用于激活骨祖细胞中细胞信号传导的肽

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年7月19日提交的美国临时申请第62/700,743号的权益，其全部公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

关于在联邦政府资助的研究和开发下做出的发明的权利的声明

本发明在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号AR061366下的政府支持下完成。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

骨质疏松症是由于雌激素缺乏和衰老而导致骨脆性增加的疾病。这是一个重大的公共卫生问题，近50％的白种女性和25％的白种男性一生有患骨质疏松性骨折的风险(国家骨质疏松基金会(National Osteoporosis Foundation)出版)。此外，美国每年发生超过200万例骨质疏松性骨折，其中27％的椎骨骨折和14％的髋骨骨折。因此，尤其是随着我们人口老龄化的全球迅速增长，骨质疏松症代表着重大的健康问题。

衰老与骨髓骨骼骨祖细胞的减少和支持这些骨祖细胞分化为成骨细胞以形成骨的适当微环境有关。随着衰老，骨髓中的间充质干细胞(MSC)数量的下降导致骨发生减少，并且可能是导致骨形成减少和骨脆性增加的最重要因素(Heersche,J.N.,C.G.Bellows和Y.Ishida,J Prosthet Dent,1998,79(1):第14-6页；Ettinger,M.P.,Arch Intern Med,2003.163(18):第2237-46页)。当前，几乎所有针对骨质疏松症的治疗都是通过减少破骨细胞性骨吸收来减少骨流失，从而预防骨的进一步破坏。重要地，这类抗再吸收药物不能恢复失去的骨结构。当前可增强骨形成的药物包括hPTH(1-34)(特立帕肽)、PTHrp(阿巴洛肽，Abaloparatide)和Evenity(罗莫珠粒单抗(Romosozumab))，并已获得FDA批准用于治疗骨质疏松症。阿巴洛肽可能比特立帕肽更有效，并且与特立帕肽相比，在骨重塑解偶联的情况下，骨折复位的起效更快。在临床前研究中，特立帕肽和阿巴洛肽的治疗限于2年，并注意到存在骨肉瘤的风险的黑框警告。不推荐将特立帕肽和阿巴洛肽用于骨肉瘤风险较高、放射史、原发性甲状旁腺功能亢进和任何形式的继发性甲状旁腺功能亢进的患者。此外，所有目前的药物制剂都可以将椎骨骨折的风险降低约50％或更高，但是他们在减少髋骨骨折方面的努力仍然很低。

通过增加成骨细胞的数量和/或活性来靶向骨形成的治疗方式可能是用于增强骨形成和促进骨再生的更有吸引力的方法。尽管通过诱导从MSC的骨发生进行骨再生是治疗骨质疏松症的合理策略，但由于MSC无法迁移至骨表面，因此体内全身性输注MSC未能促进骨的成骨应答，这是对于MSC移植的主要的临床问题(Gao,J.,等,Cells Tissues Organs,2001.169(1):第12-20页；Meyerrose,T.E.,等,Stem Cells,2007,25(1):第220-7页)。此外，MSC的移植需要使用化学疗法和/或放射的供体消融，这可能导致对内源性间充质细胞的伴随损害(Bacigalupo,A.,Best Pract Res Clin Haematol,2004,17(3):第387-99页)。

细胞粘附是这样的过程：通过该过程细胞彼此联系，朝向特定靶标迁移或定位在细胞外基质内。细胞粘附构成了许多生物学现象背后的基本机制之一。对细胞粘附的分子基础的研究表明，各种细胞表面大分子(统称为细胞粘附分子或受体)介导细胞-细胞和细胞-基质相互作用。例如，细胞表面受体整联蛋白家族的成员介导细胞-细胞和细胞-基质相互作用并调节细胞运动性、迁移、存活和增殖(Hynes,Cell,69:11-25(1992)；Hynes,Cell,1110:673-687(2002))。整联蛋白是由两个亚基α和β组成的非共价异二聚体复合物。存在至少18个不同的α亚基和至少8个不同的β亚基。

骨髓内的间充质干细胞具有多谱系潜能，并且代表了包含成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的间充质衍生的细胞类型的前体的混合物(Owen,M.等,Ciba Found Symp,1988,136:第42-60页；Bruder,S.P.,等,J Cell Biochem,1994,56(3):第283-94页；Prockop,D.J.,Science,1997,276(5309):第71-4页)。所有成熟阶段的骨细胞严重依赖于细胞-基质和细胞-细胞相互作用(Mukherjee,S.,等,J Clin Invest,2008,118(2):第491-504页；Grzesik,W.J.和P.G.Robey,J Bone Miner Res,1994,9(4):第487-96页；Vukicevic,S.,等,Cell,1990,63(2):第437-45页；Mbalaviele,G.,等,J Bone Miner Res,2006,21(12):第1821-7页)。骨髓是定型成骨细胞祖细胞所在的位置，成骨分化是MSC谱系定型的默认途径(Halleux,C.,等,J Musculoskelet Neuronal Interact,2001,2(1):第71-6页；Muraglia,A.,等,J Cell Sci,2000,113(Pt 7):第1161-6页)。动员成骨细胞祖细胞到骨表面是成骨细胞成熟并形成矿化组织的关键步骤(Adams,G.B.,等,Nature,2006,439(7076):第599-603页；Chen,X.D.,等,J Bone Miner Res,2007,22(12):第1943-56页)。一旦成骨细胞祖细胞“定向”到骨表面，它们会合成包括骨钙蛋白、骨桥蛋白、骨唾液蛋白、骨粘连蛋白、胶原蛋白-I和纤连蛋白的一系列蛋白，其将进一步增强成骨细胞的粘附和成熟(Gronthos,S.,等,Periodontol 2000,2006,41:第188-95页；Gronthos,S.,等,Bone,2001,28(2):第174-81页；Gronthos,S.,等,J Bone Miner Res,1997,12(8):第1189-97页)。这些相互作用主要由跨膜整联蛋白受体介导，该受体主要利用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列来识别并结合特定的配体。MSC表达整联蛋白α1、α2、α3、α4、α6、α11、CD51(整联蛋白αV)和CD29(整联蛋白β1)(Brooke,G.,等,Stem Cells Dev,2008)。据报道整联蛋白α

双膦酸盐广泛用于治疗骨质疏松症。这类药物也用作“媒介物”，用于将靶向骨的药物递送到骨组织作为基于其双膦酸盐部分的前药。双膦酸盐已用于将缓释双氯芬酸(非甾体类抗炎药)递送至大鼠的骨中(Hirabayashi,H.,等,J Control Release,2001,70(1-2):第183-91页)。对于该药物递送所需的双膦酸盐剂量通常比治疗骨质疏松症、低钙血症、佩吉特病或转移性骨癌所需的剂量低10倍至100倍。

众所周知，骨形成有益于治疗哺乳动物中各种不同的疾病，包括简单的衰老、骨变性和骨质疏松症、骨折愈合、融合或关节固定、骨发生不全等，以及用于成功地安装各种医用骨科和牙周植入物，例如螺钉、棒、用于脊柱融合的钛笼、髋关节、膝关节、踝关节、肩关节、牙板和棒等。

使用组织蛋白酶K抑制剂和TGF-β结合蛋白等来增加骨矿化以治疗至少部分以骨吸收增加(例如骨量减少、骨折、骨质疏松症、关节炎、肿瘤转移、佩吉特病和其他代谢性骨病症)为特征的疾病是众所周知的，如由2004年11月25日公开的Selwyn Aubrey Stoch的美国公开第2004/0235728号和Mary E.Brunkow等的美国专利第6,489,445号和2004年1月15日公开的美国公开第2004/0009535号所示。在Brunkow的445号专利和535号公开中，TGF-β结合蛋白包括干扰TGF-β结合蛋白骨硬化蛋白与TGF-β超家族成员(特别是骨形态发生蛋白)之间的相互作用的Sost多肽(全长和短肽)抗体。在Brunkow的445专利中描述了人类TGF-β结合蛋白的新家族和编码它们的核酸。该蛋白质至少与人骨形态发生蛋白-5和人骨形态发生蛋白-6结合。前述疾病是由于骨矿物质的全身性丧失，因此抗体治疗剂的施用是用于骨矿物质密度的全身性(全身)增加。

2006年7月27日公开的美国公开第2006/0165799号教导了用于刺激骨形成和骨固结的骨填充组合物，其包含生物相容性硫酸钙和粘性生物聚合物。该组合物旨在施用于受伤的骨头的缺失部分而不会扩散到周围器官。

2005年11月17日公开的美国公开第2005/025604号显示了通过机械地诱导成骨细胞活性的增加和升高骨合成代谢剂的全身性血液浓度(包括任选地升高抗骨质再吸收剂的全身性血液浓度)来诱导骨形成。

2009年8月18日授权的美国专利第7,576,175号示出了表现出高的结合亲和力、特异性和稳定性的α

2010年1月28日公开的美国公开第2010/0021379号示出了包含与抗体或其片段共价连接的靶向剂的抗体缀合物。靶向剂包含配体，该配体包含对整联蛋白受体例如α

现有技术中需要的是用于治疗骨质疏松症和促进骨生长的新的组合物和方法。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供了根据式I的化合物：

或其药物可接受的盐，

其中：

R

R

各R

X

X

L为接头；

D为膦酸盐药物；以及

下标m、n、p和q各自独立地为0至4的整数。

在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含如本文所述的化合物或其药物可接受的盐，以及一种或多种药物可接受的赋形剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗骨质疏松症的方法。该方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的化合物或其药物可接受的盐，或者包含治疗有效量的如本文所述的化合物或其药物可接受的盐的药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了促进骨生长的方法。该方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的化合物或其药物可接受的盐，或者包含治疗有效量的如本文所述的化合物或其药物可接受的盐的药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗低骨量的方法。该方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的化合物或其药物可接受的盐，或者包含治疗有效量的如本文所述的化合物或其药物可接受的盐的药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗以继发性低骨量为特征的疾病或病况的方法。该方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的化合物或其药物可接受的盐，或者包含治疗有效量的如本文所述的化合物或其药物可接受的盐的药物组合物。

附图说明

图1示出了用于筛选对成骨细胞特异性转录因子(osterix)+骨祖细胞具有亲和力的细胞信号传导激活剂的流程图。

图2示出了淋巴细胞结合。从血液中提取外周单个核细胞，并与显示乱序(scramble)、YLL3或YLL8肽的珠粒一起孵育1小时。

图3是关于在10天培养之后YLL3、YLL8和LLP2A肽对骨祖细胞结合亲和力的比较。

图4是在10天培养之后YLL3、YLL8和LLP2A肽对骨祖细胞中Akt信号传导的活化的比较。

图5是几种YLL肽关于骨祖细胞中骨发生的比较。14天之后测量碱性磷酸酶水平。21天之后，使用茜素红染色测量成骨细胞的成熟和矿化。

图6A至图6D示出了YLL3和YLL8在体外刺激了骨发生。将骨髓基质细胞与显示YLL3或YLL8肽的自动荧光猝灭的珠粒在成骨培养基中一起孵育。图6A示出了YLL3和YLL8珠粒在第10天的碱性磷酸酶(ALP)或在第21天的茜素红(AR)水平的定量测量。图6B示出了在第10天的与显示YLL3或YLL8的珠粒一起培养的BMSC中ALP染色的代表性图像。图6C示出了在第21天的与显示YLL3或YLL8的珠粒一起培养的BMSC中AR染色的代表性图像。图6D示出了在成骨培养基中与6×10

图7A至图7C示出了使用YLL8激活Akt信号传导。图7A是Akt信号传导阵列的布局。图7B示出了在成骨培养基中与6x10

图8是YLL3、YLL8和LLP2A肽对青年小鼠骨量的治疗的比较。

图9A至图9E示出了YLL3和YLL8对青年小鼠骨量的体内合成代谢作用。将两个月大的雌性和雄性小鼠用PBS对照、50μg/kg的YLL3或YLL8或者25μg/kg的PTH，皮下注射，每周5次，治疗21天(n＝4-6/组)。所有小鼠在安乐死前-7天和-2天均接受钙黄绿素。在股骨远端测量小梁骨体积和基于表面的骨形成，并且在股骨中部测量皮质骨体积和骨形成(图9A、图9B和图9C)。图9D示出了取自雄性小鼠的小梁骨样品的代表性图像。图9E示出了取自雄性小鼠的皮质骨样品的代表性图像。*，p＜0.05，相对于PBS。

图10A至图10D示出了YLL8对体内骨形成的影响。将四个月大的雌性和雄性小鼠用PBS对照、5μg/kg(～6x10

图11示出了YLL对青年小鼠的小梁骨体积、骨钙蛋白和CTX-1的合成代谢作用。将四个月大的雌性和雄性小鼠用PBS对照、5μg/kg的YLL3、5μg/kg的YLL8或25μg/kg的PTH，皮下注射，每周5次，治疗28天(n＝4-6/组)。通过股骨远端的微CT扫描获得小梁骨体积。在血清中测量骨钙蛋白和CTX-1。

图12示出了Prx1和成骨细胞特异性转录因子在骨中的表达。对于Prx1-GFP(绿色，左)和成骨细胞特异性转录因子-mCherry(红色，右)小鼠示出了代表性股骨远端。

图13A至图13D示出了使用YLL3在骨折愈合中的骨痂矿化。使雌性Prx1-GFP/ERT小鼠在两个月大时骨折，并以10mg/kg的剂量接受它莫西芬三天。YLL3或YLL8以10μg/kg给出，hPTH(1-34)以50μg/kg给出，皮下注射，每周5次，持续10或21天。在安乐死前-1天给予茜素红。图13A示出了在第10天来自Prx1-GFP/ERT小鼠的代表性股骨骨折图像。图13B示出了骨折后第10天在指定的治疗组中来自骨痂外边缘的代表性骨痂图像，以及骨折后第10天来自指定治疗组的骨痂、骨痂骨体积骨矿物质含量的代表性微CT厚度图。图13C示出了在第21天来自Prx1-GFP/ERT小鼠的代表性骨折的股骨图像。图13D示出了骨折后第21天来自指定治疗组的骨痂外边缘的代表性骨痂图像，以及骨折后第21天来自指定治疗组的骨痂、骨痂骨体积和骨矿物质含量的代表性微CT厚度图。

图14示出了YLL3-Ale和YLL8-Ale缀合物的合成方案。

图15A至图15C示出了用以下治疗的两个月大的雌性小鼠：PBS对照；100μg/kg或300μg/kg的YLL3-Aln或YLL8-Aln，皮下注射，每两周一次，2剂；或500μg/kg的YLL3-Aln或YLL8-Aln，一次静脉注射剂量。在第28天对小鼠实施安乐死(n＝4-5/组)。图15A示出了定量的小梁骨体积和小梁骨厚度。图15B示出了在指定的治疗组中取自股骨远端的小梁区域的代表性3D图像。图15C示出了在指定治疗组中通过股骨中段皮质的微CT代表性图像在股骨中测量的股骨中段皮质骨体积和皮质骨厚度。*，p＜0.05，相对于PBS。

图16示出了用PBS对照、分别100μg/kg或300μg/kg的YLL3-Aln或YLL8-Aln，皮下注射，每两周一次，治疗28天的两个月大的雌性小鼠(n＝4-6/组)。在股骨远端干骺端中测量小梁骨形成。*，p＜0.05，相对于PBS。箭头示出了双标记的骨表面。

具体实施方式

本发明提供拟肽配体化合物、包含所述化合物的药物组合物以及使用所述化合物的方法。拟肽配体也可以与膦酸盐药物如阿仑膦酸盐缀合。本发明的化合物和药物组合物由于其激活Akt信号传导的能力而可用于促进骨生长、治疗骨质疏松症、治疗低骨量以及治疗以继发性低骨量为特征的疾病或病况。

I.定义

本文使用的缩写具有其在化学和生物学领域内常规含义。

如本文所用，术语“Ale”、“Aln”或“Alen”是指阿仑膦酸盐。

当取代基基团由其常规化学式从左至右书写指定时，它们同样涵盖从右至左书写结构而产生的化学相同的取代基，例如，-CH

如本文所用，除非另外说明，否则术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一个取代基的一部分意指氟、氯、溴或碘原子。

如本文所用，术语“烷基”是指具有指定碳原子数的直链或支链的饱和脂族基团。例如，C

如本文所用，术语“卤代烷基”是指如上所定义的烷基，其中一些或全部氢原子被卤素原子取代。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1,2,3,4,5-五氟-苯基等。术语“全氟”定义了具有至少两个可用的被氟取代的氢的化合物或基团。例如，全氟苯基是指1,2,3,4,5-五氟苯基，全氟甲烷是指1,1,1-三氟甲基，全氟甲氧基是指1,1,1-三氟甲氧基。

如本文所用，术语“杂烷基”是指具有1至3个杂原子如N、O和S的烷基。另外的杂原子也可以是有用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)

如本文所用，术语“烷氧基”是指包含氧原子的烷基，例如甲氧基，乙氧基等。

如本文所用，术语“芳基”是指包含6至16个环碳原子的单环或稠合双环、三环或更多环的芳族环组合体。例如，芳基可以是苯基、苄基或萘基，优选苯基。“亚芳基”意指衍生自芳基的二价基团。芳基可以被选自烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基-烷基、三氟甲基、亚烷二氧基和氧基-C

如本文所用，术语“杂芳基”是指包含5至16个环原子的单环或稠合双环或三环芳族环组合体，其中1至4个环原子为杂原子。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、或者任何其他被例如烷基、硝基或卤素取代的(尤其是单取代或双取代的)基团。吡啶基代表2-、3-或4-吡啶基，有利地2-或3-吡啶基。噻吩基代表2-或3-噻吩基。喹啉基优选代表2-、3-或4-喹啉基。异喹啉基优选代表1-、3-或4-异喹啉基。苯并吡喃基、苯并硫代吡喃基分别优选代表3-苯并吡喃基或3-苯并硫代吡喃基。噻唑基优选代表2-或4-噻唑基，最优选代表4-噻唑基。三唑基优选为1-(1,2,4-三唑基)、2-(1,2,4-三唑基)或5-(1,2,4-三唑基)。四唑基优选为5-四唑基。

芳基和杂芳基的取代基是各种各样的，并且选自：-卤素、-OR’、-OC(O)R’、-NR’R”、-SR’、-R’、-CN、-NO

如本文所用，术语“环烃基”是指包含3至12个环原子或指定原子数的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥连多环环组合体。例如，C

如本文所用，每个以上术语(例如，“烷基”、“芳基”和“杂芳基”)意在包括所指定基团的取代和未取代形式。

烃基和杂烃基(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自但不限于以下的多种基团中的一个或多个：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO

如本文所用，术语“肽”是指由D-或L-氨基酸的单链或通过肽键连接的D-或L-氨基酸的混合物组成的化合物。通常，肽的长度为约2至约50个氨基酸。优选地，本发明的肽的长度为约2至约25个氨基酸，更优选长度为3至20个氨基酸，最优选长度为3至10个氨基酸。

如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的、非天然的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

如本文所用，术语“天然存在的氨基酸”是指由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱胺酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及其组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱胺酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)及其组合。

如本文所用，术语“非天然氨基酸”包括但不限于以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的L-构型或D-构型的氨基酸类似物、氨基酸模拟物、合成氨基酸、N

如本文所用，术语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢连接的α碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。

如本文所用，术语“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。合适的氨基酸模拟物包括但不限于β-氨基酸和γ-氨基酸。在β-氨基酸中，氨基与羧基的β-碳原子键合，使得在氨基与羧基之间存在两个碳原子。在γ-氨基酸中，氨基与羧基的γ-碳原子键合，使得在氨基与羧基之间存在三个碳原子。β-氨基酸或γ-氨基酸的合适的R基团包括但不限于存在于天然存在的氨基酸和非天然氨基酸中的侧链。

如本文所用，术语“N

氨基酸可以通过几个特性中的至少一个来表征。例如，氨基酸可以是带正电荷的、带负电荷的、亲水的或疏水的。

如本文所用，术语“带正电荷的氨基酸”是指在低于pKa的pH值下具有碱性或带正电荷的侧链的那些氨基酸，包括但不限于Lys、Arg、His、HoArg、Agp、Agb、Dab、Dap和Orn及其立体异构体。碱性氨基酸通常可以用符号“X

如本文所用，术语“带负电荷的氨基酸”是指在高于pKa的pH值下具有酸性或带负电荷的侧链的氨基酸，并且包括但不限于Asp、Glu、Aad、Bec及其立体异构体。酸性氨基酸通常可以用符号“X

如本文所用，术语“中性电荷的氨基酸”是指在等于pKa的pH值下具有中性电荷的侧链的那些氨基酸。

如本文所用，术语“亲水性氨基酸”是指具有极性和不带电荷的侧链的那些氨基酸，包括但不限于Asn、Ser、Thr和Gln。

如本文所用，术语“疏水性氨基酸”是指具有疏水性侧链的那些氨基酸，包括但不限于Val、Leu、Ile、Met和Phe。在一些实施方案中，疏水性氨基酸选自脯氨酸、脯氨酸类似物及其立体异构体。在一些实施方案中，脯氨酸类似物是羟脯氨酸。

如本文所用，术语“D-氨基酸”是指氨基酸的D立体异构体。字母D和L通常在本领域中用于指氨基酸的立体异构体。D-氨基酸是可以由甘油醛的右旋同分异构体，即D-甘油醛合成的那些氨基酸。类似地，L-氨基酸是可以由甘油醛的左旋同分异构体即L-甘油醛合成的那些氨基酸。

氨基酸在本文中可以用IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的众所周知的三个字母符号或一个字母的符号表示。同样，核苷酸可以用它们普遍接受的单字母代码来表示。

关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个替换、删除或添加(其改变、添加或删除编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中该改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸(即，疏水的、亲水的、带正电荷的、中性的、带负电荷的)替换。该化学上类似的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸如L-氨基酸，天然存在的氨基酸的立体异构体如D-氨基酸，和非天然氨基酸如氨基酸类似物、氨基酸模拟物、合成氨基酸、N-取代的甘氨酸和N-甲基氨基酸。示例性的疏水性氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。示例性的芳族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。示例性的脂族氨基酸包括丝氨酸和苏氨酸。示例性的碱性氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。示例性的具有羧酸盐侧链的氨基酸包括天冬氨酸盐和谷氨酸盐。示例性的具有甲酰胺侧链的氨基酸包括天冬酰胺和谷氨酰胺。提供功能上类似的氨基酸的保守替换表是本领域众所周知的。这样的保守修饰的变体是本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。

提供功能上类似的氨基酸的保守替换表是本领域众所周知的。例如，可以进行这样的替换：其中脂族氨基酸(例如，G、A、I、L或V)被组中的另一个成员替换。类似地，脂族极性不带电荷的基团，例如C、S、T、M、N或Q，可以被该组中的另一个成员替换；碱性残基例如K、R或H可以彼此替换。在一些实施方案中，具有酸性侧链的氨基酸，例如E或D，可以分别被其不带电荷的对应物例如Q或N取代；或反之亦然。以下八个组中的每一组均包含其他示例性氨基酸，它们是彼此的保守替换：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱胺酸(C)、甲硫氨酸(M)

(参见，例如，Creighton,Proteins(1984))。

如本文所用，术语“接头”是指具有一个或多个不同的反应性官能团的部分，其允许将诸如肽的部分与螯合剂共价连接。在一些实施方案中，连接部分具有两个不同的反应性官能团，即，异双官能接头。合适的接头包括但不限于可从Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL)获得的那些。在一些实施方案中，接头提供用于螯合剂的连接的羧基和用于肽的连接的氨基。然而，本领域技术人员理解，接头上可以存在任何反应性官能团，只要其与待共价连接的部分上的官能团相容即可。

可用于本发明的接头包括具有一个或多个不同的反应性官能团的那些，其允许将诸如肽的部分与螯合剂共价连接。连接部分具有两个或更多个不同的反应性官能团。在某些情况下，可以使用多价接头。合适的接头包括但不限于可从Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL)获得的那些。在一些实施方案中，接头提供用于螯合剂的连接的羧基和用于肽的连接的氨基。然而，本领域技术人员理解，接头上可以存在任何反应性官能团，只要其与待共价连接的部分上的官能团相容即可。如本文所用，术语“螯合剂-接头缀合物”是指与接头共价连接的螯合剂。这样的螯合剂-接头缀合物可以通过接头上存在的官能团与肽连接。一些合适的接头包括但不限于β-丙氨酸，2,2’-亚乙二氧基双(乙胺)单琥珀酰胺(Ebes)和双(Ebes)-Lys。其他合适的接头包括具有生物素的那些。另外的接头可以在Bioconjugate Techniques,Greg T.Hermanson,Academic Press,第2版,2008中找到(通过引用整体并入本文)。

如本文所用，术语“盐”是指在本发明的方法中使用的化合物的酸式盐或碱式盐。药物可接受的盐的说明性实例是无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)盐，有机羧酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)，有机磺酸(甲磺酸)盐，季铵(甲基碘、乙基碘等)盐。可以理解，药物可接受的盐是无毒的。关于合适的药物可接受的盐的另外的信息可以例如在R

本发明的酸性化合物的药物可接受的盐包括与碱形成的盐，即阳离子盐，例如碱金属盐和碱土金属盐，例如钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐，以及铵盐，例如铵盐、三甲基铵盐、二乙基铵盐和三-(羟甲基)-甲基-铵盐。

如本文所用，术语“水合物”是指与至少一个水分子复合的化合物。本发明的化合物可以与1至10个水分子复合。

如本文所用，术语“药物可接受的赋形剂”和“药物可接受的载体”是指有助于向个体施用活性剂并被其吸收的物质。“药物可接受的赋形剂”是指可以包含在本发明的组合物中并且不会对患者产生明显的有害毒理作用的赋形剂。药物可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、常规蔗糖、常规葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、矫味剂和色素等。本领域技术人员将认识到其他药物赋形剂可用于本发明。

如本文所用，术语“骨质疏松症”是指由于任何确定的或未确定的原因或病况导致骨脆性增加和/或骨密度降低或减小的疾病。“低骨量”或“骨量减少”是一种病况，而不是疾病，一旦骨密度随着时间的推移而持续降低，其可能发展成骨质疏松症。低骨量的特征是T评分为-1至-2.15。骨质疏松症的特征是小于-2.15的T评分。在本发明的方法所针对的明确原因或病况中，包括与更年期(自然的、早产的或手术的)、衰老或二者相关的原发性骨质疏松症，以及与医学病况(例如佩吉特病、慢性肾脏疾病、饮食失调引起的闭经、移植、甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进)或使用某些药物(例如各种癌症化学疗法、促性腺激素释放激素激动剂、用于生育控制的醋酸甲羟孕酮、皮质类固醇、抗惊厥药等)有关的继发性骨质疏松症或继发性低骨量。

如本文所用，短语“Akt信号传导”是指涉及丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶Akt(也称为蛋白激酶B或PKB)的酶促活性的多个生化途径中的任何一个。Akt本身在被磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和其他激酶磷酸化后被激活。活化的Akt使许多细胞靶磷酸化，从而调节包括但不限于以下的过程：细胞活力、血管生成、骨发生以及与细胞活力相关的细胞代谢。

如本文所用，术语“同分异构体”是指具有相同化学式但在结构上可区分的化合物。

如本文所用，术语“互变异构体”是指两种或更多种结构同分异构体中的一种，其平衡存在并且其易于从一种同分异构体形式转化为另一种。

如本文所用，术语“患者”或“个体”是指患有或倾向于可通过施用本文所提供的药物组合物来治疗的病况的活生物体。非限制性实例包括人、其他哺乳动物和其他非哺乳动物。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指可用于治疗或改善已鉴定的疾病或病况或表现出可检测的治疗作用或抑制作用的缀合功能剂或药物组合物的量。该作用可以通过本领域已知的任何测定方法来检测。

如本文所用，术语“治疗”是指成功治疗或改善损伤、病理或病况的任何表示，包括任何客观或主观参数，例如消减；缓解；减轻症状或使患者更能忍受伤害、病理或病况；变性或衰退的速度减慢；使变性的最终点减少衰弱；改善患者的身心健康。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括身体检查、神经精神病学检查和/或精神病学评估的结果。例如，本发明的方法通过减少意识或认知障碍的发生率成功地治疗患者的谵妄。

如本文所用，术语“病症”或“病况”是指能够用本发明的拟肽配体化合物治疗的患者或个体的状态或健康状况。

如本文所用，术语“一”、“一个”或“一种”在用于本文中的一组取代基或“取代基团”时意指至少一个/一种。例如，当化合物被烷基或芳基取代时，该化合物任选被至少一个烷基和/或至少一个芳基取代，其中每个烷基和/或芳基任选地不同。在另一个实例中，当化合物被取代基取代时，该化合物被至少一个取代基取代，其中每个取代基任选地不同。当基团可以被多个取代基中的一个或多个取代时，选择这样的取代基以符合化学键合的原理，并产生这样的化合物：其不是固有地不稳定的和/或不是本领域普通技术人员已知在诸如水性、中性或生理条件的环境条件下可能不稳定的。

II.拟肽配体和膦酸盐药物缀合物

在一些实施方案中，本发明提供式I的拟肽配体化合物：

或其药物可接受的盐，其中R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，每个R

在一些实施方案中，X

天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱胺酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及其组合。

天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-氨基酸和L-氨基酸。适用于本发明的D-氨基酸包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱胺酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)及其组合。在一些实施方案中，D-氨基酸选自D-α-氨基酸、D-β-氨基酸、D-γ-氨基酸及其组合。在一些实施方案中，D-α-氨基酸选自天然存在的α-氨基酸的立体异构体、非天然D-α-氨基酸及其组合。

非天然氨基酸包括但不限于以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的L-构型或D-构型的氨基酸类似物，氨基酸模拟物，N-取代的甘氨酸，N-甲基氨基酸，苯丙氨酸类似物，以及赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)和α,γ-二氨基丁酸(Dbu)的衍生物。非天然氨基酸不是由遗传密码编码的，并且可以但不一定具有与天然存在的氨基酸相同的基本结构或功能。

用于本发明的非天然氨基酸包括但不限于氮杂环丁烷甲酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘基丙氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、哌可酸、硫代脯氨酸、氨基苯丙氨酸、羟基酪氨酸和氨基酪氨酸。

在一些其他实施方案中，非天然氨基酸选自1-氨基环戊烷-1-甲酸(Acp)、1-氨基环丁烷-1-甲酸(Acb)、1-氨基环丙烷-1-甲酸(Acpc)、瓜氨酸(Cit)、高瓜氨酸(HoCit)、α-氨基己二酸(Aad)、3-(4-吡啶基)丙氨酸(4-Pal)、3-(3-吡啶基)丙氨酸(3-Pal)、炔丙基甘氨酸(Pra)、α-氨基异丁酸(Aib)、α-氨基丁酸(Abu)、正缬氨酸(Nva)、α,β-二氨基丙酸(Dpr)、α,γ-二氨基丁酸(Dbu)、α-叔丁基甘氨酸(Bug)、3,5-二硝基酪氨酸Tyr(3,5-二NO

在一些实施方案中，非天然氨基酸残基选自表1的以下化合物：

表1.可用于本发明的非天然氨基酸。

合适的氨基酸类似物包括但不限于高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。合适的氨基酸模拟物包括但不限于β-氨基酸和γ-氨基酸。用于β-氨基酸或γ-氨基酸的合适的R基团包括但不限于存在于天然存在的氨基酸和非天然氨基酸中的侧链。

适用于本发明的N-取代的甘氨酸包括但不限于N-(2-氨基乙基)甘氨酸、N-(3-氨基丙基)甘氨酸、N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸、N-苄基甘氨酸、(S)-N-(1-苯基乙基)甘氨酸、N-环己基甲基甘氨酸、N-(2-苯基乙基)甘氨酸、N-(3-苯基丙基)甘氨酸、N-(6-氨基半乳糖基)甘氨酸、N-(2-(3'-吲哚基乙基)甘氨酸、N-(2-(对甲氧基苯基乙基))甘氨酸、N-(2-(对氯苯基乙基)甘氨酸和N-[2-(对羟基苯基乙基)]甘氨酸。N-取代的甘氨酸低聚物，在本文中称为“类肽”，已显示出蛋白酶抗性(Miller等,Drug Dev.Res.,35:20-32(1995))。这样，包含至少一种非天然α-氨基酸、D-氨基酸或其组合的类肽在本发明的范围内。

合适的N-甲基氨基酸包括N-甲基-Ala、N-甲基-Cys、N-甲基-Asp、N-甲基-Glu、N-甲基-Phe、N-甲基-Gly、N-甲基-His、N-甲基-Ile、N-甲基-Arg、N-甲基-Lys、N-甲基-Leu、N-甲基-Met、N-甲基-Asn、N-甲基-Gln、N-甲基-Ser、N-甲基-Thr、N-甲基-Val、N-甲基-Trp、N-甲基-Tyr、N-甲基-Acp、N-甲基-Acb、N-甲基-Acpc、N-甲基-Cit、N-甲基-HoCit、N-甲基-Aad、N-甲基-4-Pal、N-甲基-3-Pal、N-甲基-Pra、N-甲基-Aib、N-甲基-Abu、N-甲基-Nva、N-甲基-Dpr、N-甲基-Dbu、N-甲基-Nle、N-甲基-Nal-2、N-甲基-Nal-1、N-甲基-Cha、N-甲基-Cpa、N-甲基-Hle、N-甲基-HoSer、N-甲基-Har、N-甲基-Hcy、N-甲基-Chg、N-甲基-Bta、N-甲基-2-Thi、N-甲基-3-Thi、N-甲基-Asu、N-甲基-Acdt、N-甲基-Ahch、N-甲基-Akch、N-甲基-Actp、N-甲基-Tyr(3-NO

可用于本发明的合适的苯丙氨酸类似物包括但不限于高苯丙氨酸(HoPhe)、苯基甘氨酸(Phg)、3,3-二苯丙氨酸(Dpa)、4-氨基苯丙氨酸(Phe(4-NH

可用于本发明的赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)和α,γ-二氨基丁酸(Dbu)的合适的衍生物包括但不限于Lys38、Lys27、Lys73、Lys55、Lys28、Lys72、Lys12、Lys123、Lys63、Lys124、Lys82、Lys31、Lys15、Lys125、Lys43、Lys24、Lys5、Lys4、Lys50、Lys81、Orn38、Orn27、Orn73、Orn55、Orn28、Orn72、Orn12、Orn123、Orn63、Orn124、Orn82、Orn31、Orn15、Orn125、Orn43、Orn24、Orn5、Orn4、Orn50、Orn81、Dbu38、Dbu27、Dbu73、Dbu55、Dbu28、Dbu72、Dbu12、Dbu123、Dbu63、Dbu124、Dbu82、Dbu31、Dbu15、Dbu125、Dbu43、Dbu24、Dbu5、Dbu4、Dbu50、Dbu81、其立体异构体，及其组合。Orn和Dbu的衍生物类似于具有分别与Orn和Dbu的侧链连接的相应的羧酸的赖氨酸衍生物。Lys、Orn和Dbu衍生物的结构公开于美国专利第7,576,175号中，其通过引用并入本文。

用于本发明的合适的疏水性氨基酸包括但不限于亮氨酸(Leu)、亮氨酸类似物、苯丙氨酸(Phe)、苯丙氨酸类似物、脯氨酸(Pro)、脯氨酸类似物、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、Met、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、1-氨基环丙烷-1-甲酸(Acpc)、1-氨基环丁烷-1-甲酸(Acb)、α-环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、炔丙基甘氨酸(Pra)、环丙基丙氨酸(Cpa)、高亮氨酸(Hle)、α-氨基异丁酸(Aib)、α-氨基丁酸(Abu)、3-(2-噻吩基)丙氨酸(2-Thi)、3-(3-噻吩基)丙氨酸(3-Thi)、3-(3-吡啶基)丙氨酸(3-Pal)、3-(2-萘基)丙氨酸(Nal-2)、2-氨基-2-萘基乙酸(Ana)、酪氨酸(Tyr)、3,5-二硝基酪氨酸(Tyr(3,5-二NO

在一些实施方案中，疏水性氨基酸选自表2的化合物：

表1.可用于本发明的疏水性氨基酸。

在一些实施方案中，疏水性氨基酸选自表3的化合物：

可用于本发明的合适的亲水性氨基酸包括但不限于Asn、Ser、Thr、Gln及其立体异构体。可用于本发明的合适的带正电荷的氨基酸包括但不限于Lys、Arg、His、HoArg、Agp、Agb、Dab、Dap、Orn及其立体异构体。可用于本发明的合适的带负电荷的氨基酸包括但不限于天冬氨酸、谷氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基辛二酸、高天冬氨酸、γ-羧基-谷氨酸、4-羧基苯丙氨酸及其立体异构体。在其他实施方案中，带负电荷的氨基酸选自Aad、Bec和Bmc。

在一些实施方案中，X

在一些实施方案中，X

在一些实施方案中，化合物具有根据式Ia的结构：

或其药物可接受的盐。

在一些实施方案中，化合物具有根据式Ib的结构：

在一些实施方案中，化合物具有根据式Ic的结构：

在一些实施方案中，化合物具有根据式II的结构：

或其药物可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明提供了式I、式Ia、式Ib、式Ic或式II的化合物，其中X

在一些实施方案中，本发明提供了式I、式Ia、式Ib、式Ic或式II的化合物，其中X

在一些实施方案中，本发明提供了式I、式Ia、式Ib、式Ic或式II的化合物，其中下标m为0，并且部分–X

在一些实施方案中，式Ib的化合物选自：

在一些实施方案中，式Ic的化合物选自：

式I、式Ia和式II的L部分可以是任何合适的接头，包括但不限于具有一个或多个不同的反应性官能团的接头，所述反应性官能团允许诸如肽、单体和聚合物的部分共价连接。连接部分可具有两个或更多个不同的反应性官能团。在某些情况下，可以使用多价接头，并且本发明的多种肽和/或多种活性剂可以经由接头连接。合适的接头包括但不限于可从Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL)获得的那些。本领域技术人员理解，接头上可以存在任何反应性官能团，只要其与待共价连接的部分上的官能团相容即可。一些合适的接头包括但不限于β-丙氨酸、2,2’-亚乙二氧基双(乙胺)单琥珀酰胺(Ebes)、双(Ebes)-Lys和聚乙二醇。其他合适的接头包括经由非共价相互作用结合部分的基于亲和力的接头(例如，包含生物素的接头)。其他合适的接头包括可裂解的接头，例如二硫化物接头，例如可以在还原条件下被切割的4-((2-((2-氨基乙基)二硫烷基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸，或者可以通过蛋白酶的作用被切割的肽接头。

本领域普通技术人员将认识到，对于本发明的化合物，其他接头也是可行的。许多这样的接头可以在Greg T Hermanson的"Bioconjugate Techniques",Academic Press,San Diego,1996中找到，或通过其中叙述的技术制备，其通过引用并入本文。此外，本领域普通技术人员将认识到，可以基于如在Kolb,H.C.,Finn,M.G.,Sharpless,K.B.,Angew.Chem.Int’l.Ed.40(11):2004–2021(2001)中描述的Click化学合成技术来制备其他接头，其通过引用并入本文。可用于本发明的接头包括基于Ebes和PEG部分的那些。接头可以包括0至6个Ebes或PEG基团。Ebes和PEG基团可以通过以上引用的技术缀合。在一些实施方案中，式I、式Ia和式II的接头L包括N-(8-氨基-3,6-二氧杂-辛基)琥珀酰胺酸(Ebes)和聚乙二醇(PEG)中的至少一种。

在一些其他实施方案中，式I、式Ia和式II的接头L选自：

其中k为0至6。

式I、式Ia和式II的D部分可以是任何合适的膦酸盐药物，包括但不限于单膦酸盐、双膦酸盐和三膦酸盐。在一些实施方案中，式I、式Ia和式II的D部分是膦酸盐或双膦酸盐化合物。在一些实施方案中，式I、式Ia和式II的D部分是双膦酸盐化合物。在一些实施方案中，D部分是双膦酸盐化合物，例如但不限于依替膦酸盐(Didronel)，氯膦酸盐(Bonefos，Loron)，替鲁膦酸盐(Skelid)，帕米膦酸盐(APD，Aredia)，奈立膦酸盐，奥帕膦酸盐，阿仑膦酸盐(Fosamax)，伊班膦酸盐(Boniva)，利塞膦酸盐(Actonel)和唑来膦酸盐(Zometa)。另外的双膦酸盐在下面更详细地描述。本领域技术人员将理解，其他双膦酸盐也可用于本发明。

在一些实施方案中，式I、式Ia和式II的D部分具有下式：

其中R

在一些其他实施方案中，式I、式Ia和式II的D部分具有选自以下的式：

在一些实施方案中，式I、式Ia和式II的化合物选自：

在一些实施方案中，式I、式Ia和式II的化合物选自：

在一些实施方案中，提供了式I、式Ia和式II的化合物的盐、水合物、溶剂化物、前药形式、同分异构体和代谢物。

在一些实施方案中，本发明提供式I、式Ia和式II的化合物的同分异构体或药物可接受的盐。盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、膦酸、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、糖质酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。其他盐包括但不限于与无机碱的盐，包括碱金属盐例如钠盐、锂盐和钾盐；碱土金属盐例如钙盐和镁盐；铝盐；和铵盐例如铵盐、三甲基-铵盐、二乙基铵盐和三-(羟甲基)-甲基-铵盐。与有机碱的其他盐包括与二乙胺、二乙醇胺、葡甲胺和N,N'-二苄基乙二胺的盐。酸加成盐，例如无机酸、有机羧酸和有机磺酸，例如盐酸、甲磺酸、马来酸也是可能的，条件是碱性基团例如吡啶基构成结构的一部分。

可以通过使式I、式Ia或式II的药物可接受的盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来再生式I、式Ia和式II化合物的中性形式。式I、式Ia和式II的化合物的母体形式在某些物理特性(例如在极性溶剂中的溶解度)方面与各种盐形式不同，但在其他方面出于本发明的目的，这些盐与化合物的母体形式等同。

本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式和溶剂化形式(包括水合形式)存在。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并且涵盖在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以多种结晶形式或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本发明预期的用途是等同的，并且意在落入本发明的范围内。

本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；对映异构体、外消旋体、非对映异构体、互变异构体、几何异构体、立体异构形式，就绝对立体化学而言，可定义为氨基酸的(R)-或(S)-，或者为(D)-或(L)-并且，单独的同分异构体涵盖在本发明的范围内。本发明的化合物不包括本领域已知的太不稳定以至于不能合成和/或分离的化合物。本发明意在包括外消旋形式和光学纯形式的化合物。光学活性(R)-和(S)-、或(D)-和(L)-同分异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。

本发明还提供了前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理条件下容易发生化学变化以提供本发明的化合物的那些化合物。另外，可以在离体环境中通过化学或生化方法将前药转化为本发明的化合物。例如，当将前药与合适的酶或化学试剂一起置于经皮贴剂储库中时，前药可以缓慢转化为本发明的化合物。

本发明的化合物可以通过本领域技术人员已知的多种方法(参见RichardC.Larock的Comprehensive Organic Transformations，1989)或通过通常众所周知的合成方法的适当组合来合成。可用于合成本发明的化合物的技术对于相关领域的技术人员而言是显而易见的，并且是容易获得的。提供以下讨论以说明可用于制成本发明化合物的多种方法中的某些方法。然而，该讨论并非旨在限定可用于制备本发明化合物的反应或反应序列的范围。本领域技术人员将理解，制备化合物的其他方法可用于本发明。

1991年首次报道了“一珠粒一化合物”(one-bead one-compound，OBOC)组合库方法(Lam等,Nature,1991,354:第82-4页)。实质上当“分混(split-mix)”合成方法(Lam等,id；Houghten等,Nature,1991,354:第84-6页；Furka等,Int.J.Peptide Protein Res.,1991,37:第487-93页)用于产生组合库时，每个珠粒仅表达一个化学实体(Lam等,id；Lam等,Chem.Rev.,1997,97:第411-48页)。然后可以针对特定的受体分子(例如受体、抗体、酶、病毒、全细胞等)并行筛选数百万个珠粒的随机库。将阳性珠粒物理分离用于使用自动Edman降解通过微量测序进行结构确定(Lam等,Nature,1991,354:第82-4页)。

一珠粒一化合物(OBOC)组合库方法合成数百万种化合物，使得每个珠粒仅显示一种化合物。通过OBOC组合库方法鉴定的化合物的一个实例是LLP2A，其与整联蛋白α

本文所述的化合物可以与已知可用于治疗骨质疏松症或促进骨生长的其他活性剂彼此组合使用，或可以与可能单独无效但可有助于活性剂功效的辅助剂组合使用。在一些实施方案中，本文中化合物与其他试剂的共同施用包括在第二活性剂的0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内施用一种活性剂。共同施用包括同时、近似同时(例如，在彼此之间约1、5、10、15、20或30分钟内)或以任何顺序依次施用两种活性剂。在一些实施方案中，共同施用可以通过共同配制，即，制备包括两种活性剂的单一药物组合物来完成。在其他实施方案中，活性剂可以分开配制。在另一个实施方案中，活性剂和/或辅助剂可以彼此连接或缀合。

III.药物组合物和施用方法

在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物和药物可接受的赋形剂。

可以以各种各样的口服服、肠胃外和局部剂型制备和施用本发明的化合物。口服制剂包括适合于被患者摄取的片剂、丸剂、散剂、糖衣丸、胶囊、液体剂、锭剂、扁囊剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等。本发明的化合物还可以通过注射，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内施用。同样，本文所述的化合物可以通过吸入，例如鼻内施用。另外，本发明的化合物可以经皮施用。本发明的化合物还可以通过以下施用：眼内、阴道内和直肠内途径(包括栓剂、吹入剂、散剂和气雾剂)(例如类固醇吸入剂，参见Rohatagi,J.Clin.Pharmacol.35:1187-1193,1995；Tjwa,Ann.Allergy Asthma Immunol.75:107-111,1995)。

该组合物典型地包含常规药物载体或赋形剂，并且可以另外包含其他药物、载体、辅料、稀释剂、组织渗透增强剂、增溶剂等。在一些实施方案中，组合物将包含约0.01重量％至约90重量％(例如，约0.1重量％至约75重量％，或约0.1重量％至约50重量％，或约0.1重量％至约10重量％)的拟肽配体化合物，其余部分由合适的药物载体和/或赋形剂组成。可以针对特定的组合物和通过例如由上述Remington所描述的本领域众所周知的方法的施用途径来定制合适的赋形剂。

对于口服施用，组合物可以是片剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂、喷雾剂、锭剂、散剂和缓释制剂的形式。口服施用的合适赋形剂包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。

在一些实施方案中，药物组合物采取丸剂、片剂或胶囊的形式，因此，该组合物可以包含与配体或配体的组合一起的以下任意一种：稀释剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等；崩解剂，例如淀粉或其衍生物；润滑剂，例如硬脂酸镁等；和粘合剂，例如淀粉、阿拉伯树胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素及其衍生物。配体也可以配制成放置在例如聚乙二醇(PEG)载体中的栓剂。

液体组合物可以通过以下来制备：将配体或配体的组合和任选的一种或多种药物可接受的辅料溶解或分散在载体例如盐水(例如0.9％w/v氯化钠)、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等中，以形成溶液或悬浮液，例如用于口服、局部或静脉内施用。本发明的配体也可以配制成保留灌肠剂。

对于局部施用，本发明的组合物可以为乳液剂、洗剂、凝胶剂、乳膏剂、胶冻剂、溶液剂、混悬剂、软膏剂和经皮贴剂的形式。为了通过吸入递送，组合物可以通过喷雾器以干粉或液体形式递送。对于肠胃外施用，组合物可以是无菌可注射溶液和无菌包装粉末的形式。在一些实施方案中，可以在约4.5至约7.5的pH下配制可注射溶液。

本发明的组合物也可以以冻干形式提供。这样的组合物可包括用于在施用前复原的缓冲剂，例如碳酸氢盐，或者该缓冲剂可以包含在例如用水重构的冻干组合物中。冻干组合物还可以包含合适的血管收缩剂，例如肾上腺素。冻干组合物可以在注射器中提供，任选地与缓冲剂一起包装以用于重构，使得可以将重构的组合物立即施用于患者。

在散剂中，载体是细小的固体，其与细小的活性成分混合。在片剂中，将活性成分与具有必要结合特性的载体以合适的比例混合，并压制成期望的形状和大小。合适的固体赋形剂包括但不限于碳酸镁；硬脂酸镁；磷酸钙；硅酸钙；滑石；果胶；葡聚糖，糊精和环糊精包合配合物；低熔点蜡；可可脂；碳水化合物；糖，包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；淀粉，包括但不限于来自玉米、小麦、大米、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯树胶、西黄蓍胶和阿拉伯胶；以及蛋白质，包括但不限于明胶、胶原蛋白；微晶纤维素、水、盐水、糖浆、乙基纤维素和聚丙烯酸，例如Carbopol，例如Carbopol 941、Carbopol 980、Carbopol 981等；润滑剂；矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，例如甲基-羟基-苯甲酸盐、乙基-羟基-苯甲酸盐和丙基-羟基-苯甲酸盐(即，对羟基苯甲酸盐)；pH调节剂，例如无机和有机酸和碱；甜味剂；和矫味剂；可生物降解的聚合物珠粒。如果需要，可以添加崩解剂或增溶剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸、藻酸盐或其盐，例如藻酸钠。

药物可接受的载体可以包括起到例如稳定本发明的化合物或调节其吸收的作用的生理学上可接受的化合物，或根据需要的其他赋形剂。生理学上可接受的化合物包括例如碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂例如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。本领域技术人员将知道，包括生理上可接受的化合物在内的药物可接受的载体的选择取决于例如本发明的化合物的施用途径以及本发明的化合物的特定生理化学特征。通常，这样的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。通常，这样的组合物的制备需要将治疗剂与缓冲剂、抗氧化剂如抗坏血酸、低分子量(少于约10个残基)多肽、蛋白质、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或糊精)、螯合剂如EDTA、谷胱甘肽和其他稳定剂和赋形剂组合。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是示例性的适当稀释剂。

糖衣丸芯具有合适的包衣，例如浓缩糖溶液，其也可以包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中以用于产品鉴定或表征活性化合物的量(即，剂量)。本发明的药物制剂也可以使用例如由明胶制成的推入配合胶囊以及由明胶制成的软密封胶囊和诸如甘油或山梨糖醇的包衣口服使用。推入配合式胶囊可以包含与填充剂或粘合剂(例如乳糖或淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的本发明化合物。在软胶囊中，本发明的化合物可以溶解或悬浮在合适的液体(例如脂肪油、液体石蜡或带有或不带有稳定剂的液态聚乙二醇)中。

一些缓释实施方案包括可生物降解和/或缓慢溶解的聚合物质。这样的聚合物质包括聚乙烯吡咯烷酮、低分子量和中分子量羟基丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素、交联的羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚乙烯醇、淀粉、淀粉衍生物、微晶纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素和纤维素衍生物、β-环糊精、聚(甲基乙烯基醚/顺丁烯二酸酐)、葡聚糖、硬葡聚糖(scierozlucans)、甘露聚糖、黄原胶、藻酸及其衍生物、糊精衍生物、单硬脂酸甘油酯、半合成甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂酸钠、滑石、苯甲酸钠、硼酸和胶体二氧化硅。

本发明的缓释剂还可以包括辅料，例如淀粉、预胶凝淀粉、磷酸钙甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、微晶纤维素、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、淀粉溶液、乙基纤维素、阿拉伯树胶、西黄蓍胶、硬脂酸镁、硬脂酸、胶体二氧化硅、单硬脂酸甘油酯、氢化蓖麻油、蜡以及单取代、二取代和三取代的甘油酯。缓释剂也可以按照WO94/06416中的一般描述来制备。

为了制备栓剂，首先将低熔点蜡例如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物熔化，并通过搅拌将活性成分均匀地分散在其中。然后将熔化的均匀混合物倒入常规尺寸的模具中，使其冷却，然后固化。

液体形式制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂，例如水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射，可以在聚乙二醇水溶液中的溶液中配制液体制剂。

可以通过将活性成分溶解在水中并根据需要添加合适的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂来制备适合于口服使用的水溶液。可以通过将细小的活性成分与以下物质分散在水中来制备适合口服使用的水性混悬剂：黏性物质例如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟基丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯树胶，以及分散剂或润湿剂例如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、氧化烯与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、氧化乙烯与长链脂族醇的缩合产物(例如，十七烷乙烯氧基鲸蜡醇)、氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可包含一种或多种防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种矫味剂以及一种或多种甜味剂例如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。可以调节制剂的渗量。

还包括了旨在于临施用前转化为用于口服施用的液体形式制剂的固体形式制剂。这样的液体形式包括溶液剂、混悬剂和乳剂。这些制剂除活性成分外还可包含例如着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。

油性悬浮剂可以通过将本发明的化合物混悬在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或矿物油(例如液体石蜡)中或这些的混合物中来配制。油性悬浮剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂(例如甘油、山梨糖醇或蔗糖)以提供适口的口服制剂。这些制剂可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。作为可注射油载体的实例，参见Minto,J.Pharmacol.Exp.Ther.281:93-102,1997。本发明的药物制剂也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是如上所述的植物油或矿物油，或这些的混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶例如阿拉伯树胶和西黄蓍胶；天然存在的磷脂例如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯；以及这些偏酯与氧化乙烯的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳剂也可以包含甜味剂和矫味剂，例如糖浆和酏剂的制剂。这样的制剂还可以包含缓和剂、防腐剂或着色剂。

在一些实施方案中，药物制剂为单位剂型。术语“单位剂型”是指适合作为用于人类个体和其他哺乳动物(例如狗)的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位包含经计算可与合适的药物赋形剂一起产生所期望发作、耐受性和/或治疗作用的预定量的活性物质(例如安瓿)。另外，可以制备更高浓度的组合物，然后可以从中制备更稀释的单位剂量组合物。因此，更高浓度的组合物将包含基本上多于例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍量的配体或配体组合。以这样的形式，将制剂细分为包含适当量的活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，包装包含离散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊剂和小瓶或安瓿中的散剂。同样，单位剂型本身可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂，或者可以是包装形式的任何这些的适当数量。如果需要，组合物还可以包含其他相容的治疗剂。某些药物制剂可以以缓释制剂的形式递送本发明的化合物。

IV.施用和治疗方法

可以通过任何可接受的施用方式将本发明的配体根据需要与合适的药物赋形剂一起进行施用。因此，施用可以是例如静脉内、局部、皮下、经皮、透皮、肌内、口服、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道或通过吸入。也可以直接施用于骨表面和/或施用于骨周围的组织。制剂可以采取上述的任何固体形式、半固体形式或液体剂型，诸如，例如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、栓剂、保留灌肠剂、乳膏剂、软膏剂、乳液剂、凝胶剂、气雾剂等。

典型地将药物制剂递送至哺乳动物，包括人类和非人类哺乳动物。使用本发明方法治疗的非人类哺乳动物包括家养动物(即，犬、猫、鼠、啮齿类动物和兔类)和农业动物(牛、马、绵羊、猪)。骨的局部增加可用于骨折愈合、融合(关节固定术)、骨科重建和牙周修复。骨的全身性增加可用于治疗低骨量，即骨量减少。

通常，施用剂量将有效地将皮摩尔至微摩尔浓度的配体递送至合适的一个或多个位点。然而，本领域普通技术人员理解，所施用的剂量将取决于许多因素而变化，这些因素包括但不限于待施用的特定配体或配体组、施用方式、施用类型(例如，成像、治疗)、患者的年龄以及患者的身体状况。优选地，应当使用产生期望结果所需的最小剂量和浓度。对于儿童、老年人、虚弱的患者以及患有心脏和/或肝脏疾病的患者，应适当调整剂量。进一步的指导可以从本领域已知的使用实验动物模型评估剂量的研究中获得。然而，与本发明的配体相关的增加的细胞结合亲和力和特异性允许剂量浓度和重复给药的更大的安全范围。

在一些实施方案中，治疗有效量是激活个体中Akt信号传导的量。Akt信号转导及其激活可以例如使用图7A至图7C所示的Akt信号传导阵列在骨髓基质细胞中进行评估。典型地，拟肽配体化合物将以每千克个体体重约0.01毫克至约1000毫克(即，约0.01mg/kg至1000mg/kg)的剂量范围施用。化合物的剂量可以是例如约0.01mg/kg至1000mg/kg，或约0.1mg/kg至250mg/kg，或约0.2mg/kg至100mg/kg。化合物的剂量可以为约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg或1000mg/kg。剂量可以根据患者的需求，所治疗病症的严重程度以及所施用的特定制剂而变化。剂量的大小也将由在特定患者中施用药物所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。可以将总剂量分开并在一段时间内分批施用，以适合于治疗病况或病症。

化合物可以被施用一段时间，该时间将根据特定病症的性质、其严重性以及被施用化合物的个体的整体状况而变化。包含本发明的配体或配体的组合的组合物可以重复施用，例如至少2、3、4、5、6、7、8或更多次，或者组合物可以通过连续输注施用。施用可以例如每小时、每2小时、3小时、4小时、6小时、8小时或每天两次(包括每12小时)、或其任何间隔地进行。施用可以每天进行一次、或者每36小时或48小时一次、或者每月或几个月一次。在治疗之后，可以监测个体状况的变化以及病症症状的缓解。在个体对特定剂量水平没有明显反应的情况下，可以增加化合物的剂量，或者如果观察到病症症状的缓解，或者如果病症已得到治疗，或者特定剂量下出现不可接受的副作用，则可以降低剂量。

在实施本发明的方法中，药物组合物可以单独使用，或与其他治疗剂或诊断剂组合使用。在本发明的组合方案中使用的另外的药物可以分开施用，或者在组合方案中使用的一种或多种药物可以一起施用，例如以混合物形式施用。如果单独施用一种或多种药物，则每种药物的施用时机和时间表可能会有所不同。其他治疗剂或诊断剂可以与本发明的化合物同时、分开或在不同时间施用。

在一些实施方案中，本发明提供了促进全身性骨生长的方法。全身性骨骼生长是指遍及个体的骨的生长，并且可能影响个体体内的所有骨。需要全身性骨生长的个体可能患有多种疾病和疾病状态。在一些实施方案中，个体患有低骨量表型疾病。低骨量可以通过本领域技术人员已知的多种方法来确定。例如，低骨量的特征在于T值小于约-1。低骨量表型疾病可以包括骨质疏松症、骨量减少和骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)。在一些其他实施方案中，低骨量表型疾病可以是骨量减少或骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)。在一些其他实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的本发明化合物来治疗低骨量的方法。

施用本发明的化合物后，可以通过多种方法例如骨密度的改善来确定全身性骨生长。骨密度可以通过多种不同的方法测量，包括T评分和Z评分。T评分是高于或低于与该患者相同性别的健康30岁成年人的平均值的标准偏差数。低骨量的特征是T评分为-1至-2.15。骨质疏松症的特征是T评分小于-2.15。Z评分是高于或低于患者年龄和性别平均值的标准偏差数。T评分或Z评分的改善表明骨生长。可以在骨骼的各个位置(例如脊柱或髋)处测量骨密度。本领域技术人员将理解，确定骨密度的其他方法可用于本发明。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗骨质疏松症的方法，其中该方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐。

本发明还提供了治疗以继发性诱发型骨质疏松症(“继发性低骨量”)为特征的疾病的方法，但不限于，骨软化症，多骨纤维性结构不良症，佩吉特病，类风湿性关节炎，零重力，骨关节炎，长期不活动或不动，骨髓炎，腹腔疾病，克罗恩病，溃疡性结肠炎，炎性肠病，胃切除术，继发性诱发型骨质疏松症，闭经，库欣病，库欣综合征，糖尿病(diabetesmellitus)，糖尿病(diabetes)，进食障碍，甲状旁腺功能亢进症，甲状腺功能亢进症，高泌乳素血症，Kleinefelter综合征，甲状腺疾病，特纳综合征，类固醇诱发型骨质疏松症，癫痫或抑郁症诱发型骨质疏松症，不动，关节炎，癌症诱发型继发性骨质疏松症，促性腺激素释放激素激动剂诱发型低骨量，甲状腺药物诱发型低骨量，狄兰汀(苯妥英)、丙戊酸钠诱发型低骨量，化学疗法诱发型低骨量，免疫无抑制剂诱发型低骨量，血液稀释剂诱发型低骨量，格雷夫斯病，青少年类风湿性关节炎，吸收不良综合征，神经性厌食症，肾脏疾病，抗惊厥治疗(例如用于癫痫)，皮质类固醇治疗(例如，用于类风湿性关节炎、哮喘)，免疫抑制治疗(例如，用于癌症)，不足的营养(尤其是钙、维生素D)，过度运动导致闭经(无月经)，吸烟和酗酒，与妊娠有关的骨质疏松症，铜缺乏，二元性氨基酸尿症2型，沃纳综合征，Hajdu-Cheney综合征，青少年变形性外层骨增生(hyperostosis corticalis deformans juvenilis)，甲基丙二酸尿症2型，胱硫醚β-合酶缺乏症，依西美坦，高免疫球蛋白E(IgE)综合征，血色素沉着症，Singleton Merten综合征，β地中海贫血(纯合子)，反射性交感神经骨营养不良症，结节病，Winchester综合征，哈勒曼-斯特雷夫综合征(HSS)，环丙孕酮，甘油激酶缺乏症，Bonnet-Dechaume-Blanc综合征，泼尼松龙，肝素，骨发育不良性老年状皮肤，Torg骨溶解综合征，睾丸切除术，法布里病，假性早衰综合征(pseudoprogeria syndrome)，Wolcott-Rallison综合征，强直性脊柱炎，骨髓瘤，全身性婴儿玻璃样变性(systemic infantilehyalinosis)，奥尔布赖特遗传性骨营养不良症，自身免疫性淋巴细胞增生综合征，布朗-塞卡综合征，Diamond-Blackfan贫血症，乳溢-高泌乳素血症，性腺发育不全，肾脏疾病，门克斯病，更年期，神经炎，由于FSH抵抗而导致的卵巢功能不全，家族性卵巢功能不全，提前老化，原发性胆汁性肝硬化，泌乳素瘤，家族性泌乳素瘤，肾性骨营养不良症，溃疡性结肠炎，体重过轻，维尔纳综合征，骨肿瘤，骨癌，脆性骨病，先天性成骨不全，和迟发性成骨不全。其他病况包括骨损伤，例如骨折或变弱的骨，或由于放射治疗而损伤的骨。本领域技术人员将理解，其他类型的病况、疾病和治疗也会导致骨质疏松症。

糖皮质激素是一类皮质类固醇，是一种类固醇激素，其通常用于治疗与免疫系统过度活跃有关的疾病或病况，例如哮喘，过敏，哮喘，自身免疫性疾病(例如，格雷夫斯病、类风湿性关节炎、狼疮、炎性肠病等)和败血症。然而，使用类固醇或糖皮质激素可能导致快速的骨流失，并导致易发生骨折的风险高。在某些情况下，类固醇或糖皮质激素(即，糖皮质类固醇)可引起骨坏死，其细节如下所述。

在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来治疗类固醇诱发型骨流失的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来治疗糖皮质激素诱发型骨流失的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来治疗类固醇诱发型骨质疏松症的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来治疗糖皮质激素诱发型骨质疏松症的方法。

骨坏死，也称为缺血性坏死或无菌性坏死，是由于血流减少而导致骨骼中骨细胞的死亡。如果不加以治疗，则骨骼中骨细胞的死亡可能导致骨骼区域的塌陷，进而可能导致骨骼附近关节的退行性关节炎。骨坏死最常影响髋和膝，但也可能影响肩、手腕、手、脚踝、足和颌。骨坏死可能有多种原因，包括创伤性和非创伤性原因。典型地在外伤性骨坏死中，对骨骼的严重外伤会中断骨骼的血液供应。非创伤性骨坏死可能是因以下导致的：某些药物，例如皮质类固醇药物(例如，强的松、可的松、地塞米松或甲基强的松龙)，尤其是长时间施用高剂量药物时；由于过量饮酒；来自放射治疗；或者是因为疾病或病况。参见例如Xie等,2015,Journal of Orthopaedic Translation,3:58-70，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来治疗骨坏死的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来治疗创伤后骨坏死(例如，在骨的骨折或脱位之后发生的骨坏死)的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来治疗非创伤性骨坏死的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来治疗类固醇诱发型骨坏死(例如，高剂量类固醇诱发型骨坏死或糖皮质激素诱发型骨坏死)、酒精诱发型骨坏死或吸烟诱发型骨坏死的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来增加骨坏死组织中的血管密度的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来上预防或减少骨坏死组织中的细胞死亡的方法。

在一些其他实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的式I、式Ia、式Ib、式II的化合物或其药物可接受的盐来治疗继发性诱发型骨坏死的方法。可以诱导骨坏死(即继发性骨坏死)的疾病或病况的实例包括但不限于：莱格-卡尔夫-佩尔特斯病(Legg-Calvé-Perthes disease)、凯松病(Caisson disease)、镰状细胞病、放射后、化学疗法、动脉疾病、戈谢病、脂质紊乱、结缔组织疾病、胰腺炎、肾脏疾病、肝脏疾病或狼疮。在一些实施方案中，骨坏死是特发性骨坏死。

本发明还提供了治疗以损伤的骨例如骨折的骨或因放射线损伤的骨为特征的患者群体以及禁用骨质疏松症药物的儿童的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的本发明的化合物来促进骨生长的方法。可以以本领域技术人员已知的多种方式来测量骨生长。测量骨骼生长的方法包括但不限于Uct(微CT)、双X射线吸收(骨密度)、超声、QCT、SPA、DPA、DXR、SEXA、QUS、X射线，在手术操作期间使用人眼，茜素红S、血清骨钙蛋白、血清碱性磷酸酶、血清骨Gla蛋白(BGP)、骨矿物质含量、血清钙、血清磷、钽标志物和血清IGF-1。

骨生长的许多指标可用于测量骨生长，包括骨密度。在一些实施方案中，骨生长可以通过骨密度增加0.1％来证明。在其他实施方案中，骨生长可以通过骨密度增加0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更高来证明。本领域的技术人员意识到骨生长是局部的，全身性的或两者兼有。

在一些其他实施方案中，本发明的方法通过施用本发明的化合物例如式I的化合物来促进骨生长。本发明的化合物的施用可以促进局部骨生长和/或全身性骨生长。在一些实施方案中，本发明化合物的施用促进全身性骨生长。骨生长可以通过增加骨矿物质含量、增加骨密度和/或新骨的生长来实现。在其他实施方案中，本发明化合物和药物的局部施用实现全身性骨生长。

V.实施例

用于发现具有细胞结合亲和力和细胞内信号传导的靶向骨细胞的成骨特异性肽的方法涉及对聚焦一珠粒一化合物(OBOC)肽库进行珠粒筛选，其设计基于整联蛋白α4β1基序。以下在方案1中示出了用于开发聚焦OBOC组合库的合成方法。

方案1

简而言之，将TentaGel珠粒(1.0g，负载量0.26mmol/g)在DMF(20mL)中溶胀3小时。将树脂分成43等份，放在带有聚乙烯玻璃料的43个一次性聚丙烯柱中。将43种不同的Fmoc-氨基酸(表4)(4当量)分别溶解在6-Cl HOBt(4当量)和DIC(4当量)的DMF溶液中，并添加到43个柱中(每个柱仅接收一种氨基酸)。在室温下进行2小时偶联。过滤之后，将珠粒合并、混合并用DMF、MeOH和再用DMF各自洗涤3次。用20％的4-甲基哌啶对珠粒进行Fmoc-脱保护(5分钟，15分钟)。用DMF、MeOH和DMF洗涤之后，将珠粒与1g空白TentaGel珠粒混合。使用相同的如上所述的分混合成法，依次将2g合并的珠粒与在X

然后，如参考文献(Liu R,Marik J,Lam KS.J Am Chem Soc.2002Jul 3；124(26):7678-80.)中所述，使用双相溶剂法制备两层珠粒。简而言之，将干燥的珠粒在水中溶胀1天。通过过滤除去水，并将Fmoc-OSu(17.5mg，0.052mmol，相对于珠粒为0.1当量)在DCM/二乙醚(150mL，55/45)中的溶液添加至湿珠粒中，随后添加DIEA(36μL，0.208mmol)。将混合物在室温下剧烈振摇45分钟。通过过滤除去液体。将珠粒用DMF、MeOH和再用DCM各洗涤3次。将Boc酸酐(567mg，2.6mmol)和DIEA(906μL，5.2mmol)的DCM溶液添加至珠粒中，并旋转1小时。Kaiser测试为阴性，表明完成了偶联。用20％4-甲基哌啶除去珠粒表面上的Fmoc(5分钟，15分钟)。洗涤珠粒，并将其在6-Cl HOBt(4当量)和DIC(4当量)存在下与4-[(N’-2-甲基苯基)脲基]-苯基乙酸(UPA)(4当量)在DMF中偶联。通过阴性Kaiser测试确认偶联在4小时内完成。用DMF、甲醇和DCM洗涤之后，然后将珠粒在真空下干燥1小时。使用82.5％TFA:5％苯酚:5％苯甲硫醚:5％水：2.5％TIS的混合物实现侧链脱保护。用2％DIEA/DMF中和两次后，依次用DMF、MeOH、DCM、DMF、DMF/水、水和PBS洗涤树脂。珠粒库存储在70％乙醇中。

如图1所示，筛选OBOC组合库并鉴定对目标细胞表现出亲和力并用作目标细胞信号传导途径(一种珠粒/一种化合物/两种功能)的激活剂或抑制剂的肽(参见Liu,R.等CurrOpin Chem Biol.,2017,38:117-26)。从小鼠获得骨髓基质细胞(BMSC)，并在间充质维持培养基中维持7天至2周(约3代)，变为成骨培养基3天，然后与聚焦整联蛋白库一起孵育1小时。然后将细胞和珠粒固定并染色用于磷酸化Atk，其为可响应细胞外信号促进细胞存活和生长的信号传导转导途径(参见Manning BD等，Cell.2007,129:1261-74)。阳性珠粒被鉴定为具有细胞结合力，并用绿色荧光(p-Akt+)染色(图1，步骤A)。手工挑出阳性珠粒，并用Edman降解进行微测序(参见，Liu和Lam，Anal.Biochem.2001,295:9-16)。珠粒上的各个肽与珠粒内部的荧光淬灭剂(硝基酪氨酸)残基重新合成，以淬灭珠粒的自发荧光。将这些珠粒与获自成骨细胞特异性转录因子-mCherry报告小鼠的骨祖细胞(OPC)一起孵育。成骨细胞特异性转录因子由骨软骨祖细胞表达，通常被认为是成骨细胞成熟的早期标记，如Mizoguchi T等Developmental cell.2014,29,340-9和Liu Y等，PLoS One.2013,8:e71318中所述。通过第二轮筛选的阳性珠粒通过它们对成骨细胞特异性转录因子+细胞的结合亲和力进行鉴定(图1步骤B)。再次确认Akt结合的激活(图1，步骤C)。使用该方法，鉴定出22种肽(表8)是对成骨细胞特异性转录因子+细胞具有高亲和力的Akt信号传导激活剂(图1，步骤D)。证实先导肽YLL3和YLL8对成骨细胞特异性转录因子细胞具有高结合亲和力，并具有体外成骨作用。显示YLL3和YLL8的珠粒也示出了对淋巴细胞的低亲和力(图2)。

使用市售的起始材料和本领域已知的方法制备表8中列出的YLL3、YLL8和其他配体。通常，YLL配体是使用4-[(N’-2-甲基苯基)脲基]苯基乙酸(UPA)、Rink Amide MBHA树脂和相关的保护氨基酸的成分经由Fmoc固相肽合成制备的，如国际公开号WO 2012/031228A2中所述。

YLL3和YLL8的固相合成

YLL8是在Rink酰胺MBHA树脂(GL Biochem，中国上海)上使用标准固相肽合成方法合成的。简而言之，将Rink酰胺MBHA树脂(0.5g，0.325mmol，负载量0.65mmol/g)在DMF中溶胀2小时，然后用在DMF中的20％4-甲基哌啶进行Fmoc-脱保护两次(5分钟，15分钟)。将珠粒用DMF(3×10mL)、MeOH(3×10mL)和DMF(3×10mL)洗涤。将Fmoc-Ach-OH(0.365g，0.975mmol)溶解在6-Cl HOBt(0.165g，0.975mmol)和DIC(152μL，0.975mmol)的DMF溶液中，然后添加至珠粒中。在室温下进行2小时偶联。过滤之后，将珠粒分别用DMF(3×10mL)、MeOH(3×10mL)和DMF(3×10mL)各洗涤3次。用20％4-甲基哌啶除去Fmoc脱保护基两次(5分钟，15分钟)。分别用DMF、MeOH和DMF洗涤之后，然后按上述相同的方式，用Fmoc-Aad(tBu)和Fmoc-Lys(A12)逐步对珠粒进行额外的偶联和脱保护循环。除去Fmoc之后，将4-[(N’-2-甲基苯基)脲基]苯基乙酸(UPA，0.923g，3.25mmol)、HOBt(0.498g，3.25mmol)和DIC(509μL，3.25mmol)的DMF溶液添加到珠粒中。反应在室温下进行过夜。用DMF(5×5mL)、MeOH(3×5mL)和DCM(3×5mL)洗涤珠粒。然后将珠粒在真空中干燥1小时，然后加入95％TFA:2.5％水:2.5％TIS的裂解混合物。裂解反应在室温下进行2小时。收集液体并浓缩。用二乙醚沉淀粗产物，并使用制备型RP-HPLC将其纯化。收集级分并冻干，以得到设计的产物YLL8、MALDI-TOF MS：813.30道尔顿。

使用与YLL8类似的方法合成YLL3，但依次将以下不同的构建单元Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cit-OH和UPA偶联至珠粒。将粗YLL3从珠粒上切割，并通过RP-HPLC纯化。MALDI-TOF MS：756.25道尔顿。

先导肽YLL3和YLL8对成骨细胞特异性转录因子细胞具有高结合亲和力，并表现出体外成骨作用，如图3和图4所示。小鼠骨髓基质细胞(BMSC)从成骨细胞特异性转录因子-mcherry转基因小鼠获得，并在成骨培养基中与编码YLL3、YLL8和LLP2A肽的聚焦库珠粒一起培养10天并固定。成骨细胞特异性转录因子(OSX+)标记成骨软骨祖细胞，并且阳性细胞呈红色(图3)。从正常小鼠获得的小鼠BMSC与显示LLP2A、YLL3或YLL8肽的聚焦库珠粒一起孵育，并在成骨培养基中培养10天。将带有珠粒的细胞染色用于抗-Akt-Alexa488。阳性细胞表现出Atk的激活，并被染成绿色(图4)。还将显示表4的几种肽的聚焦库珠粒与获自常规小鼠的小鼠BMSC一起孵育，并在成骨培养基中培养10天。在第14天测量对应于成骨分化和成骨细胞成熟的碱性磷酸酶水平。在第21天测量茜素红，其为成骨细胞成熟和矿化的量度(图5)。

在另外的体外骨发生研究中，在第10天测量了YLL3和YLL8的成骨分化(碱性磷酸酶，ALP活性)，在第21天测量了成骨细胞成熟(茜素红染色)。与显示乱序肽(对照(Con))的珠粒相比，显示肽YLL3或YLL8的珠粒增加了ALP水平(图6A和图6B)并诱导了更高的矿化结节形成(图6A和图6C)。注意，细胞被定位至或围绕着珠粒和沉积的矿物质(图6C)。这些结果通过将肽直接加入成骨细胞分化培养物中得以证实(图6D)。

然后使用Akt信号传导阵列通过蛋白质印迹分析研究YLL激活Akt信号传导的特异性。通过首先将肽(6×10

在一项确定YLL肽是否会影响体内骨代谢的研究中，对两个月大的雌性小鼠和雄性小鼠在第1天用PBS对照、YLL3、YLL8或LLP2A以50μg/kg静脉注射治疗。hPTH(1-34)以25μg/kg，皮下注射，每周5次给予持续21天(n＝4-6/组)。通过微CT测量股骨远端的小梁骨体积和皮质骨体积以及股骨远端和股骨中部的皮质骨体积(图8)。

在另外的确定YLL是否会影响体内骨代谢的研究中，将YLL3和YLL8分别以25μg/kg或50μg/kg，皮下(SC)，每周5次，注射到2个月大的小鼠中，持续21天。将以25μg/kg，每周5次皮下注射hPTH(1-34)作为阳性对照。来自50μg/kg组的结果显示在图9中。每天注射两种YLL肽持续21天都没有改变体重或引起任何可见的副作用。在雌性中，YLL3和YLL8分别使小梁骨体积增加约13％(p<0.05，相对于PBS)和8％(图9A)，这与基于表面的小梁骨形成速率增加60％(p<0.05，相对于PBS)和86％相关(图9B和图9D)。在雄性中，YLL3和YLL8分别使小梁骨体积增加约15％(p<0.05，相对于PBS)和6％(图9A)，这与小梁骨形成速率增加53％(p<0.05，相对于PBS)和50％(p<0.05，相对于PBS)相关(图9A和图9D)。在雄性中，YLL3和YLL8二者都使皮质骨体积增加了约15％，并且在骨膜表面观察到了更高的骨形成(图9C和图9E)。注意YLL3增加了皮质内骨重塑(图9E)。这些结果表明，YLL3和YLL8均刺激小梁和皮质表面的骨形成，并且与每日PTH治疗的合成代谢作用相当。

在另一项确定YLL是否会影响体内骨代谢的类似研究中，将YLL3和YLL8以5μg/kg的皮下注射(sc)，每周5次，持续21天(n＝5-7/组)，注射到4个月大的雌性小鼠和雄性小鼠中。以25μg/kg，每周5次皮下注射hPTH(1-34)作为阳性对照。每天注射YLL8持续21天不会改变体重或引起任何明显的副作用。与PBS治疗的小鼠相比，YLL8和hPTH(1-34)二者都使雌性小鼠中的股骨小梁骨体积增加约130％。在雄性小鼠中，YLL8使股骨小梁骨体积增加约70％，而hPTH(1-34)使股骨小梁骨体积增加约30％(图10A)。与成骨细胞活性相对应的参数矿物质沉积速率在雌性中增加超过70％，在雄性中增加约30％，导致基于表面的骨形成速率总体增加(图10A、图10B)。通过微CT和骨钙蛋白的血清水平在股骨远端干骺端测量的小梁骨量的增加证实了YLL的合成代谢作用(图11)。通过血清CTX1测量的骨吸收表明，尤其是在雌性小鼠中，PTH使骨吸收从PBS治疗的组增加200％，而YLLL没有明显改变CTX1(图11)。持续21天的每天YLL3和YLL8治疗增加了雄性的皮质骨量并且增加了雌性和雄性中的骨强度，这与每天hPTH(1-34)注射相当(图10D)。这些结果表明YLL3和YLL8诱导骨形成和再吸收的解偶联，并增加了骨量。

进行以下实验以确定YLL肽是否加速骨折修复。骨折愈合期间内源性成骨细胞谱系细胞的募集和激活是修复骨折的关键步骤。由于不能直接从商业上获得可诱导的成骨细胞特异性转录因子-报告小鼠，因此可诱导的Prx1-CreERT-GFP小鼠用于追踪骨折和YLL治疗后骨祖细胞的募集和成骨分化。在未受伤的小鼠中，Prx1在生长板处以及在小梁和皮质内骨表面旁边标记骨祖细胞，类似于在骨中表达成骨细胞特异性转录因子的位置(图12)。使用闭合的、稳定的股骨中骨骨折模型来跟踪成骨细胞系细胞在该模型中对膜内或软骨内骨形成的贡献的运动。将人PTH(1-34)用作阳性对照(50μg/kg，每周5次)。在骨折后的第10天，在骨痂中观察到表达Prx1/GFP的细胞的存在，一些与茜素红共定位，这表明来自那些相邻细胞的活性骨沉积(apposition)(图13A)。在YLL8和PTH治疗的小鼠中，Prx1+细胞的数量大大增加，一些与矿物质沉积共定位(图13A)。几乎所有的Prx1+绿细胞都与茜素红重叠，表明在YLL3处理后，这些细胞中的成骨细胞分化和矿物质吸收高(图13A)，与第10天的PBS治疗的小鼠相比，得到高100％的骨痂骨体积(图13B)。使用荧光染料标记用于骨折后第21天的矿化的进一步的动态组织形态学研究结果表明在所有组中几乎所有Prx1+及其后代细胞都与AR矿物沉积重叠。在YLL3治疗的小鼠中，Prx1+及其后代细胞被激活并促进骨痂形成，共同定位在再生的骨骨痂区域内(图13C)。通过微CT扫描的定量测量证实了在骨折后第21天，在YLL3治疗的小鼠中更高的骨痂矿物质含量(图13D)。这些数据表明，在骨折愈合期间，类似的合成代谢机制通过YLL8和PTH激活成骨细胞系细胞。YLL3注射极大地激活骨祖细胞的成骨分化，并诱导了明显更高的骨痂矿化，其加速了骨折修复。

为了确保合成代谢作用是骨特异性的，将YLL3和YLL8肽与阿仑膦酸盐缀合。

YLL3-阿仑膦酸盐(YLL3-Ale)和YLL8-阿仑膦酸盐(YLL8-Ale)是通过将阿仑膦酸盐-马来酰亚胺(Ale-Mal)(通过阿仑膦酸盐和磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)的缀合而产生的)与D-半胱氨酸、赖氨酸、两个N-(8-氨基-3,6-二氧杂-辛基)琥珀酰胺接头和YLL3或YLL8连接而制成的，如图14所示，并在国际公开号WO 2012/031228 A2中进一步描述，或如下所述。

通常，YLL8-Aln的合成涉及三个步骤。

用于合成YLL8-Lys(D-Cys)的合成方法如以下方案2所示。将Rink酰胺MBHA树脂(0.5g，0.325mmol，负载量0.65mmol/g)在DMF中溶胀3小时。用在DMF中的20％4-甲基哌啶将Fmoc脱保护两次(分别为5分钟和15分钟)。过滤之后，然后将珠粒分别用DMF(3×10mL)、甲醇(MeOH)(3×10mL)和DMF(3×10mL)洗涤。将Fmoc-Lys(Dde)-OH(0.519g，0.975mmol)溶解在6-Cl HOBt(0.165g，0.975mmol)和DIC(152μL，0.975mmol)的DMF(8mL)溶液中，然后添加到珠粒的悬浮液中。偶联在室温下进行过夜。过滤之后，将珠粒分别用DMF(3×10mL)、MeOH(3×10mL)和DMF(3×10mL)洗涤。用在DMF(8mL)中的20％4-甲基哌啶将Fmoc脱保护两次(分别为5分钟和15分钟)。将Fmoc-接头(0.612g，1.3mmol)溶解在HOBt(0.22g，1.3mmol)和DIC(201μL，1.3mmol)的DMF(8mL)溶液中，然后将其添加至珠粒的悬浮液中。偶联在室温下进行，直到Kaiser测试为阴性。过滤之后，将珠粒分别用DMF(3×10mL)、MeOH(3×10mL)和DMF(3×10mL)洗涤。用在DMF(8mL)中的20％4-甲基哌啶将Fmoc脱保护两次(分别为5分钟和15分钟)。将Fmoc-接头(0.612g，1.3mmol)溶解在HOBt(0.22g，1.3mmol)和DIC(201μL，1.3mmol)的DMF(8mL)溶液中，然后将其添加至珠粒的悬浮液中。偶联在室温下进行，直到Kaiser测试为阴性。过滤之后，将珠粒分别用DMF(3×10mL)、MeOH(3×10mL)和DMF(3×10mL)洗涤。用在DMF(8mL)中的20％4-甲基哌啶将Fmoc脱保护两次(分别为5分钟和15分钟)。过滤之后，将珠粒分别用DMF(3×10mL)、MeOH(3×10mL)和DMF(3×10mL)洗涤。将Fmoc-Ach-OH(0.365g，0.975mmol)溶解在6-Cl HOBt(0.165g，0.975mmol)和DIC(152μL，0.975mmol)的DMF溶液中，然后添加至珠粒中。偶联在室温下进行2小时。

方案2

过滤之后，将珠粒分别用DMF(3×10mL)、MeOH(3×10mL)和DMF(3×10mL)洗涤。用20％4-甲基哌啶除去Fmoc脱保护基两次(分别为5分钟和15分钟)。分别用DMF、MeOH和DMF洗涤之后，然后按上述相同的方式，用Fmoc-Aad(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(A12)和UPA逐步对珠粒进行额外的偶联和脱保护循环。

用在DMF中的2％肼一水合物除去Dde保护基两次(分别为5分钟和10分钟)，再将珠粒用DMF、MeOH和DMF洗涤，然后将Boc-D-Cys(Trt)-OH(对于树脂4当量，220mg，1.3mmol)、HOBt(0.176g，1.3mmol)和DIC(201μL，1.3mmol)在DMF(8mL)中偶联。偶联反应在室温下进行，直到Kaiser测试为阴性(4小时至过夜)。将珠粒分别用DMF、MeOH和DCM彻底洗涤，然后在真空下干燥1小时，然后添加82.5％三氟乙酸(TFA):5％苯甲硫醚:5％苯酚:5％水:2.5％三异丙基硅烷(TIS)(v/v)的裂解混合物(8mL)。裂解反应在室温下进行2-3小时。沉淀出灰白色粗产物，用冷二乙醚洗涤。通过分析型HPLC确定纯度，粗产物无需进一步纯化即可用于下一步。

用于合成Aln-Mal的合成方法如以下方案3所示。将阿仑膦酸二钠盐(35.4mg，0.1208mmol)(来自阿仑膦酸水溶液和2当量NaOH的冻干的粉末)溶解在0.1M PBS(15mL)(含10mM EDTA)中，pH 7.5。然后将水溶液在冰水浴中冷却，并滴加磺基-SMCC(58mg，0.133mmol)的水(14mL)溶液。添加完成后，使所得溶液升温至室温，同时搅拌2小时以产生Aln-Mal溶液，其无需纯化即可用于下一步骤的缀合。

方案3

用于合成YLL8-Aln的缀合方法如以下方案4所示。将步骤2中制备的Aln-Mal溶液用冰水浴冷却，然后添加乙腈(8mL)并滴加LLP2A-Lys(D-Cys)(200mg，0.133mmol)在少量(～4mL)的50％乙腈/水中的溶液。用NaHCO

方案4

在一些情况中，YLL-Ale化合物是由经由亲水接头与骨靶向双膦酸盐阿仑膦酸盐相连的对OPC具有高亲和力和特异性的高度衍生化的合成拟肽部分(UPA-YLL部分)组成的单一有机分子，其中双膦酸盐部分经由DBCO与N3-修饰的阿仑膦酸盐(Aln-N3)的无铜Click反应连接到接头部分，后者由阿仑膦酸盐和4-叠氮基丁酸NHS酯(N3-NHS)制备。

接下来，评估了阿仑膦酸盐缀合的肽对骨代谢的影响。对两个月大的雌性小鼠用PBS对照、YLL3-Ale或YLL8-Ale治疗，以100μg/kg(25nmol)或300μg/kg(75nmol)，皮下，每隔一周一次，或一个500μg/kg的IV剂量。每只小鼠两次注射。总累积剂量分别为200μg/kg/月至600μg/kg/月(25nmol至150nmol)。阿仑膦酸盐浓度为化合物的约1/10至1/5。YLL-Ale注射不会改变体重或引起任何可见的副作用。尽管单独的肽YLL3显示出合成代谢作用，但是与PBS对照相比，在所使用的两种剂量下的YLL3-Ale在骨形成或骨量方面未能实现统计学上显著的差异(图15)。相反，在300μg/kg×2SC剂量或500μg/kg×1IV剂量下，YLL8-Ale使小梁骨体积增加超过20％(p<0.05，相对于PBS)，这与增加的小梁厚度(30％，p＜0.05，相对于PBS)(图15A和图15B)和数量(28％，p＜0.05，相对于PBS)相关。100μg/kg和300μg/kg剂量的YLL8-Ale都使皮质骨体积增加约16％，并使皮质厚度增加约15％(图15C)。YLL8-Aln通过增加成骨细胞数量和活性(在小梁骨和皮质骨表面都具有更高的双标记表面和矿物质沉积速率，如图16所示)来增加骨形成速率。这些结果表明，YLL8肽的双膦酸盐缀合降低了给药频率并维持其合成代谢作用。更具体地，这些结果显示出，YLL8-Aln的总共为600μg/kg/月的2剂或500μg/kg的每月一剂提高成骨细胞活性、刺激骨形成、并增加小梁骨量和皮质骨量。

如本文所述，使用双重亲和力和功能性筛选方法来发现“成骨特异性”肽。成骨肽YLL8对成骨细胞特异性转录因子+细胞具有高亲和力，并激活Akt的磷酸化(成骨骨祖细胞的促存活信号)。YLL3和YLL8均可增加体外成骨细胞的分化和成熟。短期(3周)每天低剂量注射YLL3和YLL8诱导与PTH(1-34)相当的骨合成代谢作用，增加矿物质沉积速率(其对应于成骨细胞活性)和骨形成速率。与PTH(1-34)相比，每天注射YLL不会显著影响骨再吸收。骨重塑的这种解偶联导致小梁骨和皮质骨中快速的模型依赖性骨增加和骨强度的快速增加，其高于hPTH(1-34)治疗的小鼠。每天注射YLL，尤其是YLL3，持续21天，大大增加了骨折修复期间的骨痂形成和矿化。YLL8与阿仑膦酸盐的缀合降低了注射频率，但在小梁骨和皮质骨中显示了类似程度的骨增加。与其他骨合成代谢药物(例如，大分子量蛋白)相比，YLL肽的尺寸相对较小(例如，三至四个合成氨基酸)，这使得基于YLL肽的药物和/或药物制剂的制造和规模化生产更加容易，以及其更容易代谢分解。YLL可以用作“治疗肽”，也可以与骨结合剂(affiliated agent)一起使用，以增强其骨特异性。

当前用于骨质疏松症的药物治疗选择通常包括抗再吸收治疗和合成代谢治疗。例如，重组人PTH(1-34)(特立帕肽)以其骨合成代谢作用而闻名，其由34个氨基酸组成，其是激素的生物活性部分。最近被FDA批准用于治疗骨质疏松症的PTHrP(阿巴洛肽)是与PTH的N端同源的139-173-氨基酸蛋白。hPTH(1-34)和PTHrp对骨骼都有显著的合成代谢作用，但也具有在各种组织中表达的其他广泛的生理作用。除了对骨骼和关节发育的作用外，PTH和PTHrp还以自分泌/旁分泌方式起作用，以调节钙黄绿素的代谢和器官发生，例如乳腺发育。硬化蛋白抗体是另一种骨合成代谢剂，其可能对骨细胞更具特异性。硬化蛋白主要由骨细胞在骨中表达。然而，骨硬化蛋白也可以在软骨和淋巴细胞中表达，这可能导致骨骼外副作用。因此，本文所述的研究集中于可增加小梁骨量和皮质骨量的成骨合成代谢药物的开发。

典型的Wnt/β-连环蛋白信号传导途径对骨形成起关键作用，并且是用于研究/发现骨合成代谢治疗药物的活性药物靶标。本文所述的研究集中于Akt激活，因为其为与骨祖细胞结合后被α4β1整联蛋白激活的先导激酶之一。同样，重点放在激活骨祖细胞及其成骨潜能上，而不是诱导细胞丝裂原或诱导新生骨形成，这在使用Wnt-靶向或生长因子时通常会观察到。为了验证成骨性YLL肽对成骨细胞分化的影响，进行了ALP和AR染色，分别反映了成骨细胞分化的初始阶段和结束阶段。ALP和AR染色研究表明，YLL3和YLL8增强了体外骨祖细胞的成骨分化。还证实了Akt信号传导途径的激活。与PTH类似，YLL8对Akt途径激活表现出更广泛的影响，而YLL3对Atk激活的特异性更高。本文所述的研究还表明，注射YLL3和YLL8导致增加的矿物质沉积速率，这表明激活的成骨细胞功能。YLL3和YLL8注射还导致年轻小鼠的骨形成、骨量和骨强度增加。短期治疗研究(即21天)示出了YLL对雄性小鼠的合成代谢作用通常比雌性小鼠高，这可能是由于年轻雄性比雌性具有更高的骨发生，并且生长期间高的雌激素水平可能会对雌性的骨形成产生负面影响。

将YLL肽与骨靶向药物阿仑膦酸盐缀合。在这种情况下，阿仑膦酸盐被用作用于肽的骨特异性递送的“载体”。为了进一步确定YLL的增强的骨靶向作用，进行了体内实验并表明两剂皮下注射剂量或一剂YLL8-Aln的静脉注射剂量增加了小梁骨量和皮质骨量。总的来说，这些研究表明YLL8可以刺激体外和体内成骨细胞分化，证明了YLL8-Aln对骨形成的功效。动态骨形态计量学和组织学分析证实，YLL8通过增强成骨细胞活性显著促进骨形成。出人意料的是，当YLL3与阿仑膦酸盐缀合时，YLL3-Aln对骨失去了合成代谢作用。这可能是由于经Aln缀合后YLL3的结构构型发生构象变化。增加YLL3-Aln的剂量和/或给药频率可能产生对于未缀合的YLL3肽所观察到的合成代谢作用。或者，可以修改缀合方法，以使YLL3从阿仑膦酸盐缀合中被切割并在到达骨后释放。

除了衰老和骨质疏松症之外，仅在美国，每年就有近800万成年人经历骨折，其中的约5％至13％导致骨折不愈合或延迟愈合。当前用于治疗骨折不愈合的疗法主要包括骨移植和重组骨形态发生蛋白(BMP)的使用。骨移植的显著的并发症发生率范围为10％至25％，并与结果不一致相关。BMP治疗需要在BMP递送前进行骨科手术。此外，BMP可能引起炎症、矿化程度差且价格昂贵。开发能够增加骨骼矿化和加速骨折修复的造骨合成代谢剂是一项持续的工作。为此，每天注射YLL3导致早期(骨折后第10天)成熟的骨痂发育，并在后期(骨折后第21天)产生更大的骨痂矿物质密度。由于骨折修复的初始阶段是骨祖细胞的募集和激活，因此结果显示，用YLL3治疗的小鼠在早期阶段具有由骨祖细胞吸收的大量矿物质，这表明这些内源性成骨细胞的激活正在被募集到骨折部位。与PBS治疗的对照中较明显的编织骨的形成相比，YLL3治疗的小鼠在第21天形成了矿化良好的层状组织。在骨折后第21天骨折愈合，这原本直到35至45天才能在小鼠中观察到，并且优于以50μg/kg使用的PTH的每日注射。这些骨折研究不包括整体骨强度的测量，但是通过微CT测量的骨矿物质密度的增加是确定骨强度的主要决定因素，这表明较高的骨强度可能源于YLL3治疗后较高的骨矿物质密度。

总之，使用筛选方法通过促细胞存活(pro-cell surviving)机制来鉴定骨祖细胞特异性靶向成骨肽。相同的“单实体三作用(one-entity tri-action)”筛选原理可用于筛选靶向其他特定信号的拮抗剂或激动剂药物。两种靶向骨祖细胞的肽YLL3和YLL8在体外增加了成骨细胞的分化和成熟，并在体内增加了成骨细胞的活性。使用肽-双膦酸盐缀合物还观察到改善的骨特异性，所述肽-双膦酸盐缀合物在较低的药物给药频率下维持合成代谢作用。成骨肽显示出骨生长特性，并且可以用作治疗骨质疏松症和/或加速骨折修复的治疗剂。

尽管出于清楚和理解的目的，已经通过举例说明和实例的方式详细地描述了前述内容，但是本领域技术人员将理解，可在所附权利要求书的范围内进行某些变化和修改。此外，本文中提供的每个参考文献通过引用整体并入，其程度如同每个参考文献单独通过引用并入。