一种检测昆虫病原线虫募集能力的装置及使用方法

技术领域

本发明涉及一种检测昆虫病原线虫募集能力的装置及使用方法。

背景技术

昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes，EPNs)是一类专门寄生昆虫的线虫，通过3龄感染期幼虫对害虫身体的自然开口或节间膜侵入的方式进入寄主体内，并释放携带的共生细菌，使其在害虫体内繁殖，产生毒素，最终导致害虫死亡。因EPNs具有寄主范围广泛，主动寻找寄主，对非靶标生物安全，对环境无副作用，能与许多农药、肥料混用等优点，已广泛应用于防治蛴螬、地老虎、桃小食心虫、天牛等多种农林地下害虫。

然而，与化学杀虫剂相比，昆虫病原线虫杀虫效果缓慢且不稳定。研究表明，其杀虫效果受到生物因素(昆虫病原线虫品系和剂量、不同品系昆虫病原线虫混合、寄主虫态及龄期等)、环境因素(温度、湿度、杀虫剂等)以及施用方法(喷施、大水漫灌等)等因素的影响。而线虫品系自身对寄主觅食能力的差异将直接决定其杀虫效果。昆虫病原线虫觅食行为过程可分为远距离的扩散、近距离的定向和最终的募集三个主要阶段，而昆虫病原线虫觅食寄主的过程主要靠来自寄主本身或其它物质的化学刺激。而募集是指线虫在侵入寄主之前，在寄主周围1～2mm范围内的募集数量，募集数量越高则表明募集能力越强，而募集能力的强弱直接决定线虫是否可以直接侵入寄主的关键。

当前研究线虫的募集能力还没有相关的装置及技术。为了更加有效地对线虫募集能力进行有效检测，从而确定线虫的募集能力。因此，有必要研究一种新型的装置，并确定该装置检测线虫募集能力的方法，为线虫的应用提供技术支持。

发明内容

为解决以上技术上的不足，本发明提供了一种检测昆虫病原线虫募集能力的装置及使用方法，结构简单，试验时间短，试验误差低。

本发明是通过以下措施实现的：

一种检测昆虫病原线虫募集能力的装置，包括圆形透明的载玻板，所述载玻板中心上方一体连接有圆柱形的寄主固定瓶，所述寄主固定瓶底部的载玻板上标出有圆形的线虫检测区，所述载玻板边缘向上延伸有围坝，所述围坝的高度大于寄主固定瓶的高度，所述寄主固定瓶顶部的瓶口处设置有瓶盖，所述瓶盖和寄主固定瓶的侧壁上均开有筛网状小孔。

上述载波板采用圆形的透明塑料板，直径为3～12cm，厚度为1-2mm，围坝高度为1～3cm，围坝厚度与载玻板的厚度一致；寄主固定瓶底部直径小于线虫检测区的直径且为1～5cm，厚度为0.5mm，高度为0.5～2.5cm。

上述线虫检测区为圆形且位于载波板的中心，直径为2～6cm，线虫检测区设置有黑色的底层，底层上画有网格线，网格线交叉形成的正方形，其边长为1mm～2mm，网格线颜色可为红色、绿色或蓝色。

一种检测昆虫病原线虫募集能力的装置的使用方法，包括以下步骤：

步骤1，在寄主固定瓶内放入寄主昆虫，并盖住寄主固定瓶的瓶盖；

步骤2，在烧杯内将100μL的线虫悬浮液与一定量的普朗尼克凝胶轻微搅拌，直至混合均匀；

步骤3，将配好的普朗尼克凝胶和线虫混合液加入圆形载波板内，其厚度以超过寄主固定瓶的高度而不溢出围坝为止；

步骤4，然后将装置置于温度22±1℃、相对湿度60％±10％的培养箱内，光周期为24h全暗，处理不同时间后，在体式显微镜下观察线虫检测区内寄主昆虫周边方格内的线虫数量；

步骤5，通过计算线虫运动到寄主昆虫周边方格内的吸引率的大小评价其募集能力；吸引率＝(1～2mm范围内线虫数量/培养皿内的总线虫数量)×100％；

步骤6，利用统计分析软件，分析不同线虫品系对同一寄主昆虫或同一线虫品系对不同寄主昆虫或同一线品系对同一寄主昆虫口、肛门和气孔等自然开口的吸引率；

步骤2中普朗尼克凝胶配方试剂均为分析纯试剂，在混合均匀的凝胶分装后储存在4℃冷藏条件下备用；

步骤4中调查线虫数量时，当线虫虫体处于网格线交叉线上时，虫体大小在网格线内大于等于一半时，即为1条线虫；当小于一半时，忽略不计。

本发明的有益效果是：1、本发明装置结构简单，对线虫的募集能力研究装置包括载玻板，围坝，线虫检测区、寄主固定瓶。首先通过在寄主固定瓶内放入寄主昆虫，然后将配好的普朗尼克凝胶和线虫混合液加入圆形载波板内。处理不同时间后，在体式显微镜下观察线虫检测区内寄主昆虫周边方格内的线虫数量的方法，采用统计吸引率的方法评价其募集能力的差异。2、采用该装置及其方法检测，是针对昆虫病原线虫募集能力检测装置及其检测技术缺乏的现状，检测花费时间缩短了2.75～3.39倍，且采用本发明装置与采用常规显微镜检测的相对误差为0.68～2.31％，在有效缩短时间的同时，达到更准确的募集能力评估。总之，采用本发明装置及其方法可以应用在不同线虫品系对同一寄主昆虫，也可应用在同一线虫品系对不同寄主昆虫，还可应用在同一线品系对同一寄主昆虫口、肛门和气孔等自然开口的募集能力的研究，且具有显著降低试验时间，降低试验误差的水平。在提高计数准确度的同时，减少了计数时间，提高了计数效果和准确度。3、本发明装置和方法解决了当前昆虫病原线虫募集能力检测装置及其检测技术缺乏的问题，具有试验时间短、试验误差低的效果，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图2为寄主固定瓶结构示意图。

图3为本发明的整体结构俯视示意图。

其中，1、载玻板；2、围坝；3、线虫检测区；4、网格线；5、昆虫病原线虫；6、寄主固定瓶；7、瓶盖；8、小孔；10、寄主昆虫。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步详细的描述：

实施例1：

如图1、2、3所示，一种检测昆虫病原线虫5募集能力的装置，包括圆形透明的载玻板1，载玻板1中心上方一体连接有圆柱形的寄主固定瓶6，寄主固定瓶6底部的载玻板1上标出有圆形的线虫检测区3，载玻板1边缘向上延伸有围坝2，围坝2的高度大于寄主固定瓶6的高度，寄主固定瓶6顶部的瓶口处设置有瓶盖7，瓶盖7和寄主固定瓶6的侧壁上均开有筛网状小孔8。载波板采用圆形的透明塑料板，直径为3～12cm，厚度为1-2mm，围坝2高度为1～3cm，围坝2厚度与载玻板1的厚度一致；寄主固定瓶6底部直径小于线虫检测区3的直径且为1～5cm，厚度为0.5mm，高度为0.5～2.5cm。线虫检测区3为圆形且位于载波板的中心，直径为2～6cm，线虫检测区3设置有黑色的底层，底层上画有网格线4，网格线4交叉形成的正方形，其边长为1mm～2mm，网格线4颜色可为红色、绿色或蓝色。

载玻板1为圆形聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸树酯、聚苯乙烯等类型塑料材料制作，其好处在于在载玻板1标记的线虫检测区3上的黑色网格线4，能够在显微镜下看清。圆形载玻板1直径为3～12cm，厚度为1～2mm，此设计可以满足昆虫病原线虫55对不同大小寄主昆虫1010的募集能力研究。围坝2的高度为1～3cm，厚度与载玻板1的材料及厚度一致。围坝2底部与载玻板1正面为一体结构，在进行昆虫病原线虫5募集能力检测时，防止昆虫病原线虫5移动到载玻板1外。线虫检测区3位于载波板的中心部位，直径为2～6cm，线虫检测区3底板设置为黑色，底板上画有网格线4，网格线4交叉形成的正方形，其边长为1mm～2mm，网格线4颜色可为红色，绿色和蓝色中的一种，此设计的目的是由于昆虫病原线虫55为乳白色，在此颜色中下便于昆虫病原线虫5在显微镜下观察与计数。寄主固定瓶6为圆柱形，底部位于线虫检测区3的中心部位，寄主固定瓶6整体颜色为黑色，底部圆形直径为1～5cm，小于线虫检测区3的直径，此设计的目的是防止寄主昆虫10紧靠在寄主固定瓶6瓶壁时不容易在显微镜下观察。寄主固定瓶6厚度为0.5mm，其高度低于围坝2的高度，为0.5～2.5cm，此设计是可以将寄主昆虫10完全浸在普朗尼克凝胶里，便于线虫的观察。寄主固定瓶6的底部四周与线虫检测区3为一体结构。寄主固定瓶6上有瓶盖7，瓶盖7的厚度、直径与寄主固定瓶6一致。寄主固定瓶6瓶盖7及侧壁上均开有筛网状小孔8，其筛网状小孔8的直径为3～5mm，其目的是既能有利于线虫的自由活动，又能防止寄主昆虫10的离开线虫检测区3，便于线虫的检测。寄主昆虫10可以为韭蛆、桔小实蝇幼虫、桃小食心虫等小型昆虫，也可以为小地老虎、蛴螬、大蜡螟等大型昆虫。在常规使用范围内的线虫浓度，本发明的募集能力装置都能检测。

一种检测昆虫病原线虫5募集能力的装置的使用方法，包括以下步骤：

步骤1，在寄主固定瓶6内放入寄主昆虫10，并盖住寄主固定瓶6的瓶盖7；

步骤2，在烧杯内将100μL的线虫悬浮液与一定量的普朗尼克凝胶轻微搅拌，直至混合均匀；

步骤3，将配好的普朗尼克凝胶和线虫混合液加入圆形载波板内，其厚度以超过寄主固定瓶6的高度而不溢出围坝2为止；

步骤4，然后将装置置于温度22±1℃、相对湿度60％±10％的培养箱内，光周期为24h全暗，处理不同时间后，在体式显微镜下观察线虫检测区3内寄主昆虫10周边方格内的线虫数量；

步骤5，通过计算线虫运动到寄主昆虫10周边方格内的吸引率的大小评价其募集能力；吸引率＝(1～2mm范围内线虫数量/培养皿内的总线虫数量)×100％；

步骤6，利用统计分析软件，分析不同线虫品系对同一寄主昆虫10或同一线虫品系对不同寄主昆虫10或同一线品系对同一寄主昆虫10口、肛门和气孔等自然开口的吸引率；

步骤2中普朗尼克凝胶配方试剂均为分析纯试剂，在混合均匀的凝胶分装后储存在4℃冷藏条件下备用；

步骤4中调查线虫数量时，当线虫虫体处于网格线4交叉线上时，虫体大小在网格线4内大于等于一半时，即为1条线虫；当小于一半时，忽略不计。

具体地说：(1)在寄主固定瓶6内放入头寄主昆虫10，并盖住寄主固定瓶6的瓶盖7；(2)在烧杯内将100μL的昆虫病原线虫5悬浮液(大约400条左右)与一定量的普朗尼克凝胶轻微搅拌，直至混合均匀。(3)将配好的普朗尼克凝胶和昆虫病原线虫5混合液加入圆形载波板内，其厚度以超过寄主固定瓶6的高度而不溢出为止。(4)然后将装置置于温度22±1℃、相对湿度60％±10％的培养箱内，光周期为24h全暗，处理不同时间后，在体式显微镜下观察线虫检测区3内寄主昆虫10周边方格内的昆虫病原线虫5的数量。(5)通过计算昆虫病原线虫5运动到寄主昆虫10周边方格内的吸引率的大小评价其募集能力。吸引率＝1～2mm范围内线虫数量/培养皿内的总线虫数量)×100％。(6)利用统计分析软件，分析不同昆虫病原线虫5对同一寄主昆虫10或同一昆虫病原线虫5对不同寄主昆虫10或同一昆虫病原线虫5对同一寄主昆虫10的口、肛门和气孔等自然开口的吸引率。

步骤(1)中，可根据不同寄主昆虫10的大小选择不同型号的载波板。如大蜡螟等大型昆虫可选择载波板直径12cm的，韭蛆等小型昆虫幼虫可选在载波板直径为3cm的。

步骤(2)中，所有昆虫病原线虫5，包括斯氏线虫属和异小杆线虫属的所用线虫品系，昆虫病原线虫5包括在室内高致病力品系的筛选、繁殖方法、保存方法，田间应用杀虫范围以及致病机理等所有研究中所出现的线虫品系。应用的昆虫病原线虫5通过体式显微镜镜检，其存活率均应为95％以上，转移采用移液器吸取线虫悬浮液进行转移。在吸取昆虫病原线虫5之前，用移液器对线虫悬浮液应充分混合2～3次。

步骤(2)中，所用普朗尼克凝胶配方试剂均为分析纯试剂，采用将23％(wt/vol)的普朗尼克凝胶(pluronic F-127)和10mM Tris-MES缓冲液(三羟甲基氨基甲烷和吗啉乙磺酸)在4℃低温下充分搅拌过夜，在混合均匀的凝胶分装后储存在4℃冷藏条件下备用。以上各生物制剂公司均有售。

步骤(4)中温湿度条件可以根据不同的研究目的自由选择。

步骤(4)中调查线虫数量时，当线虫虫体处于网格线4交叉线上时，虫体大小在网格线4内大于等于一半时，即为1条线虫；当小于一半时，忽略不计。

步骤(6)中，统计分析软件为SPSS、DPS等软件。

实施例2

同实施例1所述一种昆虫病原线虫5募集能力检测装置，不同之处在于，

载玻板1的直径为3cm，可研究线虫对韭蛆等小型寄主昆虫10的募集能力。

实施例3

同实施例1所述一种昆虫病原线虫5募集能力检测装置，不同之处在于，

载玻板1的直径为6cm，可研究线虫对桃小食心虫等中型寄主昆虫10的募集能力。

实施例4

同实施例1所述一种昆虫病原线虫5募集能力检测装置，不同之处在于，

载玻板1的直径为12cm，可研究线虫对小地老虎等大型寄主昆虫10的募集能力。

室内试验验证

实施例5

利用实施例1中昆虫病原线虫5募集能力检测装置对昆虫病原线虫5募集能力进行检测的方法，方法如下：

(1)以小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae All(All)为例，选择载玻板1直径为3cm，线虫检测区3大小2mm的网格线4的募集装置。利用此检测装置研究此线虫对韭蛆龄幼虫的募集能力。

(2)配置普朗尼克凝胶，采用将23％(wt/vol)的普朗尼克凝胶(pluronic F-127)和10mM Tris-MES缓冲液(三羟甲基氨基甲烷和吗啉乙磺酸)在4℃低温下充分搅拌过夜备用。

(3)在寄主固定瓶6内放入1头韭蛆3龄幼虫，并盖住寄主固定瓶6的瓶盖7；

(2)在烧杯内将100μL的小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae All(All)悬浮液(大约400条左右)与一定量的普朗尼克凝胶轻微搅拌，直至混合均匀。

(3)将配好的普朗尼克凝胶和昆虫病原线虫5混合液加入圆形载波板内，其厚度以超过寄主固定瓶6的高度而不溢出为止。

(4)然后将装置置于温度22±1℃、相对湿度60％±10％的培养箱内，光周期为24h全暗，处理12h后，在体式显微镜下观察线虫检测区3内寄主昆虫10周边方格内的昆虫病原线虫5的数量。

(5)通过计算昆虫病原线虫5运动到韭蛆周边方格内的吸引率的大小评价其募集能力。吸引率＝(2mm范围内线虫数量/培养皿内的总线虫数量)×100％。

(6)利用统计分析软件SPSS，分析小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae All对韭蛆的吸引率。

实施例6

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法，以韭蛆龄幼虫为试验对象。不同之处在于，采用线虫品系不同，选用芫菁夜蛾斯氏线虫Steinernema feltiae SF-SN(SF-SN)为例。

实施例7

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法，以韭蛆龄幼虫为试验对象。不同之处在于，采用线虫品系不同，选用嗜菌异小杆线虫Heterorhabditisbacteriophora H06(H06)为例。

对比例1

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法，以韭蛆龄幼虫为试验对象。不同之处在于，选用载玻板1直径为3cm，但在线虫检测区3不设计网格线4，采用常规显微镜内标注刻度进行2mm内线虫的计数。以小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae All(All)为例。

对比例2

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法，以韭蛆龄幼虫为试验对象。不同之处在于，选用载玻板1直径为3cm，但在线虫检测区3不设计网格线4，采用常规显微镜内标注刻度进行2mm内线虫的计数。选用芫菁夜蛾斯氏线虫Steinernema feltiae SF-SN(SF-SN)为例。

对比例3

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法，以韭蛆龄幼虫为试验对象。不同之处在于，选用载玻板1直径为3cm，但在线虫检测区3不设计网格线4，采用常规显微镜内标注刻度进行2mm内线虫的计数。选用嗜菌异小杆线虫Heterorhabditisbacteriophora H06(H06)为例。

实施例8

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法。不同之处在于，选择载玻板1直径为6cm，线虫检测区3大小2mm的网格线4。利用此检测装置研究此线虫对桃小食心虫老熟幼虫的募集能力。线虫选用Steinernema carpocapsae All(All)为例。

实施例9

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法。不同之处在于，选择载玻板1直径为6cm。利用此检测装置研究此线虫对桃小食心虫老熟幼虫的募集能力。线虫选用芫菁夜蛾斯氏线虫Steinernema feltiae SF-SN(SF-SN)为例。

实施例10

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法。不同之处在于，选择载玻板1直径为6cm。利用此检测装置研究此线虫对桃小食心虫老熟幼虫的募集能力。线虫选用嗜菌异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora H06(H06)为例。

对比例4

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法，以桃小食心虫老熟幼虫为试验对象。不同之处在于，选用载玻板1直径为6cm，但在线虫检测区3不设计网格线4，采用常规显微镜内标注刻度进行2mm内线虫的计数。以小卷蛾斯氏线虫Steinernemacarpocapsae All(All)为例。

对比例2

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法，以桃小食心虫老熟幼虫为试验对象。不同之处在于，选用载玻板1直径为6cm，但在线虫检测区3不设计网格线4，采用常规显微镜内标注刻度进行2mm内线虫的计数。选用芫菁夜蛾斯氏线虫Steinernemafeltiae SF-SN(SF-SN)为例。

对比例3

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法，以桃小食心虫老熟幼虫为试验对象。不同之处在于，选用载玻板1直径为6cm，但在线虫检测区3不设计网格线4，采用常规显微镜内标注刻度进行2mm内线虫的计数。选用嗜菌异小杆线虫Heterorhabditisbacteriophora H06(H06)为例。

试验例

此试验共设12个处理，分别使用本发明装置检测(实施例5组、实施例6组、实施例7组、实施例8组、实施例9组、实施例10组)和采用常规显微镜内标注刻度计数(对比例1组、对比例2组、对比例3组，对比例4组、对比例5组、对比例6组)。步骤分别采用实施例5组、实施例6组、实施例7组、实施例8组、实施例9组、实施例10组和对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、对比例5组、对比例6组所述的方法，每个处理重复4次，记录每个重复镜检时所花费时间，记录可用于统计分析的线虫数量，并计算其募集能力，比较本发明装置与常规计数的差异，计算相对误差。具体条件步骤及结果见表1。

1处理方法及实验结果对比

注：本表中的方差分析采用SPSS软件，采用独立t检验(t检验，P＜0.05)，比较本发明装置与常规计数方法中同一线虫对同一寄主昆虫10的差异性。

由表1可以看出，通过方差分析，采用本发明装置检测(实施例5组、实施例6组、实施例7组、实施例8组、实施例9组、实施例10组)和采用常规显微镜内标注刻度计数检测(对比例1组、对比例2组、对比例3组，对比例4组、对比例5组、对比例6组)的募集能力差异不显著，表明此发明专利装置及其使用方法具备研究线虫募集能力研究的技术要求。采用本发明专利及其方法花费时间显著低于采用常规检测，其花费时间缩短了2.75～3.39倍，且采用本发明装置与采用常规检测的相对误差为0.68～2.31％，在有效缩短时间的同时，达到更准确的募集能力评估。总之，采用本发明装置及其方法能够满足线虫募集能力的研究，且具有显著降低试验时间，降低试验误差的水平。

以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。