瓜尔胶衍生物在生物杀真菌剂组合物中的用途

本申请要求于2018年11月29日提交的USPA号62/772828的优先权，出于所有目的将所述申请的全部内容通过援引方式并入本申请。

本发明涉及瓜尔胶衍生物在生物杀真菌剂组合物中的用途，尤其是瓜尔胶衍生物用于微生物、特别是抑制性微生物的生长的用途。

由真菌物种引起的病害被认为是世界范围内最普遍并且对植物最具破坏力的病害之一。目前，植物真菌病害的控制很大程度上取决于某些化学品的施用。尽管已知这些化学品中的一些具有负面的环境和人类健康问题，但是由于此类化学品对重要的真菌病害具有很强的活性，并且对环境更安全和有效的替代品的可获得性有限，所以它们继续被广泛使用。

通常，相对于更传统的合成化学控制方法，对通常侵染根区(根际)和叶区(叶面)中植物的病害进行生物控制是优选的。此类生物控制剂通常对植物宿主或环境伤害很小或没有伤害，并且有些甚至可能有利于正常的植物发育。然而，大多数此类生物控制生物体典型地在它们对抗真菌疾病的效力范围方面，或者在它们在制剂条件、存储条件、在实际田间条件下的应用和在处理应用期间存活和保持活性的能力方面非常有限。

已经尝试通过使用某些微生物来控制植物真菌性病害。

农业中使用的微生物通常是细菌、酵母菌、霉菌、菌根。

因此，需要找到维持或甚至改善目标微生物的活性和效率的方法。

还需要找到在给定培养基中特别维持或改善目标微生物生长的方法。

更一般地说，需要提供可用于选择性改善给定培养基中目标微生物生长的制剂。

还需要提供用于选择性地刺激在给定培养基中的目标微生物的制剂。

诸位发明人发现特定的瓜尔胶衍生物可用于解决这些需求。

因此，本发明涉及杀真菌剂组合物，其包含生物杀真菌剂和含有至少一个羟烷基的瓜尔胶衍生物。

根据本发明，本发明的瓜尔胶衍生物可以增加生物杀真菌剂的生长速率。

微生物、特别是抑制性微生物的生长速率可以通过以下方法测量：

微生物在瓜尔胶存在的培养基中培养。在不同的时间进行取样，以便使用铺板法确定菌落形成单位(CFU)的数目。利用这种方法，获得了细菌细胞的数目(表示为CFU)随时间的变化。微生物的生长遵循指数定律：N

根据实施例，本发明涉及用于维持或增加微生物、特别是抑制性微生物的生长速率的方法，该方法包括使所述微生物与本发明的瓜尔胶衍生物接触的步骤。

本发明基于本发明的瓜尔胶衍生物的用途，该瓜尔胶衍生物能够随着时间的推移维持微生物、特别是抑制性微生物的生物杀真菌剂作用并且使其保持恒定，并且换句话说，维持微生物的生长速率并且特别是维持细菌的生长速率。

有利地，使用所述瓜尔胶衍生物能够增加微生物、特别是抑制性微生物的生物杀真菌活性，换句话说，当与本发明的瓜尔胶衍生物联合或组合施用时，微生物的生物杀真菌活性显著或明显大于不使用所述瓜尔胶衍生物获得的生物杀真菌活性。

优选地，根据本发明，当使用如上定义的瓜尔胶衍生物时，与不使用瓜尔胶衍生物时的微生物的生长速度相比，微生物的生长速率增加了至少5％、优选地至少10％。

本发明还涉及微生物、特别是抑制性微生物和含有至少一个羟烷基的瓜尔胶衍生物作为生物杀真菌剂的用途。

本发明还涉及一种试剂盒，其包含至少一种微生物、特别是抑制性微生物以及至少一种含有至少一个羟烷基的瓜尔胶衍生物，以及所述试剂盒作为生物杀真菌剂的用途。

根据实施例，本发明涉及一种用于控制真菌生物体的方法，该方法包括施用如前所述的杀真菌剂组合物。

本发明还涉及一种控制或防止植物被致植物病真菌侵染的方法，该方法包括将如前所述的杀真菌剂组合物施用于所述植物的步骤。

根据实施例，如上提及的瓜尔胶衍生物用于植物、种子或土壤中。

贯穿本说明，包括权利要求书，术语“包含一个/一种(comprising one)”或者“包含一个/一种(comprising a)”应理解为是与术语“包含至少一个/一种”同义，除非另外指明，“在…之间”和“从...至...”应理解为包括极限值。

如在此使用的，“重量百分比”、“wt％”、“按重量计的百分比”、“按重量计％”、以及其变体指的是当将那种物质的重量除以组合物的总重量并且乘以100时的物质浓度。

如果通过援引并入本文的任何专利、专利申请和公开物的披露内容与本申请的说明相冲突到了可能导致术语不清楚的程度，则本说明应优先。

瓜尔胶

瓜尔胶是由糖半乳糖和甘露糖构成的多糖。主链是β1,4-连接的甘露糖残基直链，平均地在每隔一个甘露糖处半乳糖残基1,6-连接到该甘露糖残基直链，形成短的侧单元。

本发明的瓜尔胶衍生物含有至少一个羟烷基。

根据本发明实施例中的一个，羟烷基是C

根据本发明实施例中的一个，羟烷基是羟丙基。

根据本发明实施例中的任一个，本发明的瓜尔胶衍生物的羟烷基化度(摩尔取代度或MS)意指由存在于多糖上的游离羟基官能团的数目所消耗的环氧烷分子的数目。

根据本发明实施例中的任一个，本发明的瓜尔胶衍生物具有高于或等于约0.1、例如高于或等于约0.2的羟烷基化度(MS)。

根据本发明实施例中的任一个，本发明的瓜尔胶衍生物具有低于或等于约3.0、例如低于或等于约2.0的羟烷基化度(MS)。

根据本发明实施例中的任一个，本发明的瓜尔胶衍生物具有包括在约0.1与约3.0之间、例如在约0.1与约2.0之间的羟烷基化度(MS)。

包含至少一个羟烷基的本发明的瓜尔胶衍生物可以例如通过以下方式来制备：使相应的环氧烷(例如像环氧丙烷)与瓜尔胶反应以便获得已用羟烷基(例如羟丙基)改性的瓜尔胶衍生物。

表述本发明的瓜尔胶衍生物的“平均分子量”意指所述瓜尔胶衍生物的重量平均分子质量。

瓜尔胶衍生物的平均分子量可以通过SEC-MALS(通过多角度光散射检测进行检测的尺寸排阻色谱法)来测量。使用对dn/dc而言0.140的值来进行分子量测量。使用22.5KDa的聚乙二醇标准物来校准Wyatt MALS检测器。分子量分布的所有计算都用Wyatt的ASTRA软件进行。将样品制备为在流动相(100mM Na2NO3、200ppm NaN3、20ppm pDADMAC)中0.05％的溶液，并且在分析之前通过0.45μm PVDF过滤器进行过滤。平均分子量按重量计表示。

根据本发明实施例中的任一个，本发明的瓜尔胶衍生物的平均分子量高于约100,000g/mol、例如高于约150,000g/mol、例如高于约200,000g/mol。

根据本发明实施例中的任一个，本发明的瓜尔胶衍生物的平均分子量低于约3,000,000g/mol。

根据本发明实施例中的一个，瓜尔胶衍生物的平均分子量包括在约100,000g/mol与约3,000,000g/mol之间、例如在约150,000g/mol与约3,000,000g/mol之间、例如在约200,000g/mol与3,000,000g/mol之间。

根据本发明实施例中的任一个，本发明的瓜尔胶衍生物可进一步含有至少一种阳离子基团。

如在此使用的，术语“阳离子的”不仅涵盖带正电的基团，而且还涵盖取决于pH可变成带正电的基团。

本发明的阳离子瓜尔胶衍生物是在pH中性水性培养基中已经被化学改性以便为所述多糖提供净永久正电荷的瓜尔胶。非永久性带电的那些，例如可以是低于给定pH阳离子的并且高于该pH中性的瓜尔胶衍生物也落入本发明的范围内。

根据本发明实施例中的任一个，术语“阳离子化试剂”、“阳离子基团”以及“阳离子部分”包括铵(其具有正电荷)而且还有伯、仲和叔胺以及它们的前体(这些前体能够产生带正电的化合物)。

根据本发明，可以将瓜尔胶衍生物衍生化或改性从而含有阳离子基团。

根据本发明实施例中的一个，本发明的瓜尔胶衍生物可以由任何瓜尔胶与阳离子化试剂的反应产生。

本发明的阳离子化试剂被定义为这样的化合物，这些化合物通过与瓜尔胶衍生物的羟基进行反应能够产生根据本发明的包含至少一种阳离子基团的瓜尔胶衍生物。

本发明的阳离子化试剂被定义为含有至少一个阳离子部分的化合物。阳离子化试剂包括能够产生阳离子改性的瓜尔胶的试剂。

一组合适的衍生化试剂典型地含有反应性官能团，如环氧基团、卤化物基团、酯基团、酸酐基团或烯键式不饱和基团，以及至少一个阳离子部分或此种阳离子部分的前体。

如在此使用的，术语“衍生化试剂”意指至少含有接枝到瓜尔胶上的阳离子部分的试剂。术语“衍生化试剂”涵盖术语“阳离子化试剂”和“接枝剂”。

在本发明的一个实施例中，阳离子部分可以通过二价连接基团(如亚烷基或氧亚烷基)连接到衍生化试剂的反应性官能团上。合适的阳离子部分包括伯、仲、或叔氨基，或者季铵、硫鎓、或膦鎓基团。

衍生化试剂可以包含阳离子部分，或阳离子部分的前体，该前体含有阳离子氮部分，更典型地，季铵部分。典型的季铵部分是三烷基铵部分，如三甲基铵部分、三乙基铵部分、或三丁基铵部分，芳基二烷基铵部分，如苄基二甲基铵部分，以及其中氮原子是环状结构的成员的铵部分，如吡啶鎓部分以及咪唑啉部分，这些季铵部分中的每一个均与抗衡离子(典型地是氯离子、溴离子、或碘离子抗衡离子)相组合。

根据本发明实施例中的一个，产生本发明的阳离子瓜尔胶衍生物的阳离子化试剂的实例是：

·阳离子型环氧化物，如2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、2,3-环氧丙基三甲基溴化铵、2,3-环氧丙基三甲基碘化铵；

·氯乙醇官能的阳离子型氮化合物，如3-卤代-2-羟丙基三甲基氯化铵，例如3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵，

·阳离子型烯键式不饱和的单体或它们的前体，如三甲基铵丙基甲基丙烯酰胺氯化物盐，三甲基铵丙基甲基丙烯酰胺甲基硫酸盐，二烯丙基二甲基氯化铵，乙烯基苄基三甲基氯化铵，阳离子型单体的二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺(叔胺)前体，如N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基乙酰胺(其单元可以在聚合后水解或者接枝到乙烯胺单元上)。

在本发明的一个实施例中，这些产生本发明的阳离子瓜尔胶衍生物的阳离子化试剂是阳离子环氧化物，如2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、2,3-环氧丙基三甲基溴化铵以及2,3-环氧丙基三甲基碘化铵。

根据本发明，通过使瓜尔胶起始材料与包含反应性官能团和至少一个阳离子部分(或阳离子部分的前体)的衍生化试剂反应可以将阳离子基团引入到瓜尔胶中。

根据本发明，瓜尔胶衍生物中存在的阳离子基团通过使所述瓜尔胶的羟基与阳离子化试剂的反应结合到瓜尔胶起始材料中。

优选的阳离子基团选自由以下组成的组：伯、仲或叔氨基，季铵、硫鎓或膦鎓基团，以及其混合物。在具体优选的实施例中，阳离子基团选自三烷基铵基团，如三甲基铵基团、三乙基铵基团、三丁基铵基团，芳基二烷基铵基团，如苄基二甲基铵基团，以及其中氮原子是环状结构的成员的铵基团，如吡啶鎓基团以及咪唑啉基团，这些阳离子基团中的每一个均与抗衡离子(典型地是氯离子、溴离子、或碘离子抗衡离子)相组合。优选地，每个阳离子基团含有至少一个阳离子电荷。

瓜尔胶衍生物的阳离子度可以用取代度的方式来表示。

如在此使用的，表述“阳离子取代度”(DScat)意指每摩尔糖单元的阳离子基团的平均摩尔数。(Dscat)可以通过1H-NMR(溶剂：D2O)来测量。

一旦获得1H NMR光谱，将与所有瓜尔胶单元上的异头质子相对应的峰(通常在3.2-4.3ppm之间)的多重态的积分归一化至统一。感兴趣的峰(与瓜尔胶单元上的季铵基团的甲基质子相对应的那一个)的中心在1.8ppm附近。鉴于在铵官能团上存在3个甲基，这个峰是对9个质子的积分。因此，对于阳离子化试剂2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的情况，(DS阳离子)的计算如下：

根据本发明实施例中的一个，本发明的瓜尔胶衍生物具有等于零的阳离子取代度(DScat)。

根据本发明实施例中的另一个，本发明的瓜尔胶衍生物具有高于或等于约0.02、例如高于或等于约0.05、例如高于或等于约0.08、例如高于或等于约0.09、例如高于或等于约0.10的阳离子取代度(DScat)。

根据本发明实施例中的任一个，本发明的瓜尔胶衍生物具有低于或等于约3.0的阳离子取代度(DScat)。

根据具体的实施例，本发明的瓜尔胶衍生物可以是羟丙基瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵。

含有至少一个羟烷基的瓜尔胶衍生物的羟烷基化度(摩尔取代度或MS)，即被存在于瓜尔胶上的游离羟基官能团的数目所消耗的环氧烷分子的数目，可以包括在0与3之间，优选地在0与1.7之间。例如，MS为1可以代表一个环氧乙烷单元/单糖单元。

根据实施例，瓜尔胶衍生物的取代度(DS)，即每糖单元取代的羟基的平均数目，包括在0.005与3之间。值得注意地，DS可以通过滴定确定。本发明的瓜尔胶衍生物可以具有在0.005与2之间的DS。优选地，本发明的瓜尔胶衍生物具有在0.005与1之间的DS。更优选地，本发明的瓜尔胶衍生物具有在0.12与0.5之间的DS。

瓜尔胶衍生物的电荷密度(CD)可以包括在0.01与4.9meq/g之间，优选地在0.4与2.1meq/g之间。电荷密度指的是每克聚合物的正电荷数的比率。例如，CD＝1meq/g意指每克聚合物存在0.001个电荷。电荷密度与聚合物分子量的乘积确定了给定聚合物链上的带正电位点的数目。

根据本发明，瓜尔胶衍生物可具有在约2,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量(Mw)，优选地，该瓜尔胶衍生物具有在约5,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量，更优选地，瓜尔胶衍生物具有在约10,000道尔顿与60,000道尔顿之间的平均分子量，还更优选地，瓜尔胶衍生物具有在约10,000道尔顿与50,000道尔顿之间的平均分子量。

根据本发明的瓜尔胶衍生物可以通过解聚具有高分子量的阳离子改性的瓜尔胶以便将瓜尔胶聚合物“分裂”成所希望的尺寸来制备。应理解的是，本发明的瓜尔胶衍生物还可以通过解聚天然瓜尔胶、接着是阳离子化反应以提供具有阳离子官能度的聚合物来制备。各种解聚方法是本领域熟知的并且可以用于本发明，如通过使用过氧化合物(例如过氧化氢)的处理和照射。此类方法的实例披露于美国专利号4,547,571、美国专利号6,383,344和美国专利号7,259,192中。

使用本领域通常已知的方法，技术人员可以容易地进行瓜尔胶的阳离子化。用于提供具有阳离子官能度的瓜尔胶的各种方法是本领域已知的，例如如披露于美国专利公开号2008/0112907中的。用于交联瓜尔胶(有和没有瓜尔胶的阳离子改性)的各种方法也是已知的，参见例如美国专利号5,532,350和美国专利号5,801,116。可替代地，可以通过收获仍处于早期发育阶段的瓜尔豆来获得低分子量瓜尔胶，使得收获的瓜尔豆含有低分子量的天然瓜尔胶。然后可以对瓜尔胶进行阳离子化以为其提供阳离子官能度。

如上定义的瓜尔胶衍生物可以用在组合物中。

该含有瓜尔胶衍生物的组合物可以是固体或液体组合物。在其中该组合物是固体的情况下，该组合物可以处于粉末、颗粒、团聚体、薄片、粒料、球粒、片剂、砖形物、膏剂、块状物(如模制的块状物)、单位剂量物的形式，或本领域技术人员已知的另一种固体形式。优选地，该固体组合物处于粉末或粒料的形式。

在一些方面，含有该瓜尔胶的组合物处于粒料的形式。含有瓜尔胶衍生物的粒料可以三步法制备：湿法制粒，然后干燥并筛分。该湿法制粒步骤值得注意地涉及在制粒设备(例如混合制粒机)中引入并且混合瓜尔胶衍生物粉末和载体以及任选地其他成分。进行该混合，其中将水喷雾到该混合物上。该湿法制粒步骤将产生含有瓜尔胶衍生物的湿粒料。待混合的该载体与该瓜尔胶衍生物之间的重量比可以是在20:1至1:1之间，优选地在20:1至10:1之间。基于湿粒料的总重量，所引入的水含量可以包括在10wt％至50wt％之间。该载体可以是二氧化硅、无定形二氧化硅、沉淀二氧化硅、水合无定形二氧化硅、沉淀二氧化硅、水合无定形合成硅酸钙、疏水化的沉淀二氧化硅(hydrofobized precipitated silica)、硅胶、硅酸铝钠、粘土、沸石、膨润土、层状硅酸盐、高岭土、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、三聚磷酸钠、氯化钠、硅酸钠(水玻璃)、氯化镁、氯化钙、氯化铵、硫酸镁、碳酸钙、氧化钙、和/或硫酸钙、或其混合物。值得注意地，该载体选自氯化钙和碳酸钙。该干燥步骤值得注意地涉及通过使用热空气流干燥这些湿粒料。该步骤通常可以在装备有空气入口和空气出口的流化床中进行。该筛分步骤可以通过使用振动板进行。

粒料可以具有0.1至6mm的直径。总体上，正常粒料具有2-6mm的直径，并且微粒料具有0.1-2mm的直径。优选地，使用具有0.5-1.6mm的直径的微粒料。

可替代地，含有该瓜尔胶衍生物的粒料可以通过使用本领域技术人员熟知的挤出方法来制备。这些挤出方法描述于美国专利US 6146570中。例如，可以用加热共混瓜尔胶衍生物和载体以及任选地其他成分。该载体与该瓜尔胶衍生物之间的重量比可以是在20:1至1:1之间。然后可以将粘合剂熔融并引入到该瓜尔胶衍生物与该载体的混合物中。然后，可以用维持在55℃与65℃之间的挤出机温度进行挤出步骤。软的温热的粒料可以形成并且可以随后被冷却至低于该熔融粘合剂的凝固点(例如在室温下)以便获得固体粒料。

在组合物(种子处理组合物或用于叶施用的组合物)是液体的情况下，该液体组合物可以是悬浮液、分散体、浆料、液体载体(选自水、有机溶剂油或其混合物)中的溶液。可以通过使用常规方法通过将如如上所述的瓜尔胶衍生物与液体载体、任选地与其他组分混合来制备该液体组合物。优选地，该液体组合物处于水溶液的形式。该组合物可以包含基于该组合物的总重量从1wt％至60wt％的瓜尔胶衍生物。优选地，该组合物包含基于该组合物的总重量从5wt％至35wt％的瓜尔胶衍生物。在一些方面，该组合物包含基于该组合物的总重量从20wt％至30wt％的瓜尔胶衍生物。当以工业规模进行种子处理时，优选的是，用于该种子处理的该液体组合物含有高浓度的该瓜尔胶衍生物，使得要求较少体积的该液体组合物以实现所希望的处理剂量(即该瓜尔胶衍生物与被处理的种子的重量比)。使用小体积的液体组合物可以节省成本并且较不冗长。然而，当该液体组合物中的瓜尔胶衍生物的浓度增加时，该液体组合物的流动性将显著降低。其结果是，该液体组合物可变得太“稠”而不能有效地施用于种子或土壤中，并且具有差的在种子表面上或同样在土壤中铺展的能力。例如，包含3wt％的高分子量瓜尔胶衍生物的水性组合物可能已经是非常稠的并且因此具有差的流动性。本发明的一个优点是根据本发明的瓜尔胶衍生物具有相当低的分子量。在此种情况下，即使该瓜尔胶衍生物以高浓度存在，所得到的液体组合物可以维持优异的流动性，并且因此，此种液体组合物可以方便地用于处理种子或土壤。在一个实施例中，本发明的方法包括其中用如上所述的组合物包覆种子的步骤。然后可以将该包覆的种子施用到土壤上或土壤中，值得注意地以便使该包覆的种子与土地接触。

可利用合适的包覆技术以用根据本发明的组合物包覆种子或种子的团聚体。可用于包覆的设备可包括但不限于鼓式包衣机、旋转包衣机、翻滚式鼓、流化床以及喷射床。应理解的是，可以使用本领域技术人员已知的任何合适的设备或技术。可以通过分批式或连续式包覆工艺来包覆种子。可以用处于固体形式或液体形式的根据本发明的组合物包覆种子。优选地，使用水性分散体或溶液。

可以在该包覆步骤之前分离种子。在一个实施例中，机械手段如筛可以用于分离种子。然后可以将所分离的种子引入具有种子储存器的包衣机中。在一个实施例中，在混料罐中，将种子与在此所述的组合物、任选地与粘合剂和/或胶粘剂组合。

在一些方面，可以将一层或多层包含根据本发明的组合物的包衣添加到种子或其团聚体上。可以通过在转鼓中包覆种子或其团聚体顺序地引入外层。

还可使用团聚剂或团聚剂设备。可以在旋转包衣机中通过将种子放入旋转室来进行包覆，该旋转室推动这些种子抵靠该室的内壁。离心力和放置在该包衣机内的混合棒使种子旋转并且与包衣层混合，该包衣层包含根据本发明的组合物。可以将粘合剂或其他包覆材料泵送到该包衣机的近似中心内、到随该包衣室旋转的雾化器盘上。在碰撞该雾化器盘时，液态胶粘剂然后以小滴地被向外引导到种子上。

种子包衣技术还包括，例如，将种子放置在旋转盘或转鼓中。然后用水或其他液体喷雾这些种子并且然后将细惰性粉末(例如，硅藻土)逐渐添加到该包覆盘上。每个经雾化的种子变成粉末、层或尺寸逐渐增加的包衣的质量体的中心。然后通过该盘内的翻滚作用将该质量体圆化并且光滑化，类似于沙滩上的鹅卵石。通过该盘中材料的重量的压实作用将这些包衣层压实。在接近该包覆工艺结束时，经常结合粘合剂来将该质量体的外层硬化。粘合剂还可以降低由处理、运输以及播种成品而产生的灰尘的量。经常利用筛选技术(如，频繁手工筛选)来消除空白物或双体物，并且确保均匀的尺寸。例如，在此描述的种子包衣组合物的公差可以是+/-1/64英寸(0.4mm)，这是美国种子尺寸行业标准，建立在引入包衣很久以前。例如，最频繁地用带式种植机通过该带上8/64英寸(3.2mm)直径的圆洞来播种包覆的莴苣种子。此洞尺寸要求这些用根据本发明的组合物包覆的莴苣种子可以通过7.5/64英寸(3.0mm)的筛和通过8.5/64英寸(3.4mm)的筛进行尺寸化。

在本发明的一个实施例中，可以通过使用“原位包覆”工艺使该种子与该组合物接触，值得注意地通过将植物的种子植入土壤中的洞或沟中，并且然后施用根据本发明的组合物以包围或部分地包围该种子或者与该种子相邻，使得该种子与该组合物、值得注意地与该瓜尔胶衍生物接触。根据本发明，该洞可值得注意地是洞、腔或空心区域。该种子可以是未被任何试剂处理的种子，或者已经用农用化学品(如杀真菌剂和杀虫剂)处理的但是未用本发明的组合物处理的种子。优选地，将该组合物在施用之前沉积在该载体上以提供粒料或微粒料。含有瓜尔胶衍生物的粒料或微粒料可以通过使用以上描述的方法制备。

在仍另一个实施例中，将根据本发明的瓜尔胶衍生物(或含有所述瓜尔胶衍生物的组合物)施用到种植植物的土壤中。然后，可以将该植物的种子施用到土壤中，使得这些种子将与该组合物、值得注意地与该瓜尔胶衍生物接触。值得注意地，可以使用以液体形式(如以水性溶液/分散体的形式)的组合物，或以固体形式(如以粉末或粒料)的组合物。

优选地，机械地进行该种子的施用和根据本发明的组合物的施用。应理解的是，同样可以手动地进行所提及的施用的任何一个或两个。

根据优选的实施例，如上定义的瓜尔胶衍生物以液体形式使用。

在本发明的一个实施例中，瓜尔胶衍生物以范围从50至500g/公担种子的量使用。

生物杀真菌剂

如在此使用的术语“生物杀真菌剂”意指与使用合成化学试剂相反，通过生物手段例如通过使用微生物(如细菌)来控制或消除真菌活性的组分。

“微生物”在此意指微小的生物体，其可以以其单细胞形式或作为细胞菌落存在。在具体的实施例中，所述微生物是单细胞的。

更具体地，本发明涉及土壤微生物(soil microorganism)，也称为土壤微生物(soil microbe)。

根据实施例，这些微生物是真菌、特别是单细胞真菌或细菌。在具体的实施例中，这些微生物是细菌。

根据实施例，本发明的生物杀真菌剂是抑制性微生物，即对致病真菌具有抑制作用的微生物。

如在此使用的“抑制性微生物”意指可以通过任何方式杀死或抑制真菌生长的任何微生物。可以选择抑制性微生物(例如抑制性细菌)，其可以通过多种方式抑制或杀死致病真菌，包括将微环境的pH变成抑制或杀死真菌的pH以及产生有害的副产物(如氰化氢)、抗真菌物质、细胞壁降解(溶解)酶和称为铁载体的铁螯合化合物。

根据实施例，根据本发明的细菌选自革兰氏阳性菌。

如在此使用的，术语“革兰氏阳性菌”是指在革兰氏染色测定中染成紫色(阳性)的细菌细胞。革兰氏染色剂结合了在革兰氏阳性菌的细胞壁中丰富的肽聚糖。相反，“革兰氏阴性菌”的细胞壁具有一层薄肽聚糖，因此革兰氏阴性菌不保留染色剂并且允许吸收革兰氏染色测定中的复染。

革兰氏阳性菌是技术人员熟知的并且包括来自以下的细菌：放线棒菌、放线菌、节杆菌、双歧杆菌、弗兰克氏菌、加特德纳菌、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)、微杆菌、微球菌、小单孢子菌、分支杆菌、诺卡菌、红球菌、链霉菌、芽孢杆菌、梭菌、李斯特氏菌、肠球菌、乳酸杆菌、明串珠菌、支原体菌、脲支原体、乳球菌乳球菌、类芽孢杆菌、片球菌、醋酸杆菌、真细菌、太阳杆菌(Heliobacterium)、草螺菌(Heliospirillum)和鼠孢菌属。

在具体的实施例中，革兰氏阳性菌选自由链霉菌属和芽孢杆菌属细菌组成的组。

在具体的实施例中，革兰氏阳性菌是来自芽孢杆菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：短小芽孢杆菌(如短小芽孢杆菌菌株GB34(YieldShield；拜耳公司(Bayer))、短小芽孢杆菌菌株QST2808(Sonata；拜耳公司)和短小芽孢杆菌菌株BU F-33)、坚强芽孢杆菌(如坚强芽孢杆菌1-1582菌株(Votivo和Nortica；拜耳公司))、枯草芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌菌株GB03(Kodiak；拜耳公司)、MBI 600(Subtilex；贝克尔安德伍德公司(Becker Underwood)和QST 713(Serenade；拜耳公司)、枯草芽孢杆菌菌株GB122 plus、枯草芽孢杆菌菌株EB120、枯草芽孢杆菌菌株J-P13、枯草芽孢杆菌FB17、枯草芽孢杆菌菌株QST30002和QST3004(NRRL B-50421和NRRLB-50455)、枯草芽孢杆菌菌株QST30002和QST3004(NRRL B-50421和NRRLB-50455)砂纸突变体、枯草芽孢杆菌菌株QST 713、枯草芽孢杆菌菌株DSM 17231、枯草芽孢杆菌菌株KAS-001、枯草芽孢杆菌菌株KAS-006、枯草芽孢杆菌菌株KAS-009、枯草芽孢杆菌菌株KAS-010、枯草芽孢杆菌菌株KAS-011和枯草芽孢杆菌菌株CCT0089)、苏云金芽孢杆菌(如苏云金芽孢杆菌蜡螟亚物种菌株SDS-502、苏云金芽孢杆菌库斯塔克VBTS 2546、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚物种菌株SA 11、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚物种菌株SA 12、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚物种菌株ABTS 351、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚物种菌株EG2348、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚物种菌株VBTS 2477四重肠毒素缺陷型突变体、苏云金芽孢杆菌鲇泽亚物种菌株GC 91、以及苏云金芽孢杆菌拟步甲亚物种)，或来自链霉菌属的细菌，特别是来自链霉菌K61物种的细菌。

在更具体的实施例中，革兰氏阳性菌是来自枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌物种的细菌。还仍具体的实施例中，革兰氏阳性菌是枯草芽孢杆菌CCT 0089、苏云金芽孢杆菌CCT 2335或巨大芽孢杆菌CCT 0536。

根据实施例，根据本发明的细菌选自革兰氏阴性菌。

革兰氏阴性菌是技术人员熟知的并且包括来自以下的细菌：醋杆菌、无色杆菌、放线杆菌、农杆菌、根瘤菌、固氮螺菌、固氮菌、博代氏杆菌菌、慢生根瘤菌、布鲁氏菌、伯克霍尔德菌、弯曲杆菌、嗜碳杆菌、螯合杆菌、金黄杆菌、柠檬酸杆菌、代尔福特菌、肠杆菌、欧文氏菌、埃希氏杆菌、黄杆菌、弗朗西斯氏菌、弗拉特氏菌、葡糖杆菌、螺杆菌、嗜血杆菌、Kalstia、克雷白氏菌、军团菌、中慢生根瘤菌、莫拉克斯氏菌、奈瑟氏菌、泛菌、巴斯德菌、叶杆菌、变形杆菌、假单胞菌、根瘤菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、志贺氏菌、中华根瘤菌、密螺旋体、弧菌、黄单胞菌和耶尔森氏菌属。

在具体的实施例中，革兰氏阴性菌选自由假单胞菌属细菌组成的组。

在具体的实施例中，革兰氏阴性菌是来自醋杆菌属的细菌，特别是来自假单胞菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、Pseudomonasprotegens、绿针假单胞菌(如绿针假单胞菌菌株MA342)、桔黄假单胞菌、门多萨假单胞菌和Pseudomonas rathonis物种。

在更具体的实施例中，革兰氏阴性菌是来自慢生型大豆根瘤菌或恶臭假单胞菌物种的细菌。在仍具体的实施例中，革兰氏阴性菌是慢生型大豆根瘤菌菌株CCT 4065或恶臭假单胞菌CCT 5357。

根据本发明实施例中的任一个，微生物可以是例如选自：枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、慢生型大豆根瘤菌或恶臭假单胞菌物种的细菌。

根据实施例，根据本发明的微生物是真菌、特别是单细胞真菌。

真菌是技术人员熟知的并且包括子囊菌、球囊菌和担子菌。在具体的实施例中，所述真菌选自子囊菌门，特别是选自由以下组成的组：木霉、绿僵菌、白僵菌、蜡蚧菌、淡紫紫孢菌、粘帚霉、棒束孢、镰刀菌、节丛孢菌、青霉菌、曲霉菌、白粉寄生孢、盾壳霉、短梗霉和假丝酵母菌属；选自球囊菌门，特别是选自由球囊霉属和唼蜡甲属组成的组；和/或选自担子菌门，特别是选自由Phlebiopsis和丝核菌属组成的组。

在具体的实施例中，所述真菌是来自木霉属的真菌，特别是选自由以下组成的组的真菌：绿色木霉、深绿木霉(如深绿木霉菌株I-1237、深绿木霉菌株SC1、深绿木霉菌株、哈茨木霉(如哈茨木霉Rifai菌株T-22和ITEM-908)、棘孢木霉(如棘孢木霉菌株ICC012 T25和TV1、棘孢木霉菌株T34)；来自绿僵菌属的真菌，特别是选自由以下组成的组的真菌：金龟子绿僵菌，如金龟子绿僵菌小孢变种BIPESCO 5/F52；来自白僵菌属的真菌，特别是来自球孢白僵菌物种(如球孢白僵菌菌株ATCC 74040、球孢白僵菌菌株GHA、球孢白僵菌菌株NPP111B005和球孢白僵菌菌株147)的真菌；来自蜡蚧菌属的真菌，特别是选自Lecanicillium muscarium物种，如Lecanicillium muscarium菌株Ve6的真菌；来自粘帚菌属的真菌，特别是选自链孢粘帚菌物种，如链孢粘帚菌菌株J1446的真菌；来自棒束孢属的真菌，特别是来自玫烟色棒束孢物种，如玫烟色棒束孢Apopka菌株97的真菌；来自白粉寄生孢(Ampelomyces)属的真菌，特别是来自白粉寄生孢物种的真菌；来自假丝酵母菌属的真菌，特别是来自假丝酵母菌(Candida oleophila)物种的真菌；来自Phlebiopsis属的真菌，特别是来自大伏革菌物种的真菌。

在更具体的实施例中，真菌是来自哈茨木霉物种的真菌。在仍具体的实施例中，真菌是哈茨木霉CCT 4790。

根据本发明实施例中的任一个，微生物可以是例如选自枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、慢生型大豆根瘤菌或恶臭假单胞菌物种的细菌，或是选自哈茨木霉物种的真菌，如先前所述的那些。

待使用的微生物的量可能根据微生物而变化，并且还可能取决于待处理的种子。在本发明的一个实施例中，微生物以范围从1.10

本发明还涉及一种用于维持或增加此类微生物、特别是抑制性微生物的生长速率和/或生物杀真菌活性的方法，该方法包括使至少一种种子与如上定义的瓜尔胶衍生物接触的步骤。

根据优选的实施例，此方法在液体培养基中进行。因此，优选地，此方法包括使至少一种种子与如上定义的呈液体形式的瓜尔胶衍生物或与包含如上定义的瓜尔胶衍生物的液体组合物接触的步骤。

本发明还涉及微生物、特别是抑制性微生物和如上定义的瓜尔胶衍生物作为生物杀真菌剂的用途。

因此，本发明涉及所述微生物、特别是抑制性微生物和瓜尔胶衍生物的组合用途。已经表明所述微生物、特别是抑制性微生物和瓜尔胶衍生物的组合给予了生物杀真菌剂活性。

本发明还涉及包含至少一种微生物、特别是抑制性微生物和至少一种如上定义的瓜尔胶衍生物的生物杀真菌剂组合物。

根据本发明实施例中的任一个，微生物与瓜尔胶衍生物以如下比率组合：微生物:瓜尔胶衍生物的范围为从1.10

优选地，此生物杀真菌剂组合物呈液体形式。

本发明还涉及一种试剂盒，其包含至少一种微生物、特别是抑制性微生物和至少一种如上定义的瓜尔胶衍生物，所述试剂盒优选用作生物杀真菌剂。

因此，本发明还涉及以上提及的试剂盒作为生物杀真菌剂的用途。

本发明还涉及一种包覆有如上定义的生物杀真菌剂组合物的种子。

在一个实施例中，该种子是作物或植物物种，这些作物或植物物种包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属物种(例如，B.napus、B.rapa、B.juncea)、苜蓿(Medicagosativa)、稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、蜀黍(Sorghum bicolor、Sorghumvulgare)、粟(例如，珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黍(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、葵花(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、土豆(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、树薯(Manihotesculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘属果树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musaspp.)、牛油果(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、夏威夷果(Macadamia integrifolia)、扁桃仁(Prunus amygdalus)、糖甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物、木本植物如针叶树和落叶乔木、南瓜属植物、南瓜、大麻、绿皮西葫芦、苹果、梨、温柏、甜瓜、李子、樱桃、桃子、油桃、杏、草莓、葡萄、木莓、黑莓、大豆、蜀黍、甘蔗、油菜籽、三叶草、胡萝卜、和拟南芥。

在一个实施例中，该种子是任何蔬菜物种，这些蔬菜物种包括但不限于西红柿(Lycopersicon esculentum)、生菜(例如，Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)、花椰菜、西兰花、芜菁(turnip)、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、以及黄瓜属的成员(如黄瓜(C.sativus)、罗马甜瓜(C.cantalupensis)、以及香瓜(C.melo))。

在一个实施例中，该种子是任何观赏植物物种，这些观赏植物物种包括但不限于绣球花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、喇叭花(Petuniahybrida)、玫瑰(Rosa spp.)、杜鹃花(Rhododendron spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、圣诞红(Euphorbia pulcherrima)、以及菊花。

在一个实施例中，该种子是任何针叶树物种，这些针叶树物种包括但不限于针叶松树如厚皮刺果松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、杰克松(Pinus ponderosa)、美国黑松(Pinus contorta)、和蒙特利松(Pinus radiata)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；西加云杉(Picea glauca)；红木(Sequoiasempervirens)；冷杉如银杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；以及香柏如西红杉(Thuja plicata)和阿拉斯加黄杉(Chamaecyparis nootkatensis)。

在一个实施例中，该种子是任何豆科植物物种，这些豆科植物物种包括但不限于豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、菜用刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、扁豆、鹰嘴豆、豌豆、乌头叶菜豆、蚕豆、菜豆、兵豆、干菜豆等。豆科植物包括但不限于，落花生属(例如，花生)、蚕豆属(例如，小冠花、毛叶苕子、赤豆、绿豆、和鹰嘴豆)、羽扇豆属(例如，羽扇豆)、三叶草属、菜豆属(例如，普通菜豆和利马豆)、豌豆属(例如，蚕豆)、草木犀属(例如，三叶草)、苜蓿属(例如，苜蓿)、百脉根属(例如，车轴草)、兵豆属(lens)(例如，兵豆)、以及紫穗槐。用于在在此描述的方法中使用的典型的饲草和草坪草包括但不限于苜蓿、野茅、高羊茅、黑麦草、匍匐翦股颖、苜蓿、百脉根、三叶草、笔花豆属物种、贝恩斯罗顿豆(lotononis bainessii)、红豆草和小糠草。其他草类物种包括大麦、小麦、燕麦、黑麦、野茅、羊草、高粱或草坪草植物。

在另一个实施例中，该种子选自以下作物或蔬菜：玉米、小麦、高粱、大豆、西红柿、花椰菜、萝卜、卷心菜、油菜、生菜、黑麦草、草、稻、棉花、葵花以及类似物。在另一个实施例中，该种子选自玉米、小麦、大麦、稻、豌豆、燕麦、大豆、葵花、苜蓿、高粱、油菜籽、糖甜菜、棉花、烟草、饲料作物、亚麻籽、大麻、草、蔬菜、水果和葵花籽。

应理解的是术语“种子”或“秧苗”不限于特定或具体类型的物种或种子。术语“种子”或“秧苗”可指的是来自单一植物物种的种子、来自多种植物物种的种子混合物、或来自一个植物物种中不同株的种子共混物。在一个实施例中，作物种子包括但不限于稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、大豆、棉花、向日葵、苜蓿、高粱、油菜籽、甜菜、西红柿、豆、胡萝卜、烟草或花籽。

本发明的方面包括使用本发明的生物杀真菌剂组合物控制、防止或减少生长的植物、种子以及收获的作物上的致病真菌侵染的方法。本发明的生物杀真菌剂组合物可以用于处理植物、种子、植物、叶、插条和植物培养基，以及用于作物的收获后处理。

如先前提及的，本发明还涉及包含至少一种微生物、特别是抑制性微生物和至少一种如上定义的瓜尔胶衍生物的生物杀真菌剂组合物。

根据优选的实施例，将组合物施用到植物的叶系统上。这种施用优选地通过将如上披露的组合物喷雾到植物的叶子上进行。例如，可以使用农业中熟知的适当方法将组合物喷雾到田地上。

例如，可将本发明的生物杀真菌剂组合物稀释到足以使用标准农业喷雾设备容易地喷雾。可以通过使用用于喷雾液体的任何常规装置，如喷雾嘴、雾化器等进行喷雾来将组合物施用到叶子上。本发明的组合物可用于精确农业技术中，其中，根据变量如存在的特定植物物种、土壤组分等，使用设备来改变施用到田地不同部分的农药的量。在此类技术的一个实施例中，与喷雾设备一起操作的全球定位系统可用于将所需量的组合物施用到田地的不同部分。对于本发明的组合物有效的施用率的选择在普通农业科学家的技术范围内。

根据优选的实施例，本发明涉及一种用于处理植物的方法，其中将如先前定义的组合物施用到所述植物的至少一部分上。

可以将组合物直接施用到植物上，或者可以就在施用前用包含水或水和有机溶剂的混合物的液体稀释剂稀释，或者可以就在施用前将其与另一种农业化学组合物混合。

在一个实施例中，将组合物施用于该植物的叶系统，优选地通过将所述组合物喷雾到植物的叶子上。

本发明并不限于生物杀真菌剂组合物，还涉及用于农业应用的任何微生物，如生物农药等。

以下实例被包括来说明本发明的实施例，但并不限于所描述的实例。

实例

实例1：

在实验中使用了以下材料：

瓜尔胶：瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵，其平均分子量在5,000与25,000道尔顿之间，DS为0.2且MS在0.2与1.0之间，从索尔维公司(Solvay)可获得的(作为粉末提供)

从巴西的安德烈托塞洛基金会(AndréTosello Foundation)的热带培养物保藏获得细菌菌株。

·枯草芽孢杆菌CCT 0089

·巨大芽孢杆菌CCT 0536

·慢生型大豆根瘤菌CCT 4065

将所有菌株在-80℃下储存在含有15％甘油的适当培养基中。

实验中使用了两种不同的培养基：

·每升含有以下项的NA培养基：3g肉膏、5g蛋白胨和15g琼脂(仅用于固体培养基)

·每升含有以下项的YMA培养基：0.5g磷酸二氢钾、0.2g硫酸镁；0.1g氯化钠；0.5g酵母提取物；10g甘露醇(仅用于接种物和固体培养基)；5mL的5％溴百里酚蓝溶液和15g琼脂(仅固体培养基)。

对于菌株枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，使用NA培养基。对于菌株慢生型大豆根瘤菌，使用YMA培养基。根据菌株供应商来选择这些培养基。

用1mL的储用培养物接种含有100mL的NA或YMA培养基的250mL的摇瓶，并且在30℃、150rpm下培养72小时。

对于每种菌株，然后将10mL的再活化培养基转移到含有100mL相同培养基的250mL摇瓶中，添加瓜尔胶粉末(占培养基的1wt％)；并且在30℃、150rpm下培养96小时。还对每种菌株进行了不添加瓜尔胶粉末的实验作为对照。

培养0h、24h、48h、72h和96h后，取每个实验的100μL样品。将这些样品稀释(稀释度根据菌株的生长而变化，从1x 10

为了确定细菌的生长速率，构建log

μ值用于比较所有实验并评估瓜尔胶的添加对于细菌生长的影响。

对于此组实验，微生物与瓜尔胶的比率等于3.50x 10

表1

对于这三种菌株，在瓜尔胶的存在下获得了相当或更高的细菌生长速率值。瓜尔胶的添加允许维持或增加这些不同的细菌菌株的生长速率。在表2中报告了与每种菌株的对照相比，添加瓜尔胶的细菌生长速率的相对增加或减少。对于两种革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌)，观察到细菌的生长速率增加了+14％，而对于慢生型大豆根瘤菌，则观察到了零值，这与有和没有瓜尔胶的细菌的生长速率相当。

表2

在相同的细菌物种上，以细菌/瓜尔胶等于7.00x 10

实例2：

在实验中使用了以下材料：

瓜尔胶：瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵，其平均分子量在5,000与25,000道尔顿之间，DS为0.2且MS在0.2与1.0之间，从索尔维公司可获得的(作为粉末提供)

液体瓜尔胶制剂：来自索尔维公司的25％的粉末瓜尔胶的水性制剂

从巴西的安德烈托塞洛基金会的热带培养物保藏获得细菌菌株。

·枯草芽孢杆菌CCT 0089

·巨大芽孢杆菌CCT 0536

·慢生型大豆根瘤菌CCT 4065

将所有菌株在-80℃下储存在含有15％甘油的适当培养基中。

实验中使用了两种不同的培养基：

·每升含有以下项的NA培养基：3g肉膏、5g蛋白胨和15g琼脂(仅用于固体培养基)

·每升含有以下项的YMA培养基：0.5g磷酸二氢钾、0.2g硫酸镁；0.1g氯化钠；0.5g酵母提取物；10g甘露醇(仅用于接种物和固体培养基)；5mL的5％溴百里酚蓝溶液和15g琼脂(仅固体培养基)。

对于菌株枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，使用NA培养基。对于菌株慢生型大豆根瘤菌，使用YMA培养基。根据菌株供应商来选择这些培养基。

用1mL的储用培养物接种含有100mL的NA或YMA培养基的250mL的摇瓶，并且在30℃、150rpm下培养72小时。

对于每种菌株，然后将10mL的再活化培养基转移到含有100mL相同培养基的250mL摇瓶中，添加瓜尔胶粉末或瓜尔胶液体制剂；并且在30℃、150rpm下培养96小时。还对每种菌株进行了不添加瓜尔胶粉末的实验作为对照。

培养0h、24h、48h、72h和96h后，取每个实验的100μL样品。将这些样品稀释(稀释度根据菌株的生长而变化，从1x 10

为了确定细菌的生长速率，构建log

μ值用于比较所有实验并评估添加两种瓜尔胶对于细菌生长的影响。对于此组实验，将微生物与瓜尔胶的比率设置为1.0×10

表3

对于这三种菌株，在粉末形式的瓜尔胶和呈水性制剂的瓜尔胶的存在下，获得了相当或更高的细菌生长速率值。瓜尔胶的添加允许维持或增加这些不同的细菌菌株的生长速率。在表4中报告了与每种菌株的对照相比，添加两种瓜尔胶等级的细菌生长速率的相对增加或减少。对于两种革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌)，观察到细菌的生长速率增加了范围从8％至22％，而对于慢生型大豆根瘤菌，则观察到了零值或2％，这与有和没有瓜尔胶的细菌的生长速率相当。

表4

实例3：

在实验中使用了以下材料：

瓜尔胶：瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵，其平均分子量在5,000与25,000道尔顿之间，DS为0.2且MS在0.2与1.0之间，从索尔维公司可获得的(作为粉末提供)

从巴西的安德烈托塞洛基金会的热带培养物保藏获得细菌菌株：

·苏云金芽孢杆菌CCT 2335

·恶臭假单胞菌CCT 2357

将所有菌株在-80℃下储存在含有15％甘油的适当培养基中。

两种菌株仅使用一个培养基

·每升含有以下项的NA培养基：3g肉膏、5g蛋白胨和15g琼脂(仅用于固体培养基)

用1mL的储用培养物接种含有100mL的NA或YMA培养基的250mL的摇瓶，并且在30℃、150rpm下培养72小时。

对于每种菌株，然后将10mL的再活化培养基转移到含有100mL相同培养基的250mL摇瓶中，添加瓜尔胶粉末或瓜尔胶液体制剂；并且在30℃、150rpm下培养96小时。还对每种菌株进行了不添加瓜尔胶粉末的实验作为对照。

培养0h、24h、48h、72h和96h后，取每个实验的100μL样品。将这些样品稀释(稀释度根据菌株的生长而变化，从1x 10

为了确定细菌的生长速率，构建log

μ值用于比较所有实验并评估添加两种瓜尔胶对于细菌生长的影响。对于此组实验，将微生物与瓜尔胶的比率设置为1.0x 10

表5

对于这两种菌株，存在瓜尔胶的比未添加瓜尔胶的获得更高的细菌生长速率值。瓜尔胶的添加允许增加这些不同的细菌菌株的生长速率。在表6中报告了与每种菌株的对照相比，添加瓜尔胶的细菌生长速率的相对增加。对于这两种细菌菌株，观察到了范围从13％至14％的细菌生长速率的增加。

表6

实例4：

在实验中使用了以下材料：

瓜尔胶：瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵，其平均分子量在5,000与25,000道尔顿之间，DS为0.2且MS在0.2与1.0之间，从索尔维公司可获得的(作为粉末提供)

液体瓜尔胶制剂：来自索尔维公司的25％的粉末瓜尔胶的水性制剂

从巴西的安德烈托塞洛基金会的热带培养物保藏获得所有的微生物菌株，它们中的一些在美国模式培养物保藏所(ATCC)中具有参考。

·哈茨木霉CCT 4790

将所有菌株在-80℃下储存在含有20％甘油的适当培养基中。

实验中使用了以下培养基：

·每升含有以下项的营养肉汤(NA)培养基：3g肉膏、5g蛋白胨和15g琼脂(仅用于固体培养基)

·每升含有以下项的燕麦琼脂(OA)：25g燕麦片或燕麦粉和15g琼脂

根据供应商的推荐，将培养基OA用于菌株哈茨木霉的再活化。

对于具有瓜尔胶的实验，仅使用NA培养基。

将含有20mL的OA培养基的皮氏培养皿用于菌株哈茨木霉的再活化。

储用培养物用于接种菌株哈茨木霉的固体培养基，并且在25℃下培养皮氏培养皿直至完全生长。

从皮氏培养皿上的再活化培养基中回收真菌的孢子并且制备孢子溶液。

将500μL的孢子溶液(大约1x 10

*对照培养基＝未添加瓜尔胶的NA

将每个样品后的干生物质回收绘制成干生物质对时间的曲线图，并可获得生长曲线。

仅考虑生长的指数阶段计算生长速率(μ)，并与对照进行比较。

μ值用于比较所有实验并评估瓜尔胶的添加对于真菌生长的影响。表7总结了不同实验获得的微生物生长速率(μ)：

表7

与对照相比，在粉末形式的瓜尔胶和呈水性制剂的瓜尔胶的存在下，获得了更高的生长速率值。因此，瓜尔胶的添加允许增加此真菌菌株的生长速率。在表8中报告了与对照相比，添加两种瓜尔胶等级的生长速率的相对增加。对于此真菌菌株，观察到了范围从44％至67％的细菌生长速率的增加。

表8。