一种检测壬基酚的胶体金试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种检测壬基酚的胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术

壬基酚(nonylphenol，NP)作为环境内分泌干扰物(EEDs)的典型代表主要应用于化工业，具有蓄积性、亲脂性，能够干扰人体内分泌系统的正常工作，损伤神经系统和生殖系统，破坏抗氧化系统，损伤DNA，从而影响生物的生存和繁衍。目前壬基酚的残留分析主要是应用色谱法和免疫学方法，如GC(气相色谱)和HPLC(高效液相色谱)，ELISA(酶联免疫吸附法)。

应用这些理化分析技术对环境、生物等样品中壬基酚残留进行分析，不仅仪器化程度要求较高，并且需要经过繁复的分离、提取、净化、衍生等前处理过程，无法实现大样本的同时检测，对操作人员专业要求较高，前处理过程需要使用大量的有机溶剂，又造成了新的环境污染。色谱分析法由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。一般的免疫学方法的缺点是检测时间长，费用较高，不利于在基层单位推广使用。常见的ELISA试剂盒检测方法中：直接法一抗需标记，灵敏度不高，特异性一般，其检测速度有所提高，但仍至少需要三个小时；间接法交叉几率提高；双抗夹心法需多个抗原表位。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种成本低、操作简单、效率高的检测壬基酚的胶体金试纸条，并提供此胶体金试纸条的制备方法。

一方面，提供了一种检测壬基酚的胶体金试纸条，包括PE背衬、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线，所述质控线由羊抗鼠二抗喷涂而成，所述检测线由NP-OVA溶液喷涂而成。

本发明进一步设置为：所述加样垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水纸依次粘贴于所述PE背衬上。

本发明进一步设置为：还包括配套使用的96微孔板，所述96微孔板上包被有标记物。

本发明进一步设置为：所述标记物为壬基酚多克隆抗体-胶体金标记物。

本发明进一步设置为：所述胶体金垫由玻璃纤维材质制成。

另一方面，提供了一种制备上述的胶体金试纸条的方法，包括以下具体步骤：

1)制备胶体金颗粒；

2)除去多克隆抗体中的杂质并调节多克隆抗体的酸碱值；

3)制备多克隆抗体-胶体金标记物；

4)在硝酸纤维素膜上喷涂质控线和检测线；

5)将PE背衬、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装；

6)将步骤5)组装而成的胶体金试纸切割成条，得到胶体金试纸条。

本发明进一步设置为：在制备得所述胶体金颗粒前还包括：制备胶体金溶液，所述胶体金溶液为氯金酸水溶液与柠檬酸三钠水溶液的混合物。

本发明进一步设置为：所述多克隆抗体为壬基酚多克隆抗体，所述壬基酚多克隆抗体的浓度为200μg/ml。

本发明进一步设置为：所述制备多克隆抗体-胶体金标记物具体包括：

调节胶体金溶液的酸碱值；

加入多克隆抗体，缓慢混匀，静置反应；

封闭、离心及沉淀处理；

低温避光保存。

本发明进一步设置为：所述的胶体金试纸条的规格为长8cm×宽3.2mm。

综上所述，本发明提供了一种检测壬基酚的胶体金试纸条及其制备方法，与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：检测成本低；检测操作简单；检测效率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本实施例提供的一种检测壬基酚的胶体金试纸条的制备方法的工艺流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“前”、“后”、“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，还可以是两个元件内部的连通，可以是无线连接，也可以是有线连接。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

上面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

此外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本实施例的第一方面，提供了一种检测壬基酚的胶体金试纸条，包括PE背衬、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线，质控线由羊抗鼠二抗喷涂而成，检测线由NP-OVA溶液喷涂而成。

需要说明的是，在一些实施例中，背衬还可以为PVC背衬，质控线还可以由羊抗兔二抗、兔抗鼠二抗等溶液喷涂而成，检测线还可以由NPE-BSA溶液喷涂而成。

进一步的，加样垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴在PE背衬上。

在本实施例中，加样垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸按照由上至下的顺序依次粘贴在PE背衬上，其中，加样垫与胶体金垫的重叠长度为0.6-1.8mm，优选为0.7mm，胶体金垫与硝酸纤维素膜的重叠长度为0.6-1.8mm，优选为0.7mm，硝酸纤维素膜与吸水纸的重叠长度为0.6-1.8mm，优选为0.7mm，加样垫和吸水纸均对齐于PE背衬的上下边沿，胶体金垫由玻璃纤维材质制成。

进一步的，还包括配套使用的96微孔板，96微孔板上包被有标记物，标记物为壬基酚多克隆抗体-胶体金标记物。

在本实施例中，可将胶体金标记好的多克隆抗体按照每孔10μL用冻金稀释溶液稀释混匀后分装与96孔板中，随后将其置入冻干机中进行冻干处理。需要说明的是，本实施例所用冻金稀释溶液为0.1M三羟甲基氨基甲烷与10％蔗糖的混合液，96孔板每孔的容量为100μL。需要进一步说明的是，在一些实施例中，微孔板还可以采用12微孔板、24微孔板和48微孔板等。

本实施例的第二方面，提供了一种制备上述的胶体金试纸条的方法，如图1所示，包括以下具体步骤：

101：制备胶体金颗粒；

需要说明的是，在制备得胶体金颗粒前还包括：制备胶体金溶液，胶体金溶液为氯金酸水溶液与柠檬酸三钠水溶液的混合物。

在本实施例中，使用柠檬酸三钠作为还原剂将氯金酸还原制成粒径为50nm的胶体金颗粒：首先取0.02％氯金酸水溶液1000ml并用恒温电磁搅拌器将其加热至沸腾，在持续搅拌的情况下加入20％柠檬酸三钠水溶液1.2ml，继续搅拌加热8-10分钟，待上述混合溶液稳定地呈透亮的酒红色时，室温冷却一定时间后，用去离子水将其恢复到粒径为50nm的颗粒，在恒定为4摄氏度的避光环境中进行保存。

102：除去多克隆抗体中的杂质并调节多克隆抗体的酸碱值；

在本实施例中，首先将透析袋放入NaHCO3与EDTA·2Na的混合液中煮沸15分钟并用蒸馏水进行彻底的清洗，然后将多克隆抗体放入透析袋中进行透析处理，最后将经过透析处理的多克隆抗体放置在恒定为4摄氏度的避光环境中进行保存。需要说明的是，本实施中的多克隆抗体的酸碱值最终为7.8(效果最佳)。需要说明的是，本实施例中的多克隆抗体为壬基酚多克隆抗体，壬基酚多克隆抗体的浓度为200μg/ml。

103：制备多克隆抗体-胶体金标记物；

在本实施例中，首先用EDTA·2Na溶液调节胶体金溶液的酸碱值，使其酸碱值为7.8，然后加入酸碱值同样为7.8的多克隆抗体缓慢混匀、静置充分反应；在上述混合液中加入蒸馏水以封闭多余的位点，随后对其进行离心、沉淀处理，以制得多克隆抗体-胶体金标记物，最后在恒定为4摄氏度的避光环境中进行保存。

104：在硝酸纤维素膜上喷涂质控线和检测线；

在本实施例中，首先将羊抗鼠二抗和NP-OVA溶液在硝酸纤维素膜上喷涂成两条线，分别作为质控线和检测线，然后在室温、避光的环境中干燥1.5个小时，需要再次说明的是，在一些实施例中，质控线还可以由羊抗兔二抗、兔抗鼠二抗等溶液喷涂而成，检测线还可以由NPE-BSA溶液喷涂而成。

105：将PE背衬、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装；

106：将步骤5)组装而成的胶体金试纸切割成条，得到胶体金试纸条。

在本实施例中，胶体金试纸条的规格为长8cm×宽3.2mm，需要说明的是，在一些实施例中，还可以根据实际需要将胶体金试纸切割成其他尺寸规格的胶体金试纸条。

本实施例的第三方面，应用了一种常规的检测原理及检测结果判定方法。

目前，壬基酚的检测通常采用免疫层析法，其检测的原理为：在毛细作用的辅助下，使壬基酚分子在条状玻璃纤维制成的膜上泳动，壬基酚与玻璃纤维膜上结合有金粒子的抗体反应后继续向前泳动。由于竞争作用，结合金粒子的抗体与检测线处NP－OVA溶液的结合率会随样品中壬基酚分子含量的增加而降低，此时，检测线的颜色也会逐渐变淡直至不显色，在继续向前泳动的过程中，壬基酚分子将会和喷涂在质控线处的羊抗兔二抗发生非特异结合，此时胶体金粒子会因为被拦截而显色。因此，壬基酚胶体金的判定方法为：

阳性：质控线显色，检测线不显色。

阴性：质控线显色，检测线显色。

试纸条无效：质控线不显示。

综上，本发明具有以下有益效果：

1)检测成本低；

2)检测操作简单；

3)检测效率高。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。