一种稳定性增强的人免疫球蛋白G4试剂盒

技术领域

本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体涉及一种稳定性增强的人免疫球蛋白G4试剂盒。

背景技术

免疫球蛋白(IgG)是血液中除白蛋白外最丰富的蛋白，由通过二硫键连接的两条轻链和两条重链组成，呈“Y”型。IgG是血清中免疫球蛋白的的主成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75％。IgG有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 4个亚型，其中IgG4是体内最主要的抗体，具有抗病毒、中和病毒、抗菌及免疫调节的功能。同时IgG4在新生儿抗感染、一些自身抗体免疫病等过程中发挥着十分重要的作用。

IgG4是罕见的免疫球蛋白g亚型，对靶抗原的亲和力低，不能结合血清补体C1q，与Fc受体的亲和力低，不能激活经典补体途径和活化细胞因子，可抑制其他亚型免疫复合物的形成。其中IgG4相关性疾病是今年来广泛关注的一种系统性疾病，其以病变部位肿胀，受累组织大量淋巴浆细胞特别是IgG4阳性浆细胞浸润，席纹状纤维化为特点，常伴血清IgG4增高，但也很正常。目前研究发现IgG4相关性疾病可累及各个器官，例如胰腺(自发性胰腺炎)、泪腺(米库利兹病)、腹膜后(腹膜后纤维化)、主动脉(主动脉瘤、主动脉炎)、心脏(缩窄性心包炎)，及冠状动脉周假瘤等。由于IgG4相关性心血管疾病明显影响患者的预后，故其的早期诊断及治疗尤为重要。

1、IgG4相关性疾病与淋巴瘤：IgG4相关性疾病与淋巴瘤的发生关系密切，尤其以黏膜相关淋巴组织(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)结外边缘区B细胞淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤最为多见。

2、IgG4相关性疾病与其他类型恶性肿瘤：IgG4相关性疾病可能引起疾病发生部位或全身其他部位的除血液性恶性肿瘤之外的其他类型的肿瘤，如IgG4相关性疾病的桥本甲状腺炎能够引起甲状腺乳头状瘤的发生。

3、IgG4相关性疾病与既往发生的恶性肿瘤：恶性肿瘤可能是IgG4相关性疾病发生发展的诱因之一，且几乎所有的恶性肿瘤的发生部位都不同于IgG4相关性疾病的患病部位。

目前测定血清免疫球蛋白G4的方法主要有酶联免疫法和单向免疫扩散法。

1、酶联免疫法：此方法基本为手工操作，检测时间为90min以上，极难大规模开展；

2、单向免疫扩散法：此方法操作繁琐复杂，检测时间在5h以上，难以及时出检测结果。

公开号为CN106771251A的专利申请公开兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，该试剂盒有效消除了HAMA和RF干扰。但是现有的试剂盒开瓶后会极大影响试剂盒的稳定性，影响检测结果，同时易造成试剂盒的浪费。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于现有技术中的试剂盒开瓶后会极大影响试剂盒的稳定性，影响检测结果，同时易造成试剂盒的浪费。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种稳定性增强的人免疫球蛋白G4试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；

所述R1试剂主要由以下浓度的原料制成：50-300mmol/L磷酸盐缓冲液、0.5-2.0g/L吐温20、0.5-50.0g/L聚乙二醇-8000、10-50mmol/L NaCl，溶剂为纯化水；

所述R2试剂主要由以下浓度的原料制成：50-300mmol/L缓冲液、0.1-2.0％乳胶微球、20-50mg/L免疫球蛋白G4抗体、0.1-1.0mg/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.1-1.0mg/L N-羟基丁二酰亚胺、1％甘油、2％D-海藻糖、1.0-5.0g/L牛血清白蛋白、0.05-0.2％PC300，溶剂为纯化水。

有益效果：本发明中的试剂盒在R2试剂中加入甘油和D-海藻糖，使这二种成分相互叠加，以达到现有技术的测定试剂盒的在机稳定性可延长至15天，能极大程度利用好试剂，避免不必要的试剂浪费，有利于该方法学的试剂在临床上的推广和应用。

优选地，所述R2试剂中的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液。

优选地，所述R2试剂中的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

有益效果：当R2、R1试剂中的缓冲液为磷酸盐缓冲液时，整个反应的缓冲体系，是重组IgG4抗体最佳的保存液和反应缓冲液。

优选地，所述R1试剂与R2试剂的体积比为4:1。

优选地，所述乳胶微球的粒径为100-250nm。

优选地，所述R1试剂主要由以下浓度的原料制成：50mmol/L磷酸盐缓冲液、0.5g/L吐温20、0.5g/L聚乙二醇-8000、10mmol/L NaCl，溶剂为纯化水。

优选地，所述R1试剂主要由以下浓度的原料制成：300mmol/L磷酸盐缓冲液、2.0g/L吐温20、50.0g/L聚乙二醇-8000、50mmol/L NaCl，溶剂为纯化水。

优选地，所述R2试剂主要由以下浓度的原料制成：50mmol/L磷酸盐缓冲液、0.1％乳胶微球、20mg/L免疫球蛋白G4抗体、0.1mg/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.1mg/L N-羟基丁二酰亚胺、1％甘油、2％D-海藻糖、1.0g/L牛血清白蛋白、0.05％PC300，溶剂为纯化水。

优选地，所述R2试剂主要由以下浓度的原料制成：300mmol/L磷酸盐缓冲液、2％乳胶微球、50mg/L免疫球蛋白G4抗体、1mg/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1mg/L N-羟基丁二酰亚胺、1％甘油、2％D-海藻糖、5g/L牛血清白蛋白、0.2％PC300，溶剂为纯化水。

优选地，所述R1试剂的制备方法包括以下步骤：将磷酸盐溶于纯化水，制得磷酸盐缓冲液，将吐温2-溶于磷酸盐缓冲液中，然后继续加入聚乙二醇-8000、NaCl，溶解后，即制得R1试剂。

优选地，所述R2试剂的制备方法包括以下步骤：

(1)将磷酸盐溶于纯化水制得磷酸盐缓冲液，将乳胶微球溶于磷酸盐缓冲液，搅拌后，制得A缓冲液；

(2)将免疫球蛋白G4抗体溶于磷酸盐缓冲液，搅拌后，制得B缓冲液；

(3)将A缓冲液与B缓冲液混合，于37℃混合1-2h；

(4)然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺加入步骤(3)的缓冲液中，于37℃混合2-5h；

(5)将步骤(4)中混合后的缓冲液离心，去除上清液后，将沉淀物重悬于磷酸盐缓冲液中，然后加入甘油、D-海藻糖、牛血清白蛋白、PC300，搅拌后，于室温放置1-5h，即制得R2试剂。

本发明的优点在于：本发明中的试剂盒在R2试剂中加入甘油和D-海藻糖，使这二种成分相互叠加，以达到现有技术的测定试剂盒的在机稳定性可延长至15天，能极大程度利用好试剂，避免不必要的试剂浪费，有利于该方法学的试剂在临床上的推广和应用。

本发明中的试剂盒能够实现全自动检测，检测时间缩短为10min，且分析灵敏度高，线性范围广，稳定性好，适合大批量检测。

本发明中的试剂盒利用乳胶微球包被IgG4抗体，与含有IgG4抗原的样品混合时，形成乳胶微球-抗体-抗原复合物，从而引起吸光度的变化来检测检测IgG4，大大提高了其检测的准确度和特异性。同时通过改变添加两种原辅料，大大提升了试剂在全自动生化仪里的在机稳定性，延长至15天。

上述R1、R2试剂中所述的磷酸盐缓冲液：整个反应的缓冲体系，是IgG4抗体最佳的保存液和反应缓冲液。

TWEEN-20：表面活性剂，同时也可以作为辅助的封闭剂，防止非特异性蛋白结合位点的封闭，保证IgG4检测试剂的准确度；

聚乙二醇-8000：分散剂，避免乳胶微球相互聚集沉淀引起吸光度的变化，造成假阳性的结果；

NaCl：维持IgG4抗体所需的渗透压浓度；

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)：可用于化学标记、交联和固相固定中，制备氨基羧酸酯的胺反应酯，极大的提高整个反应的偶联效率。EDC用于提供-COOH，与NHS反应形成一个半稳定的NHS或磺基-NHS酯；

牛血清白蛋白：封闭剂，可防止非特异性蛋白结合位点的封闭，保证IgG4检测试剂的准确度；

PC300：防腐剂，可防止IgG4检测试剂微生物污染，保证该检测试剂的长效稳定性。

附图说明

图1为本发明实施例1中IgG4定标曲线图；

图2为本发明实施例1中IgG4线性相关性测定结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例1

稳定性增强的人免疫球蛋白G4试剂盒及其制备方法

稳定性增强的人免疫球蛋白G4试剂盒包括彼此独立的R1试剂和R2试剂，其中R1试剂为：50mmol/L磷酸盐缓冲液、0.5g/L吐温20、0.5g/L聚乙二醇-8000、10mmol/L NaCl，溶剂为纯化水。其中R1的pH值为7.5。

R2试剂为：50mmol/L磷酸盐缓冲液、0.1％乳胶微球、20mg/L IgG4抗体、0.1mg/L1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.1mg/L N-羟基丁二酰亚胺、1％甘油、2％D-海藻糖、1.0g/L牛血清白蛋白、0.05％PC300，溶剂为纯化水。

本实施例中稳定性增强的人免疫球蛋白G4试剂盒的制备方法包括以下步骤：

R1试剂的制备方法包括以下步骤：

(1)R1试剂的制备：将磷酸盐溶于纯化水，配制50mmol/L磷酸盐缓冲液，将吐温2-溶于磷酸盐缓冲液中，然后继续加入聚乙二醇-8000、NaCl，溶解后，即制得R1试剂。

(2)R2试剂的制备：

(a)将磷酸盐溶于纯化水制得50mmol/L磷酸盐缓冲液，将乳胶微球溶于磷酸盐缓冲液，搅拌后，制得A缓冲液；

(b)将免疫球蛋白G4抗体溶于磷酸盐缓冲液，搅拌后，制得B缓冲液；

(c)将A缓冲液与B缓冲液混合，于37℃混合1-2h；

(d)然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺加入步骤(c)的缓冲液中，于37℃混合2-5h；

(e)将步骤(d)中混合后的缓冲液离心，去除上清液后，将沉淀物重悬于磷酸盐缓冲液中，然后加入甘油、D-海藻糖、牛血清白蛋白、PC300，搅拌后，于室温放置1-5h，即制得R2试剂。

实施例2

本实施例与实施例1的区别之处在于：

R1试剂为：300mmol/L磷酸盐缓冲液、2.0g/L吐温20、50.0g/L聚乙二醇-8000、50mmol/L NaCl，溶剂为纯化水。

R2试剂为：300mmol/L磷酸盐缓冲液、2％乳胶微球、50mg/L IgG4抗体、1mg/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1mg/L N-羟基丁二酰亚胺、1％甘油、2％D-海藻糖、5g/L牛血清白蛋白、0.2％PC300，溶剂为纯化水。

实施例3

本实施例与实施例1的区别之处在于：

R1试剂为：200mmol/L磷酸盐缓冲液、1.0g/L吐温20、25.0g/L聚乙二醇-8000、30mmol/L NaCl，溶剂为纯化水。

R2试剂为：200mmol/L磷酸盐缓冲液、1％乳胶微球、35mg/L IgG4抗体、0.5mg/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.5mg/L N-羟基丁二酰亚胺、1％甘油、2％D-海藻糖、3g/L牛血清白蛋白、0.1％PC300，溶剂为纯化水。

对比例1

本对比例与实施例1的区别之处在于：R1试剂中甘油的质量分数为0.5％，D-海藻糖的质量分数为2％。

对比例2

本对比例与实施例1的区别之处在于：R1试剂中甘油的质量分数为2％，D-海藻糖的质量分数为2％。

对比例3

本对比例与实施例1的区别之处在于：R1试剂中甘油的质量分数为1％，D-海藻糖的质量分数为1％。

对比例4

本对比例与实施例1的区别之处在于：R1试剂中甘油的质量分数为1％，D-海藻糖的质量分数为3％。

对比例5

本对比例与实施例1的区别之处在于：R1试剂中甘油的质量分数为1％，不添加D-海藻糖。

对比例6

本对比例与实施例1的区别之处在于：R1试剂中D-海藻糖的质量分数为1％，不添加甘油。

对比例7

本对比例与实施例1的区别之处在于：R1试剂中不添加甘油和D-海藻糖。

实施例4

对实施例1中试剂盒的性能进行测定，操作参数如表1所示。

表1为试剂盒的操作参数

样品中免疫球蛋白G4含量的计算方法如下：

式中：ΔA

ΔA

C

(一)定标：采用校准品进行定标，结果如表2所示，定标曲线如图1所示。

表1为IgG4定标信息表

从表1和图1可以看出，标准品浓度为4.50g/L范围内，定标通过，且未出现hook现象。

(二)精密度CV检测：

选取高、低两个不同水平的样本进行测试，每个浓度水平的样本重复检测10次，结果如表2所示。

表2为精密度检测结果表

从表2可以看出，检测高、低两个不同水平的样本的重复性，其精密度CV均＜3.0％，精密度较好。

(三)线性范围检测：

采用高值样本，通过倍比稀释的方式，稀释成至少5个不同梯度浓度(Xi)，每个稀释浓度样品测定3次，分别求出测试结果的均值(yi)。以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(y

表3为IgG线性范围检测结果表

从表3和图2可以看出，在线性浓度为0.04-4.20g/L范围内，IgG4检测试剂的线性范围宽，有足够的检测优势。

(四)试剂盒的在机稳定性测试：

对试剂R2中的部分原料进行缺失对比实验，将实施例中试剂组分与缺失的对比例组分试剂，分别放置于全自动生化分析仪中进行在机稳定性考察，每天固定时间点分别监测高低值质控，每次2个测试，取平均值，观察高低值质控失控的时间。测定结果如表4和表5所示。

表4为各实验组在机稳定性中低值质控比较结果

表5为各实验组在机稳定性中高值质控比较结果

从表4和表5可以看出，实施例1中的试剂盒随着时间的延长，对于高低值质控的检测结果变化不明显，而对比例1(甘油0.5％，D-海藻糖2％)、对比例2(甘油2％，D-海藻糖2％)、对比例6(D-海藻糖2％)和对比例7(不添加甘油和D-海藻糖)随着在机开瓶时间的延长，对于高低值质控的检测结果均明显下降；同时对比例3(甘油1％，D-海藻糖1％)、对比例4(甘油1％，D-海藻糖3％)、对比例5(甘油1％)和对比例7(不添加甘油和D-海藻糖)也随着在机试剂开瓶时间的延长，对于高低值的检测结果均明显下降。可见本发明中的甘油和D-海藻糖的能延长IgG4试剂在机的开瓶稳定性。

综上，相比于对比例7和对比例6看出，D-海藻糖的加入的确能够提高试剂盒的在机稳定性，对比例7和对比例5比较看出，甘油的加入能够提高试剂盒的在机稳定性；而对比例5和对比例6比较看出，甘油这一成分提高在机稳定性，没有D-海藻糖好。从实施例、对比例1,2,3,4与对比例5,6,7相比而言，甘油和D-海藻糖的叠加效果远远高于这二个成分单独作用，且实施例为最适比例组合。其中在机稳定性是指将试剂盒进入仪器的试剂仓开始计算可以保持其稳定性的有效时间。本发明实施例2-实施例3中试剂盒的测定结果与实施例1基本相同。

实施例5

将实施例1中的试剂盒与已注册的产品进行在机稳定性对比

根据国家食品药品监督管理局的数据显示，目前只有杭州浙大迪讯生物基因工程有限公司有两种方法(蛋白芯片法和酶联免疫法)的食物特异性抗体IgG4检测试剂盒。将本说明的试剂与其公司的两种试剂盒同时考察在机稳定性，每天固定时间点分别监测高低值稳定的血清，每次2个测试，取平均值，观察高低值质控失控的时间。

具体实施方案：实施例：本说明所述的IgG检测试剂盒(乳胶增强免疫比浊法)，对比例：食物特异性抗体IgG4检测试剂盒(酶联免疫法)具体数据如下表6和表7所示：

注：由于蛋白芯片法和酶联免疫法试剂不可在全自动生化上进行操作，且蛋白芯片法试剂需要特定的仪器，不可进行操作；酶联免疫法的试剂需进行前期人工操作处理才可以在全自动生化分析仪上进行检测。

表6为两种IgG4检测试剂盒在机稳定性低值血清考察数据表

表7为两种IgG4检测试剂盒在机稳定性高值血清考察数据表

由上表6和7可知：实施例1中的试剂盒随着时间的延长，对于高低值血清的检测结果变化不明显，而对比例随着时间的变化，对于高低值血清的检测结果明显变化，且降低。可见本说明的IgG检测试剂的在机稳定性有明显的提升，可延长至15天，大大提升了试剂的临床使用率。本发明实施例2-实施例3中试剂盒的测定结果与实施例1基本相同。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。