用于提高小RNA提取效率的组合物及方法

技术领域

本发明涉及一种用于提高小RNA(small RNA)提取效率的试剂、并涉及使用该试剂分离RNA的方法。

背景技术

微小RNA(也称微小RNA，即microRNA，下面有时称“miRNA”)是一种长度约为21～25个碱基的小的单链非编码RNA，迄今为止已鉴定出20000多个miRNA(http://mirbase.org/)。已经证实这些miRNA具有通过结合靶mRNA控制mRNA表达的功能，并且它们参与细胞增殖、分化以及凋亡等各种生物学过程。据估计约30％的人类基因表达是通过miRNA调节的。近年来，有人提出miRNA的异常表达会影响包括癌症在内的各种疾病的发生和病理状况(非专利文献1和2)。miRNA存在于细胞分泌的外泌体以及存在于血液和尿液等体液中，因此，通过检测和定量体液中的miRNA来诊断疾病的微创液体活检已引起关注。

作为简单，快速的定量miRNA的方法通常采用实时定量RT-PCR。实时RT-PCR因其可以在短短数小时内获得结果且可以通过简单的设备来实现而成为一种适合临床诊断的方法。在此，为了能够通过实时RT-PCR来检测和定量miRNA，需要高精度和高产率地分离miRNA。作为分离总RNA的方法，通常使用原理为在离液盐存在下将核酸分子吸附在二氧化硅载体上的Boom法(非专利文献3)。然而，在Boom法的通常条件下，只能以低效率提取像miRNA这样的低分子量RNA，所以存在无法获得足够量的用于实时RT-PCR分析的miRNA的问题，因而，需要在如传统方法一样容易提取的同时还能高产率地提取包含miRNA的总RNA的方法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Ochiya,T.,Drug Delivery System,Vol.26,No.1,pp.10-14(2011)

非专利文献2：Rupaimoole，R.et al，Nat.Rev.Drug Discov.，Vol.16，No.3，pp.203-222(2016)

非专利文献3：Boom，R.et al.，J.Clin.Microbiol.，Vol.28，No.3，pp.495-503(1990)

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的目的是解决现有技术的问题，并提供一种能够通过安全且简单的操作以高产率和高精度从生物样品中提取miRNA的方法。

解决问题的技术方案

本发明人等反复进行了深入研究的结果发现：通过向包含离液盐的核酸提取物中加入高分子量聚乙二醇可以显著提高Boom法的miRNA提取效率。然而，高分子量聚乙二醇在室温下是固体，并且即使被加热和熔化后也非常粘，因此很难用移液管处理(称重)。

因此，本发明人等认真研究一种既能达到保持高分子聚乙二醇的高效率提取miRNA的效果还具有优异的可操作性的组合物。结果本发明人发现了聚乙二醇和四甘醇二甲醚的混合物具有优异的可操作性和稳定性，并且可以达到与高分子量聚乙二醇同样的高提取miRNA效率。

具体地，基于一实施方式，本发明提供了一种用于提高小RNA提取效率的试剂，其包含以下成分：(a)聚乙二醇，以及(b)四甘醇二甲醚。

优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为600～2000。

优选地，所述成分(a)和所述成分(b)的比例为3:7～6:4。

基于所述用于提高小RNA提取效率的试剂，所述成分(a)的含量优选为20～60体积％，并且所述成分(b)的含量优选为25～70体积％。

优选地，所述用于提高小RNA提取效率的试剂还包含离液盐。

所述离液盐优选为硫氰酸胍。

优选地，所述用于提高小RNA提取效率的试剂在15℃～35℃的温度范围是液体，并且具有能够通过微量移液管进行计量的粘度。

基于一实施方式，本发明还提供了一种从样品中提取小RNA的方法，其包括：(i)提供包含小RNA的样品的步骤；(ii)将包含离液盐的溶液添加至所述样品中的步骤；(iii)将所述用于提高小RNA提取效率的试剂添加至所述步骤(ii)中获得的第一混合液的步骤；(iv)使所述步骤(iii)中获得的第二混合液与包含二氧化硅的核酸结合载体接触的步骤，由此使小RNA结合于核酸结合载体；以及(v)将与所述核酸结合载体结合的所述小RNA洗脱的步骤。

基于一实施方式，本发明还提供了一种用于分析来自生物样品的微小RNA的方法，其包括：(i)制备包含微小RNA的生物样品的步骤；(ii)将包含离液盐的溶液添加至所述生物样品中的步骤；(iii)将所述用于提高小RNA提取效率的试剂添加至所述步骤(ii)中获得的第一混合液的步骤；(iv)使所述步骤(iii)中获得的第二混合液与包含二氧化硅的核酸结合载体接触的步骤，由此使包含微小RNA的总RNA结合于核酸结合载体；(v)将与所述核酸结合载体结合的所述总RNA洗脱的步骤；以及(vi)通过定量RT-PCR扩增所述步骤(v)中获得的总RNA中的微小RNA的步骤。

所述生物样品优选为体液或组织切片。

优选地，所述第二混合液中的用于提高小RNA提取效率的试剂的浓度为20～60体积％。

发明的有益效果

本发明涉及的用于提高小RNA提取效率的试剂具有优异的可操作性和稳定性，并且可以通过在已经建立的Boom法中将其添加到包含离液盐的核酸提取物中来提高包含miRNA的总RNA的提取效率。因此，通过简单地将本发明的用于提高小RNA提取效率的试剂应用于市售的标准RNA提取试剂盒，就能够通过与常规方法同样安全和简单的操作来高产率和高精度地提取miRNA。

此外，基于本发明的方法，能够提高miRNA的产量，从而使高精度地进行低表达miRNA的定量分析成为可能。

具体实施方式

下面详述本发明。然而，本发明不局限于本说明书中描述的实施例。

基于第一实施方式，本发明涉及一种用于提高小RNA提取效率的试剂，其包含以下成分：(a)聚乙二醇，以及(b)四甘醇二甲醚。

“小RNA”是指在生物体中产生的长度约为10个核苷酸以上且小于200个核苷酸的RNA。例如包括但不限于tRNA、rRNA、snRNA(小核RNA)、以及miRNA(微小RNA)。根据本实施方式优选的小RNA是miRNA。

作为本实施方式的成分(a)聚乙二醇(下面也称为“PEG”)可以使用任意的平均分子量，例如，可以举出：PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG1540、PEG2000、PEG3000、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000等。另外，本实施方式可以单独使用选自其中的一种PEG，或者可以组合使用其中两种以上。本实施方式的PEG优选为PEG的平均分子量为600～2000、更优选为PEG的平均分子量为1000～2000、并且进一步优选为PEG1000、PEG1540或PEG2000。

在本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂中，成分(a)PEG和成分(b)四甘醇二甲醚可以按任意比例混合，例如以1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2或9:1的比例混合，优选成分(a)与成分(b)以3:7～6:4的比例混合，并且更优选以3:7～5:5的比例混合。

只要本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂是以上述比例包含上述成分(a)和(b)，则可以在不损害本实施方式的效果的范围内适当地添加成分(a)和成分(b)以外的成分。具体而言，当本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂总体积为100％时，提高小RNA提取效率的试剂中的成分(a)PEG的含量优选为20～60％(v/v)、更优选为45～55％(v/v)。另外，当本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂的总体积为100％时，提高小RNA提取效率的试剂中的成分(b)四甘醇二甲醚的含量优选为25～70％(v/v)、更优选为40～60％(v/v)。

在本实施方式中，优选提高小RNA提取效率的试剂还包含离液盐作为成分(a)和(b)以外的成分。从而能够在室温下长时间稳定地保存提高小RNA提取效率的试剂。本实施方式的离液盐的实例包括但不限于硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、碘化钾以及尿素。在本实施方式中，这些离液盐可以单独使用或者组合两种以上使用。优选地，本实施方式的离液盐是硫氰酸胍。添加至提高小RNA提取效率的试剂中的离液盐的浓度可以在例如20～30％(W/V)的范围内适当选择。

为了进一步提高小RNA提取的效果和/或稳定性，可以将本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂与其他成分适当地配合，作为所述其他成分，可以举出1-(2-氨乙基)哌嗪和二亚乙基三胺，并且这些可以单独使用或者组合两种以上使用。添加至提高小RNA提取效率的试剂中的所述其他成分的浓度可以在例如0.01～5％(v/v)的范围适当地选择。

对于本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂的制造方法没有特别限定，可以通过混合上述成分来制造。

本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂粘度低且在室温下稳定，能够容易且准确地进行称量。具体而言，本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂优选在15℃～35℃的温度范围是液体，并且具有能够通过微量移液管进行计量的粘度。本实施方式的“粘度”例如可以采用旋转粘度计来测定。本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂的粘度优选为30mPa·s以下、并且更优选为20mPa·s以下。

本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂能够与基于Boom法的市售RNA提取试剂盒组合使用，通过与常规方法同样安全和简单的操作来高产率和高精度地提取小RNA。

具体而言，基于第二实施方式，本发明还涉及一种从样品中提取小RNA的方法，其包括：(i)提供包含小RNA的样品的步骤；(ii)将包含离液盐的溶液添加至所述样品中的步骤；(iii)将所述用于提高小RNA提取效率的试剂添加至所述步骤(ii)中获得的第一混合液的步骤；(iv)使所述步骤(iii)中获得的第二混合液与包含二氧化硅的核酸结合载体接触的步骤，由此使小RNA结合于所述核酸结合载体的步骤；以及(v)将与所述核酸结合载体结合的所述小RNA洗脱的步骤。

在本实施方式的方法中，提供并使用包含小RNA的样品。本实施方式的“小RNA”与第一实施方式中的定义相同。本实施方式的“样品”可以是包含小RNA的任意样品，并且可以是例如包含小RNA的溶液、细胞裂解液等。细胞裂解液可以由任意细胞制备，例如可以由真核细胞、原核细胞、病毒等制备。另外，本实施方式的样品也可以是第三实施方式中详述的生物样品。

随后，将包含离液盐的溶液添加至包含小RNA的样品中以获得第一混合液。本实施方式的“离液盐”与第一实施方式中的定义相同。本实施方式的离液盐的浓度应依照Boom法的一般条件，例如在添加了提高小RNA提取效率的试剂后的第二混合液中离液盐的浓度在0.1～10M的范围、优选在2.5～5M的范围。

本实施方式的包含离液盐的溶液除了离液盐以外还可以包含还原剂、表面活性剂和/或缓冲液。作为还原剂，例如可以举出2-巯基乙醇或二硫苏糖醇等，优选浓度为25～150mM。表面活性剂可以是离子型或非离子型，例如可以举出：SDS、CHAPS、Tween(注册商标)20、Triton X-100(注册商标)、NP-40(注册商标)等，优选浓度为0.1～10％(w/v)。缓冲液应该使溶液pH稳定在6.0～9.0的范围，例如可以举出Tris、HEPES、PIPES、MOPS等，优选浓度为1～10mM。

上述这样的包含离液盐的溶液可以作为与下述核酸结合载体组合而成的试剂盒通过商业途径来获得，在本实施方式中也可以使用这样的商品。优选的商品的实例可以举出：High Pure miRNA Isolation Kit(Roche Diagnostics)、MagNA Pure Compact RNAIsolation Kit(Roche Diagnostics)、RNeasy Mini Kit(Qiagen)、miRNeasy Mini Kit(Qiagen)、PureLink RNA Mini Kit(Thermo Fisher Scientific)、PureLink miRNAIsolation Kit(Thermo Fisher Scientific)、FastGene RNA Premium Kit(NipponGenetics)、Nucleo Spin miRNA(MACHEREY-NAGEL)、and mirVana miRNA Isolation Kit(Thermo Fisher Scientific)。

随后，将提高小RNA提取效率的试剂添加至上述所获得的第一混合液中以获得第二混合液。本实施方式的“用于提高小RNA提取效率的试剂”与第一实施方式中的定义相同。在添加用于提高小RNA提取效率的试剂后的第二混合液中，例如，优选本实施方式的用于提高小RNA提取效率的试剂浓度为20～60％(v/v)、更优选浓度为25～50％(v/v)。

在本实施方式的方法中，包含离液盐的溶液和提高小RNA提取效率的试剂可以互换添加顺序，也可以同时添加。具体而言，可以首先通过将提高小RNA提取效率的试剂添加至包含小RNA的样品中而获得的混合液、然后将包含离液盐的溶液添加至所获得的混合液中；或者，也可以将包含离液盐的溶液与提高小RNA提取效率的试剂同时添加到包含小RNA的样品中。

随后，使上述所获得的第二混合液与包含二氧化硅的核酸结合载体接触以使样品中的RNA结合于核酸结合载体。作为本实施方式的核酸结合载体，可以使用在Boom法中通常使用的二氧化硅系载体，例如可以举出：硅珠、玻璃珠、石英棉、玻璃纤维等。并且，硅珠可以是仅由二氧化硅构成，也可以仅由以二氧化硅涂覆磁珠而成的磁性硅珠构成。这样的核酸结合载体可以作为与上述含有离液盐的溶液组合而成的试剂盒通过商业途径来获得，在本实施方式中也可以使用这样的商品。

混合液与核酸结合载体的接触，例如可以通过将核酸结合载体和混合液在容器中混合、或者使混合液通过填充有核酸结合载体的柱子等方式来进行。然后，从混合液中分离并回收核酸结合载体。

在进行后述的RNA洗脱之前，回收的核酸结合载体可任选地用不溶解RNA但可溶解非特异性结合产物的洗涤液进行洗涤(例如包含70％(v/v)以上的乙醇的水溶液等)。

随后，针对与核酸结合载体结合的RNA进行洗脱。例如，可以通过使无核酸酶的水或低盐度的缓冲液等的洗脱溶液与包含二氧化硅的核酸结合载体接触来洗脱RNA。洗脱液与核酸结合载体之间的接触，可以按照与上述混合液与核酸结合载体之间的上述接触同样的方式进行。然后，去除核酸结合载体并回收洗脱液。

基于Boom法的自动核酸提取装置可通过商业途径获得，并且可以使用这种通过商业途径获得的装置及其提供的试剂盒来进行本实施方式的方法的上述一系列操作。可以在本实施方式的方法中使用的自动核酸提取装置及其提供的试剂盒的实例，可以举出：MagNAPure 96Instrument and MagNA Pure 96Cellular RNA Large Volume Kit(RocheDiagnostics)、Maxwell RSC Instrument and Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit(Promega)、Kingfisher Instrument and MagMAXmirVana Total RNA(Thermo FisherScientific)、以及QIAcube and RNeasy Mini QIAcube Kit(Qiagen)。

在本实施方式的方法中，除了使用提高小RNA提取效率的试剂以外，使用与已知的Boom法中相同的溶液和核酸结合载体。核酸结合与洗脱条件可以与众所周知的Boom法中的条件相似，因此，根据本实施方式的方法，可以按照与常规方法同样安全和简单的操作来高产率和高精度地提取小RNA，无需新的检测条件。

另外，在本实施方式的方法应用于生物体样品的情况下，可以容易地提取低表达水平的miRNA而又不会影响定量准确性，这是以往公知的Boom法难以实现的。因此，本实施方式的从生物样品中分离RNA的方法可用于miRNA的定量分析。

具体而言，基于第三实施方式，本发明涉及一种用于分析生物样品中微小RNA的方法，其包括：(i)制备包含微小RNA的生物样品的步骤；(ii)将包含离液盐的溶液添加至所述生物样品中的步骤；(iii)将上述提高小RNA提取效率的试剂添加至在所述步骤(ii)中获得的第一混合液的步骤；(iv)使所述步骤(iii)中获得的第二混合液与包含二氧化硅的核酸结合载体接触的步骤，由此使包含微小RNA的总RNA结合于所述核酸结合载体；(v)将与所述核酸结合载体结合的所述总RNA洗脱的步骤；以及(vi)通过定量RT-PCR扩增所述步骤(v)中获得的总RNA中的微小RNA的步骤。

在本实施方式的方法中，通过与第二实施方式相同的步骤，从生物样品中纯化包括微小RNA的总RNA，本实施方式的“离液盐”、“提高小RNA提取效率的试剂”以及“核酸结合载体”与第二实施方式中的定义相同。

“微小RNA(microRNA，也记作miRNA)”是生物体中存在的长度为21至25个碱基的单链非编码RNA。miRNA是通过以下多个步骤产生的：首先，从miRNA基因转录为初级转录物pri-miRNA(primary miRNA，初级miRNA)；然后pri-miRNA在细胞核中被Drosha剪切生成pre-miRNA(miRNA precursor，miRNA前体)；然后，pre-miRNA在细胞质中被Dicer剪切成为成熟的双链miRNA，其中的一条RNA链被分解并去除以生成单链miRNA。本实施方式的miRNA是指该最终的miRNA产物，并且不包括中间产物。

本实施方式的方法所用的“生物样品”可以是从任意生物体中分离出的任意样品，例如，可以是从小鼠、大鼠、兔子、狗、非人灵长类动物或人类等动物个体中分离出的组织切片、细胞、体液等，但并不局限于此。作为获取组织切片或细胞的组织实例，可以举出：来自脑、心肌、骨骼肌、肺、气管、咽、唾液腺、食道、胃、小肠、大肠、胰腺、肝、胆囊、血管、肾脏、膀胱、输尿管、睾丸、前列腺、卵巢、子宫、骨髓、淋巴结、脾脏、胸腺、垂体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、骨骼肌、腹腔、皮肤和乳腺的组织等。体液可以举出：血液、血浆、血清、唾液、尿液、胃液、胰液、胆汁、汗液、眼泪、母乳、鼻分泌物和肠液等。本实施方式的生物样品优选为体液或组织切片，并且特别优选为人源性体液或组织切片。

本实施方式的生物样品可以通过本领域技术人员公知的方法从动物个体中获得。另外，在使用组织切片作为生物样品的情况下，组织切片可以是针对从动物个体急性分离出的组织进行制备得到的，或者可以是针对福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)进行制备得到的。

接下来，通过定量RT-PCR(以下称为“RT-qPCR”)扩增所得到的总RNA中的miRNA。通过RT-qPCR扩增miRNA的方法已经建立，可以采用本领域公知的方法。例如，可以通过使用对miRNA特异性引物进行逆转录反应并以所得到的cDNA作为模板而使用对靶miRNA特异性引物进行实时qPCR来扩增靶miRNA。另外，用于定量分析的方法也很完善，并且可以通过例如ΔΔCt法、校准曲线法等，基于由实时qPCR结果计算得出的Cp值(也称为Ct值)来定量靶miRNA。

通过RT-qPCR扩增miRNA的试剂盒可通过商业途径获得，并且这种商品可用于本实施方式中。优选的商品的实例可以举出：miRCURY LNA miRNA PCR Assays(Qiagen公司)、MystiCp micro RNA Quantitative PCR(Sigma-Aldrich公司)、Mir-X miRNA qRT-PCR TBGreen Kit(Takara Bio公司)、TaqMan MicroRNA Assays以及TaqMan Advanced miRNAAssays(Thermo Fisher Scientific公司)。

本实施方式的方法通过用于提高小RNA提取效率的试剂的应用，即使针对表达量低的miRNA也能够不损失定量精度地进行提取，并且可以高精度地定量miRNA，因此是有用的。

下面，参考实施例进一步描述本发明，然而这些实施例并不对本发明构成任何限制。

1.探究用于提高miRNA提取效率的化合物

按照以下步骤制备包含miRNA的标准样品：使用包含10ng/μL鲑鱼精DNA的TE缓冲液(pH8.0)来制备化学合成的miR-21(5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3':SEQ ID NO：1)(北海道系统科学(Hokkaido System Science)株式会社)溶液(100nM)。将从K562细胞提取的总RNA(100ng)(来自JCRB Cell Bank，日本国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所(National Institutes of Biomedical Innovation，Health and Nutrition))添加至所获得的miR-21溶液(2.5μL)中，然后用蒸馏水制备150μL含有该混合液的溶液作为标准样品。

通过使用High Pure miRNA Isolation Kit(Roche Diagnostics公司)并根据试剂盒附带的说明书中描述的“一步法(1-Column Protocol)”，从标准样品中提取miRNA。在此，在添加试剂盒随附的结合增强剂(以下称为“BE”)的步骤中，添加以下候选化合物替代BE(200μL)：乙醇(Wako Pure Chemical)、2-丙醇(Kanto Chemical)、PEG600(KantoChemical)、PEG1000(Kanto Chemical)、PEG1540(Kanto Chemical)、PEG2000(KantoChemical)或四甘醇二甲醚(下面称为“TEGDME”)(Tokyo Chemical Industry)(均为200μL)。用100μL洗脱缓冲液进行RNA洗脱。

接下来，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(RocheDiagnostics)合成cDNA。作为引物使用茎环RT引物(5'-GTCAGAGGAGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCTCCTCTG ACTCAACA-3'：SEQ ID NO：2)。反应液的组成按照试剂盒附带的使用说明书的说明(1/2标度[1/2scale])，使用Applied Biosystems(注册商标)2720热循环仪按照下述条件进行逆转录反应。

反应条件：

-步骤1(1个循环)：16℃反应30分钟

-步骤2～4(60个循环)：30℃反应30秒，42℃反应30秒，50℃反应1秒

-步骤5(1个循环)：85℃反应5分钟

将获得的反应液用TE缓冲液稀释5倍以制备cDNA溶液。随后，按照下述条件对miR-21进行实时PCR。使用LightCycler(注册商标)96System(Roche Diagnostics公司)进行反应和分析。重复5次，并计算Cp值(平均值±SD)。

反应溶液组合物(10μL)：

-cDNA溶液：2.5μL

-2×FastStart Essential DNA Probes Master(Roche Diagnostics公司)：5μL

-10μM正向引物(5'-GCCTGCTAGCTTATCAGACTGATG-3'：SEQ ID NO：3)：0.2μL

-10μM反向引物(5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'：SEQ ID NO：4)：0.2μL

-10μM通用探针库探针#82(Roche Diagnostics)：0.2μL

-蒸馏水：余量

反应条件：

-步骤1(1个循环)：95℃反应10分钟

-步骤2～3(45个循环)：95℃反应10秒，60℃反应30秒

将结果示于表1中，当使用PEG1000、PEG1540或PEG2000替代BE时，与使用BE相比Cp值显著降低。另一方面，当使用PEG600或TEGDME时，与使用BE时几乎相同；当使用乙醇或2-丙醇时，与使用BE时相比Cp值显著增加。该结果表明，高分子量PEG可以显著提高miRNA的提取效率。

表1.miR-21的Cp值(标准样品)

2.用于提高miRNA提取效率的组合物的研究(1)

高分子量PEG可以显著提高miRNA的提取效率，但是它们在室温下为固体而且即使加热使其熔化也非常粘稠，所以难以用移液管准确计量。因此，研究了通过混合高分子量PEG和TEGDME是否可以解决上述问题。制备以各种比例混合PEG1540和TEGDME的组合物，并在60℃下培养。然后在50℃的恒温箱中使用粘度计(VISCO-895，ATAGO)测定粘度。重复5次，并且将平均值±SD用作测量值。此外，通过与上述1相同的步骤来计算添加每种组合物时的Cp值(添加量：200μL或300μL，重复2次)。

将结果示于表2。将PEG1540与TEGDME混合可以显著降低粘度，并且与使用BE相比所获得的Cp值显著低。该结果表明：PEG1540：TEGDME＝3:7～6:4的组合物可以显著提高miRNA的产率，并且具有极好的可操作性。

表2.PEG1540/TEGDME混合物的粘度和Cp值

此外，使用PEG600、PEG1000或PEG2000替代PEG1540制备PEG/TEGDME混合物(混合比为1:1)，以与上述相同的方式测定粘度并计算Cp值(添加量：200μL或300μL，重复5次)。

将结果示于表3中。已确认到任一种高分子量PEG/TEGDME混合物均具有可用移液管准确计量的粘度(约为30mPa·s以下)，特别是添加量设为300μL可以显著提高miRNA的产量(收率)。此外，使用高分子量PEG:TEGDME＝3:7～6:4的范围的任一种高分子量PEG的混合物均可获得相近水平的低Cp值(数据未显示)。

表3.高分子量PEG/TEGDME的粘度和Cp值

3.用于提高miRNA提取效率的组合物的研究(2)

PEG1000/TEGDME(混合比1:1)、PEG1540/TEGDME(混合比1:1)以及PEG2000/TEGDME(混合比1:1)在制备后约1小时凝固。因此在使用时需要通过加热来重熔(再熔化)，但是当通过凝固并重熔多达10次后测量Cp值时，几乎没有观察到变化(数据未显示)。因此，确认到所有高分子量PEG/TEGDME均具有足够的稳定性，但进而针对室温下不凝固且具有高miRNA提取效率的组合物进行了研究。

基于PEG1540/TEGDME(混合比1:1)(组合物1)，制备了组合物2～6，其中包含其他组分：硫氰酸胍(下面称为“GuSCN”)(和光纯药，Wako Pure Chemical)、乙醇(Wako PureChemical)、1-(2-氨乙基)哌嗪(下面称为“哌嗪”)(Sigma-Aldrich公司)和/或二亚乙基三胺(下面称为“DETA”)(Sigma-Aldrich公司)。

表4.基于PEG1540/TEGDME的组合物的制备

通过与上述1同样的步骤(添加量：200μL或300μL，重复5次)计算出添加上述组合物时的Cp值。

另外，目视观察制备后在25℃下放置1小时的上述组合物(1mL)，以确认是否凝固。

标准：

无凝集(无凝固)：-

有一些凝集(部分凝固)：±

凝集(完全凝固)：+

将结果示于表5，添加了GuSCN的组合物在室温下未凝固，在室温下放置了1周以上的组合物也得到了相同的结果(数据未显示)。另外，通过添加乙醇、哌嗪和/或DETA与GuSCN的组合物可获得较低的Cp值。该结果表明添加GuSCN、乙醇、哌嗪和/或DETA可以进一步提升高分子量PEG/TEGDME混合物的RNA提取效率和稳定性。

表5.基于PEG1540/TEGDME的组合物的Cp值和凝固

4.使用高分子量PEG/TEGDME混合物从FFPET样品中提取RNA

通过使用癌症患者的FFPET样品替代标准样品来测试了高分子量PEG/TEGDME混合物可在多大程度上提高从生物样品中提取miRNA的效率。

将由取自结肠癌患者的大肠制备的FFPET切片(厚度：5μm)从载玻片回收到微型管中。添加800μL的二甲苯，并将混合物在室温下培养5分钟。然后，添加400μL乙醇混合，并以13000rpm离心2分钟以去除上清液。加入1000μL乙醇再次混合，并以13000rpm离心2分钟以去除上清液。然后，添加高纯度miRNA分离试剂盒(High Pure miRNA Isolation Kit，RocheDiagnostics公司)附带的180μL的石蜡组织裂解缓冲液(Paraffin Tissue Lysis Buffer)和70μL的蛋白酶K溶液，并将混合物在56℃下培养30分钟，然后在90℃下培养30分钟。

除了使用获得的组织裂解液(150μL)替代标准样品以外，通过与上述1相同的步骤，添加高分子量PEG/TEGDME混合物以提取miRNA，并对miR-21进行RT-qPCR，计算Cp值(添加量：200μL或300μL，重复5次)。

将结果示于表6。与使用BE相比，使用任一种高分子量PEG/TEGDME混合物均可显著降低Cp值。该结果表明，高分子量PEG/TEGDME混合物可以显著提高从FFPET样品中提取miRNA的效率。

表6.从FFPET样品提取的RNA中包含的miR-21的Cp值

该结果表明，包含高分子量PEG和TEGDME的组合物可以显著提高miRNA的提取效率，并且能够更精确地定量miRNA。

5.使用高分子量PEG/TEGDME混合物从体液样品中提取RNA

通过使用健康受试者的血清样品替代标准样品来测试了高分子量PEG/TEGDME混合物可在多大程度上提高从体液样品中提取miRNA的效率。

从5名健康受试者采集全血样品，并以3000rpm离心10分钟，回收血清。将获得的血清样品立即冷冻并保存在-80℃下。向1mL血清中添加100μL的配制成20mg/mL的蛋白酶K(重组、PCR级)(Proteinase K,recombinant,PCR Grade,Roche Diagnostics公司)，并将混合物在72℃下培养10分钟。然后，将混合物以13000rpm离心5分钟并回收上清液。

除了使用所得到的上清液(150μL)替代标准样品以外，按照与上述1相同的步骤，通过添加PEG1540/TEGDME混合物(混合比1:1)提取miRNA，对miR-21进行RT-qPCR并计算Cp值(添加量：200μL或300μL，重复5次)。

将结果示于表7。通常认为Cp值为35左右是RT-qPCR中的定量极限，当Cp值超过35时，Cp值的偏差变大，被认为定量精度不可靠。在此，当使用BE时，Cp值显著超过35并且标准偏差也超过1，仅得到定量上不可靠的结果。相反，当使用PEG1540/TEGDME混合物时，特别是当添加量为300μL时，Cp值大大降低，并且可以获得具有足够小的标准偏差的可靠的定量分析结果。

miR-21是一种肿瘤标志物，已知来自健康受试者的体液样品中的含量极少，如上所述，证明即使对于表达水平如此低的miRNA，使用高分子量PEG/TEGDME混合物可以显著提高miRNA的提取效率，并可以通过RT-qPCR进行可靠的定量分析。

表7.从血清样品中提取的RNA中包含的miR-21的Cp值

序列表

<110> 社会医疗法人大雄会（Daiyukai Health System）

<120> 用于提高小RNA提取效率的组合物及方法

<130> 3057-PCT

<150> JP 2018-129064

<151> 2018-07-06

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 茎环RT引物（Stem-loop RT primer）

<400> 2

gtcagaggag gtgcagggtc cgaggtattc gcacctcctc tgactcaaca 50

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物（Forward primer）

<400> 3

gcctgctagc ttatcagact gatg 24

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物（Reverse primer）

<400> 4

gtgcagggtc cgaggt 16