一种假单胞菌CM11及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种假单胞菌及其应用。

背景技术

根际(Rhizosphere)指受植物根系活动直接影响的微域土区，是地球上最复杂的生态系统之一。植物根际定殖着丰富多样的微生物，对植物的生长和健康具有极其重要的作用。植物根际的有益细菌统称为植物根际促生菌(Plant growth-promotingrhizobacteria,PGPR)，它们可与许多宿主植物相互作用并直接(如固氮，产生植物激素等)或间接(如抑制病原菌，诱导抗性等)地促进植物生长。利用PGPR菌及其产生的信号物质接种植物，是提高作物产量的有效策略。例如园艺生产中，PGPR菌可以提高果树(苹果，葡萄，核桃等)和蔬菜(番茄，黄瓜，马铃薯等)作物的产量。PGPR菌的发现促进了商品生物制剂的发展，并最大程度地减少了化学肥料和农药的使用。

目前，关于根际微生物的研究主要集中在模式作物中，对于木本植物根际微生物的研究报道较少。木本植物的根际微生物长期受到植物-土壤反馈机制的影响，与宿主植物的生长和健康关系更为密切。中国板栗(Castanea mollissima Blume)是我国的四大干果之一，果实有很高的营养价值和药用价值，占全球板栗总产量的80％以上。中国板栗也是重要的经济林树种，寿命极长，对环境具有广泛的适应性，适于大面积荒山造林，保持水土。目前对于中国板栗根际微生物的资源挖掘严重不足。

板栗的根际细菌群落与土壤及内生菌群明显不同，而且不同树龄的板栗(10-620年)根际菌群非常类似。板栗根际的假单胞菌(Pseudomonas)丰度极高(～50％)，且与树龄无明显的相关性。这表明板栗与假单胞菌有良好的共生关系。为了揭示根际细菌在板栗生长中的重要作用，我们分离了板栗根际占据绝对优势的假单胞菌，共获得11株假单胞菌。其中一个成员可以显著促进拟南芥(异源)的生长。

假单胞菌是一类需氧的革兰氏阴性细菌，在自然界中广泛分布，包括土壤、水体、动植物体内或体表以及空气中，具有明显的代谢和生理多样性。假单胞菌是产生生物活性物质最多的微生物种类之一，在促进植物生长和生物防治方面具有重要的应用前景，但目前对假单胞菌促生和生防的研究较少。CN 201910198836.X和CN 201910199580.4公开了组分包括上述假单胞菌的一种盐碱地复合改良剂及其施用方法。CN201610585180.3公开了一种包含假单胞菌发酵液的当归专用微生物肥料，对当归根腐病防治效果为45％-48％，增产12％-16％。CN201510317635.9公开了一株拮抗连作地黄黄曲霉病原菌的假单胞菌。CN201310309701.9公开了一种吩乙霉素生物杀菌剂，主要成分为假单胞菌发酵液，并进一步公开了其在防治油菜、黄瓜、小麦、水稻、蕃茄、烟草等多种蔬菜和粮食作物真菌病害中的应用。

综上，关于假单胞菌对植物促生及根形态结构影响的报道较少。本发明公开的假单胞菌具有重要的生产潜力和应用价值。作为新型根际促生菌，将对农产品的绿色生产，以及可持续农业的发展具有积极的促进作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是促进植物生长，尤其是促进植物侧根系生长发育，促进植物侧根原基的形成、或抑制植物主根生长而诱导侧根数量增加、或增加植物地上和地下部的鲜重、或它们的一种或多种。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种假单胞菌株。

本发明所提供的是假单胞菌株(Pseudomonas sp.)CM11，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.18906。该菌种已于2019年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

进一步的，本发明还提供该假单胞菌的代谢物、该假单胞菌的发酵液、该假单胞菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的混合物一种或多种。

本发明还保护一种植物促生长剂，其活性成分包括上述的假单胞菌、该假单胞菌的代谢物、该假单胞菌的发酵液、该假单胞菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的混合物一种或多种。例如，本发明还保护一种植物促生长剂，其活性成分是上述的假单胞菌或/和所述假单胞菌的代谢物。

本发明还保护一种微生物肥料，其活性成分包括上述的假单胞菌、该假单胞菌的代谢物、该假单胞菌的发酵液、该假单胞菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的混合物一种或多种；例如，本发明还保护一种微生物肥料，其活性成分是上述的假单胞菌或/和所述假单胞菌的代谢物。

本发明还提供一种微生物肥料，将上述活性成分与植物常用肥料混合而成。

本发明还保护一种制备植物促生长剂的方法，其包括在KB培养基中培养权利要求1所述的假单胞菌，收集发酵液，得到植物促生长剂。

上述植物促生长剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述植物促生长剂中，所述活性成分可以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述植物促生长剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述植物促生长剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

本发明还提供假单胞菌株CM11、该假单胞菌的代谢物、该假单胞菌的发酵液、该假单胞菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的一种或多种混合物。所述“它们”指CM11、该假单胞菌的代谢物、该假单胞菌的发酵液、和该假单胞菌的细胞培养物的滤液。

本发明的假单胞菌株CM11能促进植物侧根原基的形成、或抑制植物主根生长而诱导侧根数量增加、或增加植物地上和地下部的鲜重、或它们的一种或多种。“它们”指促进植物侧根原基的形成、或抑制植物主根生长而诱导侧根数量增加、或增加植物地上和地下部的鲜重的作用。

本发明还提供下述1)-3)中任一种应用，其特征在于：

1)假单胞菌CM11、该假单胞菌的代谢物、该假单胞菌的发酵液、该假单胞菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的混合物一种或多种在抑制植物主根生长中的应用；

2)假单胞菌CM11、该假单胞菌的代谢物、该假单胞菌的发酵液、该假单胞菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的混合物一种或多种在诱导侧根数量增加中的应用；

3)假单胞菌CM11、该假单胞菌的代谢物、该假单胞菌的发酵液、该假单胞菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的混合物一种或多种在促进植物地上或地下部植株鲜重增加中的应用。

例如，本发明还保护以下1)-3)中任一种应用：

1)上述假单胞菌或/和所述假单胞菌的代谢物在抑制植物主根生长中的应用；

2)上述假单胞菌或/和所述假单胞菌的代谢物在诱导侧根数量增加中的应用；

3)上述假单胞菌或/和所述假单胞菌的代谢物在促进植物地上或地下部植株鲜重增加中的应用。

进一步的，本发明在上述应用中，假单胞菌的使用浓度例如可以为菌液浓度至10

本发明还提供一种培养假单胞菌的方法，具体包括将所述假单胞菌在用于培养假单胞菌的培养基中培养的步骤。进一步的，所述培养基为液体发酵培养基，如KB培养基。

本发明的有益技术效果：

1.本发明首次发现一种假单胞菌株CM11，其所产生的活性物质可显著促进植物生长。

2.本发明的假单胞菌、该假单胞菌的代谢物、该假单胞菌的发酵液、该假单胞菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的混合物一种或多种能抑制植物主根生长，具体可以表现为促进根系发育、抑制主根生长、诱导侧根数量增加、促进植物地上或地下部植株鲜重增加。

3.本发明比较了假单胞菌株CM11与猴假单胞菌(Pseudomonas simiae)WCS417对拟南芥主根生长的影响，发现假单胞菌株CM11可显著提高植物生物量，促进作物丰产；抑制主根伸长，促进侧根生长和总根面积的增加，在生产中可利用此菌株起到矮杆促壮的作用，实现增产，利于机械化栽培。

保藏说明

菌种名称：假单胞菌

拉丁名：Pseudomonas sp.

菌株编号：CM11

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年11月5日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18906

附图说明

图1：菌株CM11的生长曲线；

图2：假单胞菌CM11的系统进化树分析；

图3：假单胞菌CM11的平板促生效果及对根系结构的影响；

图4：假单胞菌CM11的土盆促生效果；

图5：假单胞菌CM11平板接种体系流程图；

图6：假单胞菌CM11对拟南芥主根长度及侧根数量的影响；

图7：假单胞菌CM11对拟南芥侧根(LR)及侧根原基(LRP)数量的影响；

图8：假单胞菌CM11对生菜的促生作用；

图9：假单胞菌CM11对番茄的促生作用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的培养基如下：

KB培养基：20.0g蛋白胨,10.0ml甘油,1.5g K

实施例1假单胞菌株CM11的分离、筛选及鉴定

1、假单胞菌株CM11的分离

采集北京怀柔板栗园板栗树根际的土壤样品，采用梯度稀释法将土壤悬液涂布至KB培养基上，获取各菌株单菌落，试管保存并进行分子生物学和生物学鉴定，筛选得到假单胞菌株CM11。

2、假单胞菌株CM11的筛选

①分子生物学测定：使用KB培养基活化板栗根际分离到的细菌，从菌落中挑取菌株细胞在KB培养液中震荡培养24小时(转速：220rpm)，收集菌株细胞于无菌离心管中，采用细菌DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，作为PCR反应的模板。利用细菌16S rRNA通用引物为扩增引物，其中正向引物63F：5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’和反向引物1389R 5’-ACGGGCGGTGTGTACAAG-3’。

50μL PCR反应体系包括模板DNA 1μL，正向引物63F 2μL，反向引物1389R 2μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，ddH

PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环扩增，最后72℃延伸10min，4℃保存。

菌株的16S rDNA序列的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到约1300bp的DNA片段，测序后，利用Geneious 8.1.9软件与板栗根际极为丰富(高达50％)的假单胞菌OTU1进行比对。

②生物测定：以指示植物拟南芥进行平板共培养促生试验。挑选对植物生物量有明显促进作用的菌株。具体方法参照实施例2。经过筛选，最终获得一株能显著促进植物生长的假单胞菌株，将该菌株标记为CM11。

3、假单胞菌株CM11的鉴定

(1)形态学鉴定

假单胞菌株CM11菌体为杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动。在KB培养基上培养24小时后可形成菌落，菌落浅黄色，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。

(2)生长曲线

如图1所示，菌株CM11的生长曲线显示，菌株CM11的延滞期为0-2h，对数生长期为2-44h左右，44h后进入稳定期。生长速度极快，且最终能达到较高的浓度。

(3)分子鉴定

对假单胞菌株CM11的基因组DNA进行了基因组重测序，在线与其他已知假单胞菌株基因组进行比较分析，并构建系统发育树(图2)。从进化树上看，假单胞菌株CM11的基因组与油菜假单胞菌株Pseudomonas brassicacearum subsp.brassicacearum NFM421较为接近，但从平均核酸相似度(Average Nucleotide Identity,ANI)来看，假单胞菌株CM11与荧光假单胞菌(P.fluorescens)的ANI最高，为88.14％，与油菜假单胞菌株Pseudomonasbrassicacearum subsp.brassicacearum NFM421的ANI为88.05％，与P.mediterranea的ANI为86.48％，与P.corrugata的ANI为86.31％，与P.thivervalensis的ANI为86.31％。因此，根据目前ANI<95％为新种的标准，本发明提供的假单胞菌株可以鉴定为假单胞菌株(Pseudomonas sp.)，但无法归属于现有的任何一个种或亚种，即

(4)菌种保藏

该菌于2019年11月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.18906。

实施例2假单胞菌株CM11对拟南芥的促生作用

1、比较本发明的假单胞菌株CM11与猴假单胞菌(Pseudomonas simiae)WCS417(目前研究报道最多的促生假单胞菌)的平板促生效果

实验方法：将假单胞菌株CM11与猴假单胞菌(Pseudomonas simiae)WCS417接种于KB液体培养基中，在28℃，转速为200rpm条件下振荡培养12h，获得菌株的悬浮液。然后将菌液在5000rpm条件下离心5min，倒掉上清液，用硫酸镁溶液重悬菌株细胞。反复两次以洗脱培养液。通过测量OD600吸光值鉴定菌液细胞浓度，调节至OD600＝1.0(大概10

将拟南芥种子表面消毒并春化后，播种至无糖1/2MS培养基中。培养皿竖直插入合适的光照培养箱内培养(温度22℃，湿度60％，长日照条件16h/8h)。在植物的主根伸长至约3cm时，将浓度10

实验结果：图3A-3C展示了本发明的假单胞菌株CM11对模式植物拟南芥在平板中的生长具有显著的促进作用。接种10d后，地上和地下部鲜重分别是对照的3.4倍和2.4倍。可作为促生菌株应用。对照菌株WCS417对拟南芥也有促生作用，接种10d后，地上地下部鲜重分别是对照的2.9倍和2.1倍。相比之下，CM11的促生作用更显著，尤其对地上部鲜重的促进作用显著高于WCS417(P≤0.05)，且显著抑制主根生长、明显增加了侧根的数量。

2、假单胞菌株CM11的土盆促生效果

实验方法：假单胞菌株CM11接种于KB液体培养基中，在28℃，转速为200rpm条件下振荡培养12h，获得菌株的悬浮液。通过测量OD600吸光值鉴定菌液细胞浓度，调节至大概10

将拟南芥种子表面消毒并春化后，播种至1/2MS培养基中。培养皿竖直插入合适的光照培养箱内培养(温度22℃，湿度60％，长日照条件16h/8h)。在植物的主根伸长至约3cm时，将拟南芥移栽到土盆。将浓度10

实验结果：图4展示了本发明的假单胞菌株CM11对模式植物拟南芥在土盆中的生长具有显著的促进作用。接种10d后，地上和地下部鲜重分别是对照的3.9倍和2.8倍。可作为促生菌株应用。

实施例3假单胞菌株CM11对植物根系结构的影响

1、平板接种体系的建立

实验方法：假单胞菌株CM11接种于KB液体培养基中，在28℃，转速为200rpm条件下振荡培养12h，获得菌株的悬浮液。(1)将菌液在5000rpm条件下离心5min，转移发酵液至另一无菌试管，用硫酸镁溶液重悬菌株细胞。反复两次以洗脱培养液。通过测量OD600吸光值鉴定菌液细胞浓度，分别调节菌液浓度至10

将拟南芥种子表面消毒并春化后，播种至1/2MS培养基中。培养皿竖直插入合适的光照培养箱内培养(温度22℃，湿度60％，长日照条件16h/8h)。设置以下几组对比试验：(1)出苗后，将拟南芥转移至无糖1/2MS培养基，或保持其在含有0.5％蔗糖的1/2MS培养基继续生长。(2)种子培养4d后或种子培养7d后接种。(3)接种不同浓度的菌液或接种发酵液。(4)在不同位置接种，包括根尖、下胚轴、整根及根尖下方1cm。以接种无菌悬液或无菌培养基的植株作为对照(Mock)。继续培养10d后，通过扫描设备对植物根系进行成像，并用ImageJ软件统计主根长度和侧根数量。

实验结果：如表1，假单胞菌株CM11诱导的典型根系表型描述为：抑制主根生长，诱导侧根数量显著增加。具体对比试验结果如下参见表1(1)-(4)：(1)在添加蔗糖和不添加蔗糖的1/2MS培养基上，CM11均可诱导明显的根系表型。(2)出苗后4d和7d接种，CM11均可诱导明显的根系表型。(3)接种不同浓度的CM11菌悬液均可诱导明显的根系表型。菌悬液浓度越高，所诱导的根系表型越明显。接种无菌发酵液可以诱导侧根数量显著增加，但不影响主根生长。(4)将CM11接种在根尖、整根及根尖下方1cm，均可诱导明显的根系表型。接种在下胚轴处，主根生长稍微受到抑制，但受抑制程度明显小于其它部位；侧根数量受到诱导，但受诱导程度小于接种整根和根尖。

表1拟南芥与假单胞菌CM11平板共培养对比试验

(1)在有糖和无糖1/2MS培养基上接种

(2)种子培养4d和7d后接种

(3)不同浓度菌悬液及发酵液接种

(4)在不同位置接种

综合以上结果，如图5，我们建立了周期短且根系表型稳定的拟南芥-假单胞菌平板互作体系。即：将拟南芥种子表面消毒并春化后，播种至1/2MS培养基中。培养皿竖直插入合适的光照培养箱内(温度22℃，湿度60％，长日照条件16h/8h)培养3d。将拟南芥转移至无糖1/2MS培养基，缓苗1d。将浓度10

2、比较假单胞菌株CM11与猴假单胞菌(Pseudomonas simiae)WCS417对拟南芥根系结构的影响

实验方法：依照上述平板互作体系，在接种后10d扫描根系，并测量主根伸长长度、接种点上方侧根数量、最长主根长度及每条侧根平均产生的二级侧根数量。

实验结果：如图3A和3C，接种CM11后，拟南芥的主根长度显著变短。接种10d后主根仅平均伸长了1.3cm，而对照植株主根伸长了5.7cm，接种对照假单胞菌WCS417的植株主根伸长了6.4cm，表现为促进主根伸长。

接种CM11后侧根数目显著增加。表现为接种点以上的根段，接种CM11的植株平均形成5.6条侧根，高于对照植株3.5条，略高于接种WCS417的植株平均4.9条。然而，除了诱导侧根数目增多，CM11诱导的侧根长度也显著增长，而且其上着生的二级侧根数目也显著提高。而接种对照菌株WCS417的植株并不表现这一根表型。

假单胞菌株CM11可以：1.显著提高生物量，促进作物丰产。2.抑制主根伸长，促进侧根生长和总根面积的增加，在生产中可利用此菌株起到矮杆促壮的作用，实现增产，利于机械化栽培。3.园艺作物及其他经济作物在组培及压条扦插扩繁时可利用此菌株促进生根，提高效率。

3、假单胞菌株CM11对拟南芥主根生长的影响

实验方法：依照上述平板互作体系，在接种后6h，12h，24h，30h，36h，48h，60h，72h扫描根系，并测量主根长度。接种后1d，2d，3d，将根尖用碘化丙啶对细胞壁染色。使用LeicaSP2激光共聚焦扫描显微镜拍照，并测量分生区长度。

实验结果：如图6，接种CM11的植株在接种后24-30h主根生长速度显著下降，接种后30h主根长度几乎不再增加。接种后1d根尖分生区长度显著下降，接种后2d,3d根尖分生区长度进一步缩短为对照的21.6％。

4、假单胞菌株CM11对拟南芥侧根及侧根原基数量的影响

实验方法：依照上述平板互作体系，在接种后1d，2d，3d扫描根系，并记录侧根数量。

将包含报告基因pPLT7::GUS的转基因拟南芥培养7d后，接种CM11。接种后1d、2d、3d分别计数拟南芥侧根原基数量并观察侧根原基的发育特征。使用Nomarski光学显微镜观察GUS标记。

实验结果：如图6，接种CM11的植株在接种后1d无侧根生长；接种后2d，在主根接种点上方平均形成2.2条侧根，而在对照根中几乎未观察到侧根出现。接种后3d，在主根接种点上方平均形成2.8条侧根，而在对照根中仅平均形成0.9条侧根。

如图7，接种后3d，主根接种点上方平均形成3.3个侧根原基，而对照同一位置无侧根原基。表明CM11改变了侧根形成节律，显著促进了接种点上方侧根原基的形成。

实施例4假单胞菌株CM11对生菜的促生作用

实验方法：假单胞菌株CM11接种于KB液体培养基中，在28℃，转速为200rpm条件下振荡培养12h，获得菌株的悬浮液。通过测量OD600吸光值鉴定菌液细胞浓度，调节至大概10

将生菜种子(北散生4号)浸种并催芽后，播种至土盆。待生菜长出真叶后，将浓度10

实验结果：图8展示了本发明的假单胞菌株CM11对生菜在土盆中的生长具有显著的促进作用。接种10d后，地上和地下部鲜重分别是对照的2.4倍和8.2倍(P≤0.01)。

实施例5假单胞菌株CM11对番茄的促生作用

实验方法：假单胞菌株CM11接种于KB液体培养基中，在28℃，转速为200rpm条件下振荡培养12h，获得菌株的悬浮液。通过测量OD600吸光值鉴定菌液细胞浓度，调节至大概10

将番茄种子(AC)浸种并催芽后，播种至土盆。待番茄长出真叶后，将浓度10

实验结果：图9展示了本发明的假单胞菌株CM11对生菜在土盆中的生长具有显著的促进作用。接种10d后，地上和地下部鲜重分别是对照的2.2倍和1.6倍(P≤0.01)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。