一种棉子糖肠球菌代谢组学研究的样品处理方法

技术领域

本专利涉及使用GC-MS对棉子糖肠球菌胞内小分子代谢物进行检测，属于化学检测分析领域。

背景技术

棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)为肠球菌属(Enterococcus)细菌，属于兼性厌氧革兰氏阳性菌，在自然界中广泛分布于各种环境中，在人与多种哺乳动物的肠道内也广泛存在，属于肠道菌群的组成部分，当机体部分功能失调时则可能发生感染。虽然棉子糖肠球菌具有一定致病性，但临床感染病例罕见，相比于屎肠球菌(Enterococcusfaecium)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)等同属菌株的致病性更低。故采用棉子糖肠球菌进行肠球菌相关实验更为安全，因此，该菌株将会成为研究肠球菌等相关菌株的重要菌株。

棉子糖肠球菌可发酵产生多种可应用到生产生活中的发酵产品。其中，高强等人在中国授权发明专利ZL201210003931.8中公开了一种制备γ-氨基丁酸(γ -aminobutyric acid)的新方法，在东北酸菜中分离选育出棉子糖肠球菌CGMCC No.5584，可大幅度提高γ-氨基丁酸产量，为生物发酵法生产γ-氨基丁酸提供了新的选择和方向。

目前通过代谢组学方法探究微生物内在代谢机制的技术日趋成熟，GC-MS 技术能检测出大量小分子代谢物，它凭借其强大的分离与鉴定能力，加之其强大的数据库成为代谢组学研究最主要的技术之一。目前，通过代谢组学研究各种微生物的方法常有报道，但是棉子糖肠球菌的代谢组学研究尚为空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于GC-MS技术对棉子糖肠球菌进行代谢组学研究的样品处理方法，为分析棉子糖肠球菌中的胞内小分子代谢物，建立一个高效、快捷、简便、精准的分析方法，并为棉子糖肠球菌代谢组学等方面的研究提供技术支持和科学依据。

所述步骤包括：细菌活化培养、菌液淬灭、菌体清洗、菌体破碎、小分子代谢物的提取和衍生化。

菌体淬灭即通过骤变菌体所处环境来降低胞内代谢酶的活性，从而使胞内代谢反应停止。常见的淬灭方式主要两种，骤变温度法和有机溶剂法。本发明将二者相结合，采用-20℃预冷的甲醇和超纯水的混合液(V

菌体清洗即清洗菌体表面的培养基，避免因培养基残留而影响检测结果。清洗的次数过少无法达到去除菌体表面杂质培养基的目的，清洗次数过多会导致菌体内代谢物外流，影响检测结果。清洗液浓度和温度也至关重要，浓度过高，导致菌体失水，代谢物随之流出，浓度过低会使菌体吸水涨破，无法进行后续试验。处理时应保持低温环境，避免菌体内的部分小分子代谢物分解。因此，本发明使用4℃预冷的0.6～0.85％NaCl溶液清洗菌体3次，以确保洗净菌体表面的杂质培养基成分，同时可避免菌体内小分代谢物流出损失影响检测结果。

菌体破碎方法有很多种，常见的破碎方法主要分为三大类：生物化学方法、机械方法、物理方法。由于生物化学方法会引入外源酶等物质，影响后续检测，所以本发明不予采用。本发明研究采用物理研磨破碎法对菌体进行破碎，通过液氮研磨与反复冻融对菌体进行破碎，由于液氮温度为-196℃，此超低温环境既能够保证菌体内物质不被分解损坏，又能够使菌体冷冻变硬从而利于菌体的破碎；冻融时间的控制也是菌体破碎过程中一个重要参数，冻融时间太短无法使菌体完全破碎，影响提取率，冻融时间过长对提取影响不大，但不利于后续试验的进行。低温超声破碎法是利用一种频率高于20kHz的声波，利用其特有的声能对菌体进行破碎，同时为其创造低温环境使菌体内小分子物质不被分解。破碎后的菌体悬液通过0.22μm的微孔滤膜过滤去除菌体碎片，滤出液用于后续的试验。

对菌体内小分子代谢物的提取要求尽可能多的提取胞内小分子代谢物，同时不改变其物理化学性质。目前已知的代谢物提取方法主要通过有机溶剂进行提取，例如，冷甲醇、热乙醇、高氯酸或碱、热甲醇、甲醇-氯仿混合液以及乙腈等。相关研究表明，氯仿、乙醇和超纯水按照一定的比例混合可以提高代谢物提取率。因此，本发明采用氯仿、乙醇和超纯水的混合液作为提取液，并结合液氮反复冻融的方法以提高代谢产物的提取率。

衍生化在GC-MS检测中是至关重要的一步，GC-MS检测原理是通过将汽化的物质通过色谱柱，从而使物质得到分离。但对一些高沸点的物质，升温程序无法升到其沸点，导致检测物质无法汽化，从而不能分离。由于菌体内物质复杂多样，所以，必须使用衍生剂取代其相关官能团，改变其沸点，使尽可能多的物质汽化，从而检测出更多的组分。本发明通过使用甲氧基铵盐酸盐/吡啶和N-甲基 -N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺作为衍生剂，可以取代羟基和羧基的官能团，从而降低其沸点，以便后续的分离和检测。

本发明实施例1～4中，所述细菌培养方法具体包括：

将保存于-80℃甘油管中的棉子糖肠球菌(E.raffinosus)CGMCC No.5584 接种于斜面培养基，30℃条件下培养12～20h，无菌环挑取单一菌落接种至种子培养液中，30℃静置培养16～24h，从而得到棉子糖肠球菌菌液样品。

本发明实施例1～4中，所述菌液淬灭方法具体包括：

将甲醇和超纯水按照体积比2～2.5∶3混合得到淬灭液，预冷至-20℃以下，取150mL与50mL菌液混合进行淬灭，离心弃上清。

本发明实施例1～4中，所述菌体清洗方法具体包括：

将淬灭后的EP管置于冰上保存，加入4℃预冷的清洗液混匀，离心弃上清，分别重复2次、3次、4次；离心后的菌体保存于-80℃冰箱备用。所述清洗液为 4℃预冷的质量分数0.6～0.85％的NaCl溶液。所述离心条件为8000r/min，4℃、 10min。

本发明实施例中，所述菌体破碎方法具体包括：

(1)取-80℃冻存的菌体，将菌体置于洁净的10～16层医用纱布滤去水分，再将菌体置于液氮预冷的研钵中，研磨至细粉状，称取100mg菌体粉末至液氮预冷的2mL EP管后，至冰上保存；每管样品加入1mL提取液，涡旋3～5min混匀至乳白色，置于冰上保存。液氮冻融时，每次分别冻融2min、3min、4min，重复4次，0.22μm微孔膜过滤至1.5mLEP管，封口，于真空干燥箱中干燥。(实施例1～3)

(2)清洗后的菌体与甲醇混匀，置于40kHz的超声仪中破碎，放入冰袋保持低温环境，每隔4～6min将菌体摇匀一次，超声30～40min，真空冷冻干燥后-80℃备用。(实施例4)

本发明实施例1～4中，胞内小分子代谢物提取方法具体包括：

在装有样品的EP管中加入1mL提取液，涡旋3～5min混匀至乳白色，置于冰盒上保存，过程所述提取液为V

本发明实施例1～4中，所述衍生化方法具体包括：

(1)取200μL提取液加15～20μL的1mg/mL氘代琥珀酸，真空冷冻干燥之后，加80μL甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液，充分溶解样品，再置于40℃水浴中，反应80min；取200μL提取液加入冻干后的样品中，真空冷冻干燥之后，加80 μL甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液，充分溶解样品，再置于40℃水浴中，反应80min；

(2)水浴后的样品中加入120μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均匀后置于40℃水浴中，反应80min；

(3)衍生后的样品于10000r/min、4℃离心5min后，取上清100μL加入已编号的进样瓶中，室温静置2～3h后置于-80℃冰冻，用于以后的GC-MS检测。衍生化过程所述的衍生化试剂为甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液(M

本发明所用菌种来源见国家发明专利：一种高产γ-氨基丁酸的方法及应用，授权号ZL201210003931.8。该专利中公开的棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.5584。

本发明具有的优势和显著效果：本发明对棉子糖肠球菌GC-MS样品前处理方法进行了多组单因素实验，侧重分析菌体的清洗次数、菌体破碎方式以及冻融时间对样品的影响，通过比较各单因素实验结果，优化建立了一种适用于棉子糖肠球菌的GC-MS样品前处理方法。采用优化后的方法通过GC-MS检测和分析时发现：首先，通过该方法处理后，可以检测出253种胞内物质，其中可以精确匹配到47种，包括：醇类5种，酸类30种，烷类2种，酯类5种，糖类1种，烯类1种，苯环类2种，其他1种；其次，该方法提取得到的样品进行检测时，数据稳定性较高，基线平稳，峰形标准。因此，综合谱图的峰数、峰形、基线以及匹配结果等多个指标，确定本方法为用于棉子糖肠球菌GC-MS检测的最佳样品前处理方法。该方法对于棉子糖肠球菌的代谢组学研究具有重要意义。

附图说明

图1：棉子糖肠球菌GC-MS总离子流图

图2：不同清洗次数对小分子代谢物提取的影响色谱图

图3：不同清洗次数对小分子代谢物提取的影响色谱叠加图

图4：不同冻融时间对小分子代谢物提取的影响色谱图

图5：不同冻融时间对小分子代谢物提取的影响色谱图叠加图

图6：不同破碎方式对小分子代谢物提取的影响色谱图

图7：不同破碎方式对小分子代谢物提取的影响色谱图叠加图

具体实施措施

为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明内容，但本发明内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

棉子糖肠球菌代谢组分析前处理方法

(1)棉子糖肠球菌CGMCC No.5584的活化培养

将棉子糖肠球菌CGMCC No.5584甘油管保藏液接种在斜面培养基，30℃条件下培养12～20h，无菌环挑取单一菌落接种至种子培养液中，置于30℃静置培养16～24h，从而得到棉子糖肠球菌菌液样品；

主要培养基

斜面培养基(g/L)：蛋白胨15～20，牛肉膏10～12，酵母浸粉5～7，葡萄糖 10～15，乙酸钠5～7，柠檬酸铵2～2.5，硫酸锰0.05，硫酸镁0.2，琼脂15～18。

种子培养基(g/L)：蛋白胨10～20，酵母浸粉5～7，葡萄糖10～15，乙酸钠 0.1，柠檬酸铵2～2.5，硫酸锰0.05，硫酸镁0.2，吐温-801～2mL。

(2)菌液淬灭

取锥形瓶中50mL菌液样品与250mL冰甲醇(-20℃预冷的V

(3)菌体的清洗

加入4℃预冷的0.6～0.85％NaCl溶液定容至50mL，涡旋3～5min后，4℃、 8000r/min离心10min，反复清洗菌体2～4次，放入-80℃冰箱备用。

(4)菌体破碎

将用洁净的10～16层医用纱布吸干水分后的菌体取出放入液氮预冷的研钵中，液氮研磨菌体至白色细粉末，称取100mg于2mL EP管中，置冰上保存待用。

(5)胞内物质提取

取1mL提取液(V

(6)胞内物质衍生化

取干燥后的样品，分别加入80μL的20mg/mL甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液(M

(7)GC-MS检测：

色谱条件：仪器：美国安捷伦5977B+7890A型单四极杆质谱仪；色谱柱：AgilentHP-560mm×0.25mm×0.25μm；载气：氮气；进样口温度：280℃；进样量：1μL；流速：1mL/min；分流比：5∶1；程序升温：初始温度70℃下保持 2min，以5℃/min程序升温至290℃保持5min。

质谱条件：接口温度：280℃；电离方式：电子轰击电离(EI+)；离子源温度：230℃；扫描质量范围：50～800m/z。

数据处理：将由GC-MS采集的原始数据和NIST 17.0数据库进行比，对搜索得到相应的代谢物的名称，去除冗杂峰和重峰。

(8)胞内成分分析

取上述胞内提取物1μL，用GC-MS检测出253种物质。将检测结果通过 NIST 17.0数据库进行匹配，选取数据库匹配度高于70％的峰，并结合相关文献对图谱解析来确定各物质，总离子流图见图1，结果见表1。由表1可知，棉子糖肠球菌胞内代谢物种类复杂，本发明鉴定出47种物质，其中包括：醇类5种，酸类30种，烷类2种，酯类5种，糖类1种，烯类1种，苯环类2种，其他1 种。

表1 棉子糖肠球菌胞内小分子代谢物组成的检测结果

实施例2

棉子糖肠球菌CGMCC No.5584清洗次数对提取物的影响

参照实例1，用0.6～0.85％的NaCl对细胞清洗时的次数分别改为2次、3次、 4次，其他条件不变，其中处理后得到的样品经过GC-MS检测，代谢物色谱图如图2所示，自上至下清洗次数依次为2次、3次、4次，其代谢物色谱叠加图如图3所示，代谢物的数量如表2所示。

表2 不同清洗次数样品中代谢物数量

通过GC-MS检测胞内代谢物发现，清洗次数为2次时，检测出238种物质；清洗次数为3次时，检测出253种物质；清洗次数为4次时，检测出197种物质。检测次数为3次时，峰的数量明显增多，说明清洗次数过多会造成菌体内物质流失，所以选取清洗次数3次为最佳清洗次数。

实施例3

棉子糖肠球菌CGMCC No.5584冻融时间对提取物的影响

参照实施例1，将冻融时间分别改为2min、3min、4min，其他条件不变，处理后得到的样品经过GC-MS检测，代谢物色谱图如图4所示，自上至下冻融时间依次为清洗2min、3min、4min，其代谢物色谱叠加图如图5所示，代谢物的数量如表3所示。

表3 不同冻融时间样品中代谢物数量

当冻融时间控制在2min时，检测出229种代谢物；当冻融时间控制在3min 时，检测出253种代谢物；当冻融时间控制在4min时，检测出247种代谢物。对实验结果比较后发现，冻融时间为3min时的代谢物检出量明显高于2min时的检测数量，但冻融时间为4min时的检测物质种类不再增多，证明当冻融时间超过3min后代谢物数量随着冻融时间增长无明显变化，但在3min内增加冻融时间有利于小分子代谢物的提取，所以选取3min为最佳冻融时间。

实施例4

棉子糖肠球菌破碎方式对提取物的影响

参照实例1，将破碎方式分别改为低温超声破碎和液氮研磨破碎，其他条件不变，其中处理后得到的样品经过GC-MS检测，代谢物提取色谱图如图6所示，自上至下破碎方式依次为超声破碎和液氮破碎，其代谢物色谱叠加图如图7所示，代谢物的数量如表4所示。

表4 不同破碎方式样品中代谢物数量

超声破碎后的样品通过GC-MS检测出211种物质，而液氮研磨破碎后的样品检测出253种物质。如图7所示，通过数据分析软件进行色谱图叠加发现，通过液氮研磨的样品单个物质峰面积明显高于超声破碎的样品，所以，液氮研磨相对于超声破碎而言，能够尽可能多的提取出胞内小分子代谢物。

虽然本发明已经把较优实施例公开如上，但并非仅限定以上实施例。任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明主旨的前提下还可以做出许多相关改动，这里无法一一列举，所以凡是基于本发明的变化和改进，均属于本发明的保护范围。