头孢菌素C酰化酶突变体及其制备方法和应用
文献发布时间:2023-06-19 10:38:35
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是β-内酰胺类抗生素合成的主要前体,工业上主要以化学法和酶法合成为主。但由于化学合成法工艺复杂、污染严重、能量消耗高,近些年已被生物酶法所代替,生物酶法工艺简单、反应条件温和,制得的产品质量稳定。化学法工艺成熟,生物酶法相比于化学法有很大的上升空间。随着国家对于绿色环保的要求逐渐提升,生物酶法将有更加美好的未来前景。
目前生物酶法主要分为一步酶法和二步酶法。二步酶法涉及D-氨基酸氧化酶和戊二酰基转移酶分步催化,已有应用于工业上生产的报道。一步酶法则涉及利用头孢菌素C酰化酶对底物CPC直接进行催化产生7-ACA。相较于二步酶法,一步酶法具有工艺更加简单、设备要求低、生产成本低等优势。但是,相比于二步酶法的GL-7-ACA酰化酶,一步酶法的头孢菌素C酰化酶对CPC的催化效率很低,仅有催化GL-7-ACA的2%~4%。
中国专利CN 108220276A公开一种头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用,头孢菌素C酰化酶突变体能够催化头孢菌素C生成7-氨基头孢烷酸,所述头孢菌素C酰化酶突变体与野生型头孢菌素C酰化酶相比表现出更高的催化活性,酶活提高约8.6倍。通过引物A获取基因序列、重组表达蛋白、检测酶活和制备7-氨基头孢烷酸。
中国专利CN 110129305A公开一种用于制备7-ACA的头孢菌素C酰化酶突变体,头孢菌素C酰化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:4,相比假单胞菌GK16(Pseudomonas sp.GK16)来源的野生型GL-7-ACA酰化酶SEQ ID NO:1,酶活力提高了52倍,可用于一步酶法生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。
虽然上述两件专利提供的头孢菌素C酰化酶突变体的酶活力比野生型头孢菌素C酰化酶分别提高了8.6倍和52倍,但其酶活力仍然较低,工业化生产效率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种头孢菌素C酰化酶突变体,酶活力高、工业化生产效率高;本发明同时提供了头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法和应用。
本发明所述的头孢菌素C酰化酶突变体,其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列是通过对SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第245-247位氨基酸进行替换突变得到;其中,第245位酪氨酸突变为苯丙氨酸,第246位的精氨酸突变为蛋氨酸,第247位的亮氨酸突变为丝氨酸。
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的编码基因为SEQ ID NO:3所示的DNA序列。
SEQ ID NO:3所示的DNA序列是通过对SEQ ID NO:4所示的DNA序列的第215、232、239、250、252、268和327位碱基进行替换突变得到;其中,第215位腺嘌呤突变为胸腺嘧啶,第232位腺嘌呤突变为胸腺嘧啶,第239位鸟嘌呤突变为胞嘧啶,第250位胞嘧啶突变为鸟嘌呤,第252位胸腺嘧啶突变为腺嘌呤,第268位腺嘌呤突变为胸腺嘧啶,第327位鸟嘌呤突变为胞嘧啶。
本发明所述的头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法,包括如下步骤:
(1)将SEQ ID NO:4所示的DNA序列进行双点突变得到SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的编码基因;
(2)将编码基因克隆进质粒载体得到重组质粒;
(3)将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中得到重组菌;
(4)重组菌进行诱导发酵得到头孢菌素C酰化酶突变体。
步骤(1)中双点突变的步骤是以SEQ ID NO:4所示的DNA序列为模板,加入引物进行PCR扩增;
引物序列如下:
上游引物F1:GGGAATTCCATATGCT F2:GAGAGTTCTGCACCG,
下游引物R1:CCCGGAATTCTCATGG R2:CTTGAAGTTGAAGTTGAAGG,
其中,F1与R2含有20bp同源臂,F2与R1含有20bp同源臂。
PCR扩增体系如下:
PCR反应条件为98℃预变性3min;98℃变性10s,45℃退火5s,72℃延伸3min,30个循环;72℃延伸10min。
步骤(2)中质粒载体为PET-28a
步骤(4)中诱导发酵是加入IPTG进行诱导发酵。
本发明所述的头孢菌素C酰化酶突变体的应用是头孢菌素C酰化酶突变体用于制备7-氨基头孢烷酸。
本发明的有益效果如下:
为了克服一步酶法催化CPC催化效率低下的缺陷,得到具有更高酶活效率的CPC酰化酶,本发明通过点突变等基因工程技术对假单胞菌GK16来源的野生型GL-7-ACA酰化酶(SED ID NO:1)进行基因突变、筛选,制备更高酶活效率的头孢菌素C酰化酶突变体。
本发明的头孢菌素C酰化酶突变体相比于野生型GL-7-ACA酰化酶SED ID NO:1酶活力提高了210倍以上,可以应用于7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的一步酶法生产。
附图说明
图1是实施例1的真阳性转化子电泳验证图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
(1)以CPC酰化酶野生型基因SEQ ID NO:4为模板克隆目的基因,引物序列为:上游引物F1:GGGAATTCCATATGCT F2:GAGAGTTCTGCACCG下游引物R1:CCCGGAATTCTCATGG R2:CTTGAAGTTGAAGTTGAAGG,其中F1与R2含有20bp同源臂,F2与R1含有20bp同源臂,从而进行双点突变。
(2)PCR扩增体系如下:
PCR反应条件为98℃预变性3min;98℃变性10s,45℃退火5s,72℃延伸3min,30个循环;72℃延伸10min。
(3)后续采用纯化试剂盒对PCR产物进行纯化提纯,所获得的目的基因采用BamHⅠ和HinDⅢ内切酶进行双酶切,对于质粒载体PET-28a
设计重组质粒的引物序列为:F:CGAAATCTTTGTTGGTGGG R:ATGAAGGATACATAAACGGCTAC。
PCR扩增体系如下:
PCR反应条件为98℃预变性3min;98℃变性10s,45℃退火5s,72℃延伸3min,30个循环;72℃延伸10min。
将扩增产物进行核酸电泳验证,电泳结果见图1,证实挑取的单菌落为真阳性转化子。
(4)挑取上述经过验证的真阳性转化子的菌落至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中,37℃,200rpm,并加入0.1mM IPTG,促进目的蛋白表达,过夜摇菌至OD值为0.6-0.8,得到菌液;菌液4000rpm离心10min,弃上清,保留沉淀,置于-20℃冷冻1h,常温下化冻,加入200ul 0.9%生理盐水,用超声波细胞破碎机裂解菌体,37℃孵育1h,采用4000rpm离心10min获得头孢菌素C酰化酶突变体,留取20ul上清液进行CPC活力测定。
(5)将步骤(4)中获得的菌液用50ml缓冲液重悬,超声裂解,破碎后的菌体在4℃下,12000rpm,离心20min,收集上清液。上清液以1ml/min速率过镍柱,用30mM咪唑清洗镍柱,用300mM咪唑清洗杂蛋白,收集目的蛋白,至反应液不再变蓝为止,收集峰值洗脱液。所得洗脱液过10KD的超浓缩柱脱盐,除去酰化酶,得纯化酶。采用Protein Assay Kit试剂盒测定纯化酶的蛋白浓度,从而获得纯化酶的比活力。野生型CPC酰化酶(wtCPC)与各种CPC酰化酶突变体的酶活测定结果见表1。
表1野生型CPC酰化酶与各种CPC酰化酶突变体的酶活测定结果
由表1可知,通过对野生型CPC酰化酶上氨基酸进行替换,得到了相对比活提高了210.1倍的突变菌种ED4(实施例1制得的CPC酰化酶突变体)。
本发明成功构建了CPC酰化酶突变体,将野生型酰化酶的比活成功提高了210倍之多,用该种CPC酰化酶突变体生产7-ACA反应效率更快,具有广阔的工业化前景。
(6)底物反应液为含有2wt.%CPC钠盐的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0),
终止反应液:0.05M NaOH,20v/v%冰醋酸,
显色剂:含0.5wt%的PDAB甲醇溶液,
酶活力定义:每分钟催化CPC产生1uM7-ACA所需要的酶量定义为一个单位(U)。
将步骤(5)中的野生型CPC酰化酶与各种CPC酰化酶突变体各20ul加入底物反应液中,在37℃下过夜培养,加入200ul终止反应液,5000rpm离心10min,加入40ul显色剂,反应10min后,检测415nm吸光度下的7-ACA产率,结果见表2。
表2野生型CPC酰化酶与各种CPC酰化酶突变体的7-ACA产率测定结果
(7)培养基pH值对于头孢菌素C酰化酶分泌表达的影响
将步骤(4)中获得的菌液分别于pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的LB培养基中培养24h后,测定各自的完整细胞的头孢菌素C酰化酶活力,结果见表3。
表3头孢菌素C酰化酶活力测定结果
由表3可知,在pH值为8.0的培养基中培养时,其酶活力最大,表达量最高。
序列表
<110> 山东金城柯瑞化学有限公司
<120> 头孢菌素C酰化酶突变体及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> PRT
<213> Pseudomonas sp .GK16
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tggtccggcg tggtccggcg agcatgaatg gcgcggctgg attccgcacg aggcgatgcc 1500
gcgcgtcatc gatccgccgg gcggcctcat cgtcacggcg aacaaccgcg tcgtggccga 1560
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gactgcgcga tggtgccgat gctctatagc tgggacagga tcgccgcgga ggccgtgacc 2340
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- 一种头孢菌素C酰化酶突变体及其应用