一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法

技术领域

本发明属于生物遗传学技术领域，具体涉及一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法。

背景技术

现有的果蝇遗传学操作系统包括GAL4/UAS双表达系统和FLP/FRT系统。其中，(一)GAL4/UAS双表达系统：GAL4/UAS系统是果蝇中最为常用的转基因技术体系，可以让外源基因或RNAi在特定细胞或组织选择性表达。半乳糖调节上游启动子元件(galactose-regulated upstream promoter element 4)，缩写GAL4，是酵母中类似于原核生物乳糖操纵子的一个转录激活子。上游激活序列UAS(upstream activate sequense)，是酵母中另一种类似高等真核生物增强子的序列。GAL4通过与UAS相结合，调节与半乳糖代谢相关基因的表达，GAL4/UAS双表达系统示意图如图1所示。1993年，科学家将目的基因X连接在UAS之后，通过转基因技术建立UAS-X果蝇品系，然后与特定的GAL4果蝇品系杂交，在后代中就可以得到同时具有Y-Gal4和UAS-X的果蝇，从而实现特异性的在Y组织表达X基因(

(二)FLP/FRT系统：FLP是酵母中的一种重组酶，它可以识别两个700bp的同源靶位点FRT(FLP recombination targets，FRTs)，如果两个FRT片段位于果蝇一对同源染色体的相同位点，热击诱导的FLP表达可以介导这两个位点进行有丝分裂重组，产生重组远端纯合的子细胞(如图2所示)(

果蝇作为研究人类疾病的模式生物，与哺乳动物不仅在基本的生物学、生理学和神经系统机能等方面比较相似，而且果蝇有其作为模式生物的独特优势。近年来的研究表明，果蝇和人类在肿瘤发生信号通路等方面的保守性很高，而且果蝇具有很强的遗传学可操作性，是肿瘤学研究有效的模型之一，可用于研究人类肿瘤发生、发展、转移等分子机制。近年来研究人员已经建立了很多用于研究特定的果蝇模型，但是新的特定的果蝇肿瘤侵袭模型的建立对阐明癌症等相关疾病发生的分子机制起到重要作用，将会为临床治疗提供新的药物靶点和治疗方案。因此，建立新的特定的果蝇肿瘤侵袭模型是本领域技术人员亟待解决的技术问题

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法，该方法为将收集好的雌性处女蝇和健康雄性果蝇按照杂交流程进行杂交，所述的杂交流程包括如下步骤：

(1)将UAS-Dorsal.H果蝇品系和Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H/Sp；+/Sb雄性果蝇；同时将Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb果蝇品系和UAS-Ras

(2)观察到GFP标记的眼部组织的肿瘤细胞已经迁移腹部神经节的果蝇品系，即为黑腹果蝇Dorsal.H；Ras

作为一种优选技术方案：步骤(2)的详细过程为：将ey-Flp act>y

进一步优选的：将ey-Flp act>y

作为一种优选技术方案：所述杂交的培养基的配方为：红糖13.5％(13.5g/100ml)，琼脂0.7％(0.7g/100ml)，玉米粉8.5％(8.5g/100ml)，酵母0.8％(0.8g/100ml)，丙酸0.4％(v/v)。

作为一种优选技术方案：于温度25℃，湿度50％-60％的条件下进行培养。

所述雌性处女蝇的选取方法为：将原种瓶中的成虫全部清除，此后每隔8小时收集刚羽化的雌果蝇，放入培养瓶中备用，由于刚羽化的果蝇，其身体细长而幼嫩得几乎透明，从腹部的腹面透过几丁质的外壳，能够看到腹腔内的黑色消化道，因此，可观察到黑色消化道的雌性个体即为处女蝇。

本发明的有益效果：

本发明方法成功构建黑腹果蝇Dorsal.H；Ras

附图说明：

图1为GAL4/UAS双表达系统示意图。

图2为FLP/FRT系统作用原理示意图。

图3为果蝇雌雄辨别示意图。

图4为Dorsal.H；Ras

图5为Dorsal和Ras共表达可诱导肿瘤侵袭。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1

一、果蝇的饲养及实验条件

1、果蝇培养基的配制

实验用的果蝇品系及杂交实验均将果蝇饲养于标准的红糖-玉米粉-酵母培养基上，其中培养基的配方如下：

配制过程：

(1)将称量好的红糖和琼脂一起倒入电饭锅中，加入适量水，充分搅拌；

(2)加热至沸腾；

(3)将已用水充分溶解好的玉米粉缓慢倒入锅中，持续搅拌；

(4)加热至沸腾；

(5)待混合物冷却至80℃左右，加入提前用温水溶解好的酵母，充分搅拌，所用酵母为英联马利(AB/MAURI

(6)加入适量丙酸溶液，充分搅拌；

(7)将培养基分装于灭菌的玻璃管中；

(8)塞上棉花后，置于阴凉处存放。

2、实验条件

温度25℃恒温，湿度50％-60％，杂交一般饲养于恒温恒湿的培养箱或果蝇房中。

3、果蝇雌雄的鉴别

(1)体型：雌果蝇体型较大，雄的较小。

(2)腹部末端：雌果蝇腹部椭圆末端稍尖，雄果蝇末端钝圆。

(3)腹部背面：雌果蝇有明显5条黑色条纹，雄果蝇的有3条，前2条细，后1条宽，至腹面，肉眼可见腹部末端有一明显黑点。

(4)腹部腹面：雌果蝇有较明显的6个腹片，雄果蝇有4个腹片。

(5)性梳：雄果蝇第一节足底侧最上部附足前端表面有黑色鬃毛－性梳。

(6)交尾器：判断雌雄果蝇的最主要的区别。

果蝇雌雄辨别示意图如图3所示。

4、果蝇的麻醉及杂交

果蝇的麻醉方法是二氧化碳(CO

将果蝇麻醉后，可以在通有CO

二、一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法

1、建立模型所需果蝇品系

(1)w

(2)ey-Flp act>y

(3)UAS-Dorsal.H，为野生型Dorsal，位于二号染色体，该品系果蝇眼睛为黄色，可以纯合，具体基因型为：w

(4)UAS-Ras

(5)Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb，为二号三号染色体平衡子(Balancer)工具果蝇品系，购于中科院上海生科院生化与细胞所果蝇资源与技术平台。

(6)Sp；Sb/SM6B-TM6B.Tb，为二-三号染色体连接的工具果蝇品系，购于中科院上海生科院生化与细胞所果蝇资源与技术平台。

2、结果基因型如下

图5A：ey-Flp act>y

图5B：ey-Flp act>y

图5C：ey-Flp act>y

图5D：ey-Flp act>y

3、实验方法

(1)将收集好的雌性处女蝇和健康雄性果蝇按照杂交流程进行杂交，果蝇杂交流程见图4，详细步骤如下：

A.将UAS-Dorsal.H果蝇品系和Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H/Sp；+/Sb雄性果蝇；同时将Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb果蝇品系和UAS-Ras

B.将ey-Flp act>y

(2)收集杂交后代中的目标果蝇，对果蝇三龄幼虫头部复杂组织及腹部神经节进行解剖并置于体式荧光显微系统下拍照。

4、模型简介

图5A-D为果蝇三龄幼虫期的头部复杂组织(Cephalic complex,CC)解剖图，其中EA代表眼成虫盘(eye-antennal discs)，BH代表果蝇的两个大脑半球，VNC代表腹部神经节(Ventral nerve cord，VNC)。

选用FLP-FRT介导的有丝分裂重组并结合GAL4/UAS系统，与正常组对照相比(图5A，A’)，我们发现特异性地在眼成虫盘中持续表达高度活化的癌基因Ras(Ras

研究者利用此模型可在果蝇全基因组范围内进行筛选，寻找抑制肿瘤迁移的基因突变或RNAi，阐明其调控肿瘤迁移的分子机制，并在哺乳动物中对其同源物进行功能验证，也可进行化学合成物、中药复方/单味药/单体的大规模药物筛选，以期为癌症的临床治疗提供新的药物、药靶和治疗方案。