基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法及系统

技术领域

本发明属于生物化学分离技术领域，尤其涉及一种基于智能控制的NTP/dNTP 层析分离方法及系统。

背景技术

核苷三磷酸(NTP)或脱氧核苷三磷酸(dNTP)，可以一磷酸为原料通过酿酒酵母菌或面包酵母生物转化生成相应的三磷酸化合物，亦可通过乙酸激酶等方法制造；例如：利用5’-腺苷酸(AMP)可生成5’-腺苷三磷酸(ATP)；利用2’-脱氧-5’- 腺苷酸(dAMP)可生成2’-脱氧-5’-腺苷三磷酸(dATP)；利用5’-胞苷酸(CMP) 可生成5’-胞苷三磷酸(CTP)等。

核苷三磷酸以往的制备方法是如下：

文献1：中国专利CN 104762347 B公开一种三磷酸腺苷(ATP)的生产方法，主要步骤为啤酒酵母冷冻处理、发酵提转化酶、板框压滤、微滤、发酵合成三磷酸腺苷、纳滤除盐、树脂吸附、树脂洗涤洗脱、超滤除蛋白和热源、乙醇沉淀和干燥等步骤；该技术在实验中仅使用201X7阴离子交换树脂，而杂质的去除使用微滤纳滤和超滤，对于实验成本大大增加。

文献2：公开号CN 104894192 A提出了三磷酸腺苷二钠的制备方法，用氯化镁代替硫酸镁，防止新的杂质离子的掺入，采用串柱上样代替单根阴柱上样，提高流速，缩短上样时间50％以上，收率提高30％以上；该技术也只使用阴离子交换树脂，并且都是在常温条件下进行实验，没有考虑到三磷酸腺苷在常温条件下的不稳定性等问题。

在文献1和文献2的生物法制备中，都需要通过阴离子交换树脂层析分离去除副反应产生的核苷、碱基，或未反应核苷酸，或作为中间体的二磷酸化合物等等；由于三磷酸化合物非常容易降解，通常需要在低温层析柜中进行；但是这样经常取样分析、调控仪器、分离收集等操作就非常不便，而且过于频繁对于保持层析柜低温也非常不利。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法及系统，通过在低温层析柜中进行NTP/dNTP的层析分离，并根据设置在低温层析柜外的核酸蛋白检测仪和HPLC检测器进行实时在线检测和智能化控制，能避免经常打开低温层析柜取样或调控仪器等致使核苷三磷酸降解，同时也保证了层析分离过程的高质量运行。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法，包括以下步骤：

(1)上样，在低温层析柜中，NTP/dNTP反应清液依次通过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，NTP/dNTP被吸附至所述阴离子交换树脂柱中；

(2)水洗，上样结束后，采用5～10倍树脂柱体积的去离子水或纯化水对阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱进行水洗；

(3)梯度洗脱，断开所述阳离子交换树脂柱，对所述阴离子交换树脂柱进行梯度洗脱，并采用HPLC检测器对所述阴离子交换树脂柱的流出液进行定时检测，并收集浓度≥5g/L的NTP/dNTP溶液。

优选地，所述步骤(1)中：

所述低温层析柜内的温度为4～8℃；和/或

所述阳离子交换树脂柱为再生的Na型阳离子交换树脂柱；所述阴离子交换树脂柱再生的Cl型阴离子交换树脂柱；和/或

所述上样过程中，采用设于所述低温层析柜外部的核酸蛋白检测仪分别对所述阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱的流出液进行实时在线检测，当所述阴离子交换树脂柱的流出液A260≥1时，上样结束。

优选地，所述步骤(2)中：

采用设于所述低温层析柜外部的核酸蛋白检测仪对所述阴离子交换树脂柱的流出液进行实时在线检测，当A260＜1时，排废，反之则收集流出液。

优选地，所述步骤(3)中：

所述梯度洗脱过程中，采用质量百分浓度为0～5％的NaCl溶液对所述阴离子交换树脂柱进行梯度洗脱；和/或

所述NTP/dNTP溶液的收集过程如下：采用HPLC检测器对所述阴离子交换树脂柱的流出液进行定时检测过程中，当所述阴离子交换树脂柱的流出液中检测出 NTP/dNTP，且NTP/dNTP的浓度≥5g/L时，则开始收集NTP/dNTP溶液；当阴离子交换树脂柱的流出液中NTP/dNTP的浓度＜5g/L时，则停止收集。

优选地，所述步骤(3)中，梯度洗脱后收集的NTP/dNTP溶液经结晶、过滤、真空干燥得到纯度≥98％的NTP/dNTP产品。

本发明第二方面提供了一种本发明第一方面所述的基于智能控制的NTP/ dNTP层析分离方法中所使用的智能层析分离系统，所述智能层析分离系统包括低温层析柜、检测机构以及控制系统；

所述低温层析柜内设有上样机构、水洗机构、洗脱机构、柱层析单元和收集器；所述柱层析单元包括串联的阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱；所述上样机构、水洗机构、洗脱机构分别与所述阳离子交换树脂柱、阴离子交换树脂柱的进液口连通；所述收集器与所述阴离子交换树脂柱的出液口连通；

所述检测机构对于所述阳离子交换树脂柱、阴离子交换树脂柱的流出液进行检测，并将检测信息传递给所述控制系统；

所述控制系统接收所述检测机构的检测信息，根据所述检测信息生成水洗指令、洗脱指令和收集指令，并输出信号至所述上样机构、水洗机构、洗脱机构、柱层析单元、收集器和检测机构。

优选地，所述检测机构包括设于所述低温层析柜外部的核酸蛋白检测仪、取样稀释机构和HPLC检测器；

所述核酸蛋白检测仪与所述阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱的出液口连通，所述核酸蛋白检测仪与所述阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱之间的管道上设有单向阀；

所述取样稀释机构与所述阴离子交换树脂柱的出液口连通，该取样稀释机构与所述阴离子交换树脂柱之间的管道上设有定时开关；

所述HPLC检测器与所述取样稀释机构连接。

优选地，所述智能层析分离系统还包括设于所述低温层析柜外部的监控系统。

本发明的有益效果如下：

1、本发明的基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法及系统，通过在低温层析柜中进行NTP/dNTP的层析分离，并根据设置在低温层析柜外的核酸蛋白检测仪和HPLC检测器进行实时在线检测和智能化控制，避免经常打开低温层析柜取样或调控仪器等致使核苷三磷酸降解，同时也保证了层析分离过程可追溯，且高质量地运行；

2、本发明的基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法及系统，通过核酸蛋白检测仪的实时在线检测，监控上样、水洗过程中是否有NTP/dNTP流出，从而了解上述过程是否正常运转；通过定时在线取样和HPLC检测器检测，控制梯度洗脱过程和收集NTP/dNTP。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法所用的智能层析分离系统的结构示意图；

图2为发明基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法所用的智能层析分离系统的逻辑关系图；

图3为本发明基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法的流程控制图。

具体实施方式

为了能更好地理解本发明的上述技术方案，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。

结合图1、图2、图3所示，本发明的总体构想如下：由于NTP/dNTP(比如 NTP中的4种核苷三磷酸5’-ATP、5’-CTP、5’-GTP、5’-UTP、dNTP中的4种脱氧核苷三磷酸5’-dATP、5’-dCTP、5’-dGTP、5’-dUTP)的在常温下不稳定，易降解，通常需要NTP/dNTP的层析分离要在低温层析柜100中进行，同时要考虑层析分离过程经常取样或调控仪器、分离收集等；因此本发明在低温层析柜100中，放置再生后的阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106，阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106的进液口分别连接上样机构、水洗机构和洗脱机构，阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106串联后连接排废罐和收集器107，其中排废罐也可放在低温层析柜100外部，用管道与阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106连接；然后阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106分别连接低温层析柜100外部的核酸蛋白检测仪108、取样稀释机构110和HPLC检测器109 (高效液相色谱检测器)；整个层析分离过程在低温层析柜100内部进行，同时通过核酸蛋白检测仪108实时在线对阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106 的流出液中A260进行检测，监控上样和水洗过程中是否有NTP/dNTP流出，从而了解上样和水洗过程是否正常运转；通过HPLC检测器109对阴离子交换树脂柱106 的流出液进行检测，控制洗脱过程和收集过程，具体为：采用取样稀释机构110定时取样稀释，并将稀释后的流出液放入HPLC检测器109的自动进样器进行检测分析，通过检测出来的色谱图判断是否有NTP/dNTP产生，以及NTP/dNTP的浓度，从而控制洗脱过程和收集过程。

结合图1、图2所示，本发明的基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法所用的智能层析分离系统，包括低温层析柜100、检测机构以及控制系统111；其中低温层析柜100内设有上样机构、水洗机构、洗脱机构、柱层析单元和收集器107；柱层析单元包括串联的阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106，阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106之间设有单向阀6；上样机构、水洗机构、洗脱机构分别与阳离子交换树脂柱105、阴离子交换树脂柱106的进液口连通；收集器107与阴离子交换树脂柱106的出液口连通；检测机构对阳离子交换树脂柱105、阴离子交换树脂柱106的流出液进行检测，并将检测信息传递给控制系统111；控制系统111接收检测机构的检测信息，根据检测信息生成水洗指令、洗脱指令和收集指令，并输出信号至上样机构、水洗机构、洗脱机构、柱层析单元、收集器107 和检测机构。

结合图1所示，上样机构包括上样罐101以及上样泵和单向阀1；水洗机构包括水洗罐102以及水洗泵和单向阀2；洗脱机构包括第一洗脱罐103、第二洗脱罐 104以及洗脱泵和单向阀3。其中上样机构、水洗机构、洗脱机构分别与柱层析单元的阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106的进液口连通，且上样机构、水洗机构、洗脱机构与阳离子交换树脂柱105之间的管道上设有单向阀4，样机构、水洗机构、洗脱机构与阴离子交换树脂柱106之间的管道上设有单向阀5。收集器 107分别与柱层析单元的阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106的出液口连通，收集器107与柱层析单元的阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106 之间的管道上设有单向阀8。

结合图1所示，柱层析单元上，阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱 106均为采用NaOH或HCl再生，其中阳离子交换树脂柱105为再生的Na型阳离子交换树脂柱105；阴离子交换树脂柱106再生的Cl型阴离子交换树脂柱106。

结合图1所示，检测机构包括设于低温层析柜100外部的核酸蛋白检测仪108、取样稀释机构110和HPLC检测器109；其中核酸蛋白检测仪108与阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106的出液口连通，核酸蛋白检测仪108与阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106之间的管道上设有单向阀7；取样稀释机构 110与阴离子交换树脂柱106的出液口连通，该取样稀释机构110与阴离子交换树脂柱106之间的管道上设有定时开关9；HPLC检测器109与取样稀释机构110连接，用于检测取样稀释机构110稀释后的流出液。

结合图1、图2所示，控制系统111包括上样控制器、水洗控制器以及洗脱控制器；上样控制器根据控制系统111的上样指令控制单向阀1的启闭，从而控制上样的开始与结束，其中上样指令包括上样时间、上样量、流速以及单向阀1的启闭等；水洗控制器根据控制系统111的水洗指令控制单向阀2的启闭，从而控制水洗的开始与结束，其中水洗指令包括单向阀2的启闭、去离子水的使用量、流速等；洗脱控制器根据控制系统111的洗脱指令控制单向阀3的启闭，从而控制洗脱过程的开始与结束，其中洗脱指令包括洗脱液的种类、浓度以及使用量、流速、单向阀 3、单向阀5的启闭等；收集器107根据控制系统111的收集指令将洗脱出来的NTP/ dNTP收集至对应的收集器107中。

结合图1所示，为了便于远程控制，该智能层析分离系统还包括设于低温层析柜100外部的监控系统。

结合图1、图2、图3所示，本发明提供的一种基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法，包括以下步骤：

(1)上样，在低温层析柜100中，NTP/dNTP反应清液依次通过阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106，NTP/dNTP被吸附至所述阴离子交换树脂柱106中；

具体过程为：首先将生物催化生成的NTP/dNTP反应液，过滤去除掉酵母，超滤去除大分子细胞自溶物得到NTP/dNTP反应清液；整个层析分离过程在4～8℃的低温层析柜100中进行，将NTP/dNTP反应清液加入到低温层析柜100中的上样机构内，控制系统111控制上样机构进行上样，在上样过程中，上样机构内的NTP/ dNTP反应清液依次通过串联的阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106， NTP/dNTP反应清液中的蛋白质、色素、阳离子等被吸附在阳离子交换树脂柱105 中，NTP/dNTP反应清液中NTP/dNTP被吸附在阴离子交换树脂柱106内；同时在此过程中，采用核酸蛋白检测仪108实时在线对阴离子交换树脂柱106的流出液进行检测，当流出液中A260≥1，则表明阴离子交换树脂柱106已经吸附饱和，上样结束；反之，则表明阴离子交换树脂柱106未吸附饱和，流出液排废；其中阳离子交换树脂柱105为再生的Na型阳离子交换树脂柱105；阴离子交换树脂柱106再生的Cl型阴离子交换树脂柱106；

(2)水洗，上样结束后，采用5～10倍树脂柱体积的去离子水或纯化水对阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱106进行水洗；

具体过程为：上样结束后，控制系统111控制水洗机构进行水洗，采用5～10 倍树脂柱体积的去离子水或纯化水对阳离子交换树脂柱105和阴离子交换树脂柱 106进行水洗后自动停止，同时采用核酸蛋白检测仪108对阴离子交换树脂柱106 的流出液进行实时在线检测，当A260＜1时，则认为流出液中没有NTP/dNTP流出来，可以正常排废，反之则认为流出液中有NTP/dNTP，此时就需要收集流出液，并将信号传递给控制系统111，进行调整上样量或者增加树脂等。在上样、水洗过程中由于核苷、碱基等一般不吸附在阴离子交换树脂柱106上，随着水洗等操作排出柱外。

(3)梯度洗脱，断开所述阳离子交换树脂柱105，对所述阴离子交换树脂柱 106进行洗脱，并采用HPLC检测器109对所述阴离子交换树脂柱106的流出液进行定时检测，并收集浓度≥5g/L的NTP/dNTP溶液。

具体过程如下：水洗结束后，控制系统111控制洗脱机构进行洗脱，关闭单向阀2，打开单向阀3，断开阳离子交换树脂柱105，采用质量百分浓度为0～5％的 NaCl溶液对阴离子交换树脂柱106进行梯度洗脱，同时采用HPLC检测器109对阴离子交换树脂柱106的流出液进行定时检测，根据HPLC检测器109检测的色谱图中NTP或dNTP的出峰时间，判断NTP或dNTP是否被洗脱出来，并计算NTP或 dNTP的浓度，其中NTP或dNTP的浓度C＝某核苷三磷酸的实测图谱峰面积×核苷三磷酸的标准浓度/核苷三磷酸的标准图谱峰面积；

当阴离子交换树脂柱106的流出液中检测出NTP或dNTP，且浓度≥5g/L时，则开始收集NTP或dNTP溶液，此时NTP或dNTP的浓度会逐步升高，直至下降到浓度＜5g/L；当阴离子交换树脂柱106的流出液中NTP或dNTP的浓度＜5g/L时，则停止收集。

分析结果传递给控制系统111，控制系统111再控制收集器107分布收集，最终收集NTP或dNTP纯度95％或98％以上的部分，合并该段收集管后，加入2～3 倍的95％乙醇，结晶、过滤、真空干燥得到纯度≥98％的高纯度NTP或dNTP产品。

下面结合具体的例子对本发明的基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法及系统进一步介绍。

实施例1

本实施例中是5’-ATP的层析分离，在分离过程中采用图1所示的智能层析分离系统，具体过程如下：

在1L含有40mmol/L腺苷、200mmol/L磷酸缓冲液(pH＝6.5)、200mmol/L 葡萄糖和5mmol/L磷酸镁的反应液中加入70g速冻的啤酒酵母，32℃反应4小时，摩尔转化率可达90％，其中反应液中尚含有未反应腺苷，中间体AMP，ADP等。将上述制备的5’-ATP反应液过滤去除酵母，获得5’-ATP反应清液。

通过智能层析分离系统上样、水洗、梯度洗脱，其中阳离子交换树脂用量为 100ml(Na型)，水洗过程中去离子水用量为1～2L，流速100ml/h，阴离子交换树脂用量为200ml(Cl型)，洗脱液采用质量百分浓度为0～5％NaCl进行梯度洗脱，流速20～30ml/h。层析分离后按控制系统报告，收集起始浓度5g/L，最终浓度5g/L 部分流出液，合并后，体积260ml，5’-ATP的平均浓度60g/L，加3倍95％乙醇， 28℃保温搅拌1～2h，即可析出ATPNa盐结晶，过滤，真空干燥，可得ATPNa 14g，含量98％。

实施例2

本实施例中是5’-dATP的层析分离，在分离过程中采用图1所示的智能层析分离系统，具体过程如下：

在1L含有40mmol/L dAMP、200mmol/L磷酸缓冲液(pH＝6.5)、200mmol/L 葡萄糖和5mmol/L磷酸镁的反应液中加入70g速冻的啤酒酵母，32℃反应4小时，摩尔转化率可达85％。将此溶液过滤去除酵母，获得澄清溶液。

通过智能层析分离系统上样、水洗、洗脱，其中阳离子交换树脂用量为100ml (Na型)，水洗过程中去离子水用量为1～2L，流速100ml/h，阴离子交换树脂用量为200ml(Cl型)，洗脱液采用质量百分浓度为0～5％NaCl进行梯度洗脱，流速 20～30ml/h。层析分离后按控制系统报告，收集起始浓度5g/L，最终浓度5g/L部分流出液，合并后，体积260ml，5’-dATP的平均浓度60g/L，加3倍95％乙醇，28℃保温搅拌1～2h，即可析出dATPNa盐结晶，过滤，真空干燥，可得dATPNa 10g，含量98.2％。

实施例3

本实施例中是5’-CTP的层析分离，在分离过程中采用图1所示的智能层析分离系统，具体过程如下：

配制1L含有40mmol/L CMP、200mmol/L磷酸缓冲液(pH＝6.5)、200mmol/L 葡萄糖和5mmol/L磷酸镁的反应液中加，入70g速冻的啤酒酵母，其他条件与实施例1相同。最终可得CTP 8g，含量98.1％。

实施例4

本实施例中是5’-UTP的层析分离，在分离过程中采用图1所示的智能层析分离系统，将实施例3中的CMP改成UMP，其它条件同上，最终可得8.5g UTP，含量98.3％。

实施例5

本实施例中是5’-GTP的层析分离，在分离过程中采用图1所示的智能层析分离系统，将实施例3中的CMP改为GMP，其它条件同上，最终可得7.8g GTP，含量98％。

采用与上述相同方法亦可制造dCTP和dGTP。

本发明基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法及系统，通过在低温层析柜中进行NTP/dNTP的层析分离，并根据设置在低温层析柜外的核酸蛋白检测仪和 HPLC检测器进行实时在线检测和智能化控制，避免经常打开低温层析柜取样或调控仪器等致使核苷三磷酸降解，同时也保证了层析分离过程的高质量运行；本发明通过核酸蛋白检测仪的实时在线检测，监控上样、水洗过程中是否有NTP/dNTP流出，从而了解上述过程是否正常运转；通过定时在线取样和HPLC检测器检测，控制洗脱过程和收集NTP/dNTP。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。