苍耳倍半萜内酯类化合物及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及苍耳倍半萜内酯类化合物及其提取方法和应用。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性关节滑膜炎为主要特征的自身免疫性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。类风湿性关节炎的治疗缺乏特效疗法，以缓解症状、延缓病情和防治并发症为主要目标。药物治疗包括非甾体抗炎药、糖皮质激素、抗风湿药、生物制剂和靶向药物等。非甾体抗炎药消炎镇痛，糖皮质激素可以抗炎，但两者均不能阻止病情进展；抗风湿药可以抑制疾病进程，但起效慢，且对肝、肾、骨髓毒副作用大；生物制剂和靶向药物可以有效改善疾病预后，但昂贵的价格和可能的药物脱靶，使大多数患者的治疗难以为继。因此，深入开发安全有效的抗RA药物具有重要意义。

中药苍耳草为菊科苍耳属植物苍耳(拉丁文名为Xanthium sibiricum L)和蒙古苍耳(拉丁文名为Xanthium mongolicum Kitag)的茎叶，《本草纲目·草部》记载苍耳的茎叶(苍耳草)具有祛风散热功效，也是现代常用来治疗抗类风湿关节炎的中药。但是其有效成分及作用机制研究较少，特别是其抗类风湿关节炎物质基础并不清楚。

基于此提出本申请。

发明内容

本发明的目的在于提供苍耳倍半萜内酯类化合物及其提取方法和应用。有助于从中药苍耳草倍半萜内酯中开发抗类风湿关节炎药物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了苍耳倍半萜内酯类化合物的提取方法，包括如下步骤：

(1)将苍耳草用乙醇回流提取，得到提取液；

(2)将所述提取液进行浓缩，得到粗浸膏；

(3)依次使用石油醚和二氯甲烷对所述粗浸膏进行萃取，得到浸膏；

(4)将所述浸膏经柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱后，得到馏分；

(5)将所述馏分纯化，得到苍耳倍半萜内酯类化合物；

步骤(1)中，所述乙醇的初始浓度为60～80wt％；所述回流提取的次数为2～4次；

步骤(2)中，所述浓缩为减压浓缩；

步骤(3)中，所述石油醚的沸程为60～80℃。

本发明还提供了所述的苍耳倍半萜内酯类化合物的提取方法提取得到的苍耳倍半萜内酯类化合物，所述苍耳倍半萜内酯类化合物的结构如式1～式10所示的化合物的一种或多种：

本发明还提供了苍耳倍半萜内酯类化合物在制备抗炎制剂中的应用。

本发明还提供了苍耳倍半萜内酯类化合物在制备抗关节炎制剂中的应用。

本发明还提供了苍耳倍半萜内酯类化合物在制备调节巨噬细胞极化平衡制剂中的应用。

本发明还提供了苍耳倍半萜内酯类化合物在制备JAK2抑制剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了苍耳倍半萜内酯类化合物的提取方法，提取得到的苍耳倍半萜内酯类化合物能抑制巨噬细胞释放炎症因子发挥抗炎作用，因此，苍耳倍半萜内酯类化合物可以作为抗炎制剂使用。通过qRT-PCR、免疫荧光法、流式细胞术和蛋白免疫印迹技术还表明本发明所述的苍耳倍半萜内酯类化合物还可以用作巨噬细胞极化调节剂和JAK2抑制剂。进一步研究表明，苍耳倍半萜内酯类化合物能够显著改善关节炎小鼠的炎性症状；因此，苍耳倍半萜内酯类化合物可以用于制备抗RA药物。

附图说明

图1为苍耳倍半萜内酯类化合物的结构式；

图2为苍耳倍半萜内酯类化合物对LPS诱导RAW264.7细胞内炎症因子的抑制效果(A为化合物1～10对RAW264.7细胞增殖的影响，B为化合物1～10对RAW264.7细胞内Tnf-α的mRNA水平的影响，C为化合物1～10对RAW264.7细胞内Il-1β的mRNA水平的影响，D为化合物1～10对RAW264.7细胞内Il-6的mRNA水平的影响)；

图3为苍耳倍半萜内酯类化合物对类风湿性关节炎的影响(A为ZIA动物模型的建立，B为关于小鼠体重的实验数据，C为关于小鼠爪垫厚度的实验数据，D为关于小鼠踝关节宽度的实验数据，E为关于关节炎评分的实验数据，F为小鼠足爪的侧视图)；

图4为苍耳倍半萜内酯类化合物对巨噬细胞极化活性的影响(A为细胞内Il-6的mRNA水平，B为细胞内Il-1β的mRNA水平，C为细胞内Tnf-α的mRNA水平，D为细胞内Inos的mRNA水平，E为细胞内Cd206的mRNA水平，F为细胞内Il-10的mRNA水平，G为CD86蛋白分子的免疫荧光染色标记图，H为CD206蛋白分子的免疫荧光染色标记图，I为流式细胞术考察苍耳倍半萜内酯类化合物对M1型巨噬细胞极化的影响，J为流式细胞术考察苍耳倍半萜内酯类化合物对M2型巨噬细胞极化的影响图)；

图5为XTEO的免疫印迹实验检测图(A为基于网络药理学预测XTEO治疗RA的潜在作用靶点，B为XTEO对LPS和IFN-γ诱导的RAW264.7细胞转录组的影响，C为XTEO对JAK2-STAT3信号通路相关蛋白表达的影响)；

图6为XTEO对关节炎小鼠的毒副作用(A为小鼠心、肝、脾、肺和肾切片H&E染色，B为小鼠心外观拍摄图，C为小鼠脾外观拍摄，图D为小鼠肾外观拍摄图)。

具体实施方式

本发明提供了苍耳倍半萜内酯类化合物的提取方法，包括如下步骤：

(1)将苍耳草用乙醇回流提取，得到提取液；

(2)将所述提取液进行浓缩，得到粗浸膏；

(3)依次使用石油醚和二氯甲烷对所述粗浸膏进行萃取，得到浸膏；

(4)将所述浸膏经柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱后，得到馏分；

(5)将所述馏分纯化，得到苍耳倍半萜内酯类化合物；

步骤(1)中，所述乙醇的初始浓度为60～80wt％，优选为65～75wt％，进一步优选为70wt％；所述回流提取的次数为2～4次，优选为3次；

步骤(2)中，所述浓缩为减压浓缩；

步骤(3)中，所述石油醚的沸程为60～80℃，优选为65～75℃，进一步优选为70℃。

本发明还提供了所述的苍耳倍半萜内酯类化合物的提取方法提取得到的苍耳倍半萜内酯类化合物，所述苍耳倍半萜内酯类化合物的结构如式1～式10所示的化合物一种或多种：

本发明还提供了苍耳倍半萜内酯类化合物在制备抗炎制剂中的应用。

本发明还提供了苍耳倍半萜内酯类化合物在制备抗关节炎制剂中的应用。

本发明还提供了苍耳倍半萜内酯类化合物在制备调节巨噬细胞极化平衡制剂中的应用。

本发明还提供了苍耳倍半萜内酯类化合物在制备JAK2抑制剂中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本发明提供了苍耳倍半萜内酯类化合物的提取方法，包括如下步骤：

(1)将苍耳草粉碎，用70wt％乙醇回流提取3次，合并提取液；

(2)将提取液进行减压浓缩，得到粗浸膏；

(3)依次使用70℃的石油醚和二氯甲烷对所述粗浸膏进行萃取，得到浸膏；

(4)将所述浸膏经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱后，得到馏分；

(5)将所述馏分经RP-C18柱层析、Sephadex LH-20柱层析和制备型HPLC，以甲醇/水梯度洗脱得到化合物1～10。

化合物的结构式如图1所示。

实施例2

苍耳倍半萜内酯类化合物抗炎活性实验：

选取生长状态良好的RAW264.7细胞，以每孔接种4×10

根据图2可知，与对照组相比，模型组中LPS诱导RAW264.7细胞内Tnf-α、Il-1β和Il-6的mRNA水平显著升高；与模型组相比，式1～10所示的倍半萜内酯类化合物显著抑制LPS诱导的Tnf-α和Il-1βmRNA水平的升高。此外，式5所示的倍半萜内酯类化合物(英文名：8-epi-xanthatin-1β,5β-epoxide，XTEO)对LPS诱导的Tnf-α、Il-1β和Il-6mRNA水平升高的抑制作用最强，其效果优于阳性对照药组。因此，以上结果表明苍耳倍半萜内酯类化合物可抑制炎症因子Il-6、Il-1β、Tnf-α和NO释放。这说明苍耳倍半萜内酯类化合物可以作为抗炎药物使用。

实施例3

苍耳倍半萜内酯类化合物抗类风湿性关节炎活性实验：

C57BL/6J小鼠适应性饲养一周后，随机分组为对照组、模型组、XTEO低剂量组(15mg/kg)、XTEO高剂量组(30mg/kg)和地塞米松组(2mg/kg)，XTEO表示实施例1得到的式5化合物，每组8只。除对照组小鼠外，其余各组小鼠均进行造模处理，本部分实验采用两次免疫法进行关节炎小鼠模型的建立，如图3所示。造模时，小鼠右后爪足内注射20μL酵母聚糖A生理盐水溶液(30mg/mL)、左后爪注射等量生理盐水，对照组小鼠左右后爪足内注射等体积生理盐水。造模后一天开始灌胃给药，对照组和模型组给予等体积生理盐水。实验为期11d，每天精准测量各组小鼠体重，用游标卡尺精准测量爪垫厚底和踝关节宽度用于定量肿胀程度，实验结果如图3所示，图中Ctrl为对照组，ZIA为模型组，XTEO为式5所示的倍半萜内酯类化合物，DM为地塞米松组。

从图3可知，与对照组相比，模型组小鼠爪垫厚度和踝关节宽度显著增加；与模型组相比，式5所示的倍半萜内酯类化合物剂量依赖性地抑制关节炎小鼠模型爪垫厚度、踝关节宽度和关节炎评分的增加。以上实验数据说明，式5所示的倍半萜内酯类化合物能够减缓关节炎小鼠疾病进程，改善关节炎小鼠足爪肿胀。这说明苍耳倍半萜内酯类化合物可以作为抗关节炎药物使用。

实施例4

调节巨噬细胞极化活性实验：

将RAW264.7细胞以1×10

如图4所示，与对照组相比，LPS和IFN-γ诱导的RAW264.7细胞内Il-6、Il-1β、Tnf-α和Inos mRNA水平显著升高；与M1型巨噬细胞极化模型组的细胞相比，XTEO能够显著抑制LPS和IFN-γ诱导的Il-6、Il-1β、Tnf-α和Inos的mRNA水平的升高，且呈浓度依赖关系。XTEO为实施例1得到的式5化合物。如图4所示，与对照组相比，IL-4和IL-13共刺激的RAW264.7细胞内Cd206和Il-10的mRNA水平显著升高；与M2型巨噬细胞极化模型组相比，XTEO能够浓度依赖地升高Cd206和Il-10的mRNA水平。其次，利用免疫荧光染色分别标记CD86和CD206蛋白分子，如图4所示，XTEO能够抑制M1型巨噬细胞中上调的CD86蛋白表达，并且能够促进M2型巨噬细胞的标记分子CD206的表达。同样地，利用流式细胞术考察XTEO对巨噬细胞极化的影响，如图4所示，在M1型巨噬细胞极化模型中，与对照组相比，CD86

实施例5

抑制JAK/STAT信号通路活性实验：

利用免疫印迹(Western Blot)实验检测XTEO对LPS和IFN-γ诱导的RAW264.7细胞中JAK2-STAT3信号通路相关蛋白表达的影响。XTEO为实施例1得到的式5化合物。

蛋白提取：选取生长状态良好的RAW264.7细胞制成细胞悬液，并接种在6孔板内，细胞贴壁后将培养基换成无血清含药培养基，以LPS(100ng/mL)和IFN-γ(20ng/mL)建立M1型巨噬细胞极化模型；以IL-4(20ng/mL)和IL-13(20ng/mL)建立M2型巨噬细胞极化模型。加入XTEO(2μM)在37℃、5％CO

免疫印迹实验：将已制好胶的玻璃板按操作方法夹入电泳夹，置于电泳槽后倒入适量电泳液，将待检测蛋白样品按顺序加入上样孔内，在样品两端加入预染蛋白质Marker。上样后进行电泳，先用60V恒压电泳至Marker全部分开，再将电压调至120V电泳至溴酚蓝位于玻璃板底部即可终止。电泳结束后，取出凝胶并将其裁切为适宜大小，取PVDF膜用甲醇活化，按海绵-双层滤纸-胶-PVDF膜-双层滤纸-海绵的顺序进行湿法转膜，避免气泡干扰，将转膜夹放置电泳槽后补足转膜液，电泳槽整体冰浴，300mA恒流转膜1.5h。转膜结束后，将PVDF膜放入封闭液中，摇床室温封闭2h后，再用相应抗体室温摇床孵育2h。孵育结束后，TBST清洗3次，每次10min，再分别放入对应的二抗稀释液中，室温孵育2h后，TBST清洗3次，每次10min。将ECL发光液A液和B液等体积混匀，均匀滴加到转印膜蛋白表面，放入凝胶成像系统中进行检测。所得图片用ImageJ软件进行分析和定量，结果如图5所示。

如图5所示，与对照组相比，M1型巨噬细胞极化模型组P-JAK2、JAK2和P-STAT3蛋白表达显著升高；与模型组相比，XTEO浓度依赖地抑制LPS和IFN-γ诱导的P-JAK2、JAK2和P-STAT3蛋白表达的上调。说明XTEO能够抑制LPS和IFN-γ诱导的JAK2-STAT3信号通路的激活。与对照组相比，M1型巨噬细胞极化模型组P-p65和P-IκBα蛋白表达显著升高，IκBα蛋白表达显著降低；XTEO能够浓度依赖地抑制LPS和IFN-γ诱导的IκBα降解以及p65和IκBα的磷酸化。以上实验数据说明，苍耳倍半萜内酯类化合物可以作为JAK2抑制剂使用。

实施例6

毒性试验：

为考察XTEO药物的毒副作用，实施例3实验结束后，处死小鼠，取心、肝、脾、肺和肾组织，用生理盐水清洗干净，固定于4％多聚甲醛中。将固定好的脏器组织和充分脱钙的关节组织进行梯度乙醇脱水和二甲苯透化，石蜡包埋处理好的组织，并用切片机将组织切成5μm厚的切片，进行H&E染色，其中XTEO为实施例1得到的式5化合物。结果如图6所示，图中Ctrl为对照组，ZIA为模型组，XTEO为式5所示的倍半萜内酯类化合物，DM为地塞米松组。

由图6可知，观察心、脾和肾外观大体未见异常，XTEO给药组小鼠的心、肝、脾、肺和肾的病理切片未见明显异常，说明XTEO给药后小鼠的主要脏器并未发生病理病变。另外，与模型组相比，给予XTEO治疗组小鼠体重没有显著差异。以上实验数据证明，XTEO在治疗剂量范围内对小鼠没有明显的毒副作用。

根据上述的实施例可见，本发明提供了苍耳倍半萜内酯类化合物的提取方法，提取得到的苍耳倍半萜内酯类化合物能抑制巨噬细胞释放炎症因子发挥抗炎作用，因此，苍耳倍半萜内酯类化合物可以作为抗炎制剂使用；本发明所述的苍耳倍半萜内酯类化合物还可以用作巨噬细胞极化调节剂和JAK2抑制剂；能够显著改善关节炎小鼠的炎性症状，因此，苍耳倍半萜内酯类化合物可以用于制备抗类风湿药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。