用于酶促油脱胶的方法

技术领域

本发明涉及一种使用具有磷脂酶A1活性的酶减少三酰基甘油酯油中磷脂的量的方法。

背景技术

从压榨或溶剂萃取方法获得的粗制植物油是三酰基甘油、磷脂、甾醇、生育酚、游离脂肪酸、痕量金属和其他微量化合物的复杂混合物。在大豆油加工中，可以先将大豆籽粒切薄片，然后再进行己烷萃取，以获得片状油(flake oil)。在另一个通常已知的方法中，籽粒首先用膨胀剂处理然后再进行萃取，从而产生膨胀剂油。后者往往导致较高的油产率，但也导致较高的磷脂含量。在其他油(例如芥花油(canola oil)或菜籽油)的制备期间，首先将籽粒压榨，从而导致经压榨的油级分。压滤饼可以用溶剂进一步处理以产生经萃取的油级分，并且将合并的两种级分称为芥花(canola)、油菜籽或向日葵的原油。

为了产生高质量的食用油，希望去除磷脂、游离脂肪酸和痕量金属。工业上最常用的方法是水或湿法脱胶、酸脱胶、苛性碱法精制和酶促脱胶或精制。通常，磷脂的去除产生了与植物油脱胶相关的损失中的大部分损失。由于大多数磷脂分子具有亲水性官能团和由具有两个脂肪酸链的甘油组成的亲脂性片段两者，因此所述磷脂分子倾向于是极好的天然乳化剂。因此，希望将磷脂水解成它们的溶血形式或磷(甘油磷酸盐)形式，以便降低乳化特性。植物油中的主要磷脂是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)。

已知有多种用于使用具有磷脂酶活性的酶(例如磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C)或磷脂酰肌醇磷脂酶C活性来对植物油进行酶促脱胶或酶促精制的方法。

WO9705219公开了一种使用来自黑曲霉(Aspergillus niger)的磷脂酶混合物降低植物油中含磷组分的含量的方法，该混合物包含磷脂酶A2和/或磷脂酶A1活性和溶血磷脂酶活性。

EP0575133教导了来自米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉菌株的磷脂酶A1(PLA1)酶，以及这些磷脂酶用于从例如源自动物、植物和微生物的磷脂底物制备溶血磷脂的用途。EP0575133公开了来自黑曲霉的PLA1在70℃下进行温度处理后的残余活性仅是在50℃和60℃下进行温度处理后的残余活性的约百分之三十(30％)。在70℃下的温度处理后，米曲霉的PLA1不显示任何活性。EP0575133没有教导用于食用油的酶促脱胶的方法。

US20160289658公开了一种源自嗜热篮状菌(Talaromyces leycettanus)的磷脂酶。与商业酶制备物Lecitase Ultra相比，该磷脂酶显示出相对较高的热稳定性并且显示出在70℃下更高的活性。

WO2011/051322公开了一种来自烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)的磷脂酶，该磷脂酶在55℃和60℃的温度下水解大豆油中的磷脂。

需要一种改进的用于使用在宽温度范围有活性的磷脂酶来降低三酰基甘油酯油中磷脂的含量的方法。

发明内容

本发明涉及一种用于减少三酰基甘油酯油中完整磷脂的量的方法，所述方法包括将所述油与具有磷脂酶A1活性的多肽一起孵育，其中所述磷脂酶A1包含与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽。已发现与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸具有至少80％同一性的磷脂酶A1能够在4小时内在55℃至70℃的宽温度范围减少三酰基甘油酯油中原始存在的磷脂的至少85％。如本文所公开的方法中的磷脂酶A1是当以0.28mg活性蛋白/kg油的量与油一起在介于55℃、60℃、65℃和70℃之间的温度下孵育4小时时，水解三酰基甘油酯油中原始存在的完整磷脂的量的至少85％、86％、87％、88％、89％或至少90％的磷脂酶A1。

“成熟多肽”在本文中定义为这样的多肽，所述多肽处于其最终形式下并且在将mRNA翻译成多肽并对所述多肽进行翻译后修饰后获得。翻译后修饰包括N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化，以及通过切割去除前导序列(诸如信号肽、前肽和/或前原肽)。

磷脂也表示为甘油磷脂。如本文所用的磷脂是“完整的”磷脂，并且包含含有两个脂肪酸和磷酸的甘油主链。磷脂也表示为包含磷酸根基团的二酰基甘油酯。

溶血磷脂是包含仅一个酰基(脂肪酸)基团以及磷酸根基团的甘油主链。溶血磷脂可以在通过磷脂酶A1和/或磷脂酶A2的作用从磷脂上去除酰基基团后形成。

措词三酰基甘油酯油和甘油三酯油在本文中可互换使用。甘油三酯是衍生自甘油和三种脂肪酸的酯。三酰基甘油酯油可以是食用油和/或用作生物柴油的油。

序列同一性或序列同源性在本文中可互换使用。为了确定两个氨基酸序列的序列同源性或序列同一性百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可以在进行比较的两个序列中的任一序列中引入空位。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核苷酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在所报告的比对区域上相同匹配的百分比。可以使用用于两个序列的比对的Needleman和Wunsch算法来确定两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法来进行比对。已在计算机程序NEEDLE中实现了Needleman-Wunsch算法。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)，第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于取代矩阵。所使用的任选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。如上所述通过程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：比对中对应位置(其显示两个序列中的相同氨基酸或相同核苷酸)的数目除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。如本文所限定的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。

本文公开的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库执行搜索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来执行此类搜索。可以用得分＝100、字长＝12的NBLAST程序来执行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用得分＝50、字长＝3的XBLAST程序来执行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以利用Gapped BLAST，如在Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

术语“变体”可以指多肽或核酸。变体包括在相对于参考序列的一个或多个位置处的取代、插入、缺失、截短、颠换和/或倒位。可以通过例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及本领域技术人员已知的各种其他重组方法来产生变体。核酸的变异基因可以通过本领域已知的技术人工合成。

具体实施方式

本发明涉及一种用于减少三酰基甘油酯油中完整磷脂的量的方法，所述方法包括将所述油与具有磷脂酶A1活性的多肽一起孵育，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽。与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有至少80％同一性的具有磷脂酶活性的多肽可以是例如在如本文所公开的方法中，当将磷脂酶A1以0.28mg活性蛋白/kg油的量与油一起在55℃、60℃、65℃和/或70℃的温度下孵育4小时时，能够减少或减少了油中原始存在的磷脂的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或至少90％的多肽。

在如本文所公开的用于减少三酰基甘油酯油中的完整磷脂的量的方法中具有磷脂酶A1活性的多肽可以是当将磷脂酶A1以0.1-0.4mg，例如0.2-0.3mg或0.28mg活性蛋白/kg油的量与油一起在55℃、60℃、65℃和/或70℃的温度下孵育4小时时，能够减少或减少了油中原始存在的磷脂的至少80％、81％、82％、83％、84％或至少85％的多肽。所述油还可包含500ppm柠檬酸和3重量％的水。

令人惊讶地，发现在如本文所公开的方法中具有磷脂酶A1活性的多肽在介于55℃与70℃之间的宽温度范围内能够减少或减少了油中原始存在的磷脂的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或至少90％，例如85％至99％，例如86％至98％，例如87％至97％，例如88％至96％、例如介于89％与95％之间，例如介于90％与94％之间。如本文所公开的磷脂酶A1可以在4小时的时段期间与油一起在55℃至70℃的温度范围内孵育。

在一个实施方式，如本文所公开的用于减少完整磷脂的量的方法是其中所减少的完整磷脂的量是油中原始存在的完整磷脂的量的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或至少90％，例如85％至99％，例如86％至98％，例如87％至97％，例如88％至96％，例如89％至95％，例如90％至94％的方法。令人惊讶地，发现完整磷脂的量在55℃、60℃、65℃的温度下和/或在70℃的温度下，在将油与0.1mg活性蛋白/kg油至0.4mg活性蛋白/kg油(例如0.28mg活性蛋白/kg油)的量的磷脂酶A1一起孵育4小时后减少。

磷组分，例如磷脂、溶血磷脂和磷酸酯，可以使用例如如在材料和方法部分中公开的

如本文所用的具有磷脂酶A1活性的多肽是根据酶分类E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1。磷脂酶A1是切割磷脂的SN1位置处从而形成溶血磷脂和脂肪酸的酶。如本文所用的磷脂酶A1还可切割溶血磷脂的SN1位置处，从而形成甘油磷酸酯和脂肪酸。措词“磷脂酶A1”和“具有磷脂酶A1活性的多肽”在本文中可互换使用。如本文所公开的具有磷脂酶A1活性的多肽不具有磷脂酶A2活性。

在如本文所公开的方法中将油与具有磷脂酶A1活性的多肽一起孵育包括将油中的磷脂转换为溶血磷脂和游离脂肪酸。在如本文所公开的方法中将油与具有磷脂酶A1活性的多肽一起孵育还可包括将油中的磷脂和/或溶血磷脂转换为溶血磷脂和/或甘油磷酸酯以及游离脂肪酸。

在如本文所公开的方法中将油与具有磷脂酶A1活性的多肽一起孵育可以在2至8，例如3至7，例如4至6的pH值下执行。

将油与具有磷脂酶A1活性的多肽一起孵育可以在酸的存在下执行。因此，如本文所公开的用于减少三酰基甘油酯油中完整磷脂的量的方法包括添加酸，使得油中酸的量为100ppm至1000ppm的酸，例如200ppm至900ppm的酸，例如300ppm至800ppm的酸，例如400ppm至600ppm的酸。在如本文所公开的方法中使用的合适的酸可包括柠檬酸、磷酸、乙酸、酒石酸和/或琥珀酸，以及它们的任何合适的混合物。

通常在如本文所公开的方法中存在水。如本文所公开的方法还可包括将水添加到油中，例如添加一定量的水，使得在如本文所公开的方法中油中存在0.5重量％至5重量％的量的水，例如1重量％至4重量％的量的水，例如2重量％至3重量％的水。

将油与具有磷脂酶A1活性的多肽一起孵育可以在40℃至75℃的温度，例如45℃至70℃的温度，例如50℃至65℃的温度下执行。

用于在如本文所公开的方法中将食用油与磷脂酶A1一起孵育的合适时间段是0.5至10小时，例如1至8小时，或2至6小时。

将油与适当量的磷脂酶A1一起孵育。磷脂酶的合适量为使得在55℃至70℃的温度下孵育4小时后，三酰基甘油酯油中原始存在的完整磷脂的量的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或至少90％、91％、92％、93％、94％或至少95％被减少。例如，量为0.02mg活性PLA1蛋白/kg油至3mg活性PLA1蛋白/kg油，例如介于0.05mg活性PLA1蛋白/kg油至1mg活性PLA1蛋白/kg油之间，例如介于0.1mg活性PLA1蛋白/kg油至0.8mg活性PLA1蛋白/kg油之间，例如0.15mg活性PLA1蛋白/kg油至0.5mg活性PLA1蛋白/kg油，例如0.2mg活性PLA1蛋白/kg油至0.4mg活性PLA1蛋白/kg油。

磷脂酶A1可来源于任何合适的生物体，例如来源于真菌。合适的真菌包括丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus)、篮状菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)，以及酵母，例如毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)，例如米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。具有磷脂酶A1活性的多肽可来源于黑曲霉。

在如本文所公开的方法中使用的磷脂酶A1可包含与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的多肽。具有磷脂酶A1活性的多肽可包含或含有SEQ IDNO:1的成熟氨基酸序列。SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列包含或含有SEQ ID NO:1的氨基酸30至298。SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列还可包含或含有SEQ ID NO:1的氨基酸29至297，例如SEQ ID NO:1的氨基酸28至296，例如SEQ ID NO:1的氨基酸31至298，例如SEQ ID NO:1的氨基酸32至297。成熟氨基酸序列还可在SEQ ID NO:1的C末端处包含一个或多个另外的氨基酸。

在如本文所公开的方法中使用的磷脂酶A1可以是天然存在的多肽或变异多肽。

磷脂酶A1可以在任何合适的可用于生产如本文所公开的具有磷脂酶A1活性的多肽的宿主细胞(例如原核或真核细胞)中产生。真核宿主细胞可以是哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

真菌细胞可以例如是酵母细胞或丝状真菌细胞，例如酵母属、毕赤酵母属、曲霉属、木霉属、例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。技术人员已知的分子生物学技术是根据Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001执行的。

将可用于生产如本文所公开的磷脂酶A1的宿主细胞在允许表达磷脂酶A1的合适的发酵培养基中培养。本领域技术人员知道如何取决于所使用的宿主细胞来执行用于制备具有磷脂酶A1活性的多肽的方法。合适的发酵培养基通常包含碳和氮源。通常，发酵培养基的pH值介于4与8之间。培养宿主细胞的合适温度通常介于25℃与60℃之间。可以通过本领域中已知的方法，例如通过离心、过滤和/或超滤，从发酵培养基中回收磷脂酶A1。

如本文所公开的方法中的磷脂酶A1可以是包含如本文所公开的磷脂酶A1的组合物，例如包含如本文所公开的磷脂酶A1的水性组合物或固体组合物。所述组合物可以是发酵液，例如是已经通过例如离心、过滤或超滤去除了细胞和/或其他组分的发酵液。

磷脂酶A1也可以是纯的或分离的磷脂酶A1，即从与其天然缔合的至少一种组分(例如其他多肽材料)取出的具有磷脂酶A1活性的多肽。

三酰基甘油酯油中的磷脂包括磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰胆碱(PC)。令人惊讶地发现，在如本文所公开的方法中，这四种磷脂的含量或量被降低。

在一个实施方式，如本文所公开的方法包括将酸添加到油中的步骤。可添加到油中的合适的酸包括柠檬酸、磷酸、乙酸、酒石酸和/或琥珀酸，以及它们的任何合适的混合物。

在又一个实施方式，如本文所公开的方法包括将苛性碱添加到油中。合适的苛性碱可以是例如氢氧化钾或氢氧化钠、硅酸钠、碳酸钠、碳酸钙、碳酸氢钠、氨、柠檬酸钠或它们的任何合适的组合。

可以在如本文所公开的用于减少三酰基甘油酯油中完整磷脂的量的方法中的任何合适步骤期间执行添加酸、水和/或苛性碱。可以在将油与磷脂酶一起孵育之前、期间或之后执行添加酸、水和/或苛性碱。优选地，在将油与磷脂酶A1一起孵育之前，执行添加酸、水和/或苛性碱。添加苛性碱可以在添加酸之前或之后执行，例如，添加苛性碱可以在添加酸之后执行。

如本文所公开的用于减少三酰基甘油酯油中完整磷脂的量的方法还可包括在酸和/或苛性碱存在下对油进行预处理的步骤。酸和/或苛性碱如上文所定义。预处理包括将油在酸和/或苛性碱的存在下在50℃至75℃的温度，例如55℃至70℃的温度下孵育。预处理可以在1分钟至2小时，例如5分钟至1小时，例如10分钟至40分钟期间执行。

在一个实施方式中，如本文所公开的方法还包括将油与具有磷脂酶C活性的酶、具有磷脂酰肌醇(PI)-磷脂酶C活性的酶和/或具有磷脂酶A2活性的酶一起孵育。

磷脂酶C(PLC)可以是来自酶分类编号EC 3.1.4.3的酶，其切割磷脂的磷酸根基团与甘油基团之间，从而产生甘油二酯和磷酸盐化合物，例如磷酸胆碱或磷酸乙醇胺。例如一种PLC是从WO2005/086900、WO2012/062817或WO2016/162456已知的。PLC可以是包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的多肽，所述多肽还公开于WO2005/086900的第196页上。磷脂酶C可以是与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的多肽。

磷脂酶C也可以是磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC)。PI-PLC具有切割磷脂酰肌醇的偏好，并且还可作用于其他磷脂，例如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。细菌PI-PLC属于酶分类EC4.6.1.13。合适的PI-PLC酶例如公开于WO2011/046812中。合适的PI-PLC可包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，该氨基酸序列对应于WO2011/046812中所公开的SEQ ID NO:8。磷脂酰肌醇磷脂酶C可以是与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的多肽。

磷脂酶A2(PLA2)从甘油的第二碳基团释放脂肪酸，并且属于酶分类EC 3.1.1.4。PLA2可以例如是猪胰PLA2，其可以在合适的宿主生物体，例如曲霉属物种，例如黑曲霉中表达。

如本文所公开的方法还可包括从油中分离含磷组分。分离含磷组分可以通过本领域中已知的任何合适方法，例如通过离心执行。含磷组分包括磷脂、溶血磷脂和甘油磷酸酯。

在如本文所公开的用于减少食用油中的磷脂的方法中可以存在或使用任何合适的三酰基甘油酯油。三酰基甘油酯油可以是原油食用油或经水脱胶的食用油。原油，也称为非脱胶油，是指压榨或萃取的油。油可以是植物油(vegetable oil/plant oil)、动物油、鱼油或藻油。植物油可以是任何合适的油，例如大豆油、菜籽油、芥花油、向日葵油、棕榈油、棕榈仁油、椰油、芝麻油、橄榄油、米糠油、棉籽油、玉米油、坚果油，例如杏仁油、核桃油、花生油，或它们的混合物。用于减少三酰基甘油酯油中完整磷脂的量的方法也可以表示为油脱胶或油精制方法。

植物原油可包含介于1ppm与2000ppm之间，例如介于1ppm与1000ppm之间的原子磷。原子磷的量指示磷脂的量。

本文还公开了一种包含具有磷脂酶A1活性的多肽的三酰基甘油酯油，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽。三酰基甘油酯油可以是通过如本文所公开的方法可获得的。上文所公开的用于如本文所公开的方法的所有实施方式均适用于如本文所公开的三酰基甘油酯油。

如本文所公开的油还可包含具有磷脂酶C活性的多肽、具有磷脂酰肌醇磷脂酶C活性(PI-PLC)的多肽和/或具有磷脂酶A2活性的多肽。如本文所公开的油还可包含具有磷脂酶C活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性；具有磷脂酰肌醇磷脂酶C活性的多肽，该多肽与SEQID NO:4的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性；和/或来自猪胰腺的磷脂酶A2。

附图说明

图1是用于表达黑曲霉PLA1酶的pGBTOPPLA-1质粒的示意图。

分子生物学技术

技术人员已知的分子生物学技术是根据Sambrook和Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001执行的。在热循环仪上根据制造商的说明使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes OY,Aspoo,Finland)执行聚合酶链式反应(PCR)。

酶

来自Novozymes的

菌株构建

分别根据如在EP 0 635 574B1和van den Hombergh等人，(1997)Eur JBiochem.247(2):605-13)中所述的方法构建包含编码葡糖淀粉酶的基因(glaA)的缺失和pepA基因的缺失的黑曲霉菌株(以保藏号CBS 513.88保藏于CBS研究所)。随后，根据如在WO2004/070022中描述的方法，从包含ΔglaA、ΔpepA的黑曲霉菌株构建草酸酯缺陷型黑曲霉菌株，从而产生包含glaA、pepA和oahA基因的缺失(ΔglaA、ΔpepA、ΔoahA)的黑曲霉。

产PLA1的黑曲霉菌株的构建

将黑曲霉PLA1酶(具有如SEQ ID NO:2所示的编码序列，以及如SEQ ID NO:1所示的蛋白质序列)选择用于在黑曲霉(ΔglaA、ΔpepA、ΔoahA)菌株中进行酶表达。

通过基因合成制备编码PLA1的基因，并使用如在WO 98/46772和WO 99/32617中所述的技术在葡糖淀粉酶启动子的控制下将其克隆到黑曲霉pGBTOP-12表达载体中，从而使用与在WO 98/46772和WO 99/32617中所述相同的技术产生黑曲霉pGBTOPPLA-1表达载体(图1)。

用于PLA1酶的产酶菌株是通过将黑曲霉(ΔglaA、ΔpepA、ΔoahA)菌株与含有amdS选择性标记基因的载体pGBAAS-1和pGBTOPLA-1载体共转化并随后选择转化体而构建的。转化和反选择工序(如在WO98/46772和WO99/32617中所述)之后进行菌株选择，导致了产生PLA1蛋白的(多拷贝)菌株。从所有pGBTOPPLA-1转化体中，选择在(ΔglaA、ΔpepA、ΔoahA)背景内的1个高拷贝产酶菌株，进一步复制铺板以获得单菌株接种物，并命名为菌株PLA1-1。在随后的实验中，将PLA1-1菌株用作相应的产PLA1的菌株。

用于PLA1生产的黑曲霉摇瓶发酵

制备新鲜的黑曲霉PLA1-1孢子。在具有挡板的500ml摇瓶中的四个具有20ml发酵培养基1(10％w/v的玉米浆固体、1％w/v的葡萄糖.H

磷脂酶A1(PLA1)活性测定

制备以下溶液：

1)底物溶液：1g来自蛋黄的L-α-磷脂酰胆碱(Sigma P3556,Zwijndrecht,theNetherlands)在2％曲拉通(triton)X-100溶液中。

2)0.2M醋酸盐缓冲液pH 4.5

3)终止溶液：1M HCl

将500μL的溶液1和300μL的溶液2的混合物在37℃下平衡。通过加入100μL的活性介于0.05-1.0U/mL之间的酶溶液来开始反应。在37℃孵育10分钟后，通过添加100μL的溶液3终止反应。通过将不含样品的底物在37℃下孵育10分钟，来另外进行空白测量。在添加100μL终止试剂后，添加100μL的样品。通过遵循Wako HR系列NEFA-HR(2)诊断试剂盒(http://www.wakodiagnostics.com/r_nefa.html)的包装说明书中所述的使用说明书来确定样品和空白中所形成的游离脂肪酸的量。活性计算如下：

ΔFFA＝样品中的FFA-空白中的FFA(μmol/mL)

Vt＝停止反应后的总体积(1mL)

Vs＝样品体积(0.1mL)

t＝孵育时间(10分钟)

df＝样品的稀释倍数

1U被定义为在测试条件下每分钟释放一微摩尔游离脂肪酸的酶量。

磷脂酶C(PLC)活性测定

底物溶液由10mM pNP-硝基苯基磷酰胆碱(来自Melford Laboratories Ltd,Ipswich,United Kingdom的制品N83020)、pH 7.3的100mM MOPS缓冲液、0.2％曲拉通X-100和1mM ZnSO

通过在上述缓冲液中制备分别为0-0.5-1.0-2.0-2.9-4.0mM的pNP溶液来执行校准。将40μL的各标准溶液与960μL底物和1000μL终止试剂混合。在405nm下测量每种溶液的OD。通过使用线性回归，计算校准线的斜率。

活性是通过使用以下公式计算的：

ΔAbs＝(A样品-A空白)

df＝样品的稀释倍数

斜率＝对硝基苯酚校准曲线的斜率(mL/μmol)

t＝孵育时间测定(30分钟)

一个单位被定义为在测试条件(pH 7.3，37℃)下每分钟释放1μmol对硝基苯酚的酶量。

磷脂酰肌醇磷脂酶(PI-PLC)活性测定

底物溶液由溶于还含有0.1％曲拉通X-100的200mM磷酸钠缓冲液pH 7.5中的20mM4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯、N-甲基-吗啉(BioSynth M-5717，Brussels,Belgium)组成。将140μL底物在37℃下平衡。通过添加10μL的活性介于0.2U/mL与1.0U/mL之间的样品来开始反应。当在37℃下孵育时，在380nm下测量相对于空白样品的吸光度变化。将曲线的线性部分的斜率(ΔOD/时间)用作活性的量度。

通过在200mM磷酸盐缓冲液中制备分别为0-1.0-2.0-3.0-4.0-5.0mM的4-甲基伞形酮溶液来执行校准。将10μL的各标准溶液与140μL底物混合。在380nm下测量每种溶液的OD。通过使用线性回归，计算校准线的斜率。

活性是通过使用以下公式计算的：U/mL＝(ΔAbs/min

ΔAbs/min

ΔAbs/min空白＝缓冲液空白的每分钟吸光度变化

df＝样品的稀释倍数

S＝4-甲基伞形酮校准曲线的斜率[mL/微摩尔]

一个单位被定义为在pH 7.5和37℃下在1分钟期间从18.7mM 4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯中释放出1μmol 4-甲基伞形酮的酶量。

使用

将500-1000mg油准确称量到合适的小瓶中，并且添加约10g冷丙酮并充分混合。将油-丙酮混合物在4℃下保持至少30分钟，然后在3000rpm下离心10分钟，在此之后将液相丢弃。将沉淀重悬于500μl缓冲液(含有25g L-1脱氧胆酸、5.84g L-1EDTA和10.9g L-1TRIS，使用KOH缓冲到pH 9.0)中，并且添加50μL内标溶液(含有在萃取缓冲液中的10g L-1磷酸三异丙酯)。

在300K的样品温度下在Bruker Avance III HD光谱仪上记录1D P

计算出相对于磷酸三异丙酯的分析物浓度。

应用校正因子来校正磷酸胆碱和磷酸乙醇胺的不完全弛豫。

油中的二酰基甘油(DAG)的定量测定

使用正相高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)分离中性脂质类别，并用蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector,ELSD)测定存在的甘油二酯。该方法已从官方AOCS方法Cd 11d-96进行了改进。含量表示为百分比(重量％)。

实施例1.使用PLA1在55-70℃下对大豆原油和菜籽原油进行脱胶

使用两种来自美国油籽加工商的大豆原油和两种来自欧洲油籽加工商的菜籽原油。将10g油称量到小瓶中，并加热至70℃，在此之后将柠檬酸(作为50％溶液)添加到油中，直到油中的最终柠檬酸浓度为500ppm。将容纳有经柠檬酸处理的油的小瓶在70℃下孵育至少30分钟。

在孵育后，将温度调节并保持在55℃、60℃、65℃和70℃。当温度稳定时，使用Ultra Turrax将如上所述产生的PLA1(0.28mg活性蛋白/kg油(1.25PLA单位/g))和水混合到油中。油中的最终水浓度为3重量％。反应持续4小时，同时用磁力搅拌器以800ppm将油保持混合。在孵育4小时后取样，并使用如上所述的

以下表1至表4中的结果表明，如本文所公开的PLA1降低了全部四种磷脂PA、PC、PE和PI的含量。在油中原始存在的磷脂(PL)总量的超过85％在55℃、60℃、65℃和70℃的温度下在4小时反应后水解。

表1.在与磷脂酶A1一起孵育之前和之后，大豆原油中的磷脂含量。

表2.在与磷脂酶A1一起孵育之前和之后，大豆原油中的磷脂含量。

表3.在与磷脂酶A1一起孵育之前和之后，菜籽原油中的磷脂含量。

表4.在与磷脂酶A1一起孵育之前和之后，菜籽原油中的磷脂含量。

实施例2.PLA1和商用磷脂酶A在55℃下的性能比较

使用来自美国油籽加工商的大豆原油和经水脱胶的大豆油。将10g油称量到小瓶中，并加热至70℃，在此之后将柠檬酸(作为50％溶液)添加到油中，直到油中的最终柠檬酸浓度为500ppm。将容纳有经柠檬酸处理的油的小瓶在70℃下孵育至少30分钟，随后将温度调节并保持在55℃。

当温度稳定时，使用Ultra Turrax将25ppm的如上所述产生的PLA1和水混合到油中。油中的最终水浓度为3重量％。

在将用柠檬酸处理并调节至55℃的油如上所述与

在使用磁力搅拌器以800ppm混合的同时在55℃下孵育4小时之后，取样并使用如上所述的

表5和表6中的结果表明，与两种商用酶

表5.在55℃下与不同磷脂酶一起孵育4小时之前和之后，大豆原油中的磷脂、溶血磷脂和甘油磷酸酯的含量

表6.在55℃下与不同磷脂酶一起孵育4小时之前和之后，经水脱胶的大豆油中的磷脂、溶血磷脂和甘油磷酸酯的含量

实施例3.在55℃、60℃和65℃的温度下大豆原油中PLA1和市售磷脂酶A之间的性能比较

使用来自美国油籽加工商的大豆原油。将10g油称量到小瓶中，并加热至70℃，在此之后将柠檬酸(作为50％溶液)添加到油中，直到油中的最终柠檬酸浓度为500ppm。将容纳有经柠檬酸处理的油的小瓶在70℃下孵育至少30分钟。

在孵育后，将温度调节并保持在55℃、60℃和65℃。当温度稳定时，使用UltraTurrax将如上所述产生的PLA1(0.25mg活性蛋白/kg油)和水混合到油中。油中的最终水浓度为3重量％。

为了与

反应持续4小时，同时用磁力搅拌器以800ppm将油保持混合。在孵育4小时后取样，并使用如上所述的

以下表7至表9中的结果表明，与商用酶

表7.与不同的磷脂酶一起孵育4小时之前和之后，大豆原油中的磷脂含量

<：未检测到

表8.与不同的磷脂酶一起孵育4小时之前和之后，大豆原油中的磷脂含量

<：未检测到

表9.与不同的磷脂酶一起孵育4小时之前和之后，大豆原油中的磷脂含量

实施例4.在55℃、60℃和65℃的温度下经水脱胶的大豆油中PLA1和市售磷脂酶A之间的性能比较

使用来自美国油籽加工商的经水脱胶的大豆油。将10g油称量到小瓶中，并加热至70℃，在此之后将柠檬酸(作为50％溶液)添加到油中，直到油中的最终柠檬酸浓度为500ppm。将容纳有经柠檬酸处理的油的小瓶在70℃下孵育至少30分钟。

在孵育后，将温度调节并保持在55℃、60℃和65℃。当温度稳定时，使用UltraTurrax将如上所述产生的PLA1(0.25mg活性蛋白/kg油)和水混合到油中。油中的最终水浓度为3重量％。

为了与

反应持续4小时，同时用磁力搅拌器以800ppm将油保持混合。在孵育4小时后取样，并使用如上所述的

表10至表12中的结果表明，在PLA1、

表10.与不同的磷脂酶一起孵育4小时之前和之后，经水脱胶的大豆油中的磷脂含量

<：未检测到

表11.与不同的磷脂酶一起孵育4小时之前和之后，经水脱胶的大豆油中的磷脂含量

<：未检测到

表12.与不同的磷脂酶一起孵育4小时之前和之后，经水脱胶的大豆油中的磷脂含量

<：未检测到

使用实施例1中公开的大豆原油和菜籽原油。将10g油称量到小瓶中，将小瓶加热到70℃。为进行预处理，将柠檬酸(50％溶液)添加到油中，油中的最终柠檬酸浓度为500ppm。将该油在70℃下孵育至少30分钟，在此之后添加NaOH至浓度为138ppm NaOH。在预处理后，将温度调节并保持在55℃。

将如上文所公开产生的PLA1和Purifine PLC/PI-PLC的混合物与水一起添加到油中，并使用Ultra Turrax进行混合。PLA1的剂量为0.28mg活性蛋白/kg油，并且PurifinePLC/PI-PLC的剂量为0.013U-PLC/g油和0.05U-PI-PLC/g油，油中的最终水浓度为3重量％。

反应进行4小时，同时用磁力搅拌器以800rpm将油保持混合。在55℃下孵育2小时和4小时后，取样以测定磷脂含量，即磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)，并使用

表13和表14中的结果表明，与使用单独的PLC/PI-PLC相比，当将PLA1与PLC/PI-PLC同时使用时，可以进一步降低完整磷脂的含量。在4小时的PLA1+PLC/PI-PLC反应后，>90％的磷脂被水解。当将PLA1与PLC/PI-PLC同时使用时，甘油二酯(DAG)的形成减少，但是在没有进行预处理的情况下，减少限于所形成的总DAG的5-15％。

表13.在55℃下与磷脂酶C、PI-PLC和磷脂酶A1一起孵育之前和之后，大豆原油中的磷脂含量

≤：未检测到

表14.在55℃下与磷脂酶C和磷脂酶A1一起孵育之前和之后，菜籽原油中的磷脂含量

≤：未检测到

使用两种来自美国油籽加工商的大豆原油。将10g油称量到小瓶中，将小瓶加热到60℃。

将

反应进行4小时，同时用磁力搅拌器以800rpm将油保持混合。在60℃下孵育2小时和4小时后，取样以测定磷脂(PL)含量，即磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)，并使用如上文所公开的

表15和表16中的结果表明，与使用单独的

表15.在60℃下与

<：未检测到

表16.在60℃下与

<：未检测到

与被保藏的微生物或其他生物材料相关的说明

(PCT Rule 13bis)

Form PCT/RO/134(1998年7月；2004年1月重印)

序列表

<110> DSM IP Assets B.V.

<120> 用于酶促油脱胶的方法

<130> 32910-WO-PCT

<150> EP18171015.3

<151> 2018-05-07

<160> 4

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 298

<212> PRT

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<220>

<223> 磷脂酶A1的氨基酸序列

<400> 1

Met Phe Leu Arg Arg Glu Phe Gly Ala Val Ala Ala Leu Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala His Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Met Gln Arg Arg Asp Ile Ser

20 25 30

Ser Thr Val Leu Asp Asn Ile Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala

35 40 45

Ala Tyr Cys Ser Ser Asn Ile Glu Ser Thr Gly Thr Thr Leu Thr Cys

50 55 60

Asp Val Gly Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ile

65 70 75 80

Asp Glu Phe Asp Asp Ser Ser Ser Tyr Gly Asp Pro Thr Gly Phe Ile

85 90 95

Ala Val Asp Pro Thr Asn Glu Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser

100 105 110

Ser Asp Leu Ser Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Gly Leu Thr Ser

115 120 125

Val Ser Ser Ile Cys Asp Gly Cys Glu Met His Lys Gly Phe Tyr Glu

130 135 140

Ala Trp Glu Val Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Glu Ala Ala

145 150 155 160

Val Ser Ser Tyr Pro Asp Tyr Thr Leu Val Phe Thr Gly His Ser Tyr

165 170 175

Gly Ala Ala Leu Ala Ala Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Asn Ala Gly

180 185 190

Tyr Thr Leu Asp Leu Tyr Asn Phe Gly Gln Pro Arg Ile Gly Asn Leu

195 200 205

Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Met Gly Ser Asn Tyr Arg

210 215 220

Val Thr His Thr Asp Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Tyr His His Phe Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asp

245 250 255

Val Thr Val Thr Thr Ser Asp Val Thr Glu Val Val Gly Val Asp Ser

260 265 270

Thr Ala Gly Asn Asp Gly Thr Leu Leu Asp Ser Thr Thr Ala His Arg

275 280 285

Trp Tyr Thr Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser

290 295

<210> 2

<211> 897

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<220>

<223> 磷脂酶A1的DNA序列（基因库：XM_001393495）

<400> 2

atgtttctcc gcagggaatt tggggctgtt gcagccctat ctgtgctggc ccatgctgct 60

cccgcacctg ctccgatgca gcgtagagac atctcctcta ccgtcttgga caatatcgac 120

ctcttcgccc aatacagtgc agcagcttac tgctcctcca acatcgagtc caccggcacg 180

actctgacct gcgacgtagg caattgccct ctcgtcgagg cagccggtgc cacgaccatc 240

gatgagtttg acgacagcag cagctacggc gacccgacgg ggttcatcgc cgttgacccg 300

acgaacgagt taatcgttct gtctttccgg ggcagttccg acctctcgaa ctggattgcc 360

gacctagact tcggcctcac atccgtaagc agcatctgtg atggctgtga gatgcacaag 420

ggcttctacg aggcctggga agtcattgcc gacaccatca catccaaggt ggaggccgcc 480

gtctccagct atccggacta caccctcgtg ttcaccggac acagctacgg cgctgcattg 540

gcggctgtcg cggccaccgt gctccgcaac gccggataca ctcttgacct gtacaacttc 600

ggccagcccc gtattggcaa cctcgcctta gccgactaca tcaccgacca aaacatgggc 660

agcaactacc gcgtcacgca caccgatgac atcgtgccta agctgcctcc ggagctgctg 720

ggctaccacc acttcagtcc ggagtactgg atcaccagcg gcaatgatgt gacggtgaca 780

acgtcggacg tcaccgaggt cgtgggggtg gattcgacgg ctgggaatga cggcacgctg 840

cttgacagta cgactgccca tcggtggtac acgatctaca ttagtgaatg ctcgtag 897

<210> 3

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自WO2005/086900的磷脂酶C

<400> 3

Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Asn Glu Gly Ile Asn Ser His Leu Trp

1 5 10 15

Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Ile Val

20 25 30

Asn Pro Asn Glu Thr Ala Leu Leu Asn Glu Trp Arg Ala Asp Leu Glu

35 40 45

Asn Gly Ile Tyr Ser Ala Asp Tyr Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Thr Gly Thr Thr Tyr Ile

65 70 75 80

Pro Phe Ala Lys His Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Asn Leu

85 90 95

Ala Gly Gln Ala Tyr Gln Asn Gln Asp Met Gln Gln Ala Phe Phe Tyr

100 105 110

Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His

115 120 125

Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Met Gly Phe His Ser Lys

130 135 140

Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asn Asn Tyr Ile Val Ser Asp

145 150 155 160

Ser Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Ala Asn Pro Glu Asp Trp Ile

165 170 175

Glu Gly Ala Ala Val Ala Ala Lys Gln Asp Tyr Pro Gly Val Val Asn

180 185 190

Asp Thr Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr

195 200 205

Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Val Thr Gly Lys Arg Leu

210 215 220

Met Glu Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile His Leu Trp Phe Asp

225 230 235 240

Thr Tyr Val Asn Arg

245

<210> 4

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自WO2011/046812的磷脂酰肌醇磷脂酶C

<400> 4

Met Ala Ser Ser Ile Asn Val Leu Glu Asn Trp Ser Arg Trp Met Lys

1 5 10 15

Pro Ile Asn Asp Asp Ile Pro Leu Ala Arg Ile Ser Ile Pro Gly Thr

20 25 30

His Asp Ser Gly Thr Phe Lys Leu Gln Asn Pro Ile Lys Gln Val Trp

35 40 45

Gly Met Thr Gln Glu Tyr Asp Phe Arg Tyr Gln Met Asp His Gly Ala

50 55 60

Arg Ile Phe Asp Ile Arg Gly Arg Leu Thr Asp Asp Asn Thr Ile Val

65 70 75 80

Leu His His Gly Pro Leu Tyr Leu Tyr Val Thr Leu His Glu Phe Ile

85 90 95

Asn Glu Ala Lys Gln Phe Leu Lys Asp Asn Pro Ser Glu Thr Ile Ile

100 105 110

Met Ser Leu Lys Lys Glu Tyr Glu Asp Met Lys Gly Ala Glu Ser Ser

115 120 125

Phe Ser Ser Thr Phe Glu Lys Asn Tyr Phe Arg Asp Pro Ile Phe Leu

130 135 140

Lys Thr Glu Gly Asn Ile Lys Leu Gly Asp Ala Arg Gly Lys Ile Val

145 150 155 160

Leu Leu Lys Arg Tyr Ser Gly Ser Asn Glu Ser Gly Gly Tyr Asn Phe

165 170 175

Phe Tyr Trp Pro Asp Asn Glu Thr Phe Thr Ser Thr Ile Asn Gly Asn

180 185 190

Val Asn Val Thr Val Gln Asp Lys Tyr Lys Val Ser Leu Asp Glu Lys

195 200 205

Ile Asn Ala Ile Lys Asp Thr Leu Asn Glu Thr Ile Asn Asn Ser Glu

210 215 220

Asp Val Asn His Leu Tyr Ile Asn Phe Thr Ser Leu Ser Ser Gly Gly

225 230 235 240

Thr Ala Trp Thr Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ala Ser Arg Ile Asn Pro Glu

245 250 255

Ile Ala Asn Tyr Ile Lys Gln Lys Asn Pro Thr Arg Val Gly Trp Ile

260 265 270

Ile Gln Asp Phe Ile Asn Glu Lys Trp His Pro Leu Leu Tyr Gln Glu

275 280 285

Val Ile Asn Ala Asn Lys Ser Leu Val Lys

290 295