具有用于去除单核细胞的任何额外步骤的情况下，如实例1中所描述由来自2名供体的白细胞层来制备PBMC。在分离之后，将含1×10

图3A展示在转导之后第6天每个孔中的活细胞的总数。与暴露于由单独的VSV-G假型化的病毒颗粒的样品相比，暴露于由VSV-G假型化的病毒颗粒且还显示UCHT1的样品在每孔中具有更多的细胞数目。当将UCHT1scFv显示为GPI连接的scFvFc时以及将scFv与VSV-G或MuLV病毒包膜融合时，都可以观察到这一点。不受理论约束，相信由抗CD3 scFv刺激CD3+T和NK细胞可以引起增殖和存活，这可以至少部分地解释此细胞数量的增加。

图3B展示被转导的CD3+细胞的百分比，如通过eTAG表达所测量。与暴露于由单独的VSV-G假型化的病毒颗粒的不呈现抗CD3抗体的样品相比，暴露于由还显示UCHT1ScFvFc-GPI的VSV-G假型化或由U-MuLV、U-MuLVSUx、U-VSV-G或

实例3.通过使全血暴露于重组反转录病毒颗粒4小时，接着进行PBMC富集程序来进行静息淋巴细胞的有效基因修饰。

在此实例中，通过反应混合物的4小时培育来有效地基因修饰未受刺激的人类T细胞和NKT细胞，所述反应混合物包括全血和由VSV-G假型化的反转录病毒颗粒且在其表面上显示T细胞活化元件。接着，使用传统的基于密度梯度离心的PBMC富集程序从转导反应混合物分离PBMC。使用流式细胞测量术通过eTag转基因的表达来评估CD3+细胞的转导。

使用深度过滤来纯化在此实例中使用以下慢病毒颗粒：由VSV-G假型化的F1-3-23(F1-3-23G)；和由VSV-G假型化且显示T细胞活化元件UCHT1-scFvFc-GPI的F1-3-23(F1-3-23GU)。

购买在含有抗凝血剂的真空采血系统管中的10ml新鲜全血样品(StemExpress,San Diego)。各个样品中的抗凝血剂是1.8mg/ml的EDTA或16USP单元/毫升血液的Na-肝素。在MOI为5的情况下(假设1×10

图4A和4B展示在全血的转导之后第6天时的每毫升的绝对活细胞计数(图4A)和CD3+eTag+细胞(即，被转导的T细胞)的百分比(图4B)的直方图。与我们的先前结果和被分离的PBMC的其它研究性转导的结果一致，在此实例中，我们发现由单独的VSV-G假型化的重组反转录病毒颗粒在转导全血中的PBMC方面的效率极低。然而，我们先前发现由VSV-G假型化且显示T细胞活化元件的重组反转录病毒颗粒能够有效地转导被分离的PBMC。意外的是，这些直方图展示反转录病毒颗粒无需PBMC富集步骤即可有效转导全血中存在的PBMC所需的。实际上，由VSV-G假型化且显示抗CD3-scFvFc的反转录病毒颗粒在直接添加至含有抗凝血剂的全血中时可有效地基因修饰和转导其中的PBMC。基因修饰可以通过在洗涤细胞以去除重组反转录病毒颗粒之前的仅耗费4小时的接触和培育来实现。在细胞被基因修饰之后，其可以使用PBMC富集程序来有效分离。如本实例中所示，抗凝血剂可以是EDTA或Na-肝素。在其它实验中使用ACD作为抗凝血剂获得类似结果。

实例4.在4小时至小于1分钟的暴露时间下的未受刺激的PBMC的反转录病毒转导的时间过程。

在此实验中，重组慢病毒颗粒与未受刺激的PBMC一起培育4小时至小于1分钟，且检查其在不存在任何外源性细胞因子的情况下转导PBMC且促进其活体外存活和/或增殖的能力。

在Freestyle

在第0天，根据制造商的说明书用Ficoll-Paque

在此实例中，发现少于1分钟的培育时段与4小时的培育时段一样有效地促进重组慢病毒颗粒对未刺激的PBMC的转导。图5展示在通过不同重组慢病毒颗粒转导来自1个供体的未受刺激的PBMC所指示时段后第6天的CD3+FLAG+绝对细胞计数(每微升)。重组慢病毒颗粒中的每一个转导PBMC的能力在所有培育时段内类似。此对表达抗CD3scFvFc-GPI的慢病毒颗粒来说尤其明显，且相较于其非抗CD3scFvFc-GPI表达对应物具有更高转导效率。对于所检查的所有培育时间，经转导PBMC的总数目在通过[F1-3-451GU]转导的样品中比在由指示在F1-3-451中编码的DL3A CLE促进这些细胞的存活和/或增殖的[F1-3-253GU]转导的样品更大。对如图5中所展示通过达匹韦林(反转录酶)及都鲁拉韦(整合酶抑制剂)的转导的抑制证实，对这些PBMC的基因修饰及转基因表达不为假转导，而为其中病毒转基因RNA被反转录、整合至PBMC的基因组中且表达的转导的结果。使用PBMC自第二供体观察到类似结果。

实例5.miRNA表达增加被转导的表达CAR的细胞的体内存活和/或增殖

在此实例中，由各个miRNA前体的池串联组装4个miRNA前体的候选(假设)区块的两个库(库314和库315)。将miRNA区块插入编码驱动CAR的表达的EF-1α启动子的慢病毒构筑体的EF-1α内含子中。用编码这些库的慢病毒颗粒转导人类PBMC且注射至携带肿瘤的小鼠中。在20天之后，收集肿瘤且通过PCR接着进行桑格测序(Sanger Sequencing)来确定来自肿瘤的PBMC中的miRNA区块的一致性。因此，筛选识别能够促进肿瘤中的被转导PBMC的增殖和/或存活的miRNA区块。

方法

库制备

108个

将miRNA构筑体的库经单独克隆至F1-1-315及F1-2-314的EF-1α内含子A中，以分别产生库315及库314。除EF-1α启动子以外，F1-1-315还包括CD8a信号肽、抗ROR2:CD28:CD3z CAR、T2A及eTag。类似地，除EF-1α启动子以外，F1-2-314包括CD8a信号肽、抗Axl:CD8:CD3z CAR、T2A及eTag。WO 2019/055946的图26A和26B包括驱动GFP而非CAR的表达的具有EF-1α启动子(包括具有4个miRNA前体的内含子A)的类似慢病毒载体。

在此实例中，27个基因目标和对应于每个位置中的miRNA的DNA序列的序列识别编号展示于以下表2中。

表2.对应于每个目标的每个位置处的miRNA的DNA序列的SEQ ID NO。

慢病毒颗粒产生

库315及库314单独用于在293T细胞的30ml悬浮培养物中产生慢病毒颗粒。采集慢病毒颗粒且通过PEG沉淀来浓缩。其它关于慢病毒颗粒制备的细节提供于WO 2019/055946的实例17中。

转导

在第0天，使PBMC自ACD周边血液分离，且用补充有100IU/ml的IL-2(Novoprotein,GMP-CD66)、10ng/ml的IL-7(Novoprotein,GMP-CD47)及50ng/ml的抗CD3抗体(Novoprotein,GMP-A018)的Complete OpTmizer

肿瘤接种和被转导的细胞的给予

使用NOD Scid Gamma(NSG)小鼠的异种移植模型经选择以探测用库315或库314的慢病毒颗粒转导的人类PBMC体内存活和/或增殖的能力，其中肿瘤表达或未表达由在这些慢病毒颗粒的基因组中编码的CAR识别的抗原。根据机构动物护理及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)所批准方案来处理小鼠。将皮下(sc)肿瘤异种移植建立于12周大的雌性NOD-Prkdc

在肿瘤接种后5天，在离体培养12天之后，通过尾静脉注射使携带CHO肿瘤的1只小鼠及携带CHO-ROR2肿瘤的1只小鼠静脉(IV)给予含有用来自库315的慢病毒颗粒转导的1×10

肿瘤采集及DNA测序

在给予经转导PBMC后第20天，切除肿瘤。自一半各肿瘤提取DNA，且来自各肿瘤的4ug在PCR反应中用作模板持续25个周期，以扩增EF-1α内含子。将扩增子克隆至测序载体中，转化为细菌且划线至盘上。选择18个总菌落(每只小鼠约5个)，且制备DNA且使用桑格测序进行分析以测定存在于肿瘤中的miRNA构筑体的样品的序列。

结果

使用小鼠异种移植模型确定靶向特定基因转录物的miRNA是否能够提高体内表达CAR的被转导的PBMC的增殖和/或存活，其中异种移植是具有或不具有CAR的目标抗原的表达的肿瘤。对于此分析，产生由针对27种不同目标的miRNA组成的miRNA构筑体的库。所分析的miRNA构筑体含有4个单独的miRNA的4个位置，如图26B以及WO 2019/055946的实例17及实例18中所示。通过对EF-1α内含子测序来分析肿瘤DNA，以识别出在注射经转导PBMC后20天存在哪些miRNA构筑体，且因此哪些miRNA构筑体增加了增殖和/或存活。

4个连续miRNA的531,441个不同组合是有可能的。在所测序的18个EF-1alpha内含子中，13个包含miRNA构筑体，其中构筑体中的所有4个miRNA都针对一个目标，且2个含有针对超过1个目标的miRNA构筑体。以下表3展示在此实例中从所检验的4种肿瘤中的每一种回收的miRNA物质。

表3.所测序的miRNA构筑体的每个位置处的miRNA目标的一致性。

值得注意的是，6个EF-1α内含子含有具有全部4个针对TNFRSF6(FAS)的miRNA的miRNA构筑体。2个EF-1α内含子含有具有全部4个针对cCBL的miRNA的miRNA构筑体.对于AHR、CD3z、Cbx和HK2中的每一个，识别1个含有miRNA构筑体的EF-1α内含子，所述miRNA构筑体具有全部4个针对所述基因转录物的miRNA。“NA”指示在所述位置中未识别miRNA嵌段。总之，这些结果表明，基因敲减可编码FAS、cCBL、CD3z、Cbx、HK2、FASL、SMAD4、EOMES和AHR的转录物可以促进肿瘤微环境中T细胞的存活和/或增殖。在所检查的18个样品中的6个中，在每种条件下与FAS串联的4个miRNA的识别表明，基因敲减FAS转录物具有存活和/或增殖的特殊优势。此外，此数据表明存在剂量效应，使得针对FAS、cCBL、AHR、CD3z、Cbx和HK2的miRNA的4种物质产生比1、2或3种物质更大的编码这些基因的转录物的基因敲减，且此增加的基因敲减赋予了存活和/或增殖优势。

实例6.使用体内分析法的候选嵌合多肽淋巴增生性元件的识别。

在此实施例中，候选(假设)嵌合淋巴增生性元件(CLE)的两个嵌合多肽库(库6及库8)被组装至来自胞外-跨膜阻断序列池、胞内阻断序列库及根据图6中所提供的编码嵌合多肽的构筑体的条形码库的病毒载体中。针对候选嵌合多肽促进体内T细胞扩增的能力来筛选嵌合库候选物(假设CLE)。

库构筑体

在本研究中制备和分析两个库；库6和库8。库共有共同结构，其在图6中展示。图6提供非限制性、例示性转基因表达盒的示意图，所述表达盒在慢病毒载体主链中含有编码CAR的聚核苷酸序列和来自库的候选CLE，其具有由EF-1α启动子和Kozak类序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:450))驱动的4个模块。每个候选淋巴增生性元件包括4个模块：胞外模块(P1)、跨膜模块(P2)和2个胞内模块(P3和P4)。P1模块编码c-Jun域的5'端处的eTAG。三重终止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO:451))从DNA条形码(P5)分离P4。在最后一个终止密码子(在P5的最后一个核苷酸之后开始4bp)与3'LTR(其在WPRE的最后一个核苷酸之后开始83个核苷酸)之间存在WPRE(GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:452))。

CAR及P1由编码T2A核糖体跨越序列的聚核苷酸序列间隔开。除P1及P2域如此实例中稍后更详细阐述以外，库的一般设计及构筑(包括条形码)如WO 2019/055946的实例11中所公开的。

库6和库8的设计仅在编码CAR的聚核苷酸方面不同。库6的CAR编码MRB-ASTR，所述MRB-ASTR具有识别人类AXL的scFv、CD28柄和跨膜序列(SEQ ID NO:25)、缺失Lck结合的CD28胞内域(ICΔ)(SEQ ID NO:55)和来自CD3z的胞内活化域(SEQ ID NO:28)。库8的CAR编码FLAG标记的MRB-ASTR，所述FLAG标记的MRB-ASTR具有识别人类ROR2的scFv、CD8柄和跨膜序列(SEQ ID NO:24)、CD137胞内域(SEQ ID NO:53)和来自CD3z的胞内活化域(SEQ ID NO:28)。

病毒载体的合成和慢病毒产生

如WO 2019/055946的实例11中所公开来合成载体并且产生各库的慢病毒颗粒。

Transduction and culturing of PBMCs

收集来自2名健康供体的人类全血且使用Sepax 2S-100器件单独地处理以获得PBMC如WO 2019/055946的实例12中所描述。将100ml的库6和8的4.75e7或5e7个活PBMC分别接种至两个1L G-Rex器件中的每一个中且活化、转导，且将培养物扩增12天，如以上实例5中所描述。对于库6，回收总共3.9e9个细胞(82倍扩增)，其中9.71e7个是CD3+eTAG+转导的T细胞。对于库8，回收总共2.47e9个细胞(49倍扩增)，其中2.44e8个是CD3+eTAG+转导的T细胞。保留来自每次扩增的4e6个细胞且冷冻以用于随后通过下一代测序来进行分析。

肿瘤接种和被转导的细胞的给予

选择使用NSG小鼠的异种移植模型探测用库6或库8的慢病毒颗粒转导的人类PBMC体内存活和/或增殖的能力，其中肿瘤表达或不表达由在这些慢病毒颗粒的基因组中编码的CAR识别的抗原。在B-NSG小鼠(Beijing Biocytogen Co.Ltd.)的后侧腹中建立皮下(sc)CHO、CHO-ROR2或CHO-AXL肿瘤异种移植物，如实例5中所描述。

在肿瘤接种之后5天，通过尾静脉注射向6只携带CHO肿瘤的小鼠和5只携带CHO-Axl肿瘤的小鼠静脉内(IV)给予含有7×10

收集组织，分离人类CD45+细胞且进行DNA测序。

在给予被转导的PBMC之后第7、14和21天(对于库6)或第7、14和19天(对于库8)从每只小鼠收集约100μl血液。还在第21天或第19天处死小鼠时收集脾和肿瘤。通过机械破坏组织，用胶原蛋白酶IV和DNAse I进行酶消化以及使用hCD45抗体(Biolegend，304004)对细胞进行磁分离，对每个组织的一半进行处理，以分离人类CD45+细胞。从这些hCD45+细胞制备基因组DNA且对应于“纯化的脾脏”和“纯化的肿瘤”样品。由每个组织的另一半直接制备基因组DNA且对应于“未纯化的脾脏”和“未纯化的肿瘤”。使用Illumina HiSeq对纯化的基因组DNA进行测序，产生配对末端150bp读数。通常，从每个编索引的fastq文件中提取一千万个读数的子集，并使用条形码读取器进行分析处理，所述条形码读取器为定制的R脚本，其经工程改造以基于恒定区域的存在来提取条形码序列。还用PacBio测序系统对纯化的基因组DNA进行测序以获得更长读取长度以将条形码与构筑体相关联。

qPCR

通过生物分析qPCR来评估从组织样品分离的基因组DNA(gDNA)的被转导的淋巴细胞的存在。使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen 51106)从样品分离基因组DNA并且使用QIAamp DNA Micro试剂盒(56304)进一步清洗DNA。使用对慢病毒的5'LTR具有特异性的引物和探针集合对被分离的基因组DNA进行TaqMan分析法(Thermo Fisher)，以定量每微克组织的慢病毒拷贝数目。

数据分析

在2000万个Illumina HiSeq测序读取子集中识别DNA条形码。组合全部样品的计数数据且将在少于2个样品中存在的条形码视为伪造的并丢弃。注射前PBMC的计数数据用作初始条形码群体的代表。使用由一些选定样品的长读取测序创建的关联表来识别全长构筑体。在将映射到同一构筑体的条形码的计数求和后，基于每微克组织的经qPCR定量的慢病毒拷贝数目来缩放所有数据。从分析中去除具有极低的慢病毒拷贝数的样品。通过计算来自携带不具有由CAR识别的同源目标抗原的CHO肿瘤的小鼠的每个相关组织中的每种构筑体的总计数，获得CAR/抗原非依赖性嵌合多肽候选物的排名。使用下式获得CAR/抗原信号依赖性驱动物的排名：MR×-log10(P)，其中MR是携带具有抗原的肿瘤的小鼠(CHO-AXL或CHO-ROR2)与携带不具有抗原的肿瘤的小鼠的计数值之间的平均比且P为由单边曼-惠特尼-威尔科克森测试获得的p值，所述测试比较携带具有或不具有抗原的肿瘤的小鼠的计数值。使用单边曼-惠特尼-威尔科克森测试确定与特定位置的所有其它代表部分相比，是否富集具体部分。使用斯托夫求和法(Stouffer sumz method)将各个组织p值汇总以获得最终排名。通过求取各个组织排名的平均值来获得完整的构筑体排名。

结果

在此实验中，嵌合多肽候选物被设计成具有4个测试域，其包括胞外域(P1)、跨膜域(P2)、第一胞内域(P3)及第二胞内域(P4)(图6)。如WO 2019/055946的实例11和12中所解释，构筑体包括DNA条形码以帮助使用下一代测序来分析和识别构筑体。此外，所有构筑体包括在具有胞外域的框中编码识别和/或消除域的核酸序列。此实例中的构筑体还编码针对嵌合多肽候选物的上游的人类AXL人类人类ROR2的CAR(图6)。用于产生库6和库8中的嵌合多肽候选物的胞外域(P1)、跨膜域(P2)、第一胞内域(P3)和第二胞内域(P4)与WO 2019/055946的实例12中的相同。库并不包括P1-P4域的所有可能的组合。

通过对在第12天培养样品中的超过一次读取中存在的各个条形码的数目进行计数，确定库6和库8的在PBMC转导和在存在外源性细胞因子的情况下在培养物中生长12天之后存在的构筑体的数目。在697,410种潜在组合中，分别关于库6和库8检测到219,649和127,634种不同的构筑体。可由表1和表4-8确定关于所分析的最高的候选物的详细信息。构筑体的编码系统与关于WO 2019/055946的实施例11和12所说明的相同。

在培养12天后，将被转导的PBMC注射至携带具有或不具有抗原的肿瘤的小鼠中。将由来自库6的编码抗AXL CAR的构筑体转导的PBMC注射至携带CHO肿瘤或CHO-AXL肿瘤的小鼠中，且将由来自库8的编码抗ROR2 CAR的构筑体转导的PBMC注射至携带CHO肿瘤或CHO-ROR2肿瘤的小鼠中。在体内扩增21或19天(分别对于库6和库8)之后，收集每只小鼠的来自血液、脾和肿瘤的样品。将每个脾脏和肿瘤的一半进行处理以分离CD45+细胞且本文中的此实例中称为“纯化”样品。对来自每只小鼠的每个样品(血液、未纯化的脾脏、纯化的脾脏、未纯化的肿瘤和纯化的肿瘤)的DNA进行测序。使用每个构筑体上条形码识别和汇总每个样品中的每个构筑体的测序读段。

使用非参数分析来识别以CAR/抗原信号无关或CAR/抗原信号依赖性方式促进体内PBMC细胞增殖的构筑体。为了识别与CAR/抗原信号无关的嵌合多肽候选物，基于携带CHO肿瘤的小鼠中测序读段的数量对每个构筑体的每个样品进行排名。识别最高的构筑体在5个组织样品中具有最佳的平均等级。库6和库8的与CAR/抗原信号无关的前100个嵌合多肽候选物分别展示于表31和32中。

为了识别CAR/抗原信号依赖性嵌合多肽候选物，每个样品的等级包括携带具有抗原的肿瘤的小鼠(CHO-AXL或CHO-ROR2)和携带不具有抗原的肿瘤的小鼠(CHO)的读数之比。库6和库8的CAR/抗原信号依赖性的前100个嵌合多肽候选物分别展示于表33和34中。

进行其它分析以识别值得注意的与CAR/抗原信号无关的嵌合多肽候选物。对于此分析，首先基于统计测试识别20个对任何P2、P3或P4位置表现最佳的部分，以确定具体部分与特定位置的所有其它代表部分相比是否被富集。在此组合分析中，由包含这20个部分中至少一个的构筑体，基于携带CHO肿瘤的小鼠的标准化计数的总和识别来自库6或库8的表现最佳的构筑体。根据此分析的与CAR/抗原信号无关的30种表现最佳的嵌合多肽候选物展示于表8中。

产生库筛选中识别且表8中展示的若干CLE作为慢病毒构筑体中的各个嵌合多肽，所述慢病毒构筑体位于库6中配置的抗AXL CAR之后，且在体外筛选中进行。将来自3名供体的冷冻的PBMC解冻且在标准加湿组织培养箱中，在37℃和5％CO

所公开的实施例、实例及实验不意图限制本发明的范围或表示以下实验为执行的全部或唯一的实验。已努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确度，但应计入一些实验性误差及偏差。应理解，可在不改变实验意图说明的基本方面的情况下对如所描述的方法进行变化。

所属领域的技术人员可在本公开的范围及精神下设计许多修改及其它实施例。实际上，可在不改变本公开的基本方面的情况下由所属领域的技术人员对所描述的材料、方法、图式、实验、实例及实施例进行变化。所公开实施例中的任一个可结合其它所公开的实施例来使用。

在一些情况下，参考特定实施例描述一些概念。然而，所属领域的一般技术人员了解，可在不背离如以下权利要求书所阐述的发明内容的范围的情况下进行各种修改及改变。因此，说明书及图式应视为呈说明性意义而非限制性意义，且所有这些修改意图包括在本发明的范围内。

表1.淋巴增生性部分P1-P2、P1、P2、P3和P4的域的部分、名称和氨基酸序列。

表4.库6中的体内、抗原无关的前100个构筑体

表5.库8中的体内、抗原无关的前100个构筑体。

表6.库6中的体内、抗原依赖性前100个构筑体

表7.库8中的体内、抗原依赖性前100个构筑体

表8.组合库6和库8中的体内、抗原无关的前30个构筑体，平均分析的总和

SEQUENCE LISTING

<110> F1 ONCOLOGY INC.

F1 BioVentures, LLC

FROST, Gregory Ian

HAERIZADEH, Farzad

ONUFFER, James Joseph

VIGANT, Frederic

<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENETICALLY MODIFYING LYMPHOCYTES IN

BLOOD OR IN ENRICHED PBMCS

<130> F1.001.WO.05

<150> US 62/894,853

<151> 2019-09-01

<150> PCT/US2018/051392

<151> 2018-09-17

<150> US 62/726,293

<151> 2018-09-02

<150> US 62/726,294

<151> 2018-09-02

<150> US 62/728,056

<151> 2018-09-06

<150> US 62/732,528

<151> 2018-09-17

<150> US 62/821,434

<151> 2019-03-20

<160> 457

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> integrin-binding peptide segment

<400> 1

Arg Gly Asp

1

<210> 2

<211> 43

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(43)

<223> wild-type CD8 Stalk

<400> 2

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

35 40

<210> 3

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(42)

<223> wild-type CD28 Stalk

<400> 3

Phe Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu

1 5 10 15

Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro

20 25 30

Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35 40

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

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Cys Pro Pro Cys

1

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

<400> 5

Asp Lys Thr His Thr

1 5

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

<400> 6

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1 5 10 15

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

<400> 7

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

<400> 8

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

1 5 10

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<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

<400> 9

Lys Cys Cys Val Asp Cys Pro

1 5

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

<400> 10

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

1 5

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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1 5 10 15

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<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

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Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

<400> 13

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys

1 5 10 15

Pro

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<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

<400> 14

Ser Pro Asn Met Val Pro His Ala His His Ala Gln

1 5 10

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<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

<400> 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Tyr Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

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<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Hinge

<400> 16

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 17

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> CD* alpha Transmembrane domain

<400> 17

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 18

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> CD8 beta Transmembrane domain

<400> 18

Leu Gly Leu Leu Val Ala Gly Val Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Val Ala Ile His Leu Cys Cys

20

<210> 19

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> CD4 Transmembrane domain

<400> 19

Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly

1 5 10 15

Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys

20 25

<210> 20

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> CD3 zeta Transmembrane domain

<400> 20

Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val

20

<210> 21

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<223> CD28 Transmembrane domain

<400> 21

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223> OX40 Transmembrane domain

<400> 22

Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro

1 5 10 15

Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu

20 25

<210> 23

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> CD7 Transmembrane domain

<400> 23

Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly

1 5 10 15

Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala

20

<210> 24

<211> 69

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(69)

<223> CD8a Stalk and Transmembrane domain

<400> 24

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

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<210> 25

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(66)

<223> CD28 Stalk and Transmembrane domain

<400> 25

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val

65

<210> 26

<211> 163

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(163)

<223> CD3Z Activating domain isoform 1

<400> 26

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys

20 25 30

Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala

35 40 45

Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

50 55 60

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

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Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

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Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

115 120 125

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

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Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

145 150 155 160

Pro Pro Arg

<210> 27

<211> 164

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(164)

<223> CD3Z Activating domain isoform 2

<400> 27

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys

20 25 30

Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala

35 40 45

Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

50 55 60

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

85 90 95

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

100 105 110

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

115 120 125

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

130 135 140

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

145 150 155 160

Leu Pro Pro Arg

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(112)

<223> CD3Z Activating domain isoform 3

<400> 28

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 29

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(113)

<223> CD3Z Activating domain isoform

<400> 29

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 30

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> CD3Z Activating domain isoform 4

<400> 30

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

1 5 10 15

Val Leu Asp Lys Arg

20

<210> 31

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> CD3Z Activating domain isoform 5

<400> 31

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

1 5 10 15

Ser Glu Ile Gly Met Lys

20

<210> 32

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> CD3Z Activating domain isoform 6

<400> 32

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

1 5 10 15

Ala Leu His Met Gln

20

<210> 33

<211> 171

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(171)

<223> CD3D Activating domain isoform 1

<400> 33

Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu

1 5 10 15

Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg

20 25 30

Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val

35 40 45

Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile

50 55 60

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys

65 70 75 80

Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys

85 90 95

Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val

100 105 110

Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His

115 120 125

Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg

130 135 140

Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr

145 150 155 160

Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

165 170

<210> 34

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(127)

<223> CD3D Activating domain isoform 2

<400> 34

Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu

1 5 10 15

Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg

20 25 30

Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val

35 40 45

Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile

50 55 60

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys

65 70 75 80

Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Thr Ala Asp Thr Gln

85 90 95

Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp

100 105 110

Asp Ala Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

115 120 125

<210> 35

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> CD3D Activating domain isoform 3

<400> 35

Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr Ser

1 5 10 15

His Leu Gly Gly Asn

20

<210> 36

<211> 206

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(206)

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<400> 36

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1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

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Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Met Ser

115 120 125

Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu

130 135 140

Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro

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Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys

165 170 175

Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys

180 185 190

Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 37

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> CD3E Activating domain isoform 2

<400> 37

Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser

1 5 10 15

Gly Leu Asn Gln Arg

20

<210> 38

<211> 182

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(182)

<223> CD3G Activating domain isoform 1

<400> 38

Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys

20 25 30

Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala

35 40 45

Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe

50 55 60

Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp

65 70 75 80

Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro

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Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala

100 105 110

Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val

115 120 125

Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln

130 135 140

Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr

145 150 155 160

Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly

165 170 175

Asn Gln Leu Arg Arg Asn

180

<210> 39

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> CD3G Activating domain isoform 2

<400> 39

Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser

1 5 10 15

His Leu Gln Gly Asn

20

<210> 40

<211> 226

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(226)

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<400> 40

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20 25 30

Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn

100 105 110

Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro

115 120 125

Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile

130 135 140

Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly

145 150 155 160

Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu

165 170 175

Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn

180 185 190

Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly

195 200 205

Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu

210 215 220

Lys Pro

225

<210> 41

<211> 188

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(188)

<223> CD79A Activating domain isoform 2

<400> 41

Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe

1 5 10 15

Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala

20 25 30

Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Glu Pro Pro Pro Arg Pro Phe Leu

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Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile

100 105 110

Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg

115 120 125

Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp Glu Tyr

130 135 140

Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met

145 150 155 160

Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly

165 170 175

Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu Lys Pro

180 185

<210> 42

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

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<222> (1)..(21)

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Asp Ile Ser Arg Gly

20

<210> 43

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

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<400> 43

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Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

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Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg

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Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly

85 90 95

Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr

100 105 110

Lys

<210> 44

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(107)

<223> DAP12 Activating domain isoform 2

<400> 44

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Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp

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Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

35 40 45

Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu

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Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Thr Arg Lys

65 70 75 80

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Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln

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<210> 45

<211> 102

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(102)

<223> DAP12 Activating domain isoform 3

<400> 45

Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu

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Leu Ala Val Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu

20 25 30

Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu

35 40 45

Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala

50 55 60

Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr

65 70 75 80

Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr

85 90 95

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100

<210> 46

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

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<223> DAP12 Activating domain isoform 4

<400> 46

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Leu Ala Val Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu

20 25 30

Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu

35 40 45

Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala

50 55 60

Glu Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln

65 70 75 80

Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln

85 90 95

Arg Pro Tyr Tyr Lys

100

<210> 47

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(86)

<223> FCERlG Activating domain isoform 1

<400> 48

Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala

1 5 10 15

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20 25 30

Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile

35 40 45

Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val

50 55 60

Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys

65 70 75 80

His Glu Lys Pro Pro Gln

85

<210> 49

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> FCERlG Activating domain isoform 2

<400> 49

Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu

1 5 10 15

Thr Leu Lys His Glu

20

<210> 50

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> DAP10 Activating domain

<400> 50

Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met

1 5 10 15

Pro Gly Arg Gly

20

<210> 51

<211> 68

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(68)

<223> CD28 Activating domain

<400> 51

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 52

<211> 619

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(619)

<223> ZAP70 Activating domain

<400> 52

Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser

1 5 10 15

Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly

20 25 30

Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu

35 40 45

Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln

50 55 60

Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro

65 70 75 80

Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys

85 90 95

Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro

100 105 110

Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg

115 120 125

Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser

130 135 140

Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg

145 150 155 160

Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys

165 170 175

Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg

180 185 190

Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val

195 200 205

Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro

210 215 220

Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys

225 230 235 240

Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn

245 250 255

Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala

260 265 270

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275 280 285

Ser Asp Gly Tyr Thr Pro Glu Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys

290 295 300

Pro Arg Pro Met Pro Met Asp Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser

305 310 315 320

Asp Pro Glu Glu Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn

325 330 335

Leu Leu Ile Ala Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val

340 345 350

Arg Gln Gly Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile

355 360 365

Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met

370 375 380

Arg Glu Ala Gln Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg

385 390 395 400

Leu Ile Gly Val Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met

405 410 415

Ala Gly Gly Gly Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu

420 425 430

Ile Pro Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly

435 440 445

Met Lys Tyr Leu Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala

450 455 460

Arg Asn Val Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe

465 470 475 480

Gly Leu Ser Lys Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg

485 490 495

Ser Ala Gly Lys Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn

500 505 510

Phe Arg Lys Phe Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr

515 520 525

Met Trp Glu Ala Leu Ser Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys

530 535 540

Gly Pro Glu Val Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys

545 550 555 560

Pro Pro Glu Cys Pro Pro Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp

565 570 575

Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg

580 585 590

Met Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro

595 600 605

Gly Ser Thr Gln Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala

610 615

<210> 53

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(42)

<223> CD137 Co-stimulatory domain

<400> 53

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 54

<211> 41

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(41)

<223> CD28 Co-stimulatory domain

<400> 54

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 55

<211> 41

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(41)

<223> IC? Co-stimulatory domain

<400> 55

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala

20 25 30

Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 56

<211> 35

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(35)

<223> ICOS Co-stimulatory domain

<400> 56

Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr

1 5 10 15

Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp

20 25 30

Val Thr Leu

35

<210> 57

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223> OX40 Co-stimulatory domain

<400> 57

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

20 25 30

Thr Leu Ala Lys Ile

35

<210> 58

<211> 49

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(49)

<223> CD27 Co-stimulatory domain

<400> 58

His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu

1 5 10 15

Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser

20 25 30

Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser

35 40 45

Pro

<210> 59

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(114)

<223> BLTA Co-stimulatory domain

<400> 59

Cys Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr

1 5 10 15

Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln

20 25 30

Thr Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr

35 40 45

Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly

50 55 60

Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile

65 70 75 80

Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu

85 90 95

Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val

100 105 110

Arg Ser

<210> 60

<211> 187

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(187)

<223> CD30 Co-stimulatory domain

<400> 60

Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr

1 5 10 15

Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro

20 25 30

Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro

35 40 45

Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys

50 55 60

His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala

65 70 75 80

Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg

85 90 95

Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met

100 105 110

Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu

115 120 125

Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu

130 135 140

Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro

145 150 155 160

Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys

165 170 175

Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys

180 185

<210> 61

<211> 54

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(54)

<223> GITR Co-stimulatory domain

<400> 61

His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln

1 5 10 15

Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln

20 25 30

Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg

35 40 45

Leu Gly Asp Leu Trp Val

50

<210> 62

<211> 60

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(60)

<223> HVEM Co-stimulatory domain

<400> 62

Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val

1 5 10 15

Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile

20 25 30

Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu

35 40 45

Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His

50 55 60

<210> 63

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Linker

<400> 63

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 64

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Linker

<400> 64

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 65

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Linker

<400> 65

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 66

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Linker

<400> 66

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 67

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Linker

<400> 67

Gly Gly Ser Gly Gly

1 5

<210> 68

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Linker

<400> 68

Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 69

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Linker

<400> 69

Gly Ser Gly Gly Gly

1 5

<210> 70

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Linker

<400> 70

Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 71

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Linker

<400> 71

Gly Ser Ser Ser Gly

1 5

<210> 72

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> CD8 Signal peptide

<400> 72

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: HA Epitope

<400> 73

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 74

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: FLAG epitope

<400> 74

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 75

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: c-myc Epitope

<400> 75

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 76

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: His5 Affinity

<400> 76

His His His His His

1 5

<210> 77

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: HisX6 Affinity

<400> 77

His His His His His His

1 5

<210> 78

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Strep Tag Affinity

<400> 78

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 79

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Affinity tag

<400> 79

Arg Tyr Ile Arg Ser

1 5

<210> 80

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Affinity tag

<400> 80

Phe His His Thr

1

<210> 81

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Affinity tag

<400> 81

Trp Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Cys Cys Arg Glu Cys Cys Ala Arg

1 5 10 15

Ala

<210> 82

<211> 357

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(357)

<223> EGFR Truncation

<400> 82

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala

325 330 335

Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly

340 345 350

Ile Gly Leu Phe Met

355

<210> 83

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Cleavage signal

<400> 83

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 84

<211> 368

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: eTAG IL7RA Ins PPCL (interleukin 7 receptor)

<400> 84

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser

325 330 335

Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile

340 345 350

Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu

355 360 365

<210> 85

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: eTAG IL7RA Ins PPCL (interleukin 7 receptor)

<400> 85

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu

195 200 205

Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu

210 215 220

Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu

225 230

<210> 86

<211> 194

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Myc Tag LMP1 NC_007605_1

<400> 86

Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Glu His Asp Leu Glu

1 5 10 15

Arg Gly Pro Pro Gly Pro Arg Arg Pro Pro Arg Gly Pro Pro Leu Ser

20 25 30

Ser Ser Leu Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe

35 40 45

Trp Leu Tyr Ile Val Met Ser Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val

50 55 60

Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu Ile Ile Ile Ile Leu Ile Ile Phe

65 70 75 80

Ile Phe Arg Arg Asp Leu Leu Cys Pro Leu Gly Ala Leu Cys Ile Leu

85 90 95

Leu Leu Met Ile Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Asn Leu His Gly

100 105 110

Gln Ala Leu Phe Leu Gly Ile Val Leu Phe Ile Phe Gly Cys Leu Leu

115 120 125

Val Leu Gly Ile Trp Ile Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu Gly

130 135 140

Ala Thr Ile Trp Gln Leu Leu Ala Phe Phe Leu Ala Phe Phe Leu Asp

145 150 155 160

Leu Ile Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr

165 170 175

Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ile Leu Ile

180 185 190

Trp Met

<210> 87

<211> 174

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Myc LMP1 NC_007605_1

<400> 87

Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser Ser Ser Leu Gly

1 5 10 15

Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe Trp Leu Tyr Ile

20 25 30

Val Met Ser Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe

35 40 45

Ala Leu Met Leu Ile Ile Ile Ile Leu Ile Ile Phe Ile Phe Arg Arg

50 55 60

Asp Leu Leu Cys Pro Leu Gly Ala Leu Cys Ile Leu Leu Leu Met Ile

65 70 75 80

Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Asn Leu His Gly Gln Ala Leu Phe

85 90 95

Leu Gly Ile Val Leu Phe Ile Phe Gly Cys Leu Leu Val Leu Gly Ile

100 105 110

Trp Ile Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu Gly Ala Thr Ile Trp

115 120 125

Gln Leu Leu Ala Phe Phe Leu Ala Phe Phe Leu Asp Leu Ile Leu Leu

130 135 140

Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp

145 150 155 160

Leu Leu Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ile Leu Ile Trp Met

165 170

<210> 88

<211> 184

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: LMP1 NC_007605_1

<400> 88

Met Glu His Asp Leu Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Arg Arg Pro Pro

1 5 10 15

Arg Gly Pro Pro Leu Ser Ser Ser Leu Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu

20 25 30

Leu Leu Ala Leu Leu Phe Trp Leu Tyr Ile Val Met Ser Asp Trp Thr

35 40 45

Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu Ile Ile

50 55 60

Ile Ile Leu Ile Ile Phe Ile Phe Arg Arg Asp Leu Leu Cys Pro Leu

65 70 75 80

Gly Ala Leu Cys Ile Leu Leu Leu Met Ile Thr Leu Leu Leu Ile Ala

85 90 95

Leu Trp Asn Leu His Gly Gln Ala Leu Phe Leu Gly Ile Val Leu Phe

100 105 110

Ile Phe Gly Cys Leu Leu Val Leu Gly Ile Trp Ile Tyr Leu Leu Glu

115 120 125

Met Leu Trp Arg Leu Gly Ala Thr Ile Trp Gln Leu Leu Ala Phe Phe

130 135 140

Leu Ala Phe Phe Leu Asp Leu Ile Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu

145 150 155 160

Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu Leu

165 170 175

Phe Leu Ala Ile Leu Ile Trp Met

180

<210> 89

<211> 162

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: LMP1 NC_007605_1

<400> 89

Met Ser Leu Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe

1 5 10 15

Trp Leu Tyr Ile Val Met Ser Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val

20 25 30

Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu Ile Ile Ile Ile Leu Ile Ile Phe

35 40 45

Ile Phe Arg Arg Asp Leu Leu Cys Pro Leu Gly Ala Leu Cys Ile Leu

50 55 60

Leu Leu Met Ile Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Asn Leu His Gly

65 70 75 80

Gln Ala Leu Phe Leu Gly Ile Val Leu Phe Ile Phe Gly Cys Leu Leu

85 90 95

Val Leu Gly Ile Trp Ile Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu Gly

100 105 110

Ala Thr Ile Trp Gln Leu Leu Ala Phe Phe Leu Ala Phe Phe Leu Asp

115 120 125

Leu Ile Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr

130 135 140

Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ile Leu Ile

145 150 155 160

Trp Met

<210> 90

<211> 363

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: eTAG CRLF2 transcript variant 1 NM_022148_3

<400> 90

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Ala Glu Thr Pro Thr Pro Pro

325 330 335

Lys Pro Lys Leu Ser Lys Cys Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile Leu

340 345 350

Leu Met Val Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Trp

355 360

<210> 91

<211> 227

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: eTAG CRLF2 transcript variant 1 NM_022148_3

<400> 91

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Ala Glu Thr Pro Thr Pro Pro Lys Pro Lys Leu Ser Lys Cys Ile

195 200 205

Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile Leu Leu Met Val Ser Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Ser Leu Trp

225

<210> 92

<211> 354

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: eTAG CSF2RB NM_000395_2

<400> 92

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Thr Glu Ser Val Leu Pro Met

325 330 335

Trp Val Leu Ala Leu Ile Glu Ile Phe Leu Thr Ile Ala Val Leu Leu

340 345 350

Ala Leu

<210> 93

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: eTAG CSF2RB NM_000395_2

<400> 93

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

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Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu

325 330 335

Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser

340 345 350

Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val

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Ala

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Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

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Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

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Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr

165 170 175

Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln

180 185 190

Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro

195 200 205

Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val

210 215 220

Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn

225 230 235 240

Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn

245 250 255

Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His

260 265 270

Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met

275 280 285

Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val

290 295 300

Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly

305 310 315 320

Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu

325 330 335

Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr

340 345 350

Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Ala

355 360 365

Ala

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Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

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65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

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165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

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290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

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Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu

325 330 335

Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser

340 345 350

Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val

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Ala Ala Ala

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50 55 60

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Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

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Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu

325 330 335

Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser

340 345 350

Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val

355 360 365

Ala Ala Ala Ala

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Val Val Ser Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Glu

20 25 30

Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn

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Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn

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20

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20

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Leu Val Leu Val Phe Ile

20

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Gly Thr Leu Leu Leu Phe

20

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Gly Ile Ile Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val

1 5 10 15

Pro Ile Phe Leu Leu Leu

20

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<211> 21

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1 5 10 15

Leu Leu Ser Leu Trp

20

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<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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Cys Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile Leu Leu Met Val Ser Leu Leu

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Leu Leu Ser Leu Trp

20

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Val Cys Gly Ile Val Leu Gly Phe Leu Phe

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1 5 10 15

Leu Ala Leu

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<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CSF2RB NM_000395_2

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Met Trp Val Leu Ala Leu Ile Glu Ile Phe Leu Thr Ile Ala Val Leu

1 5 10 15

Leu Ala Leu

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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1 5 10 15

Gly Thr Ala Trp Leu Cys Cys

20

<210> 133

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CSF3R transcript variant 1 NM_000760_3

<400> 133

Ile Ile Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Asn Cys Leu Cys

1 5 10 15

Gly Thr Ala Trp Leu Cys Cys

20

<210> 134

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<400> 134

Leu Ile Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser

20

<210> 135

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: EPOR transcript variant 1 NM_000121_3

<400> 135

Cys Cys Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser

20

<210> 136

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<400> 136

Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu

1 5 10 15

Thr Leu Leu Tyr Cys

20

<210> 137

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 137

Ile Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala

1 5 10 15

Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr

20

<210> 138

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 138

Ile Ile Val Ala Val Val Ile Ala Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala

1 5 10 15

Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr

20

<210> 139

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 139

Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val

1 5 10 15

Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser

20

<210> 140

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: GHR transcript variant 1 NM_000163_4

<400> 140

Phe Pro Trp Leu Leu Cys Ile Ile Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val

1 5 10 15

Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser

20

<210> 141

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: ICOS NM_012092.3

<400> 141

Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu

1 5 10 15

Gly Cys Ile Leu Ile

20

<210> 142

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IFNAR1 NM_000629_2

<400> 142

Ile Trp Leu Ile Val Gly Ile Cys Ile Ala Leu Phe Ala Leu Pro Phe

1 5 10 15

Val Ile Tyr Ala Ala

20

<210> 143

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IFNAR2 transcript variant 1 NM_207585_2

<400> 143

Ile Gly Gly Ile Ile Thr Val Phe Leu Ile Ala Leu Val Leu Thr Ser

1 5 10 15

Thr Ile Val Thr Leu

20

<210> 144

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IFNGR1 NM_000416_2

<400> 144

Ser Leu Trp Ile Pro Val Val Ala Ala Leu Leu Leu Phe Leu Val Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Phe Ile

20

<210> 145

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IFNGR2 transcript variant 1 NM_001329128_1

<400> 145

Val Ile Leu Ile Ser Val Gly Thr Phe Ser Leu Leu Ser Val Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Cys Phe Phe

20

<210> 146

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IFNLR1 NM_170743_3

<400> 146

Phe Leu Val Leu Pro Ser Leu Leu Ile Leu Leu Leu Val Ile Ala Ala

1 5 10 15

Gly Gly Val Ile Trp

20

<210> 147

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL1R1 transcript variant 2 NM_001288706_1

<400> 147

His Met Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu Thr Val Ile Ile Val Cys Ser

1 5 10 15

Val Phe Ile Tyr Lys Ile Phe

20

<210> 148

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL1RAP transcript variant 1 NM_002182_3

<400> 148

Val Leu Leu Val Val Ile Leu Ile Val Val Tyr His Val Tyr Trp Leu

1 5 10 15

Glu Met Val Leu Phe

20

<210> 149

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL1RL1 transcript variant 1 NM_016232.4

<400> 149

Ile Tyr Cys Ile Ile Ala Val Cys Ser Val Phe Leu Met Leu Ile Asn

1 5 10 15

Val Leu Val Ile Ile

20

<210> 150

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL1RL2 NM_003854.2

<400> 150

Ala Tyr Leu Ile Gly Gly Leu Ile Ala Leu Val Ala Val Ala Val Ser

1 5 10 15

Val Val Tyr Ile Tyr

20

<210> 151

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL2RA transcript variant 1 NM_000417_2

<400> 151

Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Gly Leu

<210> 152

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL2RB transcript variant 1 NM_000878_4

<400> 152

Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly

1 5 10 15

Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile

20 25

<210> 153

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL2RG NM_000206_2

<400> 153

Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys

1 5 10 15

Val Tyr Phe Trp Leu

20

<210> 154

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL3RA transcript variant 1 and 2 NM_002183_3

<400> 154

Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys Val

1 5 10 15

Phe Val Ile Cys

20

<210> 155

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL4R transcript variant 1 NM_000418_3

<400> 155

Leu Leu Leu Gly Val Ser Val Ser Cys Ile Val Ile Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Leu Leu Cys Tyr Val Ser Ile Thr

20

<210> 156

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL5RA transcript variant 1 NM_000564_4

<400> 156

Phe Val Ile Val Ile Met Ala Thr Ile Cys Phe Ile Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Ser Leu Ile Cys

20

<210> 157

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL6R transcript variant 1 NM_000565_3

<400> 157

Thr Phe Leu Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys

1 5 10 15

Ile Ala Ile Val Leu

20

<210> 158

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL6ST transcript variant 1 and 3 NM_002184_3

<400> 158

Ala Ile Val Val Pro Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu

1 5 10 15

Gly Val Leu Phe Cys Phe

20

<210> 159

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL7RA NM_002185_3

<400> 159

Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu

1 5 10 15

Val Ile Leu Ala Cys Val Leu

20

<210> 160

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL7RA Ins PPCL (interleukin 7 receptor)

<400> 160

Ile Leu Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser

1 5 10 15

Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu

20 25

<210> 161

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL9R transcript variant 1 NM_002186_2

<400> 161

Gly Asn Thr Leu Val Ala Val Ser Ile Phe Leu Leu Leu Thr Gly Pro

1 5 10 15

Thr Tyr Leu Leu Phe

20

<210> 162

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL10RA transcript variant 1 NM_001558_3

<400> 162

Val Ile Ile Phe Phe Ala Phe Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Tyr Cys Leu Ala Leu

20

<210> 163

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL10RB NM_000628_4

<400> 163

Trp Met Val Ala Val Ile Leu Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Gly Cys Phe

20

<210> 164

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL11RA NM_001142784_2

<400> 164

Ser Leu Gly Ile Leu Ser Phe Leu Gly Leu Val Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Gly Leu Trp Leu

20

<210> 165

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL12RB1 transcript variant 1 and 4 NM_005535_2

<400> 165

Trp Leu Ile Phe Phe Ala Ser Leu Gly Ser Phe Leu Ser Ile Leu Leu

1 5 10 15

Val Gly Val Leu Gly Tyr Leu Gly Leu

20 25

<210> 166

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL12RB2 transcript variant 1 and 3 NM_001559_2

<400> 166

Trp Met Ala Phe Val Ala Pro Ser Ile Cys Ile Ala Ile Ile Met Val

1 5 10 15

Gly Ile Phe Ser Thr

20

<210> 167

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL13RA1 NM_001560_2

<400> 167

Leu Tyr Ile Thr Met Leu Leu Ile Val Pro Val Ile Val Ala Gly Ala

1 5 10 15

Ile Ile Val Leu Leu Leu Tyr Leu

20

<210> 168

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL13RA2 NM_000640_2

<400> 168

Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Ile Leu Val Ile Phe Val Thr

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu

20

<210> 169

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL15RA transcript variant 4 NM_001256765_1

<400> 169

Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val

1 5 10 15

Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu

20

<210> 170

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL17RA NM_014339_6

<400> 170

Val Tyr Trp Phe Ile Thr Gly Ile Ser Ile Leu Leu Val Gly Ser Val

1 5 10 15

Ile Leu Leu Ile Val

20

<210> 171

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL17RB NM_018725_3

<400> 171

Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Thr Trp Val Leu Val Ala Gly

1 5 10 15

Ile Tyr Leu Met Trp

20

<210> 172

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL17RC transcript variant 1 NM_153460_3

<400> 172

Trp Ala Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ile Leu Leu Leu

20

<210> 173

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL17RD transcript variant 2 NM_017563_4

<400> 173

Ala Val Ala Ile Thr Val Pro Leu Val Val Ile Ser Ala Phe Ala Thr

1 5 10 15

Leu Phe Thr Val Met

20

<210> 174

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL17RE transcript variant 1 NM_153480_1

<400> 174

Leu Gly Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ala Leu Leu Thr Leu Leu Gly

1 5 10 15

Val Val Leu Ala Leu

20

<210> 175

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL18R1 transcript variant 1 NM_003855_3

<400> 175

Gly Met Ile Ile Ala Val Leu Ile Leu Val Ala Val Val Cys Leu Val

1 5 10 15

Thr Val Cys Val Ile

20

<210> 176

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL18RAP NM_003853_3

<400> 176

Gly Val Val Leu Leu Tyr Ile Leu Leu Gly Thr Ile Gly Thr Leu Val

1 5 10 15

Ala Val Leu Ala Ala

20

<210> 177

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL20RA transcript variant 1 NM_014432_3

<400> 177

Ile Ile Phe Trp Tyr Val Leu Pro Ile Ser Ile Thr Val Phe Leu Phe

1 5 10 15

Ser Val Met Gly Tyr

20

<210> 178

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL20RB NM_144717_3

<400> 178

Val Leu Ala Leu Phe Ala Phe Val Gly Phe Met Leu Ile Leu Val Val

1 5 10 15

Val Pro Leu Phe Val

20

<210> 179

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL21R transcript variant 2 NM_181078_2

<400> 179

Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe

1 5 10 15

Ile Pro Ala Phe Trp

20

<210> 180

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL22RA1 NM_021258_3

<400> 180

Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly Phe Leu Val Ala

1 5 10 15

Val Leu Cys Tyr Leu

20

<210> 181

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL23R NM_144701_2

<400> 181

Leu Leu Leu Gly Met Ile Val Phe Ala Val Met Leu Ser Ile Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ile Gly Ile Phe

20

<210> 182

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL27RA NM_004843_3

<400> 182

Val Leu Pro Gly Ile Leu Phe Leu Trp Gly Leu Phe Leu Leu Gly Cys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Leu Ala

20

<210> 183

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL27RA NM_004843_3

<400> 183

Val Leu Pro Gly Ile Leu Cys Leu Trp Gly Leu Phe Leu Leu Gly Cys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Leu Ala

20

<210> 184

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IL31RA transcript variant 1 NM_139017_5

<400> 184

Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly Gly Gly Leu Leu Ile Leu Ile

1 5 10 15

Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu

20

<210> 185

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: LEPR transcript variant 1 NM_002303_5

<400> 185

Ala Gly Leu Tyr Val Ile Val Pro Val Ile Ile Ser Ser Ser Ile Leu

1 5 10 15

Leu Leu Gly Thr Leu Leu Ile

20

<210> 186

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: LIFR NM_001127671_1

<400> 186

Val Gly Leu Ile Ile Ala Ile Leu Ile Pro Val Ala Val Ala Val Ile

1 5 10 15

Val Gly Val Val Thr Ser Ile Leu Cys

20 25

<210> 187

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: MPL NM_005373_2

<400> 187

Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val

1 5 10 15

Leu Gly Leu Leu Leu Leu

20

<210> 188

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: MPL NM_005373_2

<400> 188

Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val

1 5 10 15

Leu Gly Leu Leu Leu Leu

20

<210> 189

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: OSMR transcript variant 4 NM_001323505_1

<400> 189

Leu Ile His Ile Leu Leu Pro Met Val Phe Cys Val Leu Leu Ile Met

1 5 10 15

Val Met Cys Tyr Leu

20

<210> 190

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: PRLR transcript variant 1 NM_000949_6

<400> 190

Thr Thr Val Trp Ile Ser Val Ala Val Leu Ser Ala Val Ile Cys Leu

1 5 10 15

Ile Ile Val Trp Ala Val Ala Leu

20

<210> 191

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: TNFRSF4 NM_003327_3

<400> 191

Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro

1 5 10 15

Leu Ala Ile Leu Leu

20

<210> 192

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: TNFRSF8 transcript variant 1 NM_001243_4

<400> 192

Pro Val Leu Asp Ala Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu

1 5 10 15

Val Val Val Val Gly Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys

20 25

<210> 193

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: TNFRSF9 NM_001561_5

<400> 193

Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu

1 5 10 15

Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

20 25

<210> 194

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: TNFRSF14 transcript variant 1 NM_003820_3

<400> 194

Trp Trp Phe Leu Ser Gly Ser Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr

1 5 10 15

Val Gly Leu Ile Ile

20

<210> 195

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: TNFRSF18 transcript variant 1 NM_004195_2

<400> 195

Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys Val Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ser Ala

20

<210> 196

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD2 transcript variant 1 NM_001328609_1

<400> 196

Thr Lys Arg Lys Lys Gln Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu

1 5 10 15

Thr Arg Ala His Arg Val Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His

20 25 30

Gln Ile Pro Ala Ser Thr Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro

35 40 45

Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro

50 55 60

Pro Pro Gly His Arg Val Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala

65 70 75 80

Pro Ser Gly Thr Gln Val His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg

85 90 95

Pro Arg Val Gln Pro Lys Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu

100 105 110

Ser Pro Ser Ser Asn

115

<210> 197

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD3D transcript variant 1 NM_000732_4

<400> 197

Gly His Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu

1 5 10 15

Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala

20 25 30

Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

35 40 45

<210> 198

<211> 55

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD3E NM_000733_3

<400> 198

Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala

1 5 10 15

Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro

20 25 30

Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser

35 40 45

Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

50 55

<210> 199

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD3G NM_000073_2

<400> 199

Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu

1 5 10 15

Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp

20 25 30

Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly Asn Gln Leu Arg Arg Asn

35 40 45

<210> 200

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD4 transcript variant 1 and 2 NM_000616_4

<400> 200

Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ser Gln

1 5 10 15

Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro His Arg

20 25 30

Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile

35 40

<210> 201

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD8A transcript variant 1 NM_001768_6

<400> 201

Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg

1 5 10 15

Pro Val Val Lys Ser Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val

20 25 30

<210> 202

<211> 48

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD8B transcript variant 2 NM_172213_3

<400> 202

Arg Arg Arg Arg Ala Arg Leu Arg Phe Met Lys Gln Pro Gln Gly Glu

1 5 10 15

Gly Ile Ser Gly Thr Phe Val Pro Gln Cys Leu His Gly Tyr Tyr Ser

20 25 30

Asn Thr Thr Thr Ser Gln Lys Leu Leu Asn Pro Trp Ile Leu Lys Thr

35 40 45

<210> 203

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD8B transcript variant 3 NM_172101_3

<400> 203

Arg Arg Arg Arg Ala Arg Leu Arg Phe Met Lys Gln Leu Arg Leu His

1 5 10 15

Pro Leu Glu Lys Cys Ser Arg Met Asp Tyr

20 25

<210> 204

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD8B transcript variant 5 NM_004931_4

<400> 204

Arg Arg Arg Arg Ala Arg Leu Arg Phe Met Lys Gln Phe Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 205

<211> 48

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD27 NM_001242_4

<400> 205

Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr

20 25 30

Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

35 40 45

<210> 206

<211> 41

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: mutated Delta Lck CD28 transcript variant 1

NM_006139_3

<400> 206

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala

20 25 30

Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 207

<211> 41

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD28 transcript variant 1 NM_006139_3

<400> 207

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 208

<211> 62

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: CD40 transcript variant 1 and 6 NM_001250_5

<400> 208

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20 25 30

Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln

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Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln

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Ser Glu Ser Ser Glu Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro

1 5 10 15

His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro

20 25 30

Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln

35 40 45

Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu

50 55 60

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Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser

20 25 30

Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val

35 40 45

Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu Lys Pro

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Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp Ile Val Thr

20 25 30

Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro Gly Gln

35 40 45

Glu

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1 5 10 15

Lys Ser Ile Phe Pro Gly Leu Phe Glu Ile His Gln Gly Asn Phe Gln

20 25 30

Glu Trp Ile Thr Asp Thr Gln Asn Val Ala His Leu His Lys Met Ala

35 40 45

Gly Ala Glu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Gln Leu

50 55 60

Ala Lys Thr Glu Ala Glu Ser Pro Arg Met Leu Asp Pro Gln Thr Glu

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Glu Lys Glu Ala Ser Gly Gly Ser Leu Gln Leu Pro His Gln Pro Leu

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20 25 30

Glu Leu Trp Pro Pro Gly Ser Met Ser Ala Phe Thr Ser Gly Ser Pro

35 40 45

Pro His Gln Gly Pro Trp Gly Ser Arg Phe Pro Glu Leu Glu Gly Val

50 55 60

Phe Pro Val Gly Phe Gly Asp Ser Glu Val Ser Pro Leu Thr Ile Glu

65 70 75 80

Asp Pro Lys His Val Cys Asp Pro Pro Ser Gly Pro Asp Thr Thr Pro

85 90 95

Ala Ala Ser Asp Leu Pro Thr Glu Gln Pro Pro Ser Pro Gln Pro Gly

100 105 110

Pro Pro Ala Ala Ser His Thr Pro Glu Lys Gln Ala Ser Ser Phe Asp

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Pro Pro Pro Gly Ser Leu Glu Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Gly Gly Gln

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Val Gln Leu Val Pro Leu Ala Gln Ala Met Gly Pro Gly Gln Ala Val

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Glu Val Glu Arg Arg Pro Ser Gln Gly Ala Ala Gly Ser Pro Ser Leu

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Glu Ser Gly Gly Gly Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Pro Arg Val Gly

210 215 220

Gly Gln Asp Gln Lys Asp Ser Pro Val Ala Ile Pro Met Ser Ser Gly

225 230 235 240

Asp Thr Glu Asp Pro Gly Val Ala Ser Gly Tyr Val Ser Ser Ala Asp

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Ser Leu Gly Leu Pro Ser Asp Gln Thr Pro Ser Leu Cys Pro Gly Leu

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Gly Pro Gly Pro Leu Ser Leu Arg Ser Lys Pro Ser Ser Pro Gly Pro

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Gly Pro Glu Ile Lys Asn Leu Asp Gln Ala Phe Gln Val Lys Lys Pro

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Pro Gly Gln Ala Val Pro Gln Val Pro Val Ile Gln Leu Phe Lys Ala

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Leu Lys Gln Gln Asp Tyr Leu Ser Leu Pro Pro Trp Glu Val Asn Lys

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Pro Gly Glu Val Cys

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20 25 30

Glu Glu Phe Thr Pro Glu Glu Gly Lys Gly Tyr Arg Glu Glu Val Leu

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Thr Val Lys Glu Ile Thr

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Lys Arg Phe Leu Arg Ile Gln Arg Leu Phe Pro Pro Val Pro Gln Ile

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Lys Asp Lys Leu Asn Asp Asn His Glu Val Glu Asp Glu Met Gly Pro

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Gln Arg His His Arg Cys Gly Trp Asn Leu Tyr Pro Thr Pro Gly Pro

35 40 45

Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Pro Arg Leu Gly Ser Glu Ser Ser Leu

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20 25 30

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35 40 45

Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser

50 55 60

Ser Glu Thr Cys Gly Leu Pro Thr Leu Val Gln Thr Tyr Val Leu Gln

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Gly Leu Thr Pro Ser Pro Lys Ser Tyr Glu Asn Leu Trp Phe Gln Ala

130 135 140

Ser Pro Leu Gly Thr Leu Val Thr Pro Ala Pro Ser Gln Glu Asp Asp

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Gly Pro Arg Gln Gly Gln Trp Leu Gly Gln Thr Ser Glu Met Ser Arg

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Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser Ser Glu Thr Cys Gly

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Leu Pro Thr Leu Val Gln Thr Tyr Val Leu Gln Gly Asp Pro Arg Ala

100 105 110

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130 135 140

Leu Arg Cys Asp Ser Thr Gln Pro Leu Leu Ala Gly Leu Thr Pro Ser

145 150 155 160

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165 170 175

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Leu Leu Asn Phe Pro Leu Leu Gln Gly Ile Arg Val His Gly Met Glu

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50 55 60

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65 70 75 80

Gly Asp Pro Arg Ala Val Ser Thr Gln Pro Gln Ser Gln Ser Gly Thr

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20 25 30

Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys Thr

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro Glu

130 135 140

Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser

145 150 155 160

Gln Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro

165 170 175

Pro His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile Ser

180 185 190

Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu Ser

195 200 205

Asp Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala Ala

210 215 220

Glu Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser

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<210> 220

<211> 235

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<220>

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<400> 220

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1 5 10 15

Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe Gln

20 25 30

Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys Thr

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Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu Arg

50 55 60

Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu Gly

65 70 75 80

Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr Leu

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Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp Leu

100 105 110

Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro Glu

130 135 140

Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser

145 150 155 160

Gln Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro

165 170 175

Pro His Leu Lys Phe Leu Phe Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile Ser

180 185 190

Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu Ser

195 200 205

Asp Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala Ala

210 215 220

Glu Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser

225 230 235

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<211> 42

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<213> Artificial Sequence

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<400> 221

Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys

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Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr

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<400> 222

Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala

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20 25 30

Gln Pro Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr

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Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr

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Leu Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn

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<211> 77

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<400> 223

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20 25 30

Gln Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr

35 40 45

Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr

50 55 60

Leu Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn

65 70 75

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<213> Artificial Sequence

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<400> 224

Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro

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Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu

20 25 30

Glu Val Asn Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe

35 40 45

His Ser Asp Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu

50 55 60

Pro Asp Glu Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser

65 70 75 80

Asp His Glu Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser

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Gly Arg Thr Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn

100 105 110

Ala Asn Asp Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg

115 120 125

Leu Lys Gly Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn

130 135 140

Asn Ser Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val

145 150 155 160

Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala

165 170 175

Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser

180 185 190

Leu Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala

195 200 205

Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser

210 215 220

Gln Cys Asp Met His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe

225 230 235 240

Leu Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile

245 250 255

Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu

260 265 270

Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala

275 280 285

Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val

290 295 300

Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile

305 310 315 320

Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser

325 330 335

Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro

340 345 350

<210> 225

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<400> 225

Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn

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35

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<211> 100

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<213> Artificial Sequence

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<400> 226

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Pro Ser Ser Ser Ile Asp Glu Tyr Phe Ser Glu Gln Pro Leu Lys Asn

20 25 30

Leu Leu Leu Ser Thr Ser Glu Glu Gln Ile Glu Lys Cys Phe Ile Ile

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Glu Asn Ile Ser Thr Ile Ala Thr Val Glu Glu Thr Asn Gln Thr Asp

50 55 60

Glu Asp His Lys Lys Tyr Ser Ser Gln Thr Ser Gln Asp Ser Gly Asn

65 70 75 80

Tyr Ser Asn Glu Asp Glu Ser Glu Ser Lys Thr Ser Glu Glu Leu Gln

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Gln Asp Phe Val

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<211> 251

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 227

Lys Trp Ile Gly Tyr Ile Cys Leu Arg Asn Ser Leu Pro Lys Val Leu

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Asn Phe His Asn Phe Leu Ala Trp Pro Phe Pro Asn Leu Pro Pro Leu

20 25 30

Glu Ala Met Asp Met Val Glu Val Ile Tyr Ile Asn Arg Lys Lys Lys

35 40 45

Val Trp Asp Tyr Asn Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Ser Asp Thr Glu Ala

50 55 60

Ala Pro Arg Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Met His Gly Leu Thr Val

65 70 75 80

Arg Pro Leu Gly Gln Ala Ser Ala Thr Ser Thr Glu Ser Gln Leu Ile

85 90 95

Asp Pro Glu Ser Glu Glu Glu Pro Asp Leu Pro Glu Val Asp Val Glu

100 105 110

Leu Pro Thr Met Pro Lys Asp Ser Pro Gln Gln Leu Glu Leu Leu Ser

115 120 125

Gly Pro Cys Glu Arg Arg Lys Ser Pro Leu Gln Asp Pro Phe Pro Glu

130 135 140

Glu Asp Tyr Ser Ser Thr Glu Gly Ser Gly Gly Arg Ile Thr Phe Asn

145 150 155 160

Val Asp Leu Asn Ser Val Phe Leu Arg Val Leu Asp Asp Glu Asp Ser

165 170 175

Asp Asp Leu Glu Ala Pro Leu Met Leu Ser Ser His Leu Glu Glu Met

180 185 190

Val Asp Pro Glu Asp Pro Asp Asn Val Gln Ser Asn His Leu Leu Ala

195 200 205

Ser Gly Glu Gly Thr Gln Pro Thr Phe Pro Ser Pro Ser Ser Glu Gly

210 215 220

Leu Trp Ser Glu Asp Ala Pro Ser Asp Gln Ser Asp Thr Ser Glu Ser

225 230 235 240

Asp Val Asp Leu Gly Asp Gly Tyr Ile Met Arg

245 250

<210> 228

<211> 67

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IFNAR2 transcript variant 2 NM_000874_4

<400> 228

Lys Trp Ile Gly Tyr Ile Cys Leu Arg Asn Ser Leu Pro Lys Val Leu

1 5 10 15

Arg Gln Gly Leu Ala Lys Gly Trp Asn Ala Val Ala Ile His Arg Cys

20 25 30

Ser His Asn Ala Leu Gln Ser Glu Thr Pro Glu Leu Lys Gln Ser Ser

35 40 45

Cys Leu Ser Phe Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Lys Arg Ala Ser Leu Cys

50 55 60

Pro Ser Asp

65

<210> 229

<211> 223

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IFNGR1 NM_000416_2

<400> 229

Cys Phe Tyr Ile Lys Lys Ile Asn Pro Leu Lys Glu Lys Ser Ile Ile

1 5 10 15

Leu Pro Lys Ser Leu Ile Ser Val Val Arg Ser Ala Thr Leu Glu Thr

20 25 30

Lys Pro Glu Ser Lys Tyr Val Ser Leu Ile Thr Ser Tyr Gln Pro Phe

35 40 45

Ser Leu Glu Lys Glu Val Val Cys Glu Glu Pro Leu Ser Pro Ala Thr

50 55 60

Val Pro Gly Met His Thr Glu Asp Asn Pro Gly Lys Val Glu His Thr

65 70 75 80

Glu Glu Leu Ser Ser Ile Thr Glu Val Val Thr Thr Glu Glu Asn Ile

85 90 95

Pro Asp Val Val Pro Gly Ser His Leu Thr Pro Ile Glu Arg Glu Ser

100 105 110

Ser Ser Pro Leu Ser Ser Asn Gln Ser Glu Pro Gly Ser Ile Ala Leu

115 120 125

Asn Ser Tyr His Ser Arg Asn Cys Ser Glu Ser Asp His Ser Arg Asn

130 135 140

Gly Phe Asp Thr Asp Ser Ser Cys Leu Glu Ser His Ser Ser Leu Ser

145 150 155 160

Asp Ser Glu Phe Pro Pro Asn Asn Lys Gly Glu Ile Lys Thr Glu Gly

165 170 175

Gln Glu Leu Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Thr Ser Phe Gly Tyr Asp

180 185 190

Lys Pro His Val Leu Val Asp Leu Leu Val Asp Asp Ser Gly Lys Glu

195 200 205

Ser Leu Ile Gly Tyr Arg Pro Thr Glu Asp Ser Lys Glu Phe Ser

210 215 220

<210> 230

<211> 69

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: IFNGR2 transcript variant 1 NM_001329128_1

<400> 230

Leu Val Leu Lys Tyr Arg Gly Leu Ile Lys Tyr Trp Phe His Thr Pro

1 5 10 15

Pro Ser Ile Pro Leu Gln Ile Glu Glu Tyr Leu Lys Asp Pro Thr Gln

20 25 30

Pro Ile Leu Glu Ala Leu Asp Lys Asp Ser Ser Pro Lys Asp Asp Val

35 40 45

Trp Asp Ser Val Ser Ile Ile Ser Phe Pro Glu Lys Glu Gln Glu Asp

50 55 60

Val Leu Gln Thr Leu

65

<210> 231

<211> 271

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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275 280 285

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325 330 335

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340 345 350

Leu Leu Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Glu Lys Cys Gly Phe Gly Ala

355 360 365

Ser Ser Gly Glu Glu Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asp Leu Ile Pro Gly

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100 105 110

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115 120 125

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Gln Gly Gly Ser Ala Leu Gly His His Ser Pro Pro Glu Pro Glu Val

165 170 175

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180 185 190

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Ala Glu Gln Val Ser Arg Ala Leu Gln Pro Ala Leu Asp Ser Tyr Phe

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Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gln Gly Pro Val Ala Trp Phe His Ala

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275 280 285

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Gly Gly Leu Asp Gln Asp Gly Glu Ala Arg Pro Ala Leu Asp Gly Ser

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325 330 335

Asp Met Pro Arg Asp Ser Gly Ile Tyr Asp Ser Ser Val Pro Ser Ser

340 345 350

Glu Leu Ser Leu Pro Leu Met Glu Gly Leu Ser Thr Asp Gln Thr Glu

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Asn Ser Glu Ile Val Ser Phe Gly Ser Pro Cys Ser Ile Asn Ser Arg

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<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Linker

<400> 302

Gly Ser Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ala Ala Thr

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Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser

20

<210> 303

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: TRAF1, TRAF2, and TRAF3 consensus binding sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 303

Pro Xaa Gln Xaa Thr

1 5

<210> 304

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: TRAF2 consensus binding sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 304

Ser Xaa Xaa Glu

1

<210> 305

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: TRAF6 consensus binding sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 305

Gln Xaa Pro Xaa Glu Xaa

1 5

<210> 306

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Box1 motif

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 306

Pro Xaa Xaa Pro

1

<210> 307

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Shc phosphotyrosine-binding binding motif

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 307

Asn Xaa Xaa Tyr

1

<210> 308

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: STAT3 consensus binding sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 308

Tyr Xaa Xaa Gln

1

<210> 309

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: STAT5 recruitment sequence

<400> 309

Tyr Leu Pro Leu

1

<210> 310

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: STAT5 consensus recruitment sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa is phosphorylated tyrosine

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 310

Xaa Leu Xaa Leu

1

<210> 311

<211> 570

<212> PRT

<213> Influenza virus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(570)

<223> Influenze A HA from H1N1

<400> 311

Met Lys Ala Asn Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Leu Ala Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr

20 25 30

Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn

35 40 45

Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile

50 55 60

Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly

65 70 75 80

Asn Pro Glu Cys Asp Pro Leu Leu Pro Val Arg Ser Trp Ser Tyr Ile

85 90 95

Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Ile Cys Tyr Pro Gly Asp Phe

100 105 110

Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe

115 120 125

Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Asn

130 135 140

Thr Asn Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser His Glu Gly Lys Ser Ser Phe

145 150 155 160

Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Glu Gly Ser Tyr Pro Lys

165 170 175

Leu Lys Asn Ser Tyr Val Asn Lys Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu

180 185 190

Trp Gly Ile His His Pro Pro Asn Ser Lys Glu Gln Gln Asn Leu Tyr

195 200 205

Gln Asn Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Thr Ser Asn Tyr Asn Arg

210 215 220

Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Glu Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Ala

225 230 235 240

Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile

245 250 255

Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Met Tyr Ala Phe Ala

260 265 270

Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser Met

275 280 285

His Glu Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Ser

290 295 300

Ser Leu Pro Tyr Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro

305 310 315 320

Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn

325 330 335

Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly

340 345 350

Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly

355 360 365

Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala

370 375 380

Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val

385 390 395 400

Asn Thr Val Ile Glu Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys

405 410 415

Glu Phe Asn Lys Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val

420 425 430

Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val

435 440 445

Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys

450 455 460

Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu

465 470 475 480

Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys

485 490 495

Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu

500 505 510

Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Val Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser

515 520 525

Met Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser

530 535 540

Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser

545 550 555 560

Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565 570

<210> 312

<211> 470

<212> PRT

<213> Influenza virus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(470)

<223> Influenze A NA from H10N7

<400> 312

Met Asn Pro Asn Gln Lys Leu Phe Ala Leu Ser Gly Val Ala Ile Ala

1 5 10 15

Leu Ser Ile Leu Asn Leu Leu Ile Gly Ile Ser Asn Val Gly Leu Asn

20 25 30

Val Ser Leu His Leu Lys Gly Ser Ser Asp Gln Asp Lys Asn Trp Thr

35 40 45

Cys Thr Ser Val Thr Gln Asn Asn Thr Thr Leu Ile Glu Asn Thr Tyr

50 55 60

Val Asn Asn Thr Thr Val Ile Asn Lys Gly Thr Gly Thr Thr Lys Gln

65 70 75 80

Asn Tyr Leu Met Leu Asn Lys Ser Leu Cys Lys Val Glu Gly Trp Val

85 90 95

Val Val Ala Lys Asp Asn Ala Ile Arg Phe Gly Glu Ser Glu Gln Ile

100 105 110

Ile Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Leu Gly Cys Lys

115 120 125

Met Tyr Ala Leu His Gln Gly Thr Thr Ile Arg Asn Lys His Ser Asn

130 135 140

Gly Thr Ile His Asp Arg Thr Ala Phe Arg Gly Leu Ile Ser Thr Pro

145 150 155 160

Leu Gly Ser Pro Pro Val Val Ser Asn Ser Asp Phe Leu Cys Val Gly

165 170 175

Trp Ser Ser Thr Ser Cys His Asp Gly Ile Gly Arg Met Thr Ile Cys

180 185 190

Val Gln Gly Asn Asn Asn Asn Ala Thr Ala Thr Val Tyr Tyr Asp Arg

195 200 205

Arg Leu Thr Thr Thr Ile Lys Thr Trp Ala Gly Asn Ile Leu Arg Thr

210 215 220

Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys His Asn Gly Thr Cys Val Val Ile Met

225 230 235 240

Thr Asp Gly Ser Ala Ser Ser Gln Ala His Thr Lys Val Leu Tyr Phe

245 250 255

His Lys Gly Leu Val Ile Lys Glu Glu Ala Leu Lys Gly Ser Ala Arg

260 265 270

His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Gly His Asn Ser Lys Val Thr Cys

275 280 285

Val Cys Arg Asp Asn Trp Gln Gly Ala Asn Arg Pro Val Ile Glu Ile

290 295 300

Asp Met Asn Ala Met Glu His Thr Ser Gln Tyr Leu Cys Thr Gly Val

305 310 315 320

Leu Thr Asp Thr Ser Arg Pro Ser Asp Lys Ser Met Gly Asp Cys Asn

325 330 335

Asn Pro Ile Thr Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Phe Gly

340 345 350

Phe Leu Asp Ser Asp Asn Thr Trp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Pro Arg

355 360 365

Ser Arg Ser Gly Phe Glu Met Leu Lys Ile Pro Asn Ala Gly Thr Asp

370 375 380

Pro Asn Ser Arg Ile Thr Glu Arg Gln Glu Ile Val Asp Asn Asn Asn

385 390 395 400

Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Ile Asp Tyr Trp Asp Glu Ser Ser

405 410 415

Val Cys Tyr Asn Pro Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro

420 425 430

Glu Glu Ala Lys Tyr Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Leu Val Ala Leu

435 440 445

Cys Gly Ser Pro Ile Ser Val Gly Ser Gly Ser Phe Pro Asp Gly Ala

450 455 460

Gln Ile Gln Tyr Phe Ser

465 470

<210> 313

<211> 523

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: MV(ed)-F-delta-30

<400> 313

Met Ser Ile Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala

1 5 10 15

Val Leu Leu Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Asn

20 25 30

Leu Ser Lys Ile Gly Val Val Gly Ile Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val

35 40 45

Met Thr Arg Ser Ser His Gln Ser Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn

50 55 60

Ile Thr Leu Leu Asn Asn Cys Thr Arg Val Glu Ile Ala Glu Tyr Arg

65 70 75 80

Arg Leu Leu Arg Thr Val Leu Glu Pro Ile Arg Asp Ala Leu Asn Ala

85 90 95

Met Thr Gln Asn Ile Arg Pro Val Gln Ser Val Ala Ser Ser Arg Arg

100 105 110

His Lys Arg Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val

115 120 125

Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Met

130 135 140

Leu Asn Ser Gln Ala Ile Asp Asn Leu Arg Ala Ser Leu Glu Thr Thr

145 150 155 160

Asn Gln Ala Ile Glu Ala Ile Arg Gln Ala Gly Gln Glu Met Ile Leu

165 170 175

Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Ile Pro Ser

180 185 190

Met Asn Gln Leu Ser Cys Asp Leu Ile Gly Gln Lys Leu Gly Leu Lys

195 200 205

Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Leu Phe Gly Pro Ser Leu

210 215 220

Arg Asp Pro Ile Ser Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala

225 230 235 240

Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys Val Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser Gly

245 250 255

Gly Asp Leu Leu Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile

260 265 270

Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr Phe Ile Val Leu Ser Ile Ala Tyr

275 280 285

Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly

290 295 300

Val Ser Tyr Asn Ile Gly Ser Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Val Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Ser Ser

325 330 335

Cys Thr Phe Met Pro Glu Gly Thr Val Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr

340 345 350

Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln Glu Cys Leu Arg Gly Ser Thr Lys Ser

355 360 365

Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly Ser Phe Gly Asn Arg Phe Ile Leu

370 375 380

Ser Gln Gly Asn Leu Ile Ala Asn Cys Ala Ser Ile Leu Cys Lys Cys

385 390 395 400

Tyr Thr Thr Gly Thr Ile Ile Asn Gln Asp Pro Asp Lys Ile Leu Thr

405 410 415

Tyr Ile Ala Ala Asp His Cys Pro Val Val Glu Val Asn Gly Val Thr

420 425 430

Ile Gln Val Gly Ser Arg Arg Tyr Pro Asp Ala Val Tyr Leu His Arg

435 440 445

Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp Val Gly Thr

450 455 460

Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys Glu Leu Leu

465 470 475 480

Glu Ser Ser Asp Gln Ile Leu Arg Ser Met Lys Gly Leu Ser Ser Thr

485 490 495

Ser Ile Val Tyr Ile Leu Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly

500 505 510

Ile Pro Ala Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg

515 520

<210> 314

<211> 599

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: MV(ed)-H-delta-18

<400> 314

Met Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg

1 5 10 15

Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Ser Leu Ser Leu Ile

20 25 30

Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr

35 40 45

Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val Thr Asn

50 55 60

Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile

65 70 75 80

Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr Asp Leu

85 90 95

Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu

100 105 110

Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu Arg Ile

115 120 125

Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu Glu Leu

130 135 140

Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Asn

145 150 155 160

Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr Thr Ile

165 170 175

Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Leu

180 185 190

Ser Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser Gln Gly

195 200 205

Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser Ser Lys

210 215 220

Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu Val Gly

225 230 235 240

Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met Thr Asn

245 250 255

Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met Val Ala

260 265 270

Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp Ser Ile

275 280 285

Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln Leu Val

290 295 300

Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp Val Pro

305 310 315 320

Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His

325 330 335

Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro Thr Thr

340 345 350

Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln Ala Cys

355 360 365

Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu

370 375 380

Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp Leu Ser

385 390 395 400

Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu

405 410 415

Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn

420 425 430

Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Val

435 440 445

Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro Asn Leu

450 455 460

Phe Thr Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Glu Asp Cys His Ala Pro Thr

465 470 475 480

Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser Asn Leu

485 490 495

Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr Tyr Asp

500 505 510

Thr Ser Arg Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser Pro Gly

515 520 525

Arg Ser Phe Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Val

530 535 540

Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys Leu Trp

545 550 555 560

Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly His Ile

565 570 575

Thr His Ser Gly Met Val Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val Thr Arg

580 585 590

Glu Asp Gly Thr Asn Arg Arg

595

<210> 315

<211> 593

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: MV(ed)-H-delta-24

<400> 315

Met Asn Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg Pro Tyr Val Leu Leu Ala

1 5 10 15

Val Leu Phe Val Met Ser Leu Ser Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ile Ala

20 25 30

Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr Thr Ala Glu Ile His Lys

35 40 45

Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val Thr Asn Ser Ile Glu His Gln Val

50 55 60

Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly

65 70 75 80

Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr Asp Leu Val Lys Phe Ile Ser Asp

85 90 95

Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Leu

100 105 110

Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu Arg Ile Lys Leu Asp Tyr Asp Gln

115 120 125

Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu Glu Leu Met Asn Ala Leu Val Asn

130 135 140

Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Asn Gln Phe Leu Ala Val Ser

145 150 155 160

Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr Thr Ile Arg Gly Gln Phe Ser Asn

165 170 175

Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Val

180 185 190

Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser Gln Gly Met Tyr Gly Gly Thr Tyr

195 200 205

Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser Ser Lys Arg Ser Glu Leu Ser Gln

210 215 220

Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu Val Gly Val Ile Arg Asn Pro Gly

225 230 235 240

Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met Thr Asn Tyr Leu Glu Gln Pro Val

245 250 255

Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met Val Ala Leu Gly Glu Leu Lys Leu

260 265 270

Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp Ser Ile Thr Ile Pro Tyr Gln Gly

275 280 285

Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln Leu Val Lys Leu Gly Val Trp Lys

290 295 300

Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp Val Pro Leu Ser Thr Asp Asp Pro

305 310 315 320

Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His Arg Gly Val Ile Ala Asp

325 330 335

Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro Thr Thr Arg Thr Asp Asp Lys Leu

340 345 350

Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln Ala Cys Lys Gly Lys Ile Gln Ala

355 360 365

Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu Lys Asp Asn Arg Ile Pro

370 375 380

Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp Leu Ser Leu Thr Val Glu Leu Lys

385 390 395 400

Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu Ile Thr His Gly Ser Gly

405 410 415

Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn Val Tyr Trp Leu Thr Ile

420 425 430

Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Val Ile Asn Thr Leu Glu Trp

435 440 445

Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro Asn Leu Phe Thr Val Pro Ile Lys

450 455 460

Glu Ala Gly Glu Asp Cys His Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Val

465 470 475 480

Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser Asn Leu Val Ile Leu Pro Gly Gln

485 490 495

Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr Tyr Asp Thr Ser Arg Val Glu His

500 505 510

Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser Pro Gly Arg Ser Phe Ser Tyr Phe

515 520 525

Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Val Pro Ile Glu Leu Gln Val

530 535 540

Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys Leu Trp Cys Arg His Phe Cys Val

545 550 555 560

Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly His Ile Thr His Ser Gly Met Val

565 570 575

Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val Thr Arg Glu Asp Gly Thr Asn Arg

580 585 590

Arg

<210> 316

<211> 477

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: hGH polyA

<400> 316

gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60

gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120

ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180

acctgtaggg cctgcggggt ctgttgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 240

ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 300

ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 360

ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 420

tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtcctt 477

<210> 317

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: SPA1

<400> 317

aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49

<210> 318

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: SPA2

<400> 318

aataaaatat ctcagagctc tagacatctg tgtgttggtt ttttgtgtgt agtaatgagg 60

atctggagat attgaagtat cttccggacg actaacagct gtcattggcg gatcttaata 120

<210> 319

<211> 295

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: b-globin polyA spacer B

<400> 319

atctcaagag tggcagcggt cttgagtggc agcggcggta tacggcagcg gcatgtaact 60

agctcctcag tggcagcgat gaggaggcaa taaaggaaat tgattttcat tgcaatagtg 120

tgttggaatt ttttgtgtct ctcaaggttc tgttaagtaa ctgaacccaa tgtcgttagt 180

gacgcttagc tcttaagagg tcactgacct aacaatctca agagtggcag cggtcttgag 240

tggcagcggc ggtatacggc agcgctatct aagtagtaac aagtagcgtg gggca 295

<210> 320

<211> 512

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: b-globin polyA spacer A

<400> 320

acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 60

ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 120

cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 180

gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttaa taaaggaaat 240

tgattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcacacgta gtgggccatc 300

gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttcg atagtggact 360

cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg 420

gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 480

gaattttaac aaaatattaa cgcttagaat tt 512

<210> 321

<211> 243

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: 250 cHS4 insulator v1

<400> 321

gagctcacgg ggacagcccc cccccaaagc ccccagggat gtaattacgt ccctcccccg 60

ctagggggca gcagcgagcc gcccggggct ccgctccggt ccggcgctcc ccccgcatcc 120

ccgagccggc agcgtgcggg gacagcccgg gcacggggaa ggtggcacgg gatcgctttc 180

ctctgaacgc ttctcgctgc tctttgagcc tgcagacacg tggggggata cggggaaaag 240

ctt 243

<210> 322

<211> 243

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: 250 cHS4 insulator v2

<400> 322

gagctcacgg ggacagcccc cccccaaagc ccccagggat gtaattacgt ccctcccccg 60

ctagggggca gcagcgagcc gcccggggct ccgctccggt ccggcgctcc ccccgcatcc 120

ccgagccggc agcgtgcggg gacagcccgg gcacggggaa ggtggcacgg gatcgctttc 180

ctctgaacgc ttctcgctgc tctttgagcg tgcagacacg tggggggata cggggaaaag 240

ctt 243

<210> 323

<211> 650

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: 650 cHS4 insulator

<400> 323

gagctcacgg ggacagcccc cccccaaagc ccccagggat gtaattacgt ccctcccccg 60

ctagggggca gcagcgagcc gcccggggct ccgctccggt ccggcgctcc ccccgcatcc 120

ccgagccggc agcgtgcggg gacagcccgg gcacggggaa ggtggcacgg gatcgctttc 180

ctctgaacgc ttctcgctgc tctttgagca tgcagacaca tggggggata cggggaaaaa 240

gctttaggct ctgcatgttt gatggtgtat ggatgcaagc agaaggggtg gaagagcttg 300

cctggagaga tacagctggg tcagtaggac tgggacaggc agctggagaa ttgccatgta 360

gatgttcata caatcgtcaa atcatgaagg ctggaaaagc cctccaagat ccccaagacc 420

aaccccaacc cacccagcgt gcccactggc catgtccctc agtgccacat ccccacagtt 480

cttcatcacc tccagggacg gtgacccccc cacctccgtg ggcagctgtg ccactgcagc 540

accgctcttt ggagaagata aatcttgcta aatccagccc gaccctcccc tggcacaaca 600

taaggccatt atctctcatc caactccagg acggagtcag tgagaatatt 650

<210> 324

<211> 420

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: 400 cHS4 insulator

<400> 324

gagctcacgg ggacagcccc cccccaaagc ccccagggat gtaattacgt ccctcccccg 60

ctagggggca gcagcgagcc gcccggggct ccgctccggt ccggcgctcc ccccgcatcc 120

ccgagccggc agcgtgcggg gacagcccgg gcacggggaa ggtggcacgg gatcgctttc 180

ctctgaacgc ttctcgctgc tctttgagca tgcagacaca tggggggata cggggaaaaa 240

gctttaggct gaaagagaga tttagaatga cagaatcata gaacggcctg ggttgcaaag 300

gagcacagtg ctcatccaga tccaaccccc tgctatgtgc agggtcatca accagcagcc 360

caggctgccc agagccacat ccagcctggc cttgaatgcc tgcagggatg gggcatccac 420

<210> 325

<211> 949

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: 650 cHS4 insulator and b-globin polyA spacer B

<400> 325

gagctcacgg ggacagcccc cccccaaagc ccccagggat gtaattacgt ccctcccccg 60

ctagggggca gcagcgagcc gcccggggct ccgctccggt ccggcgctcc ccccgcatcc 120

ccgagccggc agcgtgcggg gacagcccgg gcacggggaa ggtggcacgg gatcgctttc 180

ctctgaacgc ttctcgctgc tctttgagca tgcagacaca tggggggata cggggaaaaa 240

gctttaggct ctgcatgttt gatggtgtat ggatgcaagc agaaggggtg gaagagcttg 300

cctggagaga tacagctggg tcagtaggac tgggacaggc agctggagaa ttgccatgta 360

gatgttcata caatcgtcaa atcatgaagg ctggaaaagc cctccaagat ccccaagacc 420

aaccccaacc cacccagcgt gcccactggc catgtccctc agtgccacat ccccacagtt 480

cttcatcacc tccagggacg gtgacccccc cacctccgtg ggcagctgtg ccactgcagc 540

accgctcttt ggagaagata aatcttgcta aatccagccc gaccctcccc tggcacaaca 600

taaggccatt atctctcatc caactccagg acggagtcag tgagaatatt gcgatgcccc 660

acgctacttg ttactactta gatagcgctg ccgtataccg ccgctgccac tcaagaccgc 720

tgccactctt gagattgtta ggtcagtgac ctcttaagag ctaagcgtca ctaacgacat 780

tgggttcagt tacttaacag aaccttgaga gacacaaaaa attccaacac actattgcaa 840

tgaaaatcaa tttcctttat tgcctcctca tcgctgccac tgaggagcta gttacatgcc 900

gctgccgtat accgccgctg ccactcaaga ccgctgccac tcttgagat 949

<210> 326

<211> 949

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: b-globin polyA spacer B and 650 cHS4 insulator

<400> 326

atctcaagag tggcagcggt cttgagtggc agcggcggta tacggcagcg gcatgtaact 60

agctcctcag tggcagcgat gaggaggcaa taaaggaaat tgattttcat tgcaatagtg 120

tgttggaatt ttttgtgtct ctcaaggttc tgttaagtaa ctgaacccaa tgtcgttagt 180

gacgcttagc tcttaagagg tcactgacct aacaatctca agagtggcag cggtcttgag 240

tggcagcggc ggtatacggc agcgctatct aagtagtaac aagtagcgtg gggcatcgcg 300

agctcacggg gacagccccc ccccaaagcc cccagggatg gtcgtacgtc cctcccccgc 360

tagggggcag cagcgagccg cccggggctc cgctccggtc cggcgctccc cccgcatccc 420

cgagccggca gcgtgcgggg acagcccggg cacggggaag gtggcacggg atcgctttcc 480

tctgaacgct tctcgctgct ctttgagcat gcagacacat ggggggatac ggggaaaaag 540

ctttaggctc tgcatgtttg atggtgtatg gatgcaagca gaaggggtgg aagagcttgc 600

ctggagagat acagctgggt cagtaggact gggacaggca gctggagaat tgccatgtag 660

atgttcatac aatcgtcaaa tcatgaaggc tggaaaagcc ctccaagatc cccaagacca 720

accccaaccc acccagcgtg cccactggcc atgtccctca gtgccacatc cccacagttc 780

ttcatcacct ccagggacgg tgaccccccc acctccgtgg gcagctgtgc cactgcagca 840

ccgctctttg gagaagataa atcttgctaa atccagcccg accctcccct ggcacaacat 900

aaggccatta tctctcatcc aactccagga cggagtcagt gagaatatt 949

<210> 327

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Kozak sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> nnn, if present, is GCC

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is A or G

<400> 327

nnngccgccn ccatg 15

<210> 328

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Kozak sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is T or U

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n, if present, is G

<400> 328

ccaccangn 9

<210> 329

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Kozak-type sequence 2

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is T or U

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n, if present, is G

<400> 329

ccgccangn 9

<210> 330

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Kozak-type sequence 3

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is T or U

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n, if present, is G

<400> 330

gccgccgcca ngn 13

<210> 331

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Kozak sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is T or U

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n, if present, is G

<400> 331

gccgccacca ngn 13

<210> 332

<211> 12

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: Kozak sequence

<400> 332

gccgccacca ug 12

<210> 333

<211> 28

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(28)

<223> SIBR (synthetic inhibitory BIC-derived RNA)

<400> 333

ctggaggctt gctgaaggct gtatgctg 28

<210> 334

<211> 45

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> 3? microRNA flanking sequence of miR-155

<400> 334

caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcc 45

<210> 335

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: synthetic DNA encoding stem

<400> 335

gttttggcca ctgactgac 19

<210> 336

<211> 511

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: VSV-G envelope protein

<400> 336

Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys

1 5 10 15

Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn

20 25 30

Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Leu Asn Trp

35 40 45

His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Leu Gln Val Lys Met Pro Lys Ser

50 55 60

His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp

65 70 75 80

Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His

85 90 95

Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile

100 105 110

Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln

115 120 125

Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln

130 135 140

Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val

145 150 155 160

Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr

165 170 175

Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu

180 185 190

Cys Asp Ser Asn Leu Ile Ser Met Asp Ile Thr Phe Phe Ser Glu Asp

195 200 205

Gly Glu Leu Ser Ser Leu Gly Lys Glu Gly Thr Gly Phe Arg Ser Asn

210 215 220