一种前交叉韧带损伤原位修复动物模型及其构建方法

技术领域

本发明涉及动物模型技术领域，尤其涉及一种前交叉韧带损伤原位修复动物模型及其构建方法。

背景技术

前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)是膝关节中最重要的韧带之一，ACL对于维持膝关节的静态与动态稳定起重要作用，而且在膝关节本体感觉方面也起到关键作用。

ACL损伤是最常见的膝关节损伤之一，且发病率逐年上升。ACL损伤常发生于篮球、滑雪、排球等膝关节负荷高且扭转动作较多的运动中，ACL急性损伤时会出现膝关节剧痛、短时间内出现肿胀、膝关节屈伸活动度受限等症状。简单的缝合修复是最早建议的治疗ACL撕裂的技术之一，早在1895年就有描述初级修复，然而这些早期技术在大约50％的患者中失败，在很长的一段时间里，前交叉韧带的“不可愈合性”成为治疗前交叉韧带撕裂的普遍观念，因此，简单的缝合修复逐渐被韧带重建的方式取代。尽管ACL重建伴随着更大的创伤、供给部位相应的并发症、更高的骨关节炎发生率以及对青少年生长的影响，但ACL重建确实是当时最可靠的方法。近年来，随着技术与认知的进步，原位修复又重新获得了关注，有研究表明近端1/3的ACL具有自发愈合潜力，也有相当多的临床报道表明ACL撕裂后观察到ACL天然附着的现象，这些研究让缝合修复的方法回到了人们的视野。原位修复与ACL重建的临床疗效和潜在机制一直存在争议，因此迫切需要贴近临床的动物模型来深入研究。

现有的ACL损伤动物模型，往往采用手术刀片锐性离断，断口整齐；而在实际临床情况中，ACL的断裂往往发生在股骨和胫骨发生相对位移或遭受外力冲击后，常用动物模型的受伤机制与临床试剂情况相差甚远。同时大部分对ACL的研究都聚焦于ACL重建技术，暂无股骨侧ACL原位修复技术标准化模型，因此，亟需一种前交叉韧带损伤原位修复动物模型及其构建方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种前交叉韧带损伤原位修复动物模型及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一方面是提供一种前交叉韧带损伤原位修复动物模型的构建方法，步骤包括：将实验动物麻醉后，仰卧位放置，固定胫骨后，断裂前交叉韧带并进行原位修复。

优选地，步骤还包括：在断裂前交叉韧带前，于实验动物的股骨远端至髌骨内侧切开皮肤，并创建内侧髌旁关节切开术以获得关节腔入路；髌骨横向半脱位后解剖髁间区域脂肪垫以充分暴露前交叉韧带。

优选地，断裂前交叉韧带包括：用针头在前交叉韧带股骨止点处扎若干次后，使用解剖刀柄沿股骨轴线手动施加轴向力，直至前交叉韧带断裂。

优选地，原位修复包括：在实验动物股骨侧前交叉韧带足印区钻股骨骨隧道，缝合线穿过骨隧道后，使用钛合金微血管夹在股骨侧隧道出口固定缝合线。

优选地，实验动物选自：小鼠、大鼠、狗、兔子或猪。

本发明的第二方面是提供一种上述动物模型构建方法构建获得的动物模型。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明的结合临床中前交叉韧带撕裂的受伤机制，建立了一种和临床前交叉韧带撕裂发病过程相近的新型动物模型，人为控制撕裂部位，使其具有可靠性和可重复性，并在此基础上实现前交叉韧带的原位缝合，为进一步研究前交叉韧带撕裂及修复的发病机制、研发新的治疗措施与产品提供了有力的动物模型工具。

附图说明

图1为本发明SD大鼠动物实验后标本microCT重建隧道入口处隧道内骨形成情况结果图；

图2为本发明SD大鼠动物实验后标本microCT分析通用骨分析参数结果图；其中，图2A为骨体积分数结果图，图2B为骨矿物质密度结果图；

图3为本发明SD大鼠动物实验后标本microCT分析骨小梁分析参数结果图；其中，图3A为小梁厚度结果图，图3B为小梁数量结果图，图3C为连接密度结果图，图3D为小梁间隙结果图；

图4为本发明SD大鼠动物实验后标本生物力学失效载荷分析结果图；

图5为本发明SD大鼠动物实验后标本生物力学刚度分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

实施例

本实施例提供一种前交叉韧带损伤原位修复动物模型的构建方法，步骤包括：将实验动物麻醉后，仰卧位放置，于实验动物的股骨远端至髌骨内侧切开皮肤，并创建内侧髌旁关节切开术以获得关节腔入路；固定胫骨后，髌骨横向半脱位后解剖髁间区域脂肪垫以充分暴露前交叉韧带，用21号针头在前交叉韧带股骨止点处扎3-5次，使用解剖刀柄沿股骨轴线手动施加轴向力，直到感觉到明显的断裂声，表明前交叉韧带断裂，前交叉韧带断裂后立即停止施力，以免对其他韧带造成进一步损伤。而后通过Lachman测试验证股骨侧前交叉韧带断裂；使用23号针在实验动物股骨侧前交叉韧带足印区钻股骨骨隧道，5-0编织缝线(金环医疗，中国)穿过骨隧道后，使用钛合金微血管夹在股骨侧隧道出口固定缝线，以实现刚性固定；术后在不同时间点观察实验动物的健康和活动状态。

检验实施例

1、实验动物及分组

获得上海市人民第六医院动物伦理委员会批准后，将132只骨骼成熟(12周龄)的雄性Sprague-Dawley大鼠按不同时间点(术后3天，1周，2周，4周，8周)分为5组(24只/组)，构建股骨侧前交叉韧带撕裂，并按分别进行原位修复和重建手术，12只正常大鼠膝关节作为对照组。

2、手术方案

(1)股骨侧前交叉韧带断裂模型构建：取大鼠仰卧位，麻醉后备皮，从股骨远端到髌骨内侧切开2cm皮肤切口，使用显微器械创建标准的内侧髌旁关节切开术以获得关节腔入路，使髌骨横向半脱位后解剖髁间区域脂肪垫以充分暴露前交叉韧带；用21号针头在前交叉韧带股骨止点处针扎3-5次后，固定胫骨，使用解剖刀柄沿股骨轴线手动施加轴向力，直到感觉到明显的断裂声，表明前交叉韧带断裂，前交叉韧带断裂后立即停止施力，以免对其他韧带造成进一步损伤。而后通过Lachman测试验证股骨侧ACL断裂。

(2)原位修复手术：使用5-0编织缝线(金环医疗，中国)用于编织断裂的前交叉韧带残端；使用23号针在股骨侧前交叉韧带足印区钻股骨骨隧道，韧带残端固定缝合线穿过隧道，确保前交叉韧带附着在骨隧道间孔上，使用钛合金微血管夹(GEM SuperFinel；Synovis)在股骨侧隧道出口固定缝线，以实现刚性固定。

(3)传统重建手术：自趾长屈肌肌腱取腱，并用2-0编织缝线(金环医疗，中国)于一端进行编织，用1.5克氏针作钻头，分别于股骨及胫骨端做骨隧道，将肌腱自胫骨侧穿入隧道后，在股骨端使用钛合金微血管夹(GEM SuperFinel；Synovis)固定；胫骨端于胫骨近端用23号针头打横向骨隧道穿线捆绑肌腱固定。

3、临床结果分析

术后在不同时间点观察大鼠的健康和活动状态；结果显示，重建组在3天、1周和2周时仍然跛行，而修复组在3天和1周时依然跛行，从2周的时间点开始逐渐恢复。

4、组织学分析

在不同时间点取下大鼠的完整膝关节标本于多聚甲醛溶液中固定，待脱钙完全后脱水、石蜡包埋，切成0.6mm切片，分别行H&E染色(组织形态、炎症反应)、番红固绿染色(蛋白多糖)以及天狼猩红染色(胶原排列)；

H&E染色显示修复组和重建组的早期时间点滑膜均有明显炎症反应，但修复组在2周左右炎症反应开始减轻，重建组持续到4周左右。

番红固绿染色显示修复组和重建组的蛋白多糖在8周时均有减少，提示早期骨关节炎的发生。

天狼猩红染色显示同一时间点修复组的韧带胶原排列优于重建组。

5、microCT分析

使用microCT评估沿肌腱-骨界面的小梁结构以及骨形成情况；每个治疗组中的五个标本在术后2周、4周、8周进行microCT分析，选择区域设置为高度为0.18mm的股骨隧道靠关节腔侧的圆柱体；经过校准后，计算骨体积分数(BV/TV)、骨矿物质密度(BMD)、小梁数量(Tb.N)、连接密度(Conn.D)以及小梁间隙(Tb.Sp)，评估术后骨隧道的骨再生情况。

结果如表1所示；

表1

结果显示骨体积分数(BV/TV)随着愈合过程而增加，第2周、第4周、第8周时间点的两组之间有显著差异，而骨矿物质密度(BMD)没有差异。

修复组2周后的小梁厚度(Tb.Th)较重建组明显增加，第4周、第8周后逐渐无差异，在第2周、第4周和第8周，修复组的小梁数量(Tb.N)显著增加。

两组相比，连接密度(Conn.D)没有差异。

与修复组相比，重建组的小梁间隙(Tb.Sp)在第2周、第4周和第8周时显著增加。

6、生物力学测试

在不同时间点取下完整的膝关节标本保存在-80℃，在测试之前解冻并解剖所有软组织，仅保留股骨、胫骨及前交叉韧带或自体移植的重建韧带；胫骨和股骨被固定于灌注有胶水的2mL离心管中；将标本固定在拉伸测试仪器上，以10mm/min的速率加载至拉伸失效。

术后4周修复组和重建组前交叉韧带的拉断负荷仅能达到正常的20％，术后8周则可以达到正常的80％-90％。修复组和重建组在所有时间点均无明显差异；线性刚度趋势同拉断负荷，表明修复组构建成功。

综上所述，本发明的结合临床中前交叉韧带撕裂的受伤机制，建立了一种和临床前交叉韧带撕裂发病过程相近的新型动物模型，人为控制撕裂部位，使其具有可靠性和可重复性，并在此基础上实现前交叉韧带的原位缝合，为进一步研究前交叉韧带撕裂及修复的发病机制、研发新的治疗措施与产品提供了有力的动物模型工具。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。