用于确定样品中分子的位置的方法和设备

发明的技术领域

本发明涉及用于确定样品中的一个或更多个空间方向上彼此间隔开的分子的位置的方法和设备，特别是根据MINFLUX方法确定样品中的一个或更多个空间方向上彼此间隔开的分子的位置的方法和设备。

现有技术

例如，在专利申请DE 10 2011 055 367 A1、WO 2015/052186 A1、专利文献DE 102013 114 860和Balzarotti F，Eilers Y，Gwosch KC，

在此，本质上是以激发光强度分布扫描具有荧光团的样品，该激发光强度分布在由强度最大值包围的中心具有局部强度最小值。例如，从STED(Stimulated EmissionDepletion：受激发射损耗)显微镜已知这种强度分布。

相反，在MINFLUX显微镜中，样品是以激发分布的最小值被逐步扫描的。首先，用独立的方法找到单个荧光团，并且在预定位步骤中，对荧光团的位置进行粗略估计。然后，将激发光分布的中心最小值依次定位在所估计的位置附近的多个位置处，并测量每个位置的发射信号，优选地通过使用共焦探测器对各个荧光光子进行计数。对于激发光分布的每个位置，测量的荧光强度或者每单位时间计数的光子数取决于激发光分布的最小值与荧光团的实际位置之间的距离：荧光团越接近最小值，荧光信号就越低。通过这种方式，特别是迭代地，可以以极高(高达1nm)的精度确定各个荧光团的位置。为此，根据现有技术，例如使用修改的最大似然估计器。

除了非常高的精度之外，MINFLUX显微镜的另一个优点还在于高光子效率：平均而言，与例如借助于PALM/STORM显微镜的单分子定位相比，定位荧光团所需的激发光子数量明显较少，这就减少了(在活体样品的情况下的)漂白和光毒性。这是因为通常随着每次迭代，激发光分布的最小值会越来越接近实际的荧光团位置—随着每一步，荧光团就被暴露在更少的光子下。

STED显微镜是基于通过受激发射使荧光损耗：通过合适波长的STED光的辐射，荧光团可以有针对性地从激发态(重新)置于荧光团不再发出荧光的基态。

在STED显微镜中，通常将近似高斯激发光分布与具有局部最小值的例如圆环形的STED光分布叠加，其中激发光分布的最大值与STED光分布的最小值相吻合。由此，位于中心以外的荧光团被STED光有针对性地激发，并且因此对荧光信号没有贡献。通过这种方式，有效分辨率可以降低到远低于衍射极限。

在一些现有技术文献中，已经提出了将MINFLUX方法和类似的单分子定位方法与STED显微镜组合起来。

因此，专利申请DE 10 2017 104 736 A1和EP 3 372 989 A1描述了具有局部最大值的激发光分布与具有局部最小值的STED光分布的叠加。通过移动具有STED最小值的STED分布来扫描样品，并且通过拟合算法来从荧光强度在STED强度分布的不同位置的测量值确定荧光团的位置。通过STED光可以抑制由位于待定位的荧光团附近的另外的荧光团引起的额外荧光。然而，所述方法的光子效率明显较低，特别是与传统的MINFLUX方法相比，因为叠加的光分布产生的有效发射(探测)点扩展函数(英语：Point Spread Function(PSF))在中心具有最大值而不是最小值(如在MINFLUX显微镜中)。

从WO 2020/198750 A1还已知一种方法，其中用第一和第二荧光团标记样品，其中两种荧光团的激发波长和发射波长不同。在4π显微镜装置中(即光束通过两个沿轴向方向定位在样品的相对侧上的物镜被聚焦到样品上的装置，其中这些光束至少部分地相互干涉)，第一荧光团的位置例如通过MINFLUX纳米镜以短间隔被测定，并且样品相对于显微镜的光束路径的位置是根据所测定的位置重新调整的，使得第一荧光团在实验期间始终位于视场的中心。为了使第二荧光团相对于第一荧光团定位或成像，然后将第二荧光团暴露在第二荧光团的激发波长范围内的高斯激发光分布下，该高斯激发光分布与仅影响第二荧光团的荧光的圆环形STED光分布叠加。通过这种方法，例如可以相对于用第一荧光团标记的特定基因位点，定位和跟踪生物细胞中用第二荧光团标记的RNA聚合酶复合物。

此外，专利文献EP 3 055 674 B1和专利申请US 2014/0042340 A1公开了一种基于MINFLUX的单分子跟踪方法，其中具有局部最小值的激发光分布和具有局部最小值的STED分布同心地叠加。在此，除了与波长相关的小偏差之外，STED分布的最小值的宽度和形状基本上对应于激发分布的宽度和形状。通过附加的STED光，荧光团仅在围绕中心的一个狭窄区域中被激发光激发。因此，不需要在整个视场范围内分离荧光团，而是只需要在STED最小值的较窄范围内实现分离，以便跟踪荧光团的运动。

中国专利申请CN 111024658 A还公开了MINFLUX和STED技术的类似组合，根据该专利申请，用同心布置的激发光分布和STED光分布对样品进行扫描，以定位样品中的单个荧光团。

除此之外，借助于所述方法，附加的STED光能够减少在单个荧光团的MINFLUX定位中的干扰背景荧光。

然而，这些方法的缺点在于，荧光发射光(探测光)的有效PSF受到激发光分布和STED光分布的影响。这特别地会导致有效激发的梯度降低和探测效率降低。此外，这些方法还需要对待定位分子的位置有相对良好的了解。

发明任务

因此，本发明的目的在于，提供用于确定在样品中的一个或更多个空间方向上彼此间隔开的分子的位置的方法和设备，所述方法和设备以相对于现有技术的上述缺点改进的方式减少了在MINFLUX定位时的背景荧光。

解决方案

本发明的目的通过具有独立权利要求1的特征的方法和具有权利要求13的特征的设备来实现。从属权利要求2至12涉及方法的有利实施方式，并且从属权利要求14和15涉及设备的有利实施方式。

发明描述

根据本发明的第一方面的方法用于确定样品中一个或更多个空间方向上彼此间隔开的分子的位置。

特别地，彼此间隔开的分子被设计用于，在用第一波长的激发光照射样品时，发射第二波长的发射光，其中发射光例如可以是荧光。

发光的分子彼此间隔开，即是分离的。换句话说：这些分子彼此间具有这样的平均距离，因此可以通过根据本发明的方法将这些分子彼此分开进行定位。因为根据本发明的方法特别地是非衍射受限的定位方法，所以平均距离特别地可以低于激发光和/或去激活光的波长。然而，在一些应用中，如果平均距离至少对应于激发光和/或去激活光的波长，则仍然是有利的。在这种情况下，特别地可以使用衍射受限的方法(例如，具有较低分辨率的相机成像的PALM/STORM显微镜)来预定位各个分子。

在荧光团(在本申请的背景下也称为“荧光染料”)的情况下，例如由此实现分子的分离，即用限定量的荧光团标记样品的分子，从而得到样品期望的标记密度。对此可替代地，如果不是所有荧光团同时发光的话，例如也可以用更高密度的荧光团来标记样品。为此，例如可以利用荧光团的闪烁行为，即以一定概率自发地从在激发光照射下发射荧光的活性状态变为在激发光照射下不发射荧光的非活性状态的特性。当然，荧光团的一部分也可以有针对性地转换为活性状态或非活性状态，例如通过辐射合适波长的激活光(也称为开关光)或去激活光(特别是在使用所谓的可开关荧光团的情况下)，以便分离活性荧光团。

在此，确定分子的位置也被称为定位(Lokalisation)或定位(Lokalisierung)，并且特别地包括精度在1nm至100nm范围内的位置确定，进一步特别地包括精度在1nm至10nm范围内的位置确定。

位置确定可以在一个空间方向上、两个空间方向上或三个空间方向上进行。特别地，两个空间方向垂直于光轴延伸，激发光和特别地还有去激活光沿着该光轴入射到样品上，即两个方向形成垂直于光轴的平面(x-y平面)，特别是样品中的焦平面。在三个空间方向上进行位置确定的情况下，第三空间方向特别地平行于光轴(即，在z方向上)延伸。当然，其他空间方向也是可能的，例如相对于光轴倾斜布置的平面。

该方法具有以下步骤：

-产生多个光分布，其中每个光分布具有局部强度最小值和与之相邻的强度上升区域，其中光分布包括激发光分布和去激活光分布，

-用激发光分布和去激活光分布照射样品，

-针对激发光分布的不同定位，检测由分子发射的光子，以及

-基于针对激发光分布的不同定位检测到的光子，推导出分子的位置。

光分布(即，光的空间强度分布)分别具有局部强度最小值，即在空间中存在最小光强度一个点或更多个彼此相邻的点。在此，最小光强度可以为零或几乎为零，即不大于背景光强度。特别地，激发光分布和去激活光分布的局部强度最小值位于样品的焦平面中。特别地，激发光分布和/或去激活光分布是对称的，其中相应的局部强度最小值位于相应的光分布的中心。当然，激发光分布和/或去激活光分布也可以分别具有更多个局部最小值，例如在周期性的光分布情况下，如线型模式或者二维或三维的光栅。

特别地，光分布通过如下方式产生：为每个光分布例如从激光源产生相干光的光束(即，激发光束和去激活光束)，并且其中光束的振幅或相位分别被调制并聚焦到样品中，特别是用物镜聚焦到样品中。由于振幅调制或相位调制，于是在焦点得到上述具有局部最小值的光分布。在此，光束可以彼此分开地或共同地进行振幅调制或相位调制。例如，可以分别通过相位调制产生所谓的2D圆环(Donut)或3D圆环。

在本说明书的上下文中，术语“激发光”应理解为如下光，该光具有适于激发样品中彼此间隔开的分子(特别是荧光团)的波长，使得这些分子发射光子，特别是荧光。

在本说明书的上下文中，“去激活光”是指如下光，该光防止彼此间隔开的分子在激发光的辐射下发射光子。为此，去激活光例如可以使分子从激发态转变为基态或基态以上的振动态，例如通过受激发射来进行。对此可替代地，去激活光也可以使分子进入非活性状态，例如暗态，在暗态下分子不能发射光子。此外，根据本发明，去激活光也可以阻止分子从非活性状态转变到活性状态。去激活光在本说明书的上下文中也可以被称为荧光阻抑光并且特别地是刺激光或者STED光。

根据本发明的方法，激发光分布和去激活光分布照射样品，即激发光分布照射待定位分子所在样品的至少一部分。

特别地，用点探测器(如，雪崩光电二极管)(英文：single photon avalanchediode(SPAD))、光电倍增管(PMT)或混合探测器或面探测器来检测发射的光子，该面探测器包括多个布置在像平面中(例如，上述类型)的点探测器。在此，例如可以测定计数率，即每时间单位探测到的光子的数量，该计数率可以类似于单个分子的发射强度来处理。

为了重新定位激发光分布，例如可以利用一个或更多个电光偏转单元(英文：electro optical deflector(EOD)，电光偏转器)、声光偏转单元(英文：acousto opticaldeflector(AOD)，声光偏转器)、检流计式扫描仪、微镜阵列或光调制器(英文：spatiallight modulators(SLM)，空间光调制器)使激发光束相对于样品移动。对于光束偏转可替代地，当然也可以例如利用压电元件相对于激发光束重新定位固定样品的样品保持器。

针对激发光分布的每个定位检测发射的光子，并且根据激发光分布的定位和分别相关联的发射光强度或者光子计数率确定分子的位置。这可以例如根据MINFLUX方法进行。在此，充分利用了以下事实：分子越接近激发光分布的局部最小值，由分子发射的光子就越少。例如，可以借助于必要时经过修改的最大似然估计器来估计分子的位置，特别地如现有技术中已知的那样。

特别地，根据本发明的方法的特征在于，激发光分布的局部最小值依次布置在扫描区域内的多个扫描位置处，其中，在与扫描区域相关联的捕获区域(在该捕获区域中，能够从扫描位置和检测到的相关联的光子中明确地推导出分子的位置)中的去激活光的光强度最大相当于去激活光的饱和强度的三倍，特别地最大相当于饱和强度的两倍，进一步特别地最大相当于该饱和强度。特别地，在扫描区域中的去激活光的光强度也最大相当于去激活光的饱和强度的三倍，特别地最大相当于饱和强度的两倍，进一步特别地最大相当于该饱和强度。

在此，术语“饱和强度”表示去激活光的光强度，其中50％的分子，特别是荧光团(例如，在STED光的情况下，通过受激发射)被去激活。

当分子位于捕获区域中时，可以通过评估相应扫描位置的光子数来明确地定位分子。相反，在捕获区域以外，特别地可以从所测定的光子数得出分子的多个估计位置。也就是说，例如如果分子实际上位于捕获区域中，则基于光子数和扫描位置测定的最大似然估计器提供了明确的值。特别地，捕获区域小于扫描区域，但也可以与扫描区域相同或更大，这取决于所使用的扫描位置的模式(英文：set of targeted coordinates(STC)，目标坐标集)以及特别地所使用的位置估计器。此外，捕获区域可以形成一个平面(例如，在2D定位的情况下在焦平面中)或一个体积(在3D定位的情况下)。

例如，可以通过与激发光分布相比更宽的去激活光分布(例如，通过调整强度或相位调制)来实现捕获区域中的去激活光的最大强度，该最大强度最大相当于饱和强度的三倍。在此，激发光分布可以被重新定位在例如静止的去激活光分布的最小值周围的更大区域内，或者去激活光分布可以与激发光分布一起被重新定位。

特别地，通过根据本发明的方法，可以实现有效探测点扩展函数(PSF)，特别是有效探测点扩展函数的宽度(例如，定义为在半最大值的位置处的全宽度，英文：full widthat half maximum(FWHM)，半峰全宽)基本上不受去激活光分布的影响，更确切地说与分子实际位于捕获区域内的何处无关。

在此，术语“有效探测PSF”是指分子在被激发光激发后发射的发射光的分布，其是由光学系统的衍射造成的。在此，探测PSF原则上由激发PSF和去激活光的PSF组合而成。然而，在根据本发明的方法中，由于激发PSF和去激活PSF未彼此同心地布置，并且因此存在与探测孔眼光阑(Detektionslochblende)的投影中心位置的偏差(即，非共焦布置)，因此会有扭曲。

在根据现有技术的STED显微镜(在此，STED光对应于去激活光)中，有效探测PSF被STED光有针对性地变窄，以便将分辨率提高至衍射极限以下。

与此相反，根据本发明的光分布被设计成使得有效探测PSF基本上仅受激发光分布的影响。因此，探测PSF在根据本发明的方法中特别地不应变的更窄。相反，应通过去激活光抑制位于激发光分布的范围中或其附近的其他荧光团的背景发射，以便提高信号背景比。去激活光分布仅轻微地影响光子发射的有效PSF的这一事实在此具有如下优点：可以抑制背景荧光，同时能够更简单且更准确地确定分子的位置。

根据一实施方式，去激活光在扫描位置处的光强度相当于饱和强度的最大50％，特别地相当于饱和强度的最大45％，进一步特别地相当于饱和强度的最大40％，进一步特别地相当于饱和强度的最大35％，进一步特别地相当于饱和强度的最大30％，进一步特别地相当于饱和强度的最大25％，进一步特别地相当于饱和强度的最大20％，进一步特别地相当于饱和强度的最大15％，进一步特别地相当于饱和强度的最大10％，进一步特别地相当于饱和强度的最大5％。

根据一实施方式，去激活光是STED光，即通过受激发射使分子(特别是荧光团)置于基态以上的振动态的光，分子从该振动态过渡到基态而不发射光子。

根据另一实施方式，重新定位激发光分布，而保持去激活光分布位置固定，使得在局部强度最小值周围区域内或者在去激活光分布的局部强度最小值周围的区域内多次不同地定位激发光分布的局部最小值。在此特别地，在局部强度最小值周围的区域(激发光分布在其该区域中被重新定位)具有这样的宽度，即在该区域中光子发射的有效探测PSF不受去激活光的影响或仅最小程度地受到去激活光的影响。

通过保持去激活光分布静止，可以实现不太复杂并且特别是更紧凑的光学结构，因为不需要同时对激发光束和去激活光束的进行快速光束移动的装置。例如，激发光可以借助于声光偏转器(AOD)移动，而去激活光束特别地仅较缓慢地(例如，通过检流计式扫描仪)移动。

根据另一实施方式，由于相干光的干涉而产生的光分布被用来确定位置。这例如在与物镜光瞳共轭的平面中对激光进行相位调制以产生焦点中的光分布就是这种情况。

根据另一实施方式，使用至少一个光束整形装置，特别是至少一个光调制器，进一步特别是具有多个可切换的像素的光调制器，产生多个光分布。例如，至少一个光调制器可以是相位调制的所谓空间光调制器(SLM)。这些调制器特别地具有带有闪耀光栅的有源表面，其中可切换的像素布置在有源表面上，并且其中通过借助液晶的切换过程可以将各个像素调节到期望的相位值。通过借助于可切换的像素产生相位模式(如，涡旋模式或同心环和圆盘)，例如可以在焦平面产生强度分布(如，2D圆环和3D圆环)。特别地，至少一个光调制器被布置在与物镜光瞳共轭的平面中。作为光调制器的可替代方案，例如也可以设置其上施加有相位模式的相位板。

根据另一实施方式，相比于与激发光分布的局部最小值相邻的激发光分布的两个局部最大值之间的相应区域，与去激活光分布的局部强度最小值相邻的去激活光分布的两个局部最大值之间的区域至少在一个空间方向上进一步扩展，特别地进一步扩展10％或更多，进一步特别地进一步扩展20％或更多，进一步特别地进一步扩展30％或更多，进一步特别地进一步扩展40％或更多，进一步特别地进一步扩展50％或更多，进一步特别地进一步扩展60％或更多，进一步特别地进一步扩展70％或更多，进一步特别地进一步扩展80％或更多，进一步特别地进一步扩展90％或更多，进一步特别地进一步扩展100％或更多，进一步特别地进一步扩展150％或更多，进一步特别地进一步扩展了200％或更多，进一步特别地进一步扩展300％或更多，进一步特别地进一步扩展400％或更多，进一步特别地进一步扩展500％或更多。例如通过改变去激活光的总强度和/或通过改变施加在去激活光束上的相位模式，可以实现去激活光分布的宽度。通过与激发光分布相比更宽的去激活光分布可以有利地实现，有效探测PSF在重新定位激发光分布期间仅最小程度地受到去激活光分布的影响。

根据另一实施方式，在激发光分布(特别是激发光分布的局部最小值)被重新定位的扫描区域内，去激活光的光强度为去激活光的最大光强度的10％或更小，特别地是5％或更小，进一步特别地是4％或更小，进一步特别地是3％或更小，进一步特别地是2％或更小，进一步特别地是1％或更小，进一步特别地是0.5％或更小，进一步特别地是0.4％或更小，进一步特别地是0.3％或更小，进一步特别地是0.2％或更小，进一步特别地是0.1％或更小。在此，去激活光的最大光强度是指局部强度最大值处的强度值，该局部强度最大值特别地在与局部最小值相邻的局部最大值的位置处。通过这种方式，可以在去激活光分布仅对有效探测PSF的影响最小的情况下实现背景抑制。

根据另一实施方式，执行多个扫描步骤，其中在每个扫描步骤中都将激发光分布的局部最小值定位在相应的扫描区域的多个扫描位置处，其中每个扫描步骤的相应的扫描区域具有比之前的扫描步骤的扫描区域更小的面积或更小的体积，并且在至少部分的扫描步骤中，特别地根据相应的扫描区域的面积或体积，调整去激活光分布。在此特别地，与之前的扫描步骤的捕获区域相比，相应的扫描步骤的与相应的扫描区域相关联的捕获区域也具有更小的面积或者更小的体积。特别地，在该方法中可以执行另外的扫描步骤，在另外的扫描步骤中，扫描区域的面积或体积(并且特别地还有捕获区域的面积或体积)保持不变，特别是直到分子定位结束保持不变。

根据另一实施方式，根据相应的扫描区域的面积或体积调整去激活光分布的总强度，其中特别地，相应的扫描区域的面积或体积越小，总强度越大。

根据另一实施方式，根据相应的扫描区域的面积或体积调整去激活光分布的形状，其中特别地，相应的扫描区域的面积或体积越小，去激活光分布的半值宽度越小。为此，例如可以在扫描布置之间修改用于对去激活光束进行相位调制的相位模式，例如通过驱动光调制器的像素来修改。

根据另一实施方式，扫描区域是半径围绕分子的估计位置的圆形或球体，其中，半径在初始扫描步骤中具有第一值，在初始扫描步骤中激发光分布在扫描区域内被多次重新定位，并且其中特别地，在初始扫描步骤之后的至少一个另外的扫描步骤中，激发光分布在扫描区域内被重新定位，其中半径在至少一个另外的扫描步骤中具有小于第一值的第二值。这例如相当于MINFLUX方法的迭代。特别地，在每个扫描步骤中，激发光分布的最小值被依次布置在围绕荧光团的估计位置在相应扫描区域内布置的坐标模式(也称为目标坐标集(STC)或targeted coordinate pattem(TCP),目标坐标模式)的多个位置处。进一步特别地，在每个扫描步骤之后，从发射的光子和激发光分布的最小值的相关位置确定荧光团的估计位置，其中在每个扫描步骤中，在先前扫描步骤中估计的分子位置限定扫描区域的中心点。

根据另一实施方式，去激活光分布在重新定位激发光分布期间保持不变。也就是说，去激活光分布的总光强度和形状特别地保持不变。特别地，去激活光分布的总强度和形状在多个扫描步骤中，特别地在所有扫描步骤中保持不变。对此可替代地，可以在重新定位激发光分布(或在激发光分布的位置改变之间)期间改变去激活光分布，即特别地可以改变去激活光分布的形状和/或总强度。

根据另一实施方式，在推导出分子的位置之后，通过以下方式确定样品中的至少一个另外的分子的位置：用激发光分布照射另外的分子，针对激发光分布的不同定位检测由该另外的分子发射的光子，并且基于针对激发光分布的不同定位检测到的光子推导出该另外的分子的位置，其中，在确定另外的分子的位置之前，特别地同时，将激发光分布的局部最小值和去激活光分布的局部最小值定位在另外的分子的预期位置处。在此，激发光分布和去激活光分布可以例如与扫描设备(例如，检流计式扫描仪)一起移动，其中特别地，另外的分子在焦平面中的预期位置被布置在探测孔眼光阑的图像中心(即，相对于分子的预期位置实现共焦布置)。

根据另一实施方式，执行分子的预定位，其中测定分子的初始估计位置，并且其中特别地，样品在预定位期间仅用激发光分布(即，不用去激活光分布)照射。特别地，预定位包括找出分子，即通过检测背景发射上方的光子来识别特定样品体积中的光发射器。特别地，基于初始估计位置执行定位，其中进一步特别地，将初始扫描区域的中点布置在初始估计位置处。预定位不必基于MINFLUX方法，而是可以例如也基于精度较低的独立定位方法。例如，可以借助于具有相机成像的宽场荧光显微镜进行预定位。另一种可能性是用激发光的近似高斯焦点对样品区域进行共焦扫描，并且用点探测器探测发射光。根据另一实施方式，在预定位时，用具有局部最小值的激发光分布(特别是与在MINFLUX定位时相同的激发光分布)照射样品，其中，发射光与位置相关地被探测，并且基于与位置相关的探测确定分子的初始位置。特别地，与位置相关的探测可以通过在激发光分布的位置保持不变的情况下，移动探测孔眼光在样品平面中的投影来进行(所谓的“针孔轨道扫描”)。在此，例如可以采用第一扫描设备(例如，检流计式扫描仪)来移动探测孔眼光阑的投影，其中，利用第二扫描设备(例如，一个或更多个EOD)校正激发光束的位置，使得激发光分布的位置保持不变。对此可替代地，例如可以也可以利用面探测器(例如，雪崩光电二极管阵列)确定发射光在探测器平面中的分布，以便测定分子的初始位置。

根据另一实施方式，在预定位时(例如，在针孔轨道扫描(Pinhole-Orbit-Scan)或使用阵列探测器的位置相关探测期间)用去激活光分布照射样品。由此，可以有利地减少背景荧光，特别是来自沿光轴位于激发光的焦点上方或下方的平面的背景荧光，由此提高了预定位的精度。特别地，在预定位和另外的定位步骤(例如，MINFLUX步骤)之间，对去激活光分布的形状和/或去激活光的强度进行调整。然而，在某些情况下，在预定位期间仅用激发光照射样品并且仅在另外的定位步骤期间用去激活光照射样品也可能是有利的。

根据另一实施方式，利用电光偏转器相对于样品移动激发光分布，其中利用检流计式扫描仪相对于样品移动去激活光分布。根据另一实施方式，利用电光偏转器相对于样品移动激发光分布和去激活光分布，特别是共同移动激发光分布和去激活光分布。

根据另一实施方式，通过沿着光轴向样品上辐射激发光束形成激发光分布，和/或通过沿着光轴(特别是沿着同一光轴)向样品上辐射去激活光束形成去激活光分布。

根据另一实施方式，去激活光分布被设计成2D圆环。在此特别地，2D圆环被理解为具有(单个)中心强度最小值(特别是强度的零点)的光分布，其中强度最小值在垂直于光轴的平面中具有与强度最小值相邻的局部强度最大值。特别地，在与物镜光瞳共轭的平面中的2D圆环可以通过具有涡旋模式的相位调制(在关于光轴的圆周方向上从0到2n·π，其中n是自然数)例如借助于相位板或SLM产生。在此特别地，相位调制的光束是圆偏振的。

根据另一实施方式，通过用第一相位模式对去激活光进行相位调制来产生2D圆环，其中，第一相位模式具有在周向方向上相对于光轴(特别是连续地)从0增加到2n·π的相位，其中n是大于1的自然数，其中特别地n≥5。也就是说，产生了从相位值为0的直至大于2π的相位值(即，例如4π、6π、8π或10π)的涡流模式。由此有利地，可以在焦平面中产生在局部最小值周围更宽的低光强度区域，这便于将扫描位置布置在去激活分布的最大为饱和强度的三倍的区域中。在此，例如可以通过用相位模式对激发光进行相位调制产生激发光分布，该相位模式具有在周向方向上(特别是连续地)从0增加到2π的相位。在此已经证明，相位从0增加到10π或更多的涡旋模式是特别有利的，因为通过该相位模式形成具有特别宽的低强度区域的去激活光分布。

根据另一实施方式，去激活光分布被设计成3D圆环。3D圆环(也称为bottle beam，局域空心光束)具有(单个)中心强度最小值，特别是强度的零点，该强度最小值在所有三个空间方向上都被局部强度最大值包围。因此特别地，3D圆环形成了在所有侧都被强度上升包围的最小值。例如，通过用第一相位模式进行调制可以产生3D圆环，该第一相位模式具有恒定相位的同心环(或者，环和圆盘)，该同心环彼此的相位差为π。3D圆环形的去激活光分布对于根据本发明的方法是特别有利的，因为其在焦平面中(在x-y方向上)具有相对宽的低光强度区域，使得有效发射PSF受去激活光的影响很小。特别地，第一相位模式具有圆盘以及围绕圆盘同心布置的第一环、围绕第一环同心布置的第二环和围绕第二环同心布置的第三环，其中圆盘和第一环、第一环和第二环以及第二环和第三环彼此的相位差为π。这有利地产生了在z方向上延伸的强度分布。

根据另一实施方式，借助于物镜将去激活光束聚焦到样品中，其中，调整(特别是缩小)去激活光束的光束横截面，使得物镜的光瞳被照射不足，从而导致去激活光分布在光轴的方向上(即，在轴向方向上)被拉伸。在此，光瞳的平面是样品中焦平面的傅里叶平面。去激活光分布的轴向拉伸具有如下优点：去激活光抑制由待定位的分子周围另外的分子引起的背景发射(特别是背景荧光)的区域在轴向方向上扩展。背景荧光对信号的干扰在轴向方向上是特别明显的，因此通过该实施方式可以明显改善定位的质量。即使在使去激活光分布拉伸时去激活光的总强度保持不变，由此降低了某些点处的光强度，这种较低的强度仍可足以有效地抑制背景发射，因此尽管有这种影响，轴向区域的扩展仍具有积极作用。

可以例如通过特别是可调节的孔径光阑实现对去激活光束的光束横截面的调整，该孔径光阑有针对性地使物镜照射不足。对此可替代地，例如可以将光阑在光束路径中布置在光束整形装置(特别是光调制器，例如SLM)前方，以便使去激活光束在撞击到光束整形装置上之前变窄。在光阑处没有光损失的另一种可能性在于利用变焦光学器件使光束横截面变窄。

根据另一实施方式，通过对光束整形装置(特别是光调制器，例如SLM)的有源表面进行调整，调整去激活光束的光束横截面。光束整形装置的有源表面被设计用于，对穿过有源表面或者在有源表面上被反射和/或衍射的光束施加特别是可调节的相位模式。特别地，有源表面具有用于衍射去激活光束的闪耀光栅和多个特别是基于液晶的像素，其中像素的相位值是可调节的，使得可调节的相位模式与闪耀光栅相叠加，以便对衍射的光束施加相位分布。

根据另一实施方式，调整在光束整形装置的有源表面的外部区域中的闪耀光栅的取向，以便调整去激活光束的光束横截面，其中特别地，调整闪耀光栅的衍射顺序。特别地，对闪耀光栅的调整导致撞击到外部区域上的光从光束路径中解耦出去，因此该光不会照射样品。特别地，有源表面的外部区域包围有源表面的内部区域，特别地，在该内部区域上是第一相位模式，以便产生去激活光分布。因此，去激活光束的光束横截面缩小到从有源表面的内部区域到达光束路径中的光。

根据另一实施方式，特别地除了第一相位模式之外，在光束整形装置的有源表面上还产生第二相位模式。在此，通过用第二相位模式对去激活光束进行相位调制来拉伸去激活光分布。

根据另一实施方式，第二相位模式被设计成在相对于光轴的周向方向上拉伸的环，特别地其中环具有多个分段，其中彼此相邻的分段之间的相位差分别为π。这种相位模式导致焦点中的光强度分布的拉伸，该光强度分布通过布置在环内的第一相位模式在与物镜光瞳共轭的平面中产生。特别地，第二相位模式围绕第一相位模式同心布置，进一步特别地布置在有源表面的外部区域上，其中第一相位模式在有源表面的内部区域上形成。例如，第一相位模式可以是围绕圆盘同心布置的另外的环，其中该另外的环和圆盘的相位差为π。通过这种方式，例如可以在保持适当的面积比的情况下产生拉伸的3D圆环。这特别好地适用于根据本发明的方法，因为3D圆环在焦平面中(在x-y方向上)具有相对宽的低光强度区域，因此有效探测PSF受去激活光的影响很小，然而，在轴向方向上(z方向上)覆盖扩展的区域，以便有效地抑制背景荧光。在此，激发光分布可以例如被设计成3D圆环(局域空心光束)，而不需要附加的轴向拉伸。

根据另一实施方式，第一相位模式和第二相位模式都具有在周向方向上从0逐渐增加到n·2π的相位值(涡旋模式)，其中，第一相位模式被布置在圆盘上，并且第二相位模式被布置在围绕第一相位模式同心布置的环上，并且其中，第一相位模式和第二相位模式在径向方向上的相位差为a·π。在专利申请WO 2019/221622 A1中描述了这种相位模式。通过对圆盘(第一相位模式)和环(第二相位模式)的外半径之间的比进行调整，可以灵活地调整所得到的光分布在光轴方向上的拉伸和分布的宽度。

根据另一实施方式，第一相位模式具有圆盘和围绕圆盘同心布置的第一环，其中，第二相位模式具有围绕第一环同心布置的第二环和围绕第二环同心布置的第三环，并且其中，圆盘和第一环、第一环和第二环以及第二环和第三环彼此之间的相位差分别为π。通过这种方式，同样可以在合适的面积比的情况下生成在z方向上拉伸的3D圆环。

根据另一实施方式，特别地相对于第一相位模式和/或第二相位模式，在光束整形装置的有源表面上产生另外的第三相位模式，其中特别地，第三相位模式至少部分地与第一相位模式叠加。特别地，第三相位模式形成具有多个分段的圆盘，其中彼此相邻的分段彼此之间的相位差分别为π。由此，可以有利地在焦平面中在焦点强度分布周围的外围区域中产生附加光(例如，次最大值)，由此可以对改进对背景发射的抑制。特别地，第三相位模式在中央的子区域中与第一相位模式叠加，或者径向地布置在第一相位模式的内部。

根据另一实施方式，第一相位模式具有圆盘的形状，该圆盘具有在周向方向上从0涡旋状地增加到2n·π的相位，其中，第三相位模式由在圆盘的中心跨圆盘的部分区域拉伸的多个圆盘分段构成，其中，

根据另一实施方式，第三相位模式具有带有多个分段的圆盘的形状，其中，彼此相邻的分段彼此的相位差为π，其中，第一相位模式具有围绕第三相位模式同心布置的第一环和围绕第一环同心布置的第二环，并且其中，第一环和第二环彼此的相位差为π。通过这种方式，在保持第一环和第二环以及特别是分段的合适的面积比的情况下，可以在焦平面中产生具有附加的次最大值的3D圆环。

根据另一实施方式，去激活光束至少近似被设计成贝塞尔光束。例如，可以通过用锥透镜聚焦去激活光或通过用特别是环形的相位模型对去激活光进行相位调制来产生这种光束。空心贝塞尔STED光束的产生在现有技术中是已知的(例如，参见P Zhanq,P.Goodwin,J.Werner的‘Fast,super resolution imaging via Bessel beam stimulatedemission depletion microscopy’,Opt.Expr.22,12398(2014)；W.Yu,Z.Ji,D.Dong,X.Yang,Y.Xiao,X.Gong,P.Xi和K.Shi的‘Super-resolution deep imaging with hollowBessel beam STED microscopy’,Laser&Photonics Review,10(1),146-152,2016年1月)。

本发明的第二方面涉及设备，特别是显微镜，其特别地根据根据第一方面的方法用于确定样品中的一个或更多个空间方向上彼此间隔开的分子的位置。该设备具有用于产生激发光束和去激活光束(特别是STED光束)的至少一个光源和至少一个光束整形装置，该光束整形装置用于由激发光束形成激发光分布和由去激活光束形成去激活光分布，其中，激发光分布和去激活光分布分别具有局部强度最小值和与其相邻的强度上升区域。此外，该设备还具有：光学装置，其用于用激发光分布和去激活光分布照射样品；至少一个探测器，其用于针对激发光分布的不同定位，检测由分子发射的光子；以及计算单元，其用于基于针对激发光分布的不同定位检测到的光子推导出分子的位置。

特别地，该设备具有至少一个光束偏转装置，该光束偏转装置被设计用于，将激发光分布的局部最小值依次布置在扫描区域内的多个扫描位置处，其中该设备还具有控制单元，该控制单元被设计用于，将在与扫描区域相关联的捕获区域(在该捕获区域中，能够从扫描位置和检测到的相关联的光子中明确地推导出分子的位置)中的去激活光的光强度最大设置到去激活光的饱和强度的三倍，特别地最大设置到去激活光的饱和强度的两倍，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度的50％，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度的45％，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度的40％，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度的35％，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度的30％，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度的25％，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度的20％，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度的15％，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度的10％，进一步特别地最大设置到去激活光的饱和强度的5％。为此特别地，控制单元控制产生去激活光的光源或用于设置去激活光的强度的单独的设备。

特别地，该设备被设计用于，在激发光分布的不同定位期间形成激发光分布和去激活光分布，使得有效探测PSF(特别是有效探测PSF的宽度)不受去激活光分布的影响。

根据一实施方式，至少一个光束偏转装置被设计用于，相对于去激活光分布重新定位激发光分布，特别地其中，至少一个光束偏转装置被设计用于，在去激活光分布的局部强度最小值周围区域内多次不同地定位激发光分布的局部最小值。特别地，至少一个光束偏转装置具有扫描设备，特别是检流计式扫描仪，该扫描设备被设计用于将激发光分布和去激活光分布共同地相对于样品重新定位，其中至少一个光束偏转装置还具有横向光束偏转装置，特别地该横向光束偏转装置包括至少一个电光或声光偏转单元，其被设计用于相对于去激活光分布重新定位激发光分布。

根据另一实施方式，至少一个光束偏转装置被设计用于重新定位激发光分布，而去激活光分布保持位置固定，使得在去激活光分布的局部强度最小值周围的区域内多次不同地定位激发光分布的局部最小值。

根据另一实施方式，至少一个光束偏转装置被设计用于共同地重新定位激发光分布和去激活光分布。

根据另一实施方式，至少一个光束偏转装置被设计用于，相比于与激发光分布的局部最小值相邻的激发光分布的两个局部最大值之间的相应区域，与去激活光分布的局部强度最小值相邻的去激活光分布的两个局部最大值之间的区域至少在一个空间方向上进一步被扩展，特别地进一步扩展至少10％，进一步特别地进一步扩展至少20％。

根据另一实施方式，该设备被设计用于执行多个扫描步骤，其中至少一个光束偏转装置被设计用于，在每个扫描步骤中都将激发光分布的局部最小值定位在相应的扫描区域的多个扫描位置处，其中每个扫描步骤的相应的扫描区域具有比之前的扫描步骤的扫描区域更小的面积或更小的体积，并且其中，至少一个光束整形装置或者控制单元被设计用于，在至少部分的扫描步骤中，根据相应的扫描区域的面积或体积，调整去激活光分布，其中至少一个光束整形装置被设计用于，根据相应的扫描区域的面积或体积，调整去激活光分布的总强度和/或形状。

根据另一实施方式，至少一个光束整形装置或者控制单元被设计用于，在激发光分布的重新定位期间保持去激活光分布不变。

根据另一实施方式，该设备被设计用于，在推导出分子的位置之后，确定样品中至少一个另外的分子的位置，其中激发光源和至少一个光束整形装置被设计用于，用激发光分布照射另外的分子，并且其中探测器被设计用于，针对激发光分布的不同定位检测由另外的分子发射的光子，并且其中计算单元被设计用于，基于针对激发光分布的不同定位检测到的光子推导出另外的分子的位置，其中至少一个光束偏转装置被设计用于，在确定另外的分子的位置之前，将激发光分布的局部最小值和去激活光分布的局部最小值定位在另外的分子的预期位置处。

根据另一实施方式，该设备具有用于产生激发光分布的第一光束整形装置(特别是第一光调制器或第一相位板)和用于独立于激发光分布的产生而产生去激活光分布的第二光束整形装置(特别是第二光调制器或第二相位板)。对此可替代地，例如也可以通过单个光调制器的两个空间上彼此分离的区域产生光分布。

根据另一实施方式，光束整形装置具有用于产生相位模式的有源表面，其中特别地，光束整形装置被设计成光调制器或相位板。

根据另一实施方式，至少一个光束整形装置被设计用于，将去激活光分布构造成2D圆环。

根据另一实施方式，至少一个光束整形装置被设计用于，在其有源表面上产生第一相位模式、第二相位模式和/或第三相位模式。

根据另一实施方式，第一相位模式具有在周向方向上相对于光轴(特别是连续地)从0增加到2n·π的相位，特别地其中n是大于1的自然数。在此特别地，该设备在光束整形装置与物镜之间的光束路径中具有圆偏振元件，特别是λ/4板。

根据另一实施方式，该设备具有控制单元，其中控制单元被设计用于，控制光束整形装置，使得第一相位模式被修改，特别是根据(特别是在扫描步骤中的)相应的扫描区域的面积或体积调整去激活光分布的形状。

根据另一实施方式，至少一个光束整形装置被设计用于，将去激活光分布构造成3D圆环。

根据另一实施方式，至少一个光束整形装置被设计用于，在其有源表面上产生第一相位模式，该第一相位模式具有恒定相位的同心环，同心环彼此的相位差为π。

根据另一实施方式，设备具有将去激活光束(并且特别地也将激发光束)聚焦到样品中的物镜，其中，设备还具有在去激活光源和光束整形装置之间的光束路径中的可调节的孔径光阑或用于缩小去激活光束的光束横截面的变焦光学器件，其中，该设备具有控制单元，该控制单元被设计用于控制孔径光阑或变焦光学器件，使得去激活光束的光束横截面被调整成物镜的光瞳被照射不足，从而导致去激活光分布在光轴的方向上(即，在轴向方向上)被拉伸。

根据另一实施方式，该设备具有光学单元，该光学单元被设计用于，将去激活光束至少近似地构造成贝塞尔光束。特别地，光学单元具有用于使去激活光束形成为或者光束整形为贝塞尔型光束的棱透镜或SLM。

根据另一实施方式，控制单元被设计用于，调整光束整形装置(特别是光调制器)的有源表面，使得通过调整有源表面来调整(特别是缩小)去激活光束的光束横截面。

根据另一实施方式，控制单元被设计用于，调整光束整形装置的有源表面的外部区域中的闪耀光栅的取向，以便调整(特别是缩小)去激活光束的光束横截面。

本发明的第三方面涉及用于在样品中定位荧光染料的单个分子的方法，该方法包括以下步骤：

通过用激活光照射，使一个或更多个荧光染料分子从受保护的非荧光形式光活化(Fotoa ktivieren)成激活的荧光形式，

确定一个或更多个激活的染料分子的初始位置估计值，

在样品中形成激发光的强度分布和荧光阻抑光的强度分布，其中激发光的强度分布和荧光阻抑光的强度分布分别具有局部强度最小值，

用激发光分布在一系列扫描位置处扫描样品或样品的一部分，

在该系列的每个扫描位置处探测荧光的光子数或强度，并且将光子数或强度与相应的扫描位置相关联，

从荧光的相互关联的光子数或强度以及扫描位置，确定一个或更多个激活的染料分子的新的位置估计值，

其中特别地，激发光分布的局部强度最小值被依次布置在扫描位置处，其中在与扫描区域相关联的捕获区域(在该捕获区域中，能够从扫描位置和检测到的相关联的光子中明确地推导出分子的位置)中的荧光阻抑光的光强度对应于最大相当于荧光阻抑光的饱和强度的三倍，特别地最大相当于荧光阻抑光的饱和强度的两倍，进一步特别地最大相当于荧光阻抑光的饱和强度，进一步特别地最大相当于荧光阻抑光的饱和强度的50％，进一步特别地最大相当于荧光阻抑光的饱和强度的20％，进一步特别地最大相当于荧光阻抑光的饱和强度的10％。

根据一实施方式，荧光阻抑光的强度分布的位置在用激发光的强度分布对扫描位置进行扫描期间是位置固定的，每一个扫描位置与激活的荧光染料分子相关联。

在扫描时，特别地，荧光阻抑光的强度分布保持位置固定，而激发光的强度分布顺序地定位在多个扫描位置处。根据荧光强度和扫描位置，相对于先前的位置估计值计算出荧光分子的新的位置估计值。当定位静止的荧光染料分子时，新的位置估计值是改进的位置估计值，即以较低的不确定性估计的相关荧光染料分子的那些实际位置。如果观察到移动的荧光染料分子，则其可能是分别估计相关的荧光染料分子的新的、改变的位置的值。

荧光阻抑光具有带有局部强度最小值的强度分布，并且阻止或抑制在该局部强度最小值之外的区域中的荧光的发射。这里的重点不是像STED显微镜那样在提高分辨率的意义上减小有效PSF的体积，而是抑制来自焦点边缘区域或样品的其他平面的染料分子的不期望的荧光。由此，荧光的探测可以被限制在位于局部强度最小值附近的荧光染料分子上，并且可以抑制来自其它荧光染料分子(特别是来自样品的焦点边缘区域或其它平面)的不期望的贡献。因此，与在STED显微镜中不同，甚至可以明确地期望，将强度最小值设计得尽可能宽，并且将强度最小值附近的强度上升设计得尽可能平坦，以便在强度最小值移位时，仅略微影响位于强度最小值附近的荧光染料分子的荧光发射。例如，可以通过用高阶涡旋相位板对荧光阻抑光束进行相位调制来产生这种具有宽零点的强度分布，其相位延迟不随旋转角(Umlaufwinkel)从0变化到2π(如在STED显微镜中常见的那样)，而是从0到变化到4π或2π的更高倍。对此可替代地，也可以通过具有可切换像素的光调制器产生相应的相位模式，以便对荧光阻抑光施加相应的相位分布。然而，尽管上述规定，在该方法的各个实施方式中，在STED显微镜的意义上通过荧光阻抑光提高分辨率也可以是有利的和期望的。

该方法的实施方式包括点状聚焦的激发光与荧光阻抑光的环形强度分布的组合，以及激发光和荧光阻抑光的两个环形强度分布的组合。

根据一实施方式，该方法包括选择荧光染料，该荧光染料能够通过用激活光照射从受保护的非荧光形式转变成激活的荧光形式，并且通过用激活光照射将一个或更多个荧光染料分子从受保护的非荧光形式光活化成激活的形式。

根据一实施方式，该方法包括第一组方法步骤，第一组方法步骤包括以下步骤：

通过用激活光照射，将一个或更多个荧光染料分子从受保护的非荧光形式光活化成激活的荧光形式，

确定一个或更多个激活的染料分子的初始位置估计值，以及

在样品中形成激发光的强度分布和荧光阻抑光的强度分布，其中激发光的强度分布和荧光阻抑光的强度分布分别具有局部强度最小值，

和/或该方法包括第二组方法步骤，第二组方法步骤包括以下步骤：

用激发光分布在一系列扫描位置处扫描样品或样品的一部分，其中，该系列包含分别具有至少两个扫描位置的子集，该至少两个扫描位置以小于d/2的距离布置在与子集相关联的激活的染料分子的位置估计值周围，

在该系列的每个扫描位置处，探测荧光的光子数或强度，并且将光子数或强度与相应的扫描位置相关联，以及

从荧光的相互关联的光子数或强度以及扫描位置，确定与子集相关联的每个激活的染料分子的新的位置估计值。

根据另一实施方式，通过用激活光照射，将一个或更多个荧光染料分子(其在空间上彼此相距最小距离d)从受保护的非荧光形式光活化成激活的形式。

根据另一实施方式，以不大于d/2的不确定性确定一个或更多个激活的染料分子的初始位置估计值，其中d是分子之间的最小距离。

根据另一实施方式，该一系列扫描位置包含分别具有至少两个扫描位置的子集，其中至少两个扫描位置以小于d/2的距离布置在与子集相关联的激活的染料分子的位置估计值周围，其中，d是分子之间的最小距离。

根据另一实施方式，从荧光的相互关联的光子数或强度以及扫描位置确定与子集相关联的每个激活的染料分子的新的位置估计值。

根据另一实施方式，确定d的值，使得初始位置估计值可以明确地与激活的荧光染料分子相关联，并且在每个扫描位置处所探测到的荧光仅分别来自单个激活的荧光染料分子。

根据另一实施方式，分子之间的最小距离d为250nm或更大。

根据另一实施方式，该一系列扫描位置的扫描位置被布置在圆形路径、螺旋路径或球壳上。

根据另一实施方式，重复执行第二组方法步骤。

根据另一实施方式，激发光和/或荧光阻抑光的具有局部强度最小值的强度分布的总强度在重复之间会升高，并且该子集的扫描位置在相关联的激活的荧光分子的各自当前位置估计值的方向上移动。

根据另一实施方式，最后确定的位置估计值在至少一个空间方向上的不确定性最高为d/10且优选最高为d/30，其中d是分子之间的最小距离。

根据另一实施方式，跟踪样品中或者样品的单个荧光染料分子的运动。

根据另一实施方式，激发光和/或荧光阻抑光的具有局部强度最小值的强度分布的总强度在两次重复之间减小，并且该子集的扫描位置在通过时间外推测定的相关联的激活的荧光分子的位置估计值的方向上移动。

根据另一实施方式，总体上重复实施第一组方法步骤和第二组方法步骤，其中在重复之间分别激活的染料分子转变成非荧光状态。

根据另一实施方式，根据各个荧光染料分子的定位重建样品中结构的空间上高分辨率的图像。

根据另一实施方式，用激活光在样品中形成多个照射点。

根据另一实施方式，照射点布置在规则的光栅上。

根据一实施方式，多次确定单个激活的染料分子的位置估计值，例如以固定的间隔确定。如果该方法是为了跟踪样品中染料分子的运动而被执行，则根据前述确定步骤的位置估计值来确定用于确定步骤的扫描位置，如在定位未运动的染料分子的情况下一样。有利地，在跟踪分子时，使扫描位置的距离与染料分子运动的速度和类型进行适配，特别是当这些信息从前面的确定步骤中已知时。如果运动是快速和随机的，则选择大的扫描位置距离，以便分子分别可靠地位于由扫描位置确定的区域内，在该区域内可以估计分子的位置。相反，例如如果运动是缓慢和定向的，则选择较小的扫描点距离，但也要选择成使得分子分别可靠地位于通过扫描位置确定的区域内，在该区域中可以估计分子的位置。在这两种情况下，扫描位置集的中心被移动到在下一系列扫描步骤期间预期的分子所处的位置。在随机移动的情况下，是与最后确定的位置估计值相对应的位置。根据连续确定的位置估计值，可以重建、可视化和必要时进一步分析染料分子的轨迹。当使用染料作为生物分子(例如，蛋白质或脂质)的标记物时，这种轨迹适于研究标记的生物分子参与的动态细胞过程。除了高空间分辨率之外，根据本发明的方法还允许比现有技术中已知的方法更快地确定各个分子的位置，从而将单分子跟踪的适用性扩展到快速的动态过程。

根据另一实施方式，激发光和荧光阻抑光的两个分别具有强度最小值的强度分布被叠加，其中，至少用激发光扫描样品或样品的一部分。如果在分别扫描激活的染料分子时，荧光阻抑光保持在位置固定的位置处，则荧光阻抑光主要仅用于抑制来自强度最小值之外的区域的荧光贡献；为此目的，具有尽可能宽的强度最小值的强度分布是特别有利的。根据在扫描位置处探测到的荧光信号，可以改进先前测定的激活染料分子的位置估计值，即可以越来越准确地定位激活的染料分子。在此优选地，扫描自适应地进行，即在考虑在先前的扫描位置处探测到的荧光信号的情况下确定扫描点，其中同时提高激发光的总强度。通过这种方式，可以在几纳米的不确定性下进行染料分子的定位。根据所描述的实施方式，可选地，也可以共同地进行激发光和荧光阻抑光的扫描；在这种情况下，在激发光和荧光阻抑光的扫描位置处调制荧光发射。

本发明的第四方面涉及设备，特别是显微镜，用于特别地根据根据本发明的第三方面的方法产生样品中结构的空间上高分辨率的图像。在此，设备可以类似于根据本发明第二方面的设备来设计。

本发明的有利的扩展方案从专利权利要求书、说明书以及附图中可以获悉。在此，权利要求不应被理解为仅那些除了独立权利要求1和13的特征外仅具有从属权利要求的全部特征或不具有从属权利要求的特征的对象、设备或方法才可能是本发明的扩展方案。更确切地说，可以从说明书中提到的以及可以从附图中提取的特征中得出另外的扩展方案，这些特征可以单独地或累积地产生影响。因此，特别地，第一方面和第二方面的实施方式也可以与本发明的第三方面和第四方面的实施方式自由组合。

附图简述

下面将基于附图中所示的优选的实施例来对本发明进行进一步阐述和描述。

图1示意性地示出了根据本发明的方法的流程；

图2示意性地示出了MINFLUX定位方法的多个步骤；

图3示出了根据本发明的第一实施方式的用于确定分子的位置的设备；

图4示出了根据本发明的第二实施方式的用于确定分子的位置的设备；

图5示出了根据本发明的实施方式的作为根据本发明的设备的一部分的光束整形装置；

图6A-图6D示出了用于产生去激活光分布的不同相位模式和通过模拟产生的相应的等高线图；

图7A-图7D示出了用于产生去激活光分布的另外的相位模式和相应模拟的等高线图；

图8A-图8D示出了沿焦平面方向的激发光分布和不同的去激活光分布的图；

图9A-图9D示出了用于产生去激活光分布的另一相位模式以及通过该相位模式产生的去激活光分布和激发光分布的不同的图；

图10A-图10E示出了用于产生去激活光分布的另一相位模式以及通过该相位模式产生的去激活光分布与局域空心光束分布相比的不同的图。

附图描述

图1以框图图示了根据本发明的方法的流程。该方法特别是利用附加的去激活光(例如，STED光)的MINFLUX定位。

在步骤101中，产生激发光分布100和去激活光分布300，特别地，去激活光分布300是STED光分布。两个光分布具有局部强度最小值110、310和与之相邻的强度上升区域120、320(也参见图8)。光分布在相应的局部强度最小值110、310周围分别具有相对低的光强度的区域。在此特别地，去激活光分布300的该区域比激发光分布100的相应区域宽。特别地，去激活光分布300在激发光分布100的区域周围形成外罩。

根据步骤102，用激发光分布100和去激活光分布300照射样品20，使得样品20中待定位的分子M被激发光激发，并发射由此而产生的光子，而去激活光会抑制样品20中的其他分子M的背景光子的发射。

在步骤103中，利用探测器(例如，与焦点共焦布置的点探测器)，针对激发光分布100的不同位置检测由分子发射的光子。

最后，在步骤104中，例如借助于最大似然估计器，基于针对激发光分布100的不同位置检测到的光子来确定分子M的位置。在此特别地，执行该方法，即在激发光分布100的不同位置期间激发光分布100和去激活光分布300被设计成，使得有效探测PSF，特别是有效的发射点扩展函数的宽度，不受去激活光分布300的影响，即仅受激发光分布的影响。这样改善了定位，同时抑制了背景发射。当然，图1以框图的形式表示，并不意味着该方法的各个步骤一定是一个接一个地进行的。

图2示出了根据本发明的方法的实施方式，其中该方法是MINFLUX定位，特别地该MINFLUX定位在多次迭代中执行，其中激发光分布100的最小值110在每次迭代中被布置在先前所测定估计的分子M位置周围的扫描区域200中多个扫描位置201处。在此，扫描区域200被限定为围绕待定位的分子的估计位置半径为L的圆。在初始步骤中被选择为扫描区域200的中点的位置估计可以借助于独立方法(例如，PALM/STORM显微镜、具有高斯激发光分布的共焦扫描或针孔轨道扫描)来测定。然后特别地，分别将在先前的MINFLUX迭代中确定的位置估计用作圆心。

在此，迭代的扫描位置201形成所谓的目标坐标集。特别地，各个扫描位置201可以位于围绕分子M的估计位置半径为L的圆上，其中特别地，扫描位置201围绕中点对称地布置。此外特别地，分子M的估计位置同样被用作扫描位置201。类似于二维示出的示例，在扫描位置201位于半径为L的球体上或球体内的情况下，样本20可以被三维扫描，以对分子M进行三维定位(3D-MINFLUX)。为了使激发光分布100(特别地还有去激活光分布300)在z方向上(沿光轴)移动，例如可以使用可变形的反射镜。特别地，捕获区域210位于扫描区域200内，其中分子M可以借助根据本发明的方法被明确地定位，只要分子M在捕获区域210内。

如图2中所示，半径L可以在每个步骤中变小，使得位置估计的精度也在每个步骤中增加，至少在分子M位于相应缩小的扫描区域200中时是如此。通常执行该方法，直到分子M失去其发射能力(例如，在荧光团的情况下由于漂白或转变为暗态)，或者如果可能的话，直到位置估计的精度接近由信噪比给定的极限值。然后，特别是用多个另外的分子M重复整个过程。然后，可以从多个定位中计算出具有多个定位的分子M的样品的高分辨率图像。通过所述扫描区域200的缩小，也分别得到比在先前的迭代步骤中更小的捕获区域210。

此外，在图2中，去激活光分布300示意性地示为围绕扫描区域200同心布置的圆。在由该圆标记的位置处，去激活光的强度可以对应于例如饱和强度或较低的值。

如在图2中所示，去激活光分布300可以至少在一次MINFLUX迭代期间保持静止，特别是也可以在多次MINFLUX迭代期间保持静止，而激发光分布100在较低的去激活光强度的区域内在去激活光分布300的局部最小值310周围运动，以便对准扫描位置201。这样的好处在于，只需为激发光束设置快速光束偏转装置(如EOD)，这降低了设备的复杂性并且使结构更加紧凑。然后特别地，在分子M的每次新的定位开始时，去激活光分布300被布置在探测孔眼光阑在相应的样品区域的焦平面的投影中心，特别是用(与EOD相比更慢但还是存在的)检流计式扫描仪来进行。特别地，可以在迭代步骤之间对去激活光分布300进行调整，使得例如去激活光的饱和强度或较低的光强度占主导地位的区域在扫描区域200在每个迭代步骤中缩小期间变小(参见图2)。这特别地可以通过控制去激活光的总强度或者也可以通过不同的光束整形(例如，在SLM上的不同的相位模式)来实现。

对此可替代地，激发光分布100也可以与去激活光分布300一起运动，从而在每次迭代中，两个光分布的局部最小值共同地依次布置在扫描位置201处。由于所需的扫描速度，这特别地通过使用电光或声光偏转器的共同的光束偏转来实现。

在图3和图4中示出了根据本发明的用于确定分子M位置的设备1的实施方式，该设备的形式是具有附加的去激活(特别是STED)光源的MINFLUX显微镜。首先，根据图3阐述了该设备的基本原理。随后，将讨论根据图4的实施方式与根据图3的实施方式之间的差异。

图3示出了设备1，该设备具有用于产生相干激发光束A的第一光源11(特别是激光源)和用于产生相干去激活光束D的第二光源12(特别是激光源)。在此，第一光源11的光具有用于激发样品中的分子M的合适的波长，并且第二光源12产生适于使分子M去激活的波长的光，使得分子在激发光的辐射下不再能够发射光子(例如，由于受激发射而耗尽，即STED)。特别地，激发光和去激活光的波长彼此不同。对于两个分开的光源11、12可替代地，设备1也可以仅具有一个光源，特别是激光源，该光源既产生激发光又产生去激活光。为此，光源例如可以产生连续波长，然后，例如借助于光学滤波器从中获得合适波长的激发光和去激活光。

在图3所示的示例中，激发光束A和去激活光束D在第一(特别是二向色)分束器13a处耦合到共同的光束路径中。随后，光束共同穿过横向的光束偏转装置15，光束偏转装置由两个串联地布置在光束路径中的光束偏转单元15a、15b组成。例如，光束偏转单元15a、15b可以是电光偏转器，其中第一光束偏转单元15a被设计用于在垂直于光轴OA的第一方向x上偏转穿过第一光束偏转单元的光束，并且其中第二光束偏转单元15b被设计用于在垂直于光轴OA且垂直于第一方向的第二方向y上偏转穿过第二光束偏转单元的光束。以事先已知的方式，横向的光束偏转装置15特别地具有另外的光学部件，特别是用于聚焦光束的透镜，这些光学部件在此为了清楚起见未示出。

然后，在第二(特别是二向色)分束器13b处，激发光束A和去激活光束D被划分成两个平行的光束路径。激发光束A射到第一光束整形装置16a上，特别是第一光调制器上，进一步特别地，射到具有可切换像素的相位调制空间光调制器SLM上。通过激发光束A在光调制器的有源表面的闪耀光栅上的衍射，对激发光束A施加借助于可切换像素设定的相位模式，由此通过干涉在样品20的焦平面中产生具有局部最小值110的激发光分布100。经相位调制的激发光束A经由第一反射镜14a和第二反射镜14b再次耦合到主光束路径中。

以类似的方式，去激活光束D经由第三反射镜14c转向到第二光束整形装置16b上，特别是第二光调制器上，该第二光束整形装置将预设的相位模式施加到去激活光束D，特别地，该相位模式可以不同于第一光束整形装置16a的相位模式。然后，经相位调制的去激活光束D经由第四反射镜14d偏转，然后经由第三(特别是二向色)分束器13c与经相位调制的激发光束A汇合。当然，如下配置也是可能的，在该配置中，去激活光束D经由反射镜耦合到主光束路径中，并且激发光束A经由分束器与去激活光束D汇合。

对于第一光调制器16a和第二光调制器16b可替代地，例如也可以使用具有固定预设的相位模式的相位板，然后这些相位板通常被相应的光束穿过(而不是在光调制器的有源表面的光栅处衍射)，以便将相应的相位模式施加到这些光束上。此外，可以在光束整形装置16a、16b的前面布置光学元件，这些光学元件会影响相应的光束的偏振方向，例如λ/2板(未示出)。此外，特别是在施加涡旋相位模式以产生2D圆环时，可以在光束整形装置16a、16b后面的光束路径中设置圆形偏振元件(例如为λ/4板)，以便实现在焦点的期望的光分布(未示出)。

特别地，光束整形装置16a、16b分别布置在垂直于光轴OA的平面中，该光轴与物镜19的光瞳共轭。特别地，在光调制器的情况下，也可以通过相应地调整相位模式来校正与该位置的轻微偏差。

借助于光束整形装置16a、16b，对激发光束A和去激活光束D施加特别是不同的相位模式，特别地使得在去激活光分布300的焦平面中，与激发分布100相比，在局部最小值310周围产生较宽的低强度区域(例如，低于饱和强度)。例如对于2D-MINFLUX定位，激发光分布100可以形成为由介于0与2π之间的涡旋相位分布产生的2D圆环，而去激活光分布形成为由介于0与4π、6π、8π或10π之间的涡旋相位分布产生的较宽的2D圆环物。同样，例如对于3D-MINFLUX定位，可以使用分别为3D圆环形式的激发光分布100和去激活光分布300，其中去激活光的3D圆环还被附加地轴向拉伸。

此外，在激发光束A和去激活光束D的共同的光束路径中，还存在轴向光束偏转装置17，该光束偏转装置17例如包括可变形的反射镜。借助于轴向光束偏转装置17，激发光束A和去激活光束D可以共同在z方向(即，平行于光轴OA)移动，例如以便在3D定位分子M的情况下在z方向上对准样品中的扫描位置201。

最后，在射光路径中布置有扫描设备18，例如检流计式扫描仪，以便在样品20上共同扫描激发光束A和去激活光束D。激发光束A和去激活光束D由具有光瞳19a的物镜19聚焦到样品20中，样品包含彼此间隔开的待定位的分子M。在此特别地，至少物镜19和扫描设备18形成用激发光分布100和去激活光分布300照射样品20的光学装置2。激发光束A和去激活光束D沿着光轴进入物镜19。

由于激发光的激发，分子发射光子(例如，荧光)。由样品20发射的光E经由扫描设备18被去除扫描，并且经由第四(特别是二色性)分束器13d耦合到探测光束路径中。在该探测光束路径中，特别地存在孔眼光阑21，该孔眼光阑与样品20中的激发光束和去激活光束的焦点共焦布置。在孔眼光阑21后面是探测器22，在此处示出的示例中是点探测器，例如雪崩光电二极管或光电倍增管，该探测器检测由分子M发射的光子，并且特别地对光子进行计数。

此外，设备1还包括计算单元23，该计算单元与探测器22电连接或数据连接，并且被设计成根据由探测器22检测到的光子和激发光分布100的局部最小值110的相关联的位置来确定分子M的位置，例如借助于最大似然估计器来确定，该最大似然估计器在软件或硬件方面在计算单元23上实现。为了获得激发光分布100的与检测到的光子计数或光子计数率相关的位置，计算单元23特别地从控制单元24接收信号或者例如直接从横向光束偏转装置15、轴向光束偏转装置17和/或扫描设备18接收信号。

此外，控制单元24还被设计用于控制横向光束偏转装置15、轴向光束偏转装置17、扫描设备18以及光束整形装置16a和16b。

利用在图3中示出的设备1，特别地实施根据本发明的方法，使得激发光束A和去激活光束D在多次MINFLUX迭代中共同地借助于横向光束偏转装置15(并且可选地也借助于轴向光束偏转装置17)相对于样品20运动。在此，用激发光分布100的局部最小值110对扫描位置201(参见图2)进行扫描，并且借助探测器22针对每个扫描位置201检测由分子M发射的光子。随后，对于每次MINFLUX迭代，借助于计算单元23从检测到的光子和激发光分布100的相关位置确定估计的分子M位置。

图4示出了根据本发明的设备1，该设备与图3所示的设备1的不同之处在于，横向光束偏转装置15和轴向光束偏转装置17布置在部分光束路径中，激发光束A经由该部分光束路径被转向到样品20上。而去激活光束D在没有相应的光束偏转装置的平行的部分光束路径上被引导。光束A、D借助于第二(特别是二向色)分束器13b被划分到部分光束路径上，并且经由第三(特别是二向色)分束器13c被再次汇聚在一起。在相应的部分光束路径中也存在与图3有关描述的光束整形装置16a、16b。

在应用图4中所示的设备1的实施方式中，特别地在定位分子M之前，激发光束A和去激活光束D借助于扫描设备18共同指向样品20的一区域，在该区域中根据预定位来推测待定位的分子M。然后，借助于横向光束偏转装置15并且可选地还借助于轴向光束偏转装置17使激发光束A在样品上运动，以便用激发光分布100的局部最小值110对准扫描位置201。特别地，在此期间，去激活光分布300保持静止。

图5示出了用于对去激活光束D进行相位调制的第二光束整形装置16b的示意性截面图。第二光束整形装置具有带有闪耀光栅的有源表面160，闪耀光栅使入射的去激活光束D以期望的顺序衍射并从而耦合到另外的光束路径中，使得去激活光束被物镜19聚焦到样品20中。此外，在有源表面上可以将相位模式与闪耀光栅叠加，从而对去激活光束D施加相应的相位分布，该相位分布在焦点处通过干涉形成去激活光分布300。特别地，有源表面160是与物镜19的光瞳19a共轭的平面(参见图3-图4)。特别地，相位模式可以以可控像素的形式产生，其中可以为每个像素预设相位值。相位模式和特别地还有闪耀光栅的取向可借助于控制单元24控制。

在图5中，还示意性地示出了有源表面160的外部区域161和有源表面160的被外部区域161包围的内部区域162。

借助于控制单元24可以在外部区域161中改变闪耀光栅的取向，使得去激活光束D不耦合到光束路径中，而是例如耦合到光束阱(未示出)中。通过这种方式，可以缩小去激活光束D的光束横截面，使得物镜19的光瞳19a被照射不足，从而使去激活光分布300在光轴OA的方向上(即，轴向地)被拉伸。

在另一实施方式中，内部区域162可以代表用于产生去激活光分布300的第一相位模式，而外部区域161可以代表第二相位模式，该第二相位模式有效地导致去激活光束D的光束横截面缩小并从而导致去激活光分布300的轴向拉伸。

在图6至图7和图9至图10中，示出了相位模式(图6A-6D的上部)，这些相位模式例如可以在光束整形装置16a、16b的有源表面160上产生，以便调制激发光束A或去激活光束D(特别是去激活光束D)的相位分布，从而在样品20中相应光束的焦点处通过干涉产生具有局部最小值的相应的光强度分布。在相位模式下方，示出了相应模拟的光分布的等高线图，更确切地说是分别作为穿过焦平面(x-y平面，垂直于光轴，其中z坐标为零，图6A-6D的中部)的截面和作为在y-z平面中的截面，其中x坐标为零(图6A-6D的下部)。图6A-6D中的中部和下部的位置坐标分别以微米为单位给出。特别地，相位模式在与物镜19的光瞳19a的平面共轭的平面中产生。

图6A(上部)示出了由第一环602构成的第一相位模式610，该第一环围绕圆盘601同心布置，其中第一环602和圆盘601彼此的相位差为π。利用这种相位模式，可以在经相位调制的光束的焦点处产生具有中央局部最小值310的3D圆环(也称为局域空心光束)。

在图6B至图6D(上部)中，同样分别示出了第一相位模式610，该第一相位模式具有围绕圆盘601同心布置的第一环602，其中圆盘601和第一环602的相突变为π。然而，第一环602和圆盘601的半径都比根据图6A的第一相位模式610(上部)中的小。此外，在图6B至图6D中，还示出了另外的第二相位模式611，该第二相位模式具有第二环603，该第二环围绕第一相位模式610的第一环602同心地布置。该第二环603具有多个分段604，这些分段的相位值交替地对应于第一环602的相位值和圆盘601的相位值。相应地，第二环603上相邻的分段604相对于彼此的相移为π。在此示出的示例中，所有分段604具有相同的尺寸，因此围绕第一环602对称地布置。

从图6A(下部)和图6B(下部)的等高线图之间的比较可以看出，具有分段的第二环603的附加的第二相位模式611导致3D圆环在轴向方向(z方向)上的拉伸。相比之下，焦平面中的光强度分布只有轻微变化(图6A和6B的中部)。3D圆环形的去激活光分布300在z方向上的拉伸对于根据本发明的方法是有利的，因为由此可以有效地抑制来自在z方向上位于焦点上方和下方的区域的背景发射。

此外，从图6C和图6D中可以看出，通过在径向方向上向内加宽第二环603，同时减小圆盘601，在z方向上可以实现比图6A所示的情况更进一步的拉伸。在图6D所示的配置中，可以额外看到焦平面内中心局部最小值310的加宽(图6D，中部)，这同样可以对背景荧光的抑制产生有利的影响。

在图7A和图7B中，示出了用于对去激活光束进行相位调制的另外的相位模式。图7C-图7D示出了在焦点处获得的XZ平面内光强分布的对应等高线图，其中图7C与图7A所示的相位模式相关联，并且图7D与图7B所示的相位模式相关联。与图6A一样，图7A示出了由圆盘601和第一环602构成的第一相位模式，第一环602围绕圆盘601同心地布置，相位差为π。相应地，图7C示出了3D圆环的等高线图。

根据图7B，除了圆盘601和第一环602之外，还设置有第二环603和第三环605，其中相邻的环彼此的相位差分别为π。由此，有利地在焦点处得到在z方向上延伸的强度分布(图7D)。标度以μm为单位给出。

图8A-8D示出了沿焦平面内一方向(例如，沿x坐标)的波长为642nm的模拟2D圆环形的激发光分布100分别与波长为775nm的不同形状和宽度的模拟2D圆环形的去激活光分布300叠加的图。x轴的标度以微米为单位。激发光分布100具有中央局部最小值110，并且去激活光分布300分别具有至少一个局部最小值310。与局部最小值110、310相邻，分布100、300具有强度上升区域120、320并且分别具有至少两个局部最大值130、330。激发光分布100通过在与物镜光瞳共轭的平面中用涡旋形相位模式对激发光束A进行相位调制来产生，该涡旋形相位模式在相对于光轴的顺时针周向方向上具有从0到2π逐渐增加的相位值。附加地，激发光束A被左圆偏振，从而在焦平面中通过干涉得到激发光分布100。

图8A中示出的去激活光分布300通过用涡旋形相位模式(也就是左圆偏振)对去激活光束100进行相位调制而产生。在这里，分布100、300的局部最小值110、310位于同一位置。根据图8A的去激活光分布300由于较大的波长而比激发光分布100稍宽。

与此相反，在图8B至图8D中示出的去激活光分布300以涡旋形的相位模式产生，这些涡旋形的相位模式在周向方向上具有介于0和4π(图8B)、0和6π(图8C)或者0和10π(图8D)之间的逐渐上升的第一相位模式。因此，去激活光分布300的宽度随着最大相位值的增大而增大，即与局部最小值110、310相邻的局部最大值130、330之间的距离越大，局部最大值130、330之间的相对低的光强度区域越宽。最大10π的该区域特别宽。有利地，这些分布的去激活光虽然降低了背景荧光，但并不明显影响发射光的探测PSF。

图8B中示出的去激活光分布300在激发光分布100的最小值的位置处具有另外的局部最大值330。在这种特殊的相位模式(0到4π的涡旋模式)中，这种效应是由光的偏振方向而产生的。

在图9A中，示出了用于产生图9B和9D所示的去激活光分布300的第一相位模式610，该去激活光分布与用于产生次最大值的第三相位模式612叠加。第一相位模式610是在周向方向上相位从0增加到10π的涡旋形的。该模式与呈划分成分段604的圆盘601形式的第三相位模式612叠加，其中分段604相对于第一环602在径向方向上相邻的区域的相位差为

利用所示出的相位模式可以产生2D圆环形的去激活光分布300，该去激活光分布在中央局部最小值310(参见图8D)周围具有宽的低强度区域和附加的光强度次最大值。有利地，这些次最大值抑制远离焦点的区域中的背景发射。

图9B示出了沿x坐标的去激活光分布300的图。在图9D中，示出了在xy平面中的去激活光分布300的2D图，并且图9C示出了图8A所示的去激活光分布300的2D圆环的xy图，以供比较。

在图10A中，示出了用于对去激活光进行相位调制的另外的第一相位模式610，该另一第一相位模式与用于在z方向上拉伸去激活光分布300的第二相位模式611以及与用于产生次最大值的第三相位模式612叠加。第一相位模式610具有第一环602和围绕第一环602同心布置的第二环603，其中，第一环602和第二环603彼此的相位差为π，因此在焦点处形成3D圆环。第二相位模式611由围绕第二环603同心布置的第三环605形成，该第三环被划分成交替的分段604，其中，这些分段604相对于第二环603的相位差交替地为0或π。第三相位模式612形成同心地布置在第一环602内的圆盘601，圆盘又被划分成分段604，这些分段604相对于第一环602的相位差交替地为0或π。

图10B和图10C示出了由图10A所示的相位模式产生的焦点中相应的去激活光分布300，其中图10B是x-y截面(焦平面)图，并且图10C是x-z截面图。在图10D和图10E中，作为比较示出了常规的3D圆环，即局域空心光束(参见图6A和图7A的相位模式)的截面图。所有标度都以μm为单位。

特别如图10B所示，第三相位模式612产生了次最大值，该次最大值对于通过去激活光抑制背景发射产生了有利的影响。另外，如从图10C所示，去激活光分布300被第二相位模式611在z方向上拉伸。

参考标记列表

1 用于确定分子的位置的设备

2 光学装置

11 激发光源

12 去激活光源

13a 第一分束器

13b 第二分束器

13c 第三分束器

13d 第四分束器

14a 第一反射镜

14b 第二反射镜

14c 第三反射镜

14d 第四反射镜

15 横向光束偏转装置

15a 第一光束偏转单元

15b 第二光束偏转单元

16a 第一光束整形装置

16b 第二光束整形装置

17 轴向光束偏转装置

18 扫描设备

19 物镜

19a 光瞳

20 样品

21 孔眼光阑

22 探测器

23 计算单元

24 控制单元

100 激发光分布

101 产生多个光分布

102 用激发光分布照射

103 检测发射的光子

104 推导分子的位置

110 激发光分布的局部最小值

120 激发光分布的强度上升区域

130 激发光分布的局部最大值

160 有源表面

161 外部区域

162 内部区域

200 扫描区域

201 扫描位置

210 捕获区域

300 去激活光分布

310 去激活光分布的局部最小值

320 去激活光分布的强度上升区域

330 去激活光分布的局部最大值

601 圆盘

602 第一环

603 第二环

604 分段

605 第三环

610 第一相位模式

611 第二相位模式

612 第三相位模式

A 激发光束

D 去激活光束

E 发射的光

L 半径

M 分子

OA 光轴。