肌红蛋白突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及肌红蛋白突变体及其应用。

背景技术

肌红蛋白是一种小分子蛋白质，其分子结果与血红蛋白相似，具有在肌细胞内转运和贮存氧的功能。人体心肌、骨骼肌内含有大量肌红蛋白，正常人的血液中很少，主要由肾脏代谢并排泄。当心肌或横纹肌有损伤时，肌红蛋白便释放入血中，血清中的肌红蛋白即可明显升高。

肌红蛋白广泛存在于生物体内，它是由一条肽链和血红素辅因子折叠而成的色素蛋白，其中，血红素(铁原卟啉)在肌红蛋白发挥功能时扮演重要角色。

肌红蛋白的三级结构呈紧密球形。多肽链中氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部,亲水侧链多位于分子表面,因此其水溶性较好。肌红蛋白有8段α-螺旋区每个α-螺旋区含7～24个氨基酸残基，分别称为A、B、C…G及H肽段。有1～8个螺旋间区，肽链拐角处为非螺旋区(亦称螺旋间区)，包括N端有2个氨基酸残基，C端有5个氨基酸残基的非螺旋区，处在拐点上的氨基酸残基Pro、Ile、Ser、Thr、Asn等极性氨基酸分布在分子表面。内部存在一口袋形空穴，血红素居于此空穴中。血红素是铁卟啉化合物，它由4个吡咯通过4个甲炔基相连成一个大环，Fe

铁与卟啉环及多肽链氨基酸残基的连接:铁卟啉上的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连。血红素的Fe

近年来，研究者利用多种方法对含有血红素蛋白的辅因子进行替换，生成人工金属卟啉蛋白，用于催化高价值反应。目前能够实现将肌红蛋白的铁原卟啉替换为其他金属原卟啉或具有类似大小的金属卟啉框架，但无法实现大卟啉框架的高效替换，限制了人工金属卟啉蛋白的发展与应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了肌红蛋白突变体及其应用，从而实现肌红蛋白的铁原卟啉与大框架卟啉的高效替换。

本发明提供肌红蛋白突变体，该突变体的突变位点包括：

第30位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；

第33位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；

第69位氨基酸残基由缬氨酸突变为丙氨酸；

第73位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；

第76位氨基酸残基由异亮氨酸突变为丙氨酸；

第77位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；

第104位氨基酸残基由酪氨酸突变为丝氨酸；

第105位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；

第108位氨基酸残基由异亮氨酸突变为丙氨酸；

第112位氨基酸残基由异亮氨酸突变为丙氨酸；

第136位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；

第139位氨基酸残基由苯丙氨酸突变为丙氨酸；

第143位氨基酸残基由异亮氨酸突变为丙氨酸。

本发明提供的肌红蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了编码所述肌红蛋白突变体的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。在本发明一些实施例中，所述核酸分子由定点突变技术引入突变，之后纯化回收得到相应片段，并用Gibson Assembly进行片段连接得到。

本发明还提供包含所述核酸分子的载体。在本发明一些实施例中，所述载体的骨架载体为大肠杆菌表达载体pET28a。

本发明还提供了包含所述核酸分子或所述载体的菌株。在本发明一些实施例中，所述菌株为DH5α。在本发明另一些实施例中，所述菌株为BL21(DE3)。

本发明提供编码肌红蛋白突变体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体及包含上述两者任意项的菌株在制备可结合金属卟啉蛋白中的应用。所述应用包括将所述编码肌红蛋白突变体的核酸分子插入载体，将所述载体转化至所述菌株，之后对所述菌株进行诱导表达。在一些实施例中，所述诱导表达所用培养基为含50μg/mL卡那抗生素的LB培养基，所用诱导剂为IPTG。

本发明提供肌红蛋白突变体及编码所述肌红蛋白突变体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子及所述载体的菌株在制备金属卟啉蛋白和/或酶中的应用。

本发明提供金属卟啉蛋白，所述蛋白包括肌红蛋白突变体和金属卟啉。在一些实施例中，所述金属卟啉包括四苯基卟啉氯化锰(Ⅲ)、5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)或5,10,15,20-四(2,4,6-三甲基苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)。

本发明实验证明，本发明提供的抹香鲸肌红蛋白突变体失去了对血红素的结合能力，能够有效结合大框架卟啉，应用前景良好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示肌红蛋白质突变体结合四苯基卟啉氯化锰(Ⅲ)的光谱表征，其中灰色表示肌红蛋白突变体的吸收光谱图，黑色表示肌红蛋白突变体结合四苯基卟啉氯化锰(Ⅲ)的吸收光谱图，约在470nm处出现最高吸收，表明肌红蛋白突变体成功结合；

图2示肌红蛋白质突变体结合5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的光谱表征，其中灰色表示肌红蛋白突变体的吸收光谱图，黑色表示肌红蛋白突变体结合5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的吸收光谱图，约在448nm处出现最高吸收，表明肌红蛋白突变体成功结合；

图3示肌红蛋白质突变体结合5,10,15,20-四(2,4,6-三甲基苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的光谱表征，其中灰色表示肌红蛋白突变体的吸收光谱图，黑色表示肌红蛋白突变体结合5,10,15,20-四(2,4,6-三甲基苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的吸收光谱图，约在470nm处出现最高吸收，表明肌红蛋白突变体成功结合。

具体实施方式

本发明公开了肌红蛋白突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的肌红蛋白突变体的氨基酸序列为：

MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDI

所述肌红蛋白突变体相应的野生型蛋白序列为：

MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDI

编码肌红蛋白突变体的核苷酸序列为：

ATGGTGCTGAGCGAAGGCGAATGGCAGCTGGTGCTGCATGTGTGGGCGAAAGTGGAAGCGGACGTGGCGGGCCATGGCCAAGATATT

编码所述肌红蛋白突变体相应的野生型蛋白的核苷酸序列为：ATGGTGCTGAGCGAAGGCGAATGGCAGCTGGTGCTGCATGTGTGGGCGAAAGTGGAAGCGGACGTGGCGGGCCATGGCCAAGATATT

本发明提供的肌红蛋白突变体及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：肌红蛋白突变体表达菌株构建及菌体制备

1)合成抹香鲸肌红蛋白基因，将该基因插入大肠杆菌表达载体pET28a中，得到重组载体，之后将重组载体转入DH5α感受态细胞，提取质粒进行后续的定点突变实验。利用蛋白可视化软件进行突变位点分析，选择13个突变位点，利用定点突变技术引入突变，纯化回收得到相应的片段后，利用Gibson Assembly进行片段的连接。

引入突变过程中所用引物及其核苷酸序列如下：

Mb-L30A/L33A-for：

5’-GCAATTCGCGCCTTTAAAAGCCATCCGGA-3’(Forward)，如SEQ ID No.5所示；

Mb-L30A/L33A-rev：

5’-TTCCGGATGGCTTTTAAAGGCGCGAATTGCAATATCTTGGCCATGGCCCGC-3’(Reverse)，如SEQ ID No.6所示；

Mb-V69A/L73A/I76A/L77A-for：

5’-GCACTGACCGCGGCAGGCGCGGCGGCAAAAAAGAAAGGCCATCATGA AGC-3’(Forward)，如SEQ ID No.7所示；

Mb-V69A/L73A/I76A/L77A-rev：

5’-TGCCGCCGCGCCTGCCGCGGTCAGTGCGGTAACGCCATGTTTTTTCAG-3’(Reverse)，如SEQID No.8所示；

Mb-Y104S/L105A/I108A/I112A-for：

5’-AGCGCAGAATTTGCAAGCGAAGCGGCGATTCATGTGCTGCATAG-3’

(Forward)，如SEQ ID No.9所示；

Mb-Y104S/L105A/I108A/I112A-rev：

5’-TTCGCTTGCAAATTCTGCGCTTTTAATCGGAATTTTATGTTTGGTCGCA-3’(Reverse)，如SEQ ID No.10所示；

Mb-L136A/F139A/I143A-for：

5’-AAAGCGGCAGAACTGGCACGCAAAGATGCTGCGGCGAAATATAAAGA ACTGGGC-3’(Forward)，如SEQ ID No.11所示；

Mb-L136A/F139A/I143A-rev：

5’-AGCATCTTTGCGTGCCAGTTCTGCCGCTTTGTTCATCGCGCCT-3’(Reverse)，如SEQ IDNo.12所示。

利用上述引物进行PCR扩增时，目的片段及所用引物组合如下：

片段1(长度为144bp)：Mb-L30A/L33A-for与Mb-V69A/L73A/I76A/L77A-rev；

片段2(长度为126bp)：Mb-V69A/L73A/I76A/L77A-for与Mb-Y104S/L105A/I108A/I112A-rev；

片段3(长度为120bp)：Mb-Y104S/L105A/I108A/I112A-for与Mb-L136A/F139A/I143A-rev；

片段4(长度为5483bp)：Mb-L136A/F139A/I143A-for与Mb-L30A/L33A–rev；

所述片段4的序列如下所示，其中加粗序列为编码肌红蛋白突变体的部分核苷酸序列：

TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATC

CATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATA

TGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTA

TTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGT

CAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCT

GCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGT

GGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACT

GGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGT

AGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGC

TCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGT

CTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGG

TCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACG

ACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCC

ACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAG

GGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCT

GGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCG

ATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAG

CAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACA

TGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCC

TTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGC

GAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTC

CTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAG

TACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTAT

CGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCG

CTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACA

AGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCA

TCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCG

TGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGA

GTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTT

AAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGA

TTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTC

ACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGT

GAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAAT

CACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCA

CAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTG

CAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCG

AAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGT

CGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAG

GCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCAT

GCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCC

GAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTG

CAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCA

GCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTG

TCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGAT

AGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCT

CAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTAC

ATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCG

TGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTG

CGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAAC

AGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGG

TCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTA

ACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTAC

CGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCAT

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CTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGA

GATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTA

ATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGAT

GCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTT

GATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGT

GCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTT

AATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGC

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GCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGAC

GGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGA

CTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGC

TCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCT

GGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATA

CTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAAT

TGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCC

ATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCA

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CAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCA

CGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGA

AGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGC

CAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGG

CGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTAT

AGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTT

AACTTTAAGAAGGAGATATACCATGTCCTCGTACTACCATCACCATCAC

CATCACGATTACGATATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCG

CCATGGATATGGTGCTGAGCGAAGGCGAATGGCAGCTGGTGCTGCA

TGTGTGGGCGAAAGTGGAAGCGGACGTGGCGGGCCATGGCCAAGA

TATTGCAATTCGCGCCTTTAAAAGCCATCCGGAAAAAGCGGCAGAA

CTGGCACGCAAAGATGCTGCGGCGAAATATAAAGAACTGGGCTAT

CAAGGCGGCAGCGGCTGAAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAG

GAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCC

CTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT(SEQ IDNo.13)

PCR扩增条件如下：

片段1、片段2、片段3扩增条件：先95℃预变性1min，然后98℃30s，58℃15s，72℃15s，共25个循环；最后72℃延伸5min。

片段4扩增条件：先95℃预变性10min，然后98℃30s，58℃15s，72℃5min30s，共25个循环；最后72℃延伸5min。

片段4在PCR反应结束后加入DpnⅠ，37℃消化2h。

胶回收上述PCR产物，获得相应大小的片段。测量每个片段浓度，进行GibsonAssembly；Gibson Assembly时按照片段4：片段1：片段2：片段3＝1:10:10:10的摩尔比添加各片段量，37℃反应1h。

2)Gibson Assembly结束后，将所得产物转入大肠杆菌感受态DH5α中，冰上放置30min，42℃热激1min，再次放于冰上3min，加入900μL LB培养基，37℃复苏1h，之后瞬离，将所得菌液涂布到含卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养。

3)挑取平板上的单克隆，过夜培养，提取质粒，送测，测序正确的质粒即为构建成功的肌红蛋白突变体表达载体；将上述构建成功的肌红蛋白突变体表达载体转至表达宿主BL21(DE3)中，由此得到肌红蛋白突变体表达菌株。

4)制得的肌红蛋白突变体表达菌株划至带有卡那霉素抗性的平板中，37℃培养箱过夜培养。

5)挑取单克隆接至LB培养基(含有终浓度为50μg/mL的卡那抗生素)过夜培养。

6)转接到LB培养基(含有终浓度为50μg/mL的卡那抗生素)，培养至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，18℃，220rpm过夜诱导表达，得到表达肌红蛋白突变体的菌体。

实施例2：构建含有金属大卟啉的肌红蛋白

收集实施例1所得过夜诱导菌体，用30mL pH＝7.5细胞悬浮液重悬菌体，将1mL大框架卟啉溶液加至30mL细胞悬浮液中(大框架卟啉溶于DMF中，浓度为5mg/mL)，然后进行超声破碎，6号变幅杆，45％功率，3s开，6s关，破碎30min。破碎结束后，置于室温孵育30min。之后高速离心12000rpm60min收集上清，与镍胶孵育后利用低浓度咪唑(40mmol/L咪唑)的Tris-HCl缓冲液洗脱杂蛋白后再用带500mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液收集结合大框架的突变体蛋白。Tris-HCl缓冲液：50mmol/L Tris，200mmol/L氯化钠，1mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)，10％(v/v)甘油，pH为7.5-8.0；

将洗脱得到的突变体蛋白透析至缓冲液100mmol/L KPi，pH为7.5-8.0。

实施例3：构建含有金属大卟啉的肌红蛋白

收集实施例1所得过夜诱导菌体，用30mL pH＝7.5细胞悬浮液重悬菌体，利用高压均质仪进行破碎，850bar，5min。破碎结束后，将1mL大框架卟啉溶液加至30mL破碎液中(大框架卟啉溶于DMF中，浓度为5mg/mL)，置于室温孵育30min。之后高速离心12000rpm 60min收集上清，与镍胶孵育后利用低浓度咪唑(40mmol/L咪唑)的Tris-HCl缓冲液洗脱杂蛋白后再用带500mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液收集结合大框架的突变体蛋白。Tris-HCl缓冲液：50mmol/L Tris，200mmol/L氯化钠，1mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)，10％(v/v)甘油，pH为7.5-8.0；

将洗脱得到的突变体蛋白透析至缓冲液100mmol/L KPi，pH为7.5-8.0。

实施例4：构建含有金属大卟啉的肌红蛋白

收集实施例1所得过夜诱导菌体，用30mL pH＝7.5细胞悬浮液重悬菌体，利用高压均质仪进行破碎，850bar，5min。破碎结束后，高速离心12000rpm60min收集上清，与镍胶孵育后利用低浓度咪唑(40mmol/L咪唑)的Tris-HCl缓冲液洗脱杂蛋白后再用30mL 500mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液收集突变体蛋白。将1mL大框架卟啉溶液加至30mL蛋白洗脱液中(大框架卟啉溶于DMF中，浓度为5mg/mL)，置于室温孵育30min，重复上述纯化步骤。Tris-HCl缓冲液：50mmol/L Tris，200mmol/L氯化钠，1mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)，10％(v/v)甘油，pH为7.5-8.0；

将洗脱得到的突变体蛋白透析至缓冲液100mmol/L KPi，pH为7.5-8.0。效果例：结合大框架卟啉突变体蛋白的光谱测定

利用实施例2、实施例3、实施例4三者任意实施例所述方案分别构建含有四苯基卟啉氯化锰(Ⅲ)的肌红蛋白、含有5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的肌红蛋白、含有5,10,15,20-四(2,4,6-三甲基苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的肌红蛋白，三种结合大框架卟啉的突变体蛋白各取100μL(蛋白量约为500μg)进行光谱的测定，测定时采用酶标仪进行，测定范围为300-600nm，步长为1nm。

利用酶标仪进行光谱测定，由于肌红蛋白结合血红素时会在412nm处出现最高吸收，而突变体失去结合血红素的能力，故在412nm处无吸收，当加入大框架卟啉时，肌红蛋白突变体结合大框架卟啉，根据不同金属大框架卟啉的吸收特征，突变体在特定的位置出现相应吸收峰(具体数据如表1所示)，所得吸收光谱图如图1、图2、图3所示。其中：

图1示肌红蛋白质突变体结合四苯基卟啉氯化锰(Ⅲ)的光谱表征，其中灰色表示肌红蛋白突变体的吸收光谱图，黑色表示肌红蛋白突变体结合四苯基卟啉氯化锰(Ⅲ)的吸收光谱图，约在470nm处出现最高吸收，表明肌红蛋白突变体成功结合；

图2示肌红蛋白质突变体结合5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的光谱表征，其中灰色表示肌红蛋白突变体的吸收光谱图，黑色表示肌红蛋白突变体结合5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的吸收光谱图，约在448nm处出现最高吸收，表明肌红蛋白突变体成功结合；

图3示肌红蛋白质突变体结合5,10,15,20-四(2,4,6-三甲基苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的光谱表征，其中灰色表示肌红蛋白突变体的吸收光谱图，黑色表示肌红蛋白突变体结合5,10,15,20-四(2,4,6-三甲基苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的吸收光谱图，约在470nm处出现最高吸收，表明肌红蛋白突变体成功结合。

本发明的实验证明，本发明提供的抹香鲸肌红蛋白突变体蛋白与野生型相比，失去了对血红素的结合能力，能够有效地结合大框架卟啉。

表1

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。