靶向禽腺病毒4型Fiber1蛋白的抗病毒亲和肽及应用

技术领域

本发明涉及一种靶向禽腺病毒4型Fiber1蛋白的抗病毒亲和肽及应用，属于分子生物学领域。

背景技术

目前，禽腺病毒4型(FAdV-4)的感染引起了全世界的关注，对于该病的防控仍需得到重视。具有抗病毒活性的多肽因其生物相容性、特异性和有效性备受关注，克服了现有药物的局限性。特别是通过虚拟筛选技术和分子对接技术设计合成的多肽，既缩短了研究周期，降低了研发成本，又可以显著提高筛选出理想结果的可能性，当前分子对接技术已被广泛应用于寻找适合各种疾病的治疗靶点或药物。

FAdV-4病毒粒子外层主要由四种结构蛋白Hexon、Penton、Fiber1和Fiber2组成。其中Fiber1为FAdV-4受体CAR结合蛋白，与病毒感染直接相关。因此，可根据Fiber1蛋白结构筛选对FAdV-4具有抗病毒活性的亲和肽。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的是提供一种靶向禽腺病毒4型Fiber1蛋白的抗病毒亲和肽及其应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种靶向禽腺病毒4型Fiber1蛋白的抗病毒亲和肽，所述亲和肽的序列为YMKHRV。

所述的亲和肽在制备抑制禽腺病毒4型病毒感染药物方面的应用。

所述的亲和肽在制备禽腺病毒4型病毒Fiber1蛋白检测试剂方面的应用。

所述的亲和肽在制备抗禽腺病毒4型病毒疫苗中的应用。

本发明有益效果：

本发明根据纤突蛋白Knob结构域的三维结构，利用计算机虚拟筛选技术设计了靶向Fiber1 Knob结构域的亲和肽。选取活性口袋对接范围，经体外试验筛选得到Fiber1-20号肽(F1-P20)是对FAdV-4具有抗病毒活性的最佳肽，为进一步研究病毒受体及抗病毒药物设计提供线索和理论支持，并为未来应用于FAdV-4感染的预防和控制提供了新思路。

大多数腺病毒的Fiber-受体复合物结构已被确定，考虑到其他腺病毒通常通过Knob结构域与受体相互作用，并且Knob结构域暴露在病毒粒子的外侧，在空间上更容易与其他分子相互作用，因此本发明选择Fiber1 C端Knob结构域作为对接口袋进行对接尝试。通过对Fiber1 Knob结构域的同源建模，获得了分子对接初始的蛋白结构，同时选定对接口袋。以2-3个氨基酸为核心通过逐个延长的方式最终获得了虚拟肽库。利用SYBYL-X 2.1.1软件的Surflex-Dock程序将虚拟肽库和活性口袋进行分子对接，根据打分函数和亲和力分析，最终得到了靶向Fiber1 Knob结构域的亲和肽。

本发明筛选得到的亲和肽F1-P20可以在体外有效抑制FAdV-4病毒感染。Westernblot结果显示，在48h.p.i.，F1-P20不同浓度处理组与病毒组相比，FAdV-4病毒的Fiber2蛋白表达量均显著降低。IFA结果显示，与阳性对照相比，F1-P20不同浓度处理组的FAdV-4病毒的感染细胞数明显减少。TCID

附图说明

图1CELO长Fiber C端Head结构域蛋白晶体结构(PDB：2IUM)。

图2同源建模后的FAdV-4Fiber1 Knob结构域蛋白三维结构。

图3Fiber1 Knob结构域活性口袋位置展示。

其中，Fiber1 Knob结构域同源建模后的三维结构以灰色进行展示，红色区域为选中的活性对接口袋位置，A图为Surface形式，B图为Cartoon形式，均由PyMOL软件生成。图4Fiber1 Knob结构域活性口袋序列展示。

Chain A、Chain B为Fiber1 Knob结构域蛋白的两条肽链，其中黄色高亮部分为对接口袋；

图5通过IPMA初步筛选对FAdV-4感染有抗病毒作用的靶向Fiber1 Knob结构域亲和肽。

其中，NC：只接毒处理组；MOCK：不接毒也不孵育肽处理组；比例尺：200μm。

图6通过qPCR筛选对FAdV-4感染具有抗病毒作用的靶向Fiber1 Knob结构域的亲和肽。

图7Fiber1 Knob结构域蛋白偶联芯片时摸索醋酸钠缓冲液的最佳pH信号图。

图8Fiber1 Knob结构域蛋白通过pH＝4.5醋酸钠缓冲液偶联CM5芯片时信号图。

图9SPR测定亲和肽F1-P20与Fiber1 Knob结构域蛋白之间的亲和力。

图10亲和肽F1-P20在24h和48h对LMH细胞毒性测定。

图11亲和肽F1-P20体外抑制FAdV-4病毒感染。

其中，用FAdV-4病毒(MOI＝0.01)和F1-P20预孵育后的混合物接种LMH细胞。(A)在48h.p.i，用蛋白免疫印迹试验(WB)分析各组Fiber2和GAPDH的表达水平；(B)利用抗Fiber2的单克隆抗体5A5和FITC偶联的山羊抗小鼠IgG抗体通过间接免疫荧光试验(IFA)检测FAdV-4感染细胞的情况，比例尺：100μm；(C)采用Reed-Muench方法计算各时间点的半数组织培养感染剂量(TCID50)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

(1)可能用到的试剂及耗材

CM5传感芯片、10mM醋酸钠溶液(pH＝5.5，5.0，4.5和4.0)、10×HBS-EP缓冲液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)冻干粉和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自美国GE公司；鼠源GAPDH单克隆抗体和FITC标记的山羊抗鼠单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天公司；针对FAdV-4Fiber2蛋白的单克隆抗体5A5、兔源多克隆抗体以及FAdV-4的阳性血清均由本实验室制备并保存。

(2)可能用到的仪器与设备

生物大分子相互作用分析仪(Biacore X100)购自美国GE公司；多功能酶标仪购自德国BMG公司；超净工作台购自SANYO公司；CO

(3)数据统计与分析

数据以组间平均值±标准误差(Means±SEM)表示，并使用GraphPad Prism软件利用t-test、单因素方差分析(One-way analysis of variance，ANOVA)对两组、两组以上数据进行统计学分析。当p<0.05表示有统计学差异，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001，****代表p<0.0001；ns表示无统计学意义。

实施例1分子对接及靶向Fiber1 Knob结构域亲和肽的筛选

(1)Fiber1 Knob结构域蛋白三维结构的准备

通过SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org)选择与FAdV-4Fiber1蛋白氨基酸序列同源性评分最高的CELO长Fiber C端Head结构域蛋白晶体结构(PDB：2IUM)进行同源建模。

在SWISS-MODEL中，输入FAdV-4Fiber 1Knob的氨基酸序列，通过匹配找到评分最高的晶体结构，即以CELO长Fiber C端Head结构域蛋白晶体结构(PDB：2IUM)(图1)为模板，进行同源建模，最终得到FAdV-1Fiber 1Knob结构域蛋白的三维结构，如图2。

(2)蛋白三维结构的优化

通过SYBYL-X 2.1.1.软件的BIOPOLYMER模块对FAdV-4Fiber 1Knob结构域蛋白结构进行优化准备。载入欲优化的蛋白结构(pdb文件)，打开Structure Preparation Tool>Analyze Selected Structure，检验所有氨基酸残基上的原子名称和主链原子编号是否正确；接着修补sidechain、处理mainchain末端、加氢、设定氨基酸残基的质子化状态、指定AMBER7-FF99的原子类型、加电荷、侧链氨基定位以最大化氢键形成，最后利用AMBER7 FF99力场优化Protein-Ligand复合物，以Mol2格式保存。操作简述如下：

修补侧链：Repair Sidechain>Show，显示需要修补的氨基酸残基；Fix添加缺失原子；Center View on Residue>Rotamer设为Lovell，在Lovell异构体数据库中根据chi值选择概率最高的构象>Set Selected；

处理主链末端:Termini Treatment>Show>Fix>New Block改为Charged>Apply toSelected Protein；

加氢：Add hydrogens，确认添加所有氢原子并给水分子加氢时进行Random定位，点击OK，完成加氢；

设定残基的质子化状态以便与配体形成氢键：Set Protonation Type>Fix，激活List Only Residues Near Ligands,Manipulate>Acids，激活Auto Center，选择与Ligand有足够近的距离形成氢键的残基，选择Flip 180Degrees；

指定AMBER7-FF99的原子类型：Type Atoms>Show>Fix，选中AMBEER7 FF99原子类型>Assign Atom Types，General Structure Display>Residues>Select All>Undisplay，激活Highlight Missing Atom Types，为没有指定原子类型的原子进行手动操作指定AMBER7 FF99原子类型；

加电荷：Add charges>Add,Biopolymer>AMBER7 FF99，Ligand>Gasteiger-Huckel>OK，A/MTX164>OK；

侧链氨基定位以最大化氢键形成：Fix Sidechain Amides>Fix；AMBER7 FF99力场优化Protein-Ligand复合物：

Compute>minimize>Molecule>Modify修改为Energy Setup，Force Field设为AMBER7FF99，Cherges设为Use Current，Minimize对话框中iterations设为20。

(3)对接活性口袋的生成

通过SYBYL-X 2.1.1生成对接活性口袋，具体操作过程如下：首先在程序界面找到靶标蛋白优化后的结构文件，选择在空间结构上更易于与受体接触的Fiber1 Knob结构域的顶端位置作为活性口袋(Pan et al.2020)，并将Threshold，Bloat(A)的参数值分别设置为0.5和10，确认后即产生对接活性口袋。由SYBYL-X 2.1.1生成的对接口袋如图3。组成Fiber1 Knob结构域活性口袋的氨基酸序列如图4。

Chain A和Chain B为Fiber1 Knob结构域蛋白的两条肽链，序列如下：

Chain A：

SPFATYEVTPVLGISQRNGNVKSKGLQNWSI

Chain B：

SPFATYEVTPVLGISQRNGNVKSKGLQNWSIGYYIYMVSSAGLVNGLITLELAHDLTGASGENSLTSGLNFTFVLSPMYPIETEVNLSLIVPPTVSPTNQNHVFVPNSNQSDVGYLGLPPHTRDNWYVPIDSPGLRLVSFMPTATGNEKFGQGTLGYCAATIQNTSSGTTPSDAIAFTVSLPQTSGSNWFDQNAPDTVVTTGPIPFSYQGYVYSPNGNNAPGP(SEQ2)

(4)分子对接通过逐个氨基酸延长的模式，将20种氨基酸以二肽或三肽为核心进行筛选建库，得到靶向Fiber1 Knob结构域的虚拟肽库(库容量23869)。

点击SYBYL-X 2.1.1软件的Application>Docking Suite>Dock Ligands，将构建好的虚拟肽库与在靶标蛋白上预选择的活性口袋在SFXC模式下进行对接。操作界面中选择Perform CScore Calculations，开始分子对接，最终通过CScore打分函数评价多肽与目的蛋白的亲和力大小。

对接结果生成CScore、Crash和Polar值。CScore代表了生成的配体与对接靶标蛋白之间的亲和力，结果以总分数值展示；Crash代表配体分子与靶标蛋白的空间交互程度，绝对值越低越好；Polar则代表生成的配体与靶标蛋白之间氢键作用和盐桥对总亲和力的影响。根据对接之后的评分，选择评分最高的30条多肽送至上海吉尔生化公司合成(表1)。

表1靶向Fiber1 Knob结构域活性口袋对接后评分最高的30条亲和肽的评分

实施例2靶向Fiber1 Knob结构域亲和肽抑制FAdV-4感染的免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)鉴定

为了筛选到具有抗FAdV-4感染作用的亲和肽，设计并合成30条靶向Fiber1 Knob结构域的亲和肽(表1)，用100μM的浓度孵育LMH细胞(鸡肝癌细胞)24h后在显微镜下观察LMH细胞形态，作为对每种亲和肽细胞毒性的预先评估。具体如下：

(1)将细胞培养瓶中长至90％的LMH单层细胞使用胰蛋白酶液消化后，用DMEM(含10％ FBS)重悬细胞，然后按100μL/每孔铺至96孔细胞培养板中，放置于37℃的5％ CO

(2)将合成的多肽用无血清的DMEM分别稀释至200μM，然后将感染复数(Multiplicity of infection，MOI)为0.01的FAdV-4病毒液与稀释好的多肽预孵育1h；

(3)使用排枪将96孔细胞板中的细胞上清小心吸干净，然后将预孵育结束的多肽病毒混合物加入到LMH细胞上，加入要迅速，防止96孔板中细胞变干。每次确保都要更换新的枪头，然后将96孔培养板放置于培养箱孵育1h；

(4)弃去LMH细胞上清，用PBS小心清洗3次；

(5)培养24h后，弃去LMH细胞上清，然后小心地加入100μL PBS清洗细胞孔，避免清洗过程中细胞脱落，重复清洗操作三次；弃去最后一次的PBS，每孔加入-40℃预冷的甲醇100μL放置于-40℃冰箱中30min后进行细胞固定；

(6)弃去细胞上的甲醇，用PBST清洗孔板4-6次，彻底去除残留的甲醇试剂，将96孔板甩干后每孔加入100μL的用PBST配制的5％脱脂奶溶液，于37℃恒温培养箱封闭1h；

(7)使用PBST溶液清洗细胞板并重复4-6次，然后在37℃下与FAdV-4阳性血清孵育1h；

(8)使用PBST溶液清洗细胞板并重复4-6次，然后在37℃下与HRP标记的兔抗鸡IgG(H+L)(1：2 000稀释度)二抗孵育40min；

(9)使用PBST清洗细胞板并重复4-6次，然后使用AEC过氧化物酶底物试剂盒获得结果，并用倒置显微镜观察，待出现明显的红色颗粒时弃去显色液再用超纯水清洗。最终在细胞板中加入PBS(100μL/孔)防止细胞干燥脱落，在倒置显微镜下观察记录阳性孔的红色颗粒数，用于判断多肽的抗病毒效果。

结果显示，有部分多肽会严重损伤细胞，导致细胞收缩甚至破碎成碎片。接着通过IPMA检测没有细胞毒性的亲和肽对FAdV-4感染的抗病毒作用，将FAdV-4病毒(MOI＝0.01)与100μM肽在37℃预孵育1h，然后将混合物接种到单层LMH细胞中。通过IPMA在24h.p.i.(hours post-infection)检测FAdV-4的感染细胞数。结果表明，其中11条亲和肽(F1-P6、F1-P9、F1-P12、F1-P14、F1-P18、F1-P19、F1-P20、F1-P22、F1-P23、F1-P25和F1-P30)的感染病毒细胞数与阳性对照相比明显减少，初步证明这11条亲和肽的抗病毒作用(图5)。

实施例3靶向Fiber1 Knob结构域的亲和肽抑制FAdV-4感染的qPCR检测

为了进一步验证亲和肽的抗病毒作用，检测了FAdV-4的基因组拷贝数。将FAdV-4病毒(MOI＝0.01)分别与100μM的11条亲和肽在37℃预孵育1h，然后将混合物接种到单层LMH细胞中。通过qPCR在24h.p.i.检测FAdV-4的基因组拷贝数。

结果表明，与未处理组相比，这11条亲和肽处理过的细胞中FAdV-4拷贝数均显著降低，亲和肽F1-P20表现出最明显的抗病毒作用(图6)。

实施例4表面等离子体共振试验(SPR)测定多肽与蛋白之间的亲和力

为了检测上述亲和肽与Fiber1 Knob结构域蛋白之间的亲和力，通过SPR测定亲和肽与Fiber1蛋白的平衡解离常数(KD)。多肽与蛋白之间的平衡解离常数(KD)采用美国GE公司的Biacore X100仪测定(结果见表2)。

其操作步骤简述如下：

(1)首先打开仪器芯片室的门，点击Undock Chip按钮，拉开芯片槽导轨，把芯片按朝内方向插入并保证放平后推入芯片槽导轨，并关上芯片室的门；点击Dock Chip按钮。确认缓冲液瓶中有足够的溶液，用缓冲液润洗整个管道系统；

(2)顺序使用pH＝5.5、5.0、4.5、4.0的醋酸钠溶液进行偶联最佳pH测试，进样时间180秒，用50mM NaOH作为清洗溶液。最后根据预实验结果，选择合适的pH作为偶联条件；

(3)通过EDC/NHS法将目的蛋白在最佳pH醋酸钠溶液条件下偶联至CM5芯片；

(4)将待测的亲和肽用去除气泡的HBS-EP缓冲液倍比稀释，浓度从低到高依次上样，每个循环中，稀释好的多肽样以30μL/min的恒定速度流经芯片，在多肽与蛋白充分反应后，HBS-EP缓冲液以同样的速度流过芯片，使多肽从蛋白上解离，最后通过0.25％的SDS溶液将与蛋白结合的多肽完全解离后进行下一个循环，通过软件可以实时观察到芯片表面的共振信号变化；

(5)利用Biacore X100自带的评价软件(Biacore Evaluation Software)对信号图进行拟合分析，最终得到多肽与蛋白之间的KD值，从而评价两者之间的亲和力。

表2亲和肽与Fiber1 Knob结构域的平衡解离常数

本试验利用EDC/NHS法活化CM5芯片上的羧基基团，目的蛋白的氨基会与芯片上的羧基基团反应，二者通过脱水缩合生成肽键，这样蛋白就可以共价偶联至芯片上。利用预试验得到目的蛋白偶联芯片时醋酸钠缓冲液的最优pH值，根据运行结果显示的实时信号响应值曲线图，选择相差高于5 000的缓冲液pH作为偶联条件。如图7所示，于4个醋酸钠缓冲液pH条件下(pH＝4.0、4.5、5.0和5.5)进行试验，综合考虑溶液pH条件的缓和程度，选用pH＝4.5的醋酸钠溶液进行偶联。图8表明，蛋白偶联前后的信号值基线有明显差值，表明芯片与蛋白偶联成功。

将偶联的CM5芯片装载进机器，运行HBS-EP缓冲液。将多肽分别用HBS-EP缓冲液梯度稀释为50、25、12.5、6.25、3.125和0.78μM，从低浓度到高浓度的顺序流经CM5-Fiber1Knob芯片，每个浓度循环结束后用0.25％的SDS溶液解离芯片蛋白上结合的全部多肽，再进行下一条多肽的测试。最终通过Biacore X100自带的Evaluation软件拟合不同浓度的信号响应值曲线，得到多肽与蛋白结合的动力学数据，评价两者之间的亲和力，结果如图9所示。

结果表明，在与靶标蛋白Fiber1 Knob结构域有亲和力的前提下，与初筛得到的其余亲和肽相比，F1-P20初步展示出明显的FAdV-4体外抗病毒效果，因此选择F1-P20进行后续试验验证。

实施例5亲和肽F1-P20的细胞毒性试验

使用碧云天公司的Cell Counting Kit-8试剂盒进行细胞毒性试验评估。根据商品说明书操作，通过CCK-8试验检测不同浓度亲和肽F1-P20不同时间点对LMH细胞的毒性试验，用无血清DMEM稀释的不同浓度(0，1.56，3.125，6.25，12.5，25，50，100和200μM)的亲和肽F1-P20加入96孔板LMH细胞中，每个浓度设置8个重复孔，依次在24h和48h向每个孔中加入10μL CCK-8试剂，37℃孵育1h后用多功能酶标仪测定OD

实施例6亲和肽F1-P20体外抑制FAdV-4病毒感染试验

为了进一步确定亲和肽F1-P20对FAdV-4病毒的抗病毒作用，将不同浓度的亲和肽F1-P20与FAdV-4病毒(MOI＝0.01)在37℃预孵育1h后接种LMH细胞，作用1h后弃去上清，换为含有相同浓度的亲和肽F1-P20的2％维持液，于37℃培养至固定时间点进行收样。通过蛋白免疫印迹试验(WB)、间接免疫荧光试验(IFA)、半数组织培养感染剂量(TCID

在48h.p.i，用WB分析各组Fiber 2和GAPDH的表达水平。WB结果显示，在48h.p.i.，F1-P20不同浓度(3.125、6.25、12.5、25和50μM)处理组与病毒组相比，FAdV-4病毒的Fiber2蛋白表达量均显著降低(图11A)。

利用抗Fiber 2的单克隆抗体5A5和FITC偶联的山羊抗小鼠IgG抗体，通过IFA检测FAdV-4感染细胞的情况。IFA结果显示，与只接毒处理组(0μM)相比，F1-P20不同浓度(3.125、6.25、12.5、25和50μM)处理组的FAdV-4病毒的感染细胞数明显减少(图11B)。

采用Reed-Muench方法计算各时间点的TCID