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快速检测新型冠状病毒及其Delta突变株的试剂盒和方法

文献发布时间：2023-06-19 16:11:11

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说本发明涉及一种快速检测新型冠状病毒及Delta突变株的组合物、试剂盒、方法及用途。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种单股正链RNA病毒，容易发生变异。在临床上，新冠病毒感染者的症状差异较大，从无症状到危重症都有可能发生。除了个体因素的差异外，病毒变异也可能是导致感染患者症状差异大的重要因素。研究表明，新型冠状病毒突变速率约为每月2～4个突变，目前在已知的株系发现了超过 25个突变的变异株。相继在多个国家发现Alpha新冠变异株、Beta新冠变异株、 Gamma新冠变异株以及Delta新冠变异株，它们在病毒表面刺突蛋白的受体结合域 (RBD)发生了突变，使其与人体细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)受体更容易结合，病毒的变异会显著影响其传播能力和致病能力，甚至出现耐药问题而加大治疗难度，尤其是Delta变异株目前席卷全球，在所有变异株中占85％以上，其病毒载量是以往的1260倍左右。

因此，开发一种能够同时检测新型冠状病毒以及Delta变异株的联合筛查试剂盒，对于疫情防控和确诊患者的治疗具有非常积极的意义。但是目前还没有相应的联合检测试剂。

发明内容

本发明针对新型冠状病毒及其德尔塔(Delta)变异株开发了快速检测新型冠状病毒及Delta突变株的组合物、试剂盒、方法及用途。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔 (Delta)变异株的引物对集，所述引物对集包括第一引物：

所述第一引物对特异性扩增新型冠状病毒(2019-nCoV)Delta突变位点，所述第一引物对包括：如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.8所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括第二引物对，所述第二引物对特异性扩增新型冠状病毒ORF1ab基因，所述第二引物对包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括第三引物对，所述第三引物对特异性扩增新型冠状病毒N基因，所述第三引物对包括：

如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括第四引物对，所述第四引物对特异性扩增内参RNase P基因，所述第四引物对包括：

如SEQ ID NO.10所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.11所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的探针集，所述探针集包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第一探针。

在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第二探针。

在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第三探针。

在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的第四探针。

在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的 3’端包含有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，所述各探针标记的荧光报告基团互不相同。

本发明的第三方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种成分：热启动 Taq酶、逆转录酶、UDG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、dNTPs。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括阳性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液包括：SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述第一容器内还包含：MgCl

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含酶混合液，所述酶混合液包含热启动Taq酶、逆转录酶、和尿嘧啶糖基化酶(UNG))。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器内包含阴性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第四容器，所述第四容器内包含阳性质控品。

本发明的第四方面，提供了一种检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的样本；

(2)制备荧光定量PCR反应体系并进行荧光定量PCR检测：

其中，所述荧光定量PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述样本为核酸样本。

在另一优选例中，所述样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。

在另一优选例中，所述荧光定量PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。

在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR反应酶系。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株。

在另一优选例中，所述PCR为荧光定量PCR。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为新型冠状病毒和delta突变株检测多重引物探针组合1(包括SEQID NO.1～SEQ ID NO.12)试验扩增结果图，新型冠状病毒标准物质核酸浓度为 100copies/mL；

图2为新型冠状病毒和delta突变株检测多重引物探针组合2(包括SEQID NO.13，SEQID NO.14，SEQID NO.15，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.49，SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51，SEQ ID NO.10， SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12)试验扩增结果图，新型冠状病毒标准物质核酸浓度为100copies/mL；

图3为新型冠状病毒和delta突变株检测多重引物探针组合3(包括SEQID NO.19，SEQID NO.20，SEQID NO.21，SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.43，SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.45，SEQ ID NO.55， SEQ ID NO.56，SEQ ID NO.57)试验扩增结果图，新型冠状病毒标准物质核酸浓度为100copies/mL；

图4a至图4c为中国计量院的新型冠状病毒德尔塔(B.1.617.2)突变株基因组RNA标准物质10倍倍比稀释浓度分别为1×10

图4a为新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF 1ab靶基因浓度梯度检测结果；

图4b为新型冠状病毒(2019-nCoV)N靶基因浓度梯度检测结果；

图4c为新型冠状病毒(2019-nCoV)Delta突变位点浓度梯度检测结果；

图5a至图5r分别为人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1 流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、肠病毒的假病毒特异性检测图、阴性对照、阳性对照检测图。

图6a、图6b分别为中国计量院的新型冠状病毒德尔塔(B.1.617.2)突变株基因组RNA标准物质(标物编号：NIM-RM-5217)，稀释至终浓度为100 copies/mL和500copies/mL重复21次的检测结果。

图7a、图7b、图7c、图7d分别为稀释至终浓度为100copies/mL中国计量院的新型冠状病毒德尔塔(B.1.617.2)突变株基因组RNA标准物质在0天， 4℃7天，4℃15天，37℃7天的试剂盒稳定性测试；

图8a、图8b、图8c、图8d、图8e为全国新型冠状病毒德尔塔突变株核酸检测室间质量评价检测图，分别为批号：202121、202122、202123、202124、 202125。

具体实施方式

本发明针对新型冠状病毒及其德尔塔突变株，选取新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因，以及德尔塔突变株突变位点开发检测试剂，能够高效率、高特异性、高稳定性、低成本的对新型冠状病毒及其德尔塔突变株感染患者进行检测。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、 99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

实时荧光PCR

是基于荧光共振能量转移(FRET)原理的技术。其中，以TaqMan荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术利用热稳定DNA聚合酶Taq酶在具有 5’-3’方向的聚合酶活性的同时，还具有对聚合延伸过程中遇到的与靶序列结合的核苷酸序列的5’-3’方向的核酸外切酶活性。TaqMan荧光探针在5’ 和3’端分别标记荧光发射基团和淬灭基团，探针的3’末端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用即被解除，荧光发射基团发射波长处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板 DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动至探针位置时，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性能降解特异性荧光标记探针，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光发射出来。

多重PCR

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

影响多重PCR反应的因素有很多，比如：

(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是 DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。

(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。

(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。

(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。

虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了特异性好、扩增效率高并且能够进行多重检测的检测新型冠状病毒、及其德尔塔(Delta)突变株和内参基因的引物、探针组合：

在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了包含上述引物、探针组合的试剂盒，试剂盒包括：

RT-PCR反应液，包括：MgCl

酶混合液，包括：热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG))；

阴性质控品：DEPC H

阳性质控品：含新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF 1ab靶基因、新型冠状病毒 (2019-nCoV)N靶基因、新型冠状病毒(2019-nCoV)Delta突变位点及内参基因目的片段质粒。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明建立了可同时检测新型冠状病毒及其德尔塔(Delta)突变株的检测方法及核酸检测试剂盒。

(2)本发明所述新型冠状病毒及其德尔塔(Delta)突变株的检测方法及核酸检测试剂盒，可对鼻/咽拭子样本进行快速免提取直接扩增检测，具有超强抗干扰性能。

(3)本发明所述新型冠状病毒德尔塔(Delta)突变株的检测方法，具有特异性强，灵敏度高的优势，而且检测结果稳定。

(4)本发明针对新型冠状病毒德尔塔(Delta)突变株的特异性检测引物、探针进行了大量的设计、筛选，获得了能够特异性扩增Delta突变位点的引物对，经过反复验证，意外发现该引物对对野生型新型冠状病毒无非特异性扩增，不仅极大地简化了新型冠状病毒德尔塔(Delta)突变株的检测流程，而且显著提高了鉴别新型冠状病毒德尔塔(Delta)突变株的准确性。

本发明适用于对新型冠状病毒的检测，为病毒鉴定分型和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为公众健康管理之需。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。例如，本发明实施例中涉及的热启动Taq酶、UDG酶、C-MMLV酶、RNasin可购自Invitrogen公司。

实施例1用于多重快速检测新型冠状病毒(2019-nCoV)和突变株delta鉴定的试剂盒

为获得特异性及灵敏度较好的多重引物探针体系组合，针对各靶标共设计了包括数十条引物和数十条探针，并组合多重试验。

同时，设计人源内参基因对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程进行监控。

最终确定了一套灵敏度和特异性最优的引物、探针序列。

由于内容过多，选择部分结果进行呈现，部分引物探针如下表1所示，表1 中引物探针组合经单重验证均具有良好灵敏度和特异性。部分引物探针组合的多重试验结果如图1、图2、图3所示。

表1部分引物探针

本发明实验发现，由于新型冠状病毒德尔塔(Delta)突变株和新型冠状病毒野生型的核酸差异极小，针对德尔塔突变株的不同突变位点所设计的绝大部分引物对会对野生型表现出非特异性扩增，因而很难准确鉴别出德尔塔突变株。本发明针对新型冠状病毒德尔塔突变株的特异性检测引物、探针进行了大量的设计、筛选，获得了能够特异性扩增Delta突变株特定突变位点的引物对 (SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)，经过反复验证，意外发现该引物对对野生型新型冠状病毒无非特异性扩增，不仅极大地简化了新型冠状病毒德尔塔(Delta)突变株的检测流程，而且显著提高了鉴别新型冠状病毒德尔塔 (Delta)突变株的准确性。

多重引物探针组合1包括SEQID NO.1～SEQ ID NO.12；

多重引物探针组合2包括SEQID NO.13，SEQID NO.14，SEQID NO.15，SEQ IDNO.31，SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.49，SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51，SEQ IDNO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12；

多重引物探针组合3包括SEQID NO.19，SEQID NO.20，SEQID NO.21，SEQ IDNO.34，SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.43，SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.45，SEQ IDNO.55，SEQ ID NO.56，SEQ ID NO.57；

多重引物探针组合4包括SEQID NO.16，SEQID NO.17，SEQID NO.18，SEQ IDNO.28，SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.46，SEQ ID NO.47，SEQ ID NO.48，SEQ IDNO.52，SEQ ID NO.53，SEQ ID NO.54；

多重引物探针组合5包括SEQID NO.22，SEQID NO.23，SEQID NO.24，SEQ IDNO.40，SEQ ID NO.41，SEQ ID NO.42，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ IDNO.55，SEQ ID NO.56，SEQ ID NO.57；

多重引物探针组合6包括SEQID NO.25，SEQID NO.26，SEQID NO.27，SEQ IDNO.37，SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.49，SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51，SEQ IDNO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12。

多重检测结果表明，引物探针组合1、引物探针组合4、引物探针组合5的扩增效率较高，可以进行进一步性能测试。引物探针组合2、引物探针组合3在多重扩增时，部分靶标扩增效率受到明显抑制。引物探针组合6在多重扩增时，无法扩增出Delta突变株靶核酸。

图1为新型冠状病毒和Delta突变株检测多重引物探针组合1(包括SEQID NO.1～SEQ ID NO.12)试验扩增结果图，新型冠状病毒标准物质核酸浓度为100 copies/mL；

图2为新型冠状病毒和Delta突变株检测多重引物探针组合2(包括SEQID NO.13，SEQID NO.14，SEQID NO.15，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.49，SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12)试验扩增结果图，新型冠状病毒标准物质核酸浓度为100 copies/mL；

图3为新型冠状病毒和Delta突变株检测多重引物探针组合3(包括SEQID NO.19，SEQID NO.20，SEQID NO.21，SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.43，SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.45，SEQ ID NO.55，SEQ ID NO.56，SEQ ID NO.57)试验扩增结果图，新型冠状病毒标准物质核酸浓度为100 copies/mL。

基于上述大量工作，最终优选出特异性好、扩增效率高的新型冠状病毒引物探针组合(包括内参)如表2所示：

表2本试剂盒所使用的引物探针

本实施例提供的试剂盒包括：

RT-PCR反应液(925μl)：MgCl

酶混合液(75μL)：包括热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG))；

阴性质控品：DEPC H

阳性质控品：含新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF 1ab靶基因、新型冠状病毒 (2019-nCoV)N靶基因、新型冠状病毒(2019-nCoV)Delta突变位点及内参基因目的片段质粒。

实施例2多重快速检测新型冠状病毒(2019-nCoV)和突变株Delta鉴定的方法

本实施例提供了使用实施例1中的试剂盒，多重快速检测新型冠状病毒 (2019-nCoV)和突变株Delta的方法。

1.标本类型：口咽拭子、鼻咽拭子。

2.核酸提取：

采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到80μL RNA溶液，直接进行检测。

或保存于-80℃。阴性质控品、阳性质控品均需进行提取。

3.体系配置：

根据检测所需总反应数N(包括待检样本数、1份阴性质控品、1份阳性质控品)，每管PCR加入18.5μL RT-PCR扩增液及1.5μL的酶混合液。计算所需的总量，混匀后再分装到特制的PCR反应管中。

4.加样：

向已分装有试剂的PCR反应管中分别加入阴性质控品，样本RNA溶液，阳性质控品，加样量均为20μL，盖紧管盖，混匀，离心收集溶液置管底。

5.上机扩增检测：

荧光检测通道的设定如表3所示：

表3

RT-PCR扩增程序的设定如表4所示：

表4

6.结果分析：

在满足扩增有效的前提下，判定依据如表5所示：

表5

实施例3灵敏度检测

使用购于中国计量院的新型冠状病毒德尔塔(B.1.617.2)突变株基因组RNA 标准物质(标物编号：NIM-RM-5217)，稀释到合适浓度后再进行10倍倍比稀释，浓度分别为1×10

用上述确定的检测体系和循环参数对上述新型冠状病毒德尔塔(B.1.617.2)突变株基因组RNA标准物质稀释的6个梯度浓度进行检测。

灵敏度检测结果表明，引物探针组合1、引物探针组合4、引物探针组合5的灵敏度数据分别为1×10

使用多重引物探针组合1的扩增结果Ct例举如图4a至图4c所示。结果显示灵敏度数据为1×10

表6

实施例4特异性检测

将地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、SARS冠状病毒、MERS 冠状病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、肠病毒的假病毒稀释至1×10

图5a至图5r分别为使用引物探针组合1检测人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2 流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、肠病毒的假病毒特异性检测图、阴性对照、阳性对照检测图。

检测结果表明，人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、肠病毒，共16种病原体，检测结果均为阴性，阴阳性质控品正常检出，表明本试剂盒特异性良好。

实施例5重复性检测

使用购于中国计量院的新型冠状病毒德尔塔(B.1.617.2)突变株基因组RNA 标准物质(标物编号：NIM-RM-5217)，稀释至终浓度为500copies/mL和100 copies/mL。

采用上述试剂盒及循环参数，进行重复测试，每个浓度重复21次。

使用引物探针组合1检测结果如下表7所示：

表7

实施例6直扩抗干扰性能检测

对带有干扰因素的100copies/mL的低浓度2019新型冠状病毒样本进行直扩抗干扰性能检测。干扰样本为带有明显浑浊的呼吸道鼻/咽拭子样本，并往其中加入不同干扰物质，模拟不同类型的干扰样本，通过直接扩增的方式，对比灵敏度样本检出情况，以测试试剂的抗干扰性能。

采用的样本检测方式为，20μL干扰样本+18.5μL RT-PCR扩增液+1.5μL酶混合液的扩增的方式，考察不同组合在不同干扰条件下对新冠病毒核酸扩增效果的影响。不同的组合是指在PCR反应液含有不同组合物的组合，同时该方案采用了一组无干扰物质的对照样本(用生理盐水替代)。

本发明对临床样本中可能存在的26种潜在干扰物进行验证，包括血液、鼻腔分泌物、粘液及用于缓解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和过敏症状的鼻腔和咽喉药物、抗菌药物、抗病毒药物等，根据临床可能存在的潜在最大浓度设置干扰物质浓度值，并将干扰物质添加至呼吸道鼻/咽拭子样本中，制备成不同类型的干扰样本，其灵敏度样本检出情况如下，经本发明筛选优化后的多重反应体系组合1具有超强的抗干扰能力，可对鼻/咽拭子样本进行快速免提取直接扩增检测。

表8显示了多重引物探针组合1至多重引物探针组合5的直扩抗干扰性能检测结果。

表8

其中“√”表示该干扰样本的100copies/mL浓度水平的检出率>95％，“/”表示该干扰样本的100拷贝/mL浓度水平的检出率<95％。

实施例7稳定性检测

使用购于中国计量院的新型冠状病毒德尔塔(B.1.617.2)突变株基因组RNA 标准物质(标物编号：NIM-RM-5217)，稀释至终浓度为100copies/mL，采用上述试剂盒及循环参数，进行稳定性测试，分别在0天，4℃7天，4℃15天，37℃7 天检测浓度为100copies/mL的标准品，重复21次。

图7a、图7b、图7c、图7d分别为使用引物探针组合1检测稀释至终浓度为100copies/mL中国计量院的新型冠状病毒德尔塔(B.1.617.2)突变株基因组RNA标准物质在0天，4℃7天，4℃15天，37℃7天的稳定性测试。

检测结果如下表9所示：

表9

实施例8临床样本检测

本试剂盒检测已经临床确认的50例阳性样本核酸(含Delta突变株样本18 例)，30例阴性样本核酸，其中内参通道(CY5通道)阳性扩增结果80例、阴性扩增结果0例，ORF 1ab(FAM通道)阳性扩增结果50例、阴性扩增结果30例，N基因检测通道(HEX通道)阳性扩增结果50例、阴性扩增结果30例，Delta突变位点检测通道(ROX通道)阳性扩增结果18例、阴性扩增结果62例，与临床确认结果的阴、阳符合率为100％，突变株检测符合率100％。

新冠检测结果

Delta变异株检测结果

实施例9室间质评验证

为检测试剂盒针对新冠病毒2019-nCoV和Delta突变株检测的准确性和有效性，我们对国家临检中心发放的全国新型冠状病毒德尔塔突变株核酸检测能力验证室间质控品进行验证，结果100％符合。

图8a、图8b、图8c、图8d为全国新型冠状病毒德尔塔突变株核酸检测室间质量评价检测图，分别为批号：202121、202122、202123、202124、202125。

具体结果见下表10所示：

表10.2021年全国新型冠状病毒德尔塔突变株核酸检测室间质量评价检测结果

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 深圳联合医学科技有限公司

<120> 快速检测新型冠状病毒及其Delta突变株的试剂盒和方法

<130> 041001

<160> 57

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA