一种鱼皮胶原多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种具有抗骨质疏松活性的鱼皮胶原多肽的制备方法。

背景技术

据统计，全球至少有2亿人被骨质疏松及其引起的相关疾病所困扰，其中主要包括老年人以及绝经后女性。骨质疏松的根本原因是年老、疾病、药物等因素导致身体内骨代谢异常，骨质吸收增加、骨量减少、骨微小结构发生异常变化，从而导致骨脆性增高、易骨折。因此，治疗骨质疏松的关键在于抑制骨吸收、促进骨形成。除药物治疗外，合理的饮食也是治疗骨质疏松的关键。研究表明，胶原多肽可作为食物补充剂，通过刺激关节，促使软骨组织产生II型胶原蛋白、透明质酸以及蛋白聚糖等物质，从而改善低骨密度疾病。此方法相比较于传统药物治疗，更安全可靠，无任何副作用影响。

胶原多肽的制备是由具有不同生物活性的氨基酸序列的胶原蛋白经过酸、碱和酶等作用下水解制得，水解作用促使胶原蛋白肽活性中心暴露，使其发挥抗骨质疏松功能。一般而言，胶原多肽多由哺乳动物或水生生物制得，而以哺乳动物为原料制备胶原多肽会受政策和宗教信仰所限制，而水生生物胶原多肽不受以上因素限制，且资源丰富、产品成品低、生物活性高。

罗非鱼是我国重要的淡水养殖品种之一，总量已经超过162万吨，但在罗非鱼加工过程中，大量的鱼鳞、鱼皮和鱼骨等60-70％的下脚料被废弃，而鱼皮中胶原蛋白的含量最高可达蛋白质总量的80％以上，且脂肪含量极低。因此，以鱼皮胶原蛋白制备胶原多肽在食品和医疗领域中受到人们的认可，在大幅度提高鱼类副产物价值的同时在一定程度上减少对环境的影响。

目前，制备鱼皮胶原多肽的方法主要有化学法、重组DNA法、直接提取法和蛋白水解法。但化学法在制备合成过程中会产生废弃、废料等副产物，对环境造成一定污染；直接提取法成本较高而提取率低；重组DNA法制备的多肽肽链较长，生物活性偏低；蛋白水解法耗时短、营养物质流失少，且不会对环境造成污染，因此制备鱼皮胶原多肽的最佳方法为蛋白水解法。专利CN103805665公开了一种深海鱼皮胶原多肽的制备方法，该方法将胶原蛋白液粗品在55℃下利用复合蛋白酶进行酶解，并多次使用超滤膜过滤，获得的酶解液经复合活性炭吸附、脱色、去腥后纳滤、干燥，最终制得粉末状胶原多肤。该制备方法联合使用酶解和超滤分离工艺，可人为控制反应条件，获得理化性质更好的产品，但复合活性炭吸附效果不太理想，且产品具有一定苦涩味。专利201810408287.X在此基础上进行改进，选用胶原酶和风味蛋白酶进行蛋白酶解，并利用改性活性炭吸附，该方法提高了吸附效率并减少产品的苦涩味，但酶解时间较长，不适合大规模生产。此外，针对胶原多肽活性的研究多为抗氧化活性，而制备具有抗骨质疏松活性的方法目前还比较少。因此，确定一种具有抗骨质疏松活性的胶原多肽的制备方法是目前胶原多肽行业发展的攻坚方向。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有抗骨质疏松活性的鱼皮胶原多肽的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种鱼皮胶原多肽的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)以蛋壳膜(ESM)为载体将枯草杆菌碱性蛋白酶(BAP)固定化，制得ESM-BAP；

(2)将鱼皮胶原蛋白加入碱性缓冲液中，并加入ESM-BAP进行酶解，酶解完成后将酶灭活，离心取上清液，上清液经1～5kDa的超滤膜进行分离，得到鱼皮胶原多肽，冷冻干燥获得胶原多肽粉末。

优选地，所述ESM-BAP的制备方法为：取蛋壳膜在京尼平溶液中振荡浸泡，之后洗去蛋壳膜上多余的京尼平，在恒温水浴振荡条件下，加入枯草杆菌碱性蛋白酶溶液，进行交联反应，得到ESM-BAP。

优选地，所述交联反应的温度为25-50℃，时间为1-4h。

优选地，所述京尼平浓度为0.5％-1.0％，BAP浓度为1-8mg/mL。

优选地，所述京尼平浓度为0.75±0.15％，BAP浓度为5±1mg/mL。

优选地，所述酶解的pH值为7.5-10.5，酶解温度为25-75℃。

优选地，所述酶解的pH值为9.5±1.0，酶解温度为在55±10℃。

优选地，所述鱼皮为罗非鱼鱼皮，超滤膜的截留分子量为1～3kDa。

上述方法制得的鱼皮胶原多肽在制备抗骨质疏松药物或保健品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明制备的胶原多肽所使用的所有原材料为鱼类加工行业废弃物，原材料安全可靠，且有利于废弃物资源化利用。

(2)本发明利用ESM作为载体将BAP酶固定化，ESM来源丰富易获取，且安全性高。

(3)本发明使用ESM固定BAP，制得ESM-BAP，在保持BAP对底物的亲和力和催化效率的同时，大大提高其酶活性能。

(4)本发明制备的鱼皮胶原多肽抗骨质疏松活性可比肩依替膦酸二钠药物的抗骨质疏松活性。

(5)本发明制备的胶原多肽可应用于食品、药品等各大领域，应用前景好，工艺技术简单易大量生产。

附图说明

图1是实施例1中所得ESM和ESM-BAP样品照片。

图2是实施例1中所得胶原多肽hBMSC诱导成骨分化实验结果。

图3是实施例1中所得胶原多肽斑马鱼动物实验中斑马鱼颅骨茜素红S染色图(胶原多肽浓度分别为1mg/mL，0.5mg/mL，0.2mg/mL)。

图4是实施例1中所得胶原多肽与依替膦酸二钠(DI)药物对地塞米松(DE)诱导的斑马鱼骨质疏松幼鱼的影响(P1(1-3:50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL)和P3(4-6：50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL))(a:颅骨骨矿化改善率,b:颅骨累积光密度计算)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明中所使用的枯草杆菌碱性蛋白酶(BAP)购自诺维信(日本)有限公司。

实施例1

(1)将鸡蛋壳放入20％的醋酸溶液中，浸泡24h，去除鸡蛋外壳，用超纯水漂洗至中性，获得蛋壳膜(ESM)，4℃条件下置于pH 7.4磷酸缓冲液中保存；

(2)称取一定量步骤(1)制得的ESM，在0.75％的京尼平中振荡浸泡3h后，用超纯水洗去ESM上多余的京尼平，在45℃恒温水浴振荡条件下，加入5mg/mL BAP溶液，交联2h后用PBS进行洗涤，得到ESM-BAP；

(3)将罗非鱼鱼皮胶原蛋白置于20mmol/L Na

(4)将步骤(3)获得的上清液经5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤分离，得到3种不同分子量的罗非鱼鱼皮胶原多肽组分P5(3kDa～5kDa)、P3(1kDa～3kDa)和P1(<1kDa)。冷冻干燥获得胶原多肽粉末；

(5)将步骤(4)制得的3种不同分子量的罗非鱼鱼皮胶原多肽进行人骨髓间充质干细胞(hBMSC)诱导成骨分化实验：胰酶消化收集hBMSC细胞(第六代)，用0.4mL生长培养基混悬后置于培养箱孵育24h(融合度80％)。将P1、P3、P5样品分别配制1mg/mL，0.5mg/mL，0.2mg/mL三个浓度，采用专用成骨分化诱导培养液(添加、或不添加一定浓度测试样品)诱导成骨分化，连续诱导15天后采用茜素红S染色试剂盒染色细胞，观察钙结节(红色)。再进行斑马鱼动物实验：斑马鱼设正常对照组(含0.5％DMSO养鱼用水处理)、模型组(10μmol/mL地塞米松水溶给药处理)、阳性对照组(25μg/mL依替膦酸二钠+10μmol/mL地塞米松水溶给药处理)斑马鱼；实验组(胶原多肽样品+10μmol/mL地塞米松水溶给药处理)。斑马鱼在28.5±0.5℃下培养至10dpf，6dpf前隔天换药，7dpf开始喂食。根据试验结果筛选出抗骨质疏松活性最高的鱼皮胶原多肽。

由图2可知，红色钙结节越深代表成骨细胞的分化效果越好。与Control组相比，P1和P3的三个浓度均能够促进成骨细胞钙结节形成，且呈剂量依赖性，而P5仅在1mg/mL浓度下具有促成骨生成的作用。因此选择P1和P3进行后续的实验，以进一步筛选最适分子量的抗骨质疏松鱼皮胶原活性肽。

由图3可知，茜素红S能与钙盐结合呈红色，根据茜素红S染液结果可观察和检测骨矿化面积。

由图4可知，DE组能够显著降低斑马鱼幼鱼颅骨的骨矿化面积和累积光密度，说明DE对骨形成有抑制作用。DI药物组、ESM-BAP的P1、P3组分对斑马鱼幼鱼的骨形成抑制都有改善作用，且P1组分结果与DI药物组结果相近。

实施例2

步骤(2)中分别使用0.1、0.25、0.5、1％京尼平，其余条件与实施例1一致。

实施例3

步骤(2)中恒温水浴振荡条件温度分别为25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，其余条件与实施例1一致。

实施例4

步骤(2)中加入BAP浓度分别为1、2、5、8、10mg/mL，其余条件与实施例1一致。

实施例5

步骤(2)中交联时间分别为1、2、4、6、8h，其余条件与实施例1一致。

实施例6

步骤(3)酶解温度分别为25、35、45、55、65、75、85℃，其余条件与实施例1一致。

实施例7

步骤(3)酶解pH分别为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11，其余条件与实施例1一致。

表1-4分别是实施例1-5制备的ESM-BAP酶活性回收率、ESM酶负载量和酶活负载量。由表1-4可知，ESM-BAP最佳制备条件为0.75％的京尼平浓度，交联温度为45℃，酶浓度为5mg/mL，交联时间2h，酶活回收率高达63.36％，酶负载量为319.69mg/g，酶活负载量为30039.94U/g。

表1

表2

表3

表4

表5-6分别是实施例6-7制备的ESM-BAP催化性能。由表5-6可知，ESM-BAP最适催化pH为9.5，最适催化温度为55℃。

表5

表6

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。