一种强直性脊柱炎病的肠型评分模型及构建方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种强直性脊柱炎病的肠型评分模型及构建方法和应用。

背景技术

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是以骶髂关节和脊柱附着点炎症为主要症状的疾病。与HLA-B27呈强关联。某些微生物(如克雷白杆菌)与易感者自身组织具有共同抗原，可引发异常免疫应答。是四肢大关节，以及椎间盘纤维环及其附近结缔组织纤维化和骨化，以及关节强直为病变特点的慢性炎性疾病。强直性脊柱炎属风湿病范畴，病因尚不明确，是以脊柱为主要病变部位的慢性病，累及骶髂关节，引起脊柱强直和纤维化，造成不同程度眼、肺、肌肉、骨骼病变，是自身免疫性疾病。迄今为止，其发病机制还不是很清楚且免疫特征也未明确。

群体分型(分层/层化，stratification)是一种有助于更好的理解人类身心健康等复杂生物学问题的有效方法。将这种方法应用于肠道微生物中，可以将不同的群落组成定义为“肠型”。主要类群如拟杆菌(Bacteroides)和普氏菌属(Prevotella)的比例在成人肠道内是稳定的。考虑到肠道系统的重要性和复杂性，确定微生物群落组成的结构模式及其背后的组装机制是非常必要的，这些能够帮助我们更好的了解AS的疾病状态。基于群落组成结构的分类方法将加强基于微生物的疾病诊断、治疗或预防。

发明内容

针对强直性脊柱炎发病机制不很清楚且免疫特征未明确的问题，本发明提供了一种强直性脊柱炎病的肠型评分模型及构建方法和应用。

本发明的目的是将AS患者进行“肠型”分类，构建肠型评分，并研究不同肠型的临床特征，增强对AS疾病的深入了解，为AS的诊疗提供新的思路和依据。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种强直性脊柱炎病的肠型评分模型，采用Dirichlet多项式混合无监督聚类描述微生物组数据的变异性，对样本肠道菌群分型为E1型和E2型；以LDA SCORE log10＞2为界，通过LEfSe筛选出不同肠型间基于属水平的肠道微生物分类标志物；通过主成分分析PCA，分别提取两个肠型各优势菌的主成分PC1作为分类标志物的特征评分PC1i和PC1j，构建肠型的评分，具体计算公式如下：

肠型评分＝∑PC1i-∑PC1j

E1型的特征性菌为：科林塞拉(Collinsella)、单球状体(Monoglobus)、阿克曼西亚(Akkermansia)、多莉娅(Dorea)、亨加泰拉(Hungatella)、伦布西亚(Romboutsia)、副卡特尼菌(Fusicatenibacter)、RF39菌(RF39)、NK4A214\组(NK4A214_group)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)、CAG\56菌(CAG_56)、毛螺菌科\UCG\003菌(Lachnospiraceae_UCG_003)、普雷沃氏菌科_NK3B31群(Prevotellaceae_NK3B31_group)、粪杆菌(coprobacter)、臭细菌(Odoribacter)、拟杆菌门,拟杆菌目(Muribaculaceae)、巴内西拉(Barnesiella)、真杆菌\木霉菌(_Eubacterium__xylanophilum_group)、共右旋杆菌(Colidextribacter)、嗜胆汁菌(Bilophila)、真杆菌科\锡雷乌姆菌(_Eubacterium__siraeum_group)、瘤胃球菌(_Ruminococcus__gauvreauii_group)、UCG\005菌(UCG_005)、UCG\002菌(UCG_002)、GCA_900066575菌(GCA_900066575)、毛螺菌科\UCG\001菌(Lachnospiraceae_UCG_001)、UCG\003菌(UCG_003)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus_gnavus_group)、毛螺菌科\NK4A136\菌(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、拉赫诺斯皮拉(Lachnospira)、菊科\R\7\菌(Christensenellaceae_R_7_group)、杆菌\埃希菌(_Eubacterium__eligens_group)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、CAG\352菌(CAG_352)、粪球菌(Coprococcus)、阿利斯蒂普斯(Alistipes)、毛螺菌科\FCS020\菌(Lachnospiraceae_FCS020_group)、真杆菌\共前列烷烯菌(_Eubacterium__coprostanoligenes_group)、Fournierella、无杆菌(Agathobacter)、梭状芽孢杆菌UCG\014(Clostridia_UCG_014)、蔷薇属(Roseburia)、拨号器菌(Dialister)、下穹窿(Subdoligranulum)、普雷沃菌属(Prevotella)、粪杆菌(Faecalibacterium)；

E2型的特征性菌为：大肠杆菌志贺氏菌(Escherichia_Shigella)、类杆菌(Bacteroides)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus_gnavus_group)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、腔隙杆菌(Lachnoclostridium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、_梭菌群(_Clostridium__innocuum_group)、丹毒杆菌(Erysipelatoclostridium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、黄酮萃取菌(Flavonifractor)、毛f螺菌科\ND3007\菌(Lachnospiraceae_ND3007_group)、硝酸盐还原远洋杆菌(Pelagibacterium)、真杆菌科\腹菌(_Eubacterium__ventriosum_group)、萨特氏菌(Sutterella)、丹毒菌科UCG\003菌(Erysipelotrichaceae_UCG_003)。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

本发明利用16s rRNA肠道菌群测序数据，对AS患者进行肠型分析结果显示，AS患者可以分为两种目前认可的肠型，即Prevotella(普氏菌)驱动的肠型和Bacteroides(拟杆菌)驱动的肠型，且两型之间的物种多样性、物种结果、物种组成和临床特征存在差异。此外，我们该构建了肠型评分，可有有效区分两种肠型。肠型跟饮食习惯密切相关，因普氏菌属型具有较强的植物纤维发酵能力，素食主义者或者食用较多纤维素的人肠道菌群倾向于普氏菌属肠型；拟杆菌型具有较强的蛋白和脂肪酵解能力，以肉类和蛋白类为主要食谱的人更多为拟杆菌属肠型。本研究系AS疾病的基础研究，为加强对AS疾病的深入了解提供理论依据，有可能成为预防和治疗AS疾病提供参考。

附图说明

图1是本发明肠型分型的折线图；

图2是本发明肠型表征的箱线图；

图3是本发明LEfSe选择肠型间的肠道微生物分类标志物；

图4是本发明不同肠型受试者菌群不同Alpha多样性分析指数下的稀释曲线图。其中横轴为测序深度，纵轴为样本的Alpha多样性指标。下图为两组间Alpha多样性的比较分析图。

图5是本发明不同肠型受试者菌群Alpha多样性分析图；

图6是本发明不同肠型受试者菌群beta多样性分析PcoA图；

图7是本发明不同肠型菌群的门水平物种分布堆叠图；

图8是本发明不同肠型菌群的属水平物种分布堆叠图；

图9是本发明在不同肠型之间的临床特征箱线图。

图10是本发明构建的肠型评分的ROC曲线。

具体实施方式

本发明采用采用高通量二代测序检测77例AS测试样本的16s rRNA肠道菌群扩增子。探究肠型的分类构建肠型评分，及不同肠型的临床特征，研究主要分为以下四部分：

(1)收集AS测试样本的粪便样本及外周血，采用流式细胞术(FCM)和CBA法检测外周淋巴细胞和细胞因子。(2)采用llumina高通量测序技术进行肠道菌群16s测序。(3)采用QIIME2平台对16s测序数据进行分析。(4)采用Dirichlet多项式混合无监督聚类描述微生物组数据的变异性，对AS肠道菌群分型，挖掘测试样本肠道菌群的特征。

实施例1

收集2018年1月至2019年6月就诊于山西医科大学第二医院风湿免疫科住院确诊的强直性脊柱炎病(AS)77例测试样本。取测试样本约10g清晨初次中段粪便标本，在1min内精确称取250mg粪便样本并放入新的2mL无菌容器中，样本保存至-80℃冰箱中备用，随后进行基因组DNA提取及测序。所有测试样本要求临床资料完整，积极配合按时留取粪便标本，同时排除合并有其他的免疫相关性疾病或肠道疾病、近6个月有慢性感染史、合并有恶性肿瘤等可能对检测结果造成影响的疾病、近1个月内参加过其他药物观察组或近期服用免疫调节药物、免疫抑制药物、抗生素和益生菌、益生元等微生态调节剂和处于怀孕或哺乳期的测试样本。

采集所有测试样本外周血，以流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测其外周血总T、B、CD4+T、CD8+T、NK细胞及Th1、Th2、Th17、Treg细胞等CD4+淋巴细胞亚群的绝对计数。检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、INF-γ以及TNF-α等细胞因子的水平。各免疫细胞的标记如下：T细胞：CD45+CD3+；B细胞：CD45+CD3-CD19+；CD4+T细胞：CD45+CD3+CD4+；CD8+T细胞：CD45+CD3+CD8+；NK细胞：CD45+CD3-CD16+CD56+。Th1细胞：CD4+INFγ+；Th2细胞：CD4+IL-4+；Th17细胞：CD4+IL-17+；Treg细胞：CD4+CD25+Foxp3+。

采用CTAB法提取粪便微生物DNA。我们扩增了细菌16S基因V3-V4区。采用16S正向引5-'ACTCCTACGGGACCCAGCAG-3'和16S反向引物5-'GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'PCR扩增16S核糖体DNA(16S rDNA)基因。采用KAPAHiFi HotStart Ready Mix(Promega,Madison,WI)，按照制造商的方法进行PCR扩增反应。PCR循环条件为:95℃变性2min，55℃退火30s，72℃延伸步骤30s，扩增25个循环，72℃延伸步骤5min。用2％琼脂糖凝胶检测，检查扩增产物的质量。PCR产物经Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymoclean Research)纯化回收。凝胶纯化产物用

采用fastqc对原始序列数据进行质量控制，通过usearch和vsearch软件获取引物的位置信息。用QIIME2的DADA2软件将Hiseq/Miseq测序获得的Paired-end(PE)reads拼接成一条序列，过滤低质量和重复的reads，去除嵌合体，修正扩增子的测序错误，最终得优化序列(ASV)。基于优化序列采用silva数据库作为物种注释的参考数据库进行物种分类注释。

采用Dirichlet多项式混合无监督聚类描述微生物组数据的变异性，对AS样本肠道菌群分型为E1型和E2型。以LDA SCORE(log10)＞2为界，通过LEfSe筛选出不同肠型间基于属水平的肠道微生物分类标志物。通过主成分分析(PCA)，分别提取两个肠型各优势菌的主成分PC1作为分类标志物的特征评分PC1i和PC1j，构建肠型的评分，具体计算公式如下：

肠型评分＝∑PC1i-∑PC1j

其中，E1型的特征性菌为：科林塞拉(Collinsella)、单球状体(Monoglobus)、阿克曼西亚(Akkermansia)、多莉娅(Dorea)、亨加泰拉(Hungatella)、伦布西亚(Romboutsia)、副卡特尼菌(Fusicatenibacter)、RF39菌(RF39)、NK4A214\组(NK4A214_group)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)、CAG\56菌(CAG_56)、毛螺菌科\UCG\003菌(Lachnospiraceae_UCG_003)、普雷沃氏菌科_NK3B31群(Prevotellaceae_NK3B31_group)、粪杆菌(coprobacter)、臭细菌(Odoribacter)、拟杆菌门,拟杆菌目(Muribaculaceae)、巴内西拉(Barnesiella)、真杆菌\木霉菌(_Eubacterium__xylanophilum_group)、共右旋杆菌(Colidextribacter)、嗜胆汁菌(Bilophila)、真杆菌科\锡雷乌姆菌(_Eubacterium__siraeum_group)、瘤胃球菌(_Ruminococcus__gauvreauii_group)、UCG\005菌(UCG_005)、UCG\002菌(UCG_002)、GCA_900066575菌(GCA_900066575)、毛螺菌科\UCG\001菌(Lachnospiraceae_UCG_001)、UCG\003菌(UCG_003)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus_gnavus_group)、毛螺菌科\NK4A136\菌(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、拉赫诺斯皮拉(Lachnospira)、菊科\R\7\菌(Christensenellaceae_R_7_group)、杆菌\埃希菌(_Eubacterium__eligens_group)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、CAG\352菌(CAG_352)、粪球菌(Coprococcus)、阿利斯蒂普斯(Alistipes)、毛螺菌科\FCS020\菌(Lachnospiraceae_FCS020_group)、真杆菌\共前列烷烯菌(_Eubacterium__coprostanoligenes_group)、Fournierella、无杆菌(Agathobacter)、梭状芽孢杆菌UCG\014(Clostridia_UCG_014)、蔷薇属(Roseburia)、拨号器菌(Dialister)、下穹窿(Subdoligranulum)、普雷沃菌属(Prevotella)、粪杆菌(Faecalibacterium)。E2型的特征性菌为：大肠杆菌志贺氏菌(Escherichia_Shigella)、类杆菌(Bacteroides)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus_gnavus_group)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、腔隙杆菌(Lachnoclostridium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、_梭菌群(_Clostridium__innocuum_group)、丹毒杆菌(Erysipelatoclostridium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、黄酮萃取菌(Flavonifractor)、毛f螺菌科\ND3007\菌(Lachnospiraceae_ND3007_group)、硝酸盐还原远洋杆菌(Pelagibacterium)、真杆菌科\腹菌(_Eubacterium__ventriosum_group)、萨特氏菌(Sutterella)、丹毒菌科UCG\003菌(Erysipelotrichaceae_UCG_003)。

基于上述两种肠型，使用MicrobiotaProcess包进行alpha多样性指数分析，采用Bray-curtis距离进行beta多样性分析，通过Anosim分析(Analysis of similarities)，一种基于置换检验和秩和检验的非参数检验方法，用来检验组间的差异是否显著大于组内差异，从而判断分型是否有意义。

为了更好的解析测试样本肠道菌群复杂的特征，我们将AS的测试样本的菌群进行了肠型特征分析。如图1所示，在K＝2时候曲线出现明显拐点，提示其肠道菌群均可分为两型(肠型1和肠型2)。我们发现，肠型1是由Prevotella(普氏菌)驱动的。肠型2是由Bacteroides(拟杆菌)驱动的，且肠型1和肠型2之间存在差异(P<0.05)，如图2所示。我们通过LEfSe分析发现，普氏菌属(Prevotella)为肠型1的优势菌(图3)，拟杆菌属(Bacteroides)为肠型2的优势菌(图3)，且在两型之间存在差异。以上所有分析都是基于属水平分类进行的，因为属水平可以更好的反映生态位变化。

为了更好的表征两种肠型，我们进行了如下分析：逐步扩大随机抽样的测序深度，可见随着测序深度的增加，Rarefaction Curve逐渐升高，曲线斜率逐渐趋于平滑，提示测序量充足，样本Alpha多样性指标达到稳定(图4)。通过Alpha多样性分析发现，肠型1肠道菌群的物种Observe指数(P<0.001)、Chao1指数(P<0.001)、ACE指数(P<0.001)、Shannon指数(P<0.001)、Simpson指数(P<0.001)均高于肠型2(图5)。通过Beta多样性分析发现，如图6所示，肠型1和肠型2菌群显著分离，其Beta多样性指数Bray-curtis距离Anosim的r值为0.372，各肠型的Beta多样性存在明显差异(P＝0.001)。

物种组成分析发现：在门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌属(Bacteroides)、变形菌门(Proteobacteria)为两型的优势菌(图7)。在属水平上，拟杆菌属(Bacteroides)、柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)、大肠-志贺氏杆菌(Escherichia-Shigella)为两型的优势菌(图8)。结合临床特征发现，CRP，CD8+T，和NK在肠型1的表达量大于肠型2，且存在差异(P<0.05)(图9)。

为了识别每种AS患者肠型的潜在生物学特征，使用LEfSe确定了62个基于属水平的肠道微生物分类标志物，构建了肠型评分。我们的结果表明，肠型评分可以有效区分两种肠型，AUC为95.8％(95％CI:91.3％～100.0％)(图10)。

本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。