肽的苦味遮蔽

肽，无论是天然存在的、人工合成的，还是通过酸性、碱性或酶催蛋白水解获得的，均广泛用于营养和药用领域。有些肽为苦味的且因此会降低产品的接受度。苦味为由特定的氨基酸序列与舌头上特定的苦味感受器结合而产生的。因此，并非所有的肽均具有苦味且苦的程度取决于不同的蛋白来源和不同的蛋白水解模式(Bumberger E.and Belitz H.-D.1993)。肽已经变得非常流行，特别是作为功能性成分和生物活性物质(Hartmann R.andMeisel H.2007)。然而，由于它们对其作为或包括在其中的产品的风味的影响，它们的使用目前受限。

已经采取了许多方法来降低苦味，例如使用α-环糊精，然而需要大过量的α-环糊精，但由于肽过大而无法由α-环糊精遮蔽，因此降低苦味的效果非常有限(Tamura M.等，1990)。还建议淀粉来遮蔽苦味，因为肽可以并入淀粉结构中且因此不能被舌头上的苦味感受器达到。该方法可以降低苦味，但使肽进入淀粉核心的方法包括过夜加热至100℃且因此该方法不容易推广(Tamura M.等，1990)。还使用乙酰化来降低苦味，然而，该类方法会导致新成分(乙酰化肽)，其要求单独的监管注册且被认为是一种更化学的化合物，不能被正在进行成分的清洁标签改变的健康功能食品接受，而且乙酰化肽仅通向要标记更多化学成分的另一方向。

除了苦味遮蔽的接受度和有效性之外，几种已知方法也改变了遮蔽肽的活性，使得它们不再提供所需生物活性或放任了其各自应用的其它所需性能。

因此，本发明的目的为提供苦味降低且不损失肽活性的掩蔽肽。

令人惊奇地发现该目的通过如下肽而解决，该肽与至少一种选自葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、纤维素二糖、甘油醛、核糖、木糖和甘露糖的还原糖共轭且共轭度为至少10％，并且经共轭的蛋白仅具有低于6的加德纳增量。共轭度定义为：

共轭度＝[(OPA-N

OPA-N

共轭肽的苦味比不经引发共轭过程的肽和糖的组合低。因此，味道遮蔽不是由糖的甜味引起的，而是由特定的共轭反应引起的。共轭度以共轭胺基相对于肽链上游离胺基的比值来测量。

根据本发明，应用了一种在食品制备过程如烘烤和油炸(称为美拉德反应)中发生的方法。优点为还原糖通常用于许多食品制剂中且美拉德反应不会以要求新的监管注册或声明的方式影响肽的活性和化学结构的方式改变其。美拉德反应为由肽上的氨基与还原糖上的羰基的缩合引发的，导致希夫碱形成并重排为Amadori和Heyns产物(Lund M.N.andRay C.A.2017)。还原糖为任何可以用作还原剂的糖，因为它具有游离的醛基或游离的酮基(Pratt C.W.and Cornely K.2013)。该过程可以通过控制例如pH值、温度和反应时间控制(Lund M.N.and Ray C.A.2017)。美拉德反应可以在溶液/分散体中或在干燥状态下进行(Lund M.N.and Ray C.A.2017)。最佳策略总是具有非常高浓度的具有还原端的糖和肽。根据本发明，仅达到美拉德反应的第一阶段，并且在显示美拉德反应所典型的强褐色和风味之前停止该过程。

共轭度和美拉德反应的延伸为不相同的，因为共轭度表示多少肽的胺基与糖反应，而美拉德反应的延伸表示美拉德反应的阶段，美拉德反应最终导致显示褐色和各种风味。根据本发明，这些副风味为不想要的，而和美拉德反应的初始阶段导致无色且无风味的糖和肽的共轭。美拉德反应的延伸可以用加德纳值测量(见方法部分)，该值决定了褐色显示的存在和延伸。因为一些肽已经具有天然的颜色，所以美拉德反应前相对于美拉德反应后的加德纳值的增量用于测量美拉德反应的延伸。

根据本发明，还原糖选自葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、纤维素二糖、甘油醛、核糖、木糖和甘露糖。还可使用还原糖的混合物，特别是由淀粉水解产生的那些，如包含不同的葡萄糖的单糖、二糖至低聚糖的分子的麦芽糊精。

在一个实施方案中，仅轻微的加德纳值增量(加德纳增量)为可接受的，并且加德纳增量低于4，优选低于3。这意指根据该实施方案，不存在大多与美拉德反应相关的典型的共轭物的美拉德褐化。这仅为共轭而没有褐化和焙烧风味产生。

在一个优选实施方案中，共轭度为至少15％，优选至少20％、25％、30％、35％或40％。较高的共轭度允许较高的苦味降低。必要度和期望的苦味降低取决于肽的单独苦味。

未共轭肽可以为天然存在的、合成制备的或通过酸性、碱性或酶催蛋白水解获得的。优选地，肽为蛋白水解物，优选源自植物或动物蛋白，特别是选自小麦、大豆、稻、马铃薯、豌豆、向日葵、油菜籽、羽扇豆和乳蛋白，优选选自酪蛋白和豌豆蛋白中的至少一种。各水解物的苦味还取决于水解方式和水解物的水解程度或MW。

优选地，肽由通过酶，特别是内肽酶，优选碱性蛋白酶水解的蛋白产生。水解的方式如酶催或化学水解会导致水解物的性质不同，例如不同的MW或对具有相同MW的水解物而言不同的肽性质。通常化学水解会导致更大的MW肽，且酶催水解会导致更特殊和更短的MW肽。

根据一个具体实施方案，蛋白水解物在水解后不经过滤和/或用选自柠檬酸、磷酸、盐酸、乳酸和硫酸的酸中和pH值。

根据一个实施方案，共轭度为10-90％，优选15-70％，更优选20-50％，特别是25-40％。过高的共轭度可能导致共轭物的颜色较深或烧焦或焦糖化风味。优选的最大共轭度取决于糖和肽的单独组合。

在一个具体实施方案中，肽的最大分子量为2300Da，优选2000、1500、1200、1000或900Da。

在另一实施方案中，肽的最小分子量为650Da，优选660、670、680、690、700、710、720、750或800Da。

优选地，肽的分子量为650-2400Da，优选650-1000Da。

根据本发明的MW为通过测量OPA-N(Frister H.等，1988)测定的平均表观MW值，如下文在方法部分中所述。

优选地，还原糖与肽的摩尔比为0.5-20，优选1.1-1.7。对于作为还原糖的葡萄糖，肽与还原糖的重量比为90:10至60:40，优选80:20至70:30。糖的量越高，共轭肽的苦味越低，因为更多导致苦味的基团可与还原糖反应。因此，较多苦味肽的糖的量比较少苦味肽高，并将根据单独的苦味调整。

优选地，共轭肽为固体、颗粒形式，优选粉末形式，特别是喷雾干燥或冻干的形式。

优选地，共轭肽的溶解度为至少90％，优选至少91、92、93、94、95、95、97、98或99％，特别是100％。肽的溶解度为许多应用的基本特征，因为仅溶解的肽可在应用组合物中提供其性能。

本发明还提供了一种遮蔽肽苦味的方法，包括以下步骤：使肽和选自葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、纤维素二糖、甘油醛、核糖、木糖和甘露糖的还原糖混合，优选在溶液或分散体中，加热混合物以在两种组分之间进行美拉德反应，其中美拉德反应在55-90℃，优选60-85℃的温度下，特别是在65℃+/-3℃下进行20-120分钟，优选30-60分钟的时间，且此后美拉德反应通过喷雾干燥组合物停止且获得粉末。优选地，肽为经水解的蛋白。

在本发明的一个替换实施方案中，共轭在干燥状态下进行，并且将由肽和还原糖的粉末组成的混合物在25-60℃的温度和60-80％的升高的相对湿度下储存几天或几周。

优选的反应的参数范围一起允许控制反应不形成显现出无褐色并且不具有焦糖化或烧焦的味道的最终产品(Lund M.N.and Ray C.A.2017)。褐色和焦糖化风味在一些特定食品中可能为期望的，但它限制了应用，且对大多数应用而言并不是有利的。可以由表1看出，对于美拉德反应而言，为了获得足够的苦味降低，温度越高，时间越短，且温度越低，时间越长。

根据本发明的方法，优选仅达到美拉德反应的第一阶段，并且在形成强褐色之前停止该过程。

根据本发明的方法不同于在食品制备过程如直接烘焙过程中发生的美拉德反应，因为在食品应用如烘焙产品中肽和还原糖的浓度不足够高以导致在共轭肽时广泛和良好控制的反应和至少10％的足够共轭程度。

优选进行美拉德反应直至获得至少10％，优选至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的共轭度。充分遮蔽苦味所必需的共轭度取决于单独肽的苦味。

共轭度和美拉德反应的延伸为不相同的，因为共轭度表示多少肽的胺基与糖反应，而美拉德反应的延伸表示美拉德反应的阶段，美拉德反应最终导致显示褐色和各种风味。根据本发明，这些副风味为不想要的，而和美拉德反应的初始阶段导致无色且无风味的糖和肽的共轭。美拉德反应的延伸可以用加德纳值测量(见方法部分)，该值决定了褐色显示的存在和延伸。因为一些肽已经具有天然的颜色，所以美拉德反应前相对于美拉德反应后的加德纳值的增量用于测量美拉德反应的延伸。根据本发明，仅轻微的加德纳值增量(加德纳增量)为可接受的。在一个实施方案中，加德纳增量低于6，优选低于4，特别是低于3。

在一个优选实施方案中，还原糖与肽的摩尔比为0.5-20，优选1.1-1.7。对于作为还原糖的葡萄糖，肽与还原糖的重量比为90:10至60:40，优选80:20至70:30。糖的量越高，共轭肽的苦味越低，因为更多导致苦味的基团可与还原糖反应。因此，较多苦味肽的糖的量比较少苦味肽高，并将根据单独的苦味调整。

优选地，美拉德反应在7-9，优选8-8,5的pH值下进行。

在一个优选实施方案中，美拉德反应在具有高浓度的肽和具有还原端的糖的溶液中进行，然后将材料喷雾干燥以停止反应并形成粉末。

肽优选为水解蛋白，其中水解为由酶，特别是由内肽酶，优选碱性蛋白酶进行的。水解的方式如酶催或化学水解会导致水解物的性质不同，即使肽包含相同的氨基酸序列。

根据一个具体实施方案，蛋白水解物在水解后不经过滤和/或用选自柠檬酸、磷酸、盐酸、乳酸和硫酸的酸中和pH值。

本发明还提供了一种制备无苦味共轭蛋白水解物的方法，包括以下步骤：用至少一种酶水解至少一种蛋白，使所得蛋白水解物和至少一种选自葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、纤维素二糖、甘油醛、核糖、木糖和甘露糖的还原糖混合，优选在溶液或分散体中，加热混合物以在两种组分之间进行美拉德反应，其中美拉德反应在为55-90℃，优选60-85℃的温度下，特别是在65℃+/-3℃下进行20-120分钟，优选30-60分钟的时间，且此后美拉德反应通过喷雾干燥组合物停止且获得蛋白水解物的无苦味粉末。

优选的反应的参数范围一起允许控制反应不形成显现出无褐色并且不具有焦糖化或烧焦的味道的最终产品(Lund M.N.and Ray C.A.2017)。褐色和焦糖化风味在一些特定食品中可能为期望的，但它限制了应用，且对大多数应用而言并不是有利的。可以由表1看出，对于美拉德反应而言，为了获得足够的苦味降低，温度越高，时间越短，且温度越低，时间越长。

根据本发明，仅达到美拉德反应的第一阶段，并且在显示美拉德反应所典型的强褐色和风味之前停止该过程。

优选地，蛋白由内肽酶，优选碱性蛋白酶水解。水解的方式如酶催或化学水解会导致水解物的性质不同，即使所得肽包含相同的氨基酸序列。

根据一个具体实施方案，蛋白水解物在水解后不经过滤而使用和/或通过向水解物中加入选自柠檬酸、磷酸、盐酸、乳酸和硫酸的酸中和pH值。

优选进行美拉德反应足够时间，直至获得至少10％，优选至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的共轭度。充分遮蔽苦味所必需的共轭度及随即必要时间和温度取决于单独肽的苦味。

优选地，美拉德反应在7-9，优选8-8，5的pH值下进行。

共轭度和美拉德反应的延伸为不相同的，因为共轭度表示多少肽的胺基与糖反应，而美拉德反应的延伸表示美拉德反应的阶段，美拉德反应最终导致显示褐色和各种风味。根据本发明，这些副风味为不想要的，而和美拉德反应的初始阶段导致无色且无风味的糖和肽的共轭。美拉德反应的延伸可以用加德纳值测量(见方法部分)，该值决定了褐色显示的存在和延伸。因为一些肽已经具有天然的颜色，所以美拉德反应前相对于美拉德反应后的加德纳值的增量用于测量美拉德反应的延伸。根据本发明，仅轻微的加德纳值增量(加德纳增量)为可接受的。在一个实施方案中，加德纳增量低于6，优选低于4，特别是低于3。

在一个优选实施方案中，还原糖与肽的摩尔比为0.5-20，优选1.1-1.7。对于作为还原糖的葡萄糖，肽与还原糖的重量比为90:10至60:40，优选80:20至70:30。糖的量越高，共轭肽的苦味越低，因为更多导致苦味的基团可与还原糖反应。因此，较多苦味肽的糖的量比较少苦味肽高，并将根据单独的苦味调整。

在一个优选实施方案中，美拉德反应在具有高浓度的肽和具有还原端的糖的溶液中进行，然后将材料喷雾干燥以停止反应并形成粉末。

本发明还提供了根据本发明的第一实施方案的共轭肽或根据本发明第三、上述实施方案的方法可获得的共轭蛋白水解物在食品产品，优选饮料，烘焙产品、口香糖、运动营养、膳食补充剂、糖果、甜点、食品泡沫或益生菌中，在药用产品、生物活性物质或动物饲料产品中的用途。

实施例

试验C1-C6和P1的结果显示通过使肽与还原糖共轭可以显著降低苦味。在苦味与共轭度之间具有明显的相关性。糖的量越大导致苦味越小且反应温度越高导致苦味越小。

表1.共轭的反应条件和酪蛋白与豌豆蛋白水解物的共轭物的苦味评价

蛋白水解物

将21，15kg自来水加热至60℃且在整个水解时间内保持该温度。加入182g作为20％的NaOH溶液的NaOH。将6，93kg酪蛋白分散于温水中并使用20％的NaOH溶液将pH值调节至9，0。加入87g Alcalase，搅拌材料30分钟，同时缓慢加入10，42g酪蛋白，同时pH值保持在9，0。加入87gAlcalase，并使用20％的NaOH溶液将pH值在8，5下保持恒定60分钟。搅拌60分钟，同时在最后60分钟内pH值保持恒定，最终pH值为约pH7，9。通过加热至80-84℃停止酶催反应并保持该温度15分钟。将溶液喷雾干燥以形成酪蛋白水解物粉末，将其用于共轭。

豌豆蛋白水解物以商品购得。

肽的共轭

将70-90g蛋白水解物溶于86-110g水中，在65或85℃下向溶液中加入10-30g葡萄糖并用NaOH将pH值调节至8或8.5。在用NaOH保持pH值恒定的同时，搅拌该体系。在30或60分钟后，将该体系喷雾干燥以形成粉末。

测量美拉德反应的延伸(加德纳增量)

制备5重量％的肽和共轭肽的水溶液，用0，2μm的Whatman过滤器(红边注射器过滤器)过滤溶液，以移除任何会影响测量的浑浊。加德纳值使用LICO 500(Hach Lange，Rheineck，瑞士)以11mm比色杯测量。根据方法ISO 4630:2015进行测量。加德纳值的增量为美拉德反应前后加德纳值的差异。

加德纳

共轭度

将OPA-N值除以总氮量，即游离氨基除以所有氨基酸的总氮量。然后计算该比值在共轭后的降低百分比。

共轭度＝[(OPA-N

OPA-N

为了测量样品中的共轭度(其中不能测量共轭前的体系)，可以利用Davidek T.等，(2003)的HPLC方法。

氮含量(Dumas)

蛋白浓度按照ISO标准方法(ISO 16634)分析。使样品通过在燃烧管中加热使样品气化而转化为气体。由所得气体混合物移除干扰组分。使气体混合物中的氮化合物或其中的代表部分转化为分子氮，其由热导检测器定量检测。氮含量由微处理器计算出。为了估算基于氮的蛋白含量，使用以下因素：酪蛋白和豌豆6,25。

OPA-N

OPA-N值使用Frister H.等，1988开发的方法测量。

苦味的感官评价

将样品在室温下使用五位经训练的感官评估员以1％的肽水溶液测试。为了消除稀释作用，将所有酪蛋白水解物样品调节为仅含有1％的肽，无论加入多少糖。评估员获得用于比较的标准品(非共轭水解物)并将该标准品的苦味设定为3。如果可以检测出苦味的任何变化，评估员会对较低苦味给出较低评分且对较高苦味给出较高评分。因此，较低“苦味值”表明体系的苦味较小。

由于酪蛋白的苦味比豌豆肽高，所以酪蛋白标准品以1％肽加入且豌豆肽以5％加入。然后，将共轭肽加入含有与标准品相同重量的肽(因此以较高浓度加入的共轭肽以考虑糖的稀释作用)。因此，结果应以与未经共轭的相同材料相比的苦味降低来评价。

平均分子量

平均表观MW值通过测量OPA-N而测量(Frister H.等，1988)。OPA-N并不能给出MW值的直接表示，而仅给出每个样品中的胺端基量。表观MW值通过使用下式将测得的氮总量(氮总量使用上述Dumas方法测量)除以OPA-N值获得：

(总氮/OPA-N)＊100＝表观MW值。

材料

使用以下材料：

NaOH，Sigma-Aldrich(St.Luis Missuri USA)，酪蛋白(Acid Casein741，Fonterra Ltd，Auckland，New Zeeland)，水解豌豆蛋白，(Peptipea，Triballatingredients，Cedex France)，葡萄糖(Dextrose Monohydrat，Roquette，Lestrem，France)，Alcalase 2.4L FG，Novozymes(Novozymes A/S，Gagsvaerd，Dennmark)，注射器过滤器(0.2μm Whatman Red rim syringe filter，Maidstone，United Kingdom)

参考文献

Bumberger E.，Belitz H.-D.(1993).Bitter taste of enzymic hydrolysatesof casein.Zeitschrift für Lebensmittel Untersuchung und Forschung，v 197，第14-19页

Davidek T.等(2003).Simultaneous quantitative analysis of Maillardreaction precursors and products by high performance anion exchangechromatography.Journal of agricultural and food chemistry，v 51，(25)，第7259-7265页

Frister H.，Meisel H.，Schlimme E.(1988)OPA method modified by use ofN,N-dimethyl-2-mercaptoethylammonium chloride as thiol component.Anal.Chem.V330，第631-633页

Hartmann R.and Meisel H.(2007).Food-derived peptides with biologicalactivity:from research to food applications.Current opinion in biotechnology，v 18，第163-169页.

Lund M.N.and Ray C.A.(2017)Control of Maillard reactions in foods:Strategies and chemical mechanism.Agricultural and food chemistry，v65，第4537-4552页.

Pratt C.K.and Cornely K.(2013).Essential biochemistry(third ed.)Wilay第626页

Tamura M.，Mori N.，Miyoshi T.，Koyama S.，Kohri H.and Okai H.(1990).Practical debittering using model peptides and relatedcompounds.Agricultural and biological chemistry，v 54(1)，第41-51页。