用于分析血液样本的血小板的方法

技术领域

本发明涉及体外血液分析方法的领域，具体是用于分析血液样本中存在的血小板的方法的领域。更具体地，本发明所述的方法可用于在受试者中体外诊断外周性血小板减少症或中枢性血小板减少症。

背景技术

血小板是缺乏细胞核的血细胞，由骨髓中的巨核细胞分裂产生。它们通常以150000至400000个/μL的平均浓度存在于人类血液中，并在止血中发挥重要作用，止血是一种生物过程，其涵盖了预防和阻止出血的所有现象。

许多病症与血液中血小板数量的异常有关。这些可能是血液中血小板浓度增加(即血小板增多症)，或血液中血小板浓度降低(即血小板减少症)。

大多数血小板增多症是由严重的骨髓损伤(特别是骨髓增生综合征)引起的。检测这些类型的血小板增多症是必要的，以便能够采取适当的医学治疗。血小板和年轻血小板的百分比的初步分析是一个简单过程，可以很容易地指导探索步骤，所述探索步骤可包括骨髓活检分析，这是一个颇具侵入性的过程。

血小板减少症可分为两种类型：

-中枢性或原发性血小板减少症，其由巨核细胞形成在质量和/或数量方面的缺陷引起，并表现为血小板生成减少，从而导致血液中血小板浓度降低。中枢性血小板减少症可能有不同的原因，这些原因可能是源于基因或是后天性的，如维生素B12缺乏、某些癌症、骨髓发育不良、肝损伤或某些治疗，如化疗或放疗。在某些情况下，原因不明。一些疾病已知与中枢性血小板减少症有关，如巨大血小板综合征(Bernard-Soulier syndrome)或May-Hegglin异常(MYH9)。

-外周性血小板减少症的特点是循环型血小板计数减少，巨核细胞生成代偿性增加，因此血小板产量增加。外周性血小板减少症通常是由循环型血小板的破坏引起的，例如在某些药物(例如肝素、奎宁)的存在下，由自身抗体或与血小板结合的抗体的作用引起。因此，外周性血小板减少症的特点是年轻血小板(有时称为未成熟血小板)比例较高。自身免疫性起源的特发性血小板减少性紫癜(ITP)是外周性血小板减少症最常见的病因。外周性血小板减少症也可以通过患者的炎症状况来解释，该炎症状况可能导致循环型血小板的消耗或具有过敏性来源。

血小板减少症可导致出血，可见以下形式：瘀斑或紫癜、口鼻异常出血、月经过多，也可发生血肿。

血小板减少症的治疗取决于其病因。因此，必须能够区分中枢性血小板减少症和外周性血小板减少症。

通常通过称为“全血计数”或“CBC”或“血像”的血液检测，通过测量血液中血小板的数量来识别血小板减少症。如果血小板数量低于150×10

因此，测定血液中年轻血小板(即骨髓刚刚产生的血小板)的数量对于区分中枢性血小板减少症和外周性血小板减少症特别有意义。年轻血小板与其它循环型血小板的区别在于更高含量的大RNA(信使RNA和核糖体RNA)和稍大的体积。噻唑橙(TO)或其类似物(例如吖啶橙)是在与RNA结合后荧光发射增加1000倍的染料，用于通过流式细胞术鉴别年轻血小板。然而，使用TO及其类似物分析年轻血小板是棘手的，特别是在年轻血小板群通常只占总血小板的1％至2％的人类中。事实上，血小板中TO(或其类似物)的部分荧光对采用以细胞溶质RNA为靶标的Rnase的处理不敏感，这可以通过与线粒体核酸或存在于致密颗粒中的核苷酸结合后的荧光来解释。因此，用TO(或其类似物)标记血小板揭示了两个群体：第一个称为“TO

尽管有这一限制，迄今为止用于识别血小板减少症(即中枢性或外周性)病因的过程是以TO类似物的使用为基础来确定全血样本中年轻血小板的比例，称为“未成熟血小板分数”或“IPF”。例如，它可以是称为

因此，确实需要一种易于使用的方法，该方法可以省去噻唑橙(TO)或其类似物的一种(例如吖啶橙)的使用，以便能够以可靠和可重复的方式分析血液样本中存在的血小板，特别是用于外周性血小板减少症或中枢性血小板减少症的体外诊断。

发明内容

本发明人证明，血小板的质膜中的主要组织相容性复合体I类(MHC I)分子的表达水平的流式细胞术测量值与血小板年龄相关，较高的表达水平对应于“年轻血小板”。因此，本发明人开发了通过流式细胞术分析血液样本中血小板的方法，该方法使用与荧光色素偶联的抗MHC Iα链配体。该分析方法特别适合于区分外周性血小板减少症和中枢性血小板减少症。

本发明的第一个目的涉及用于分析血液样本中存在的血小板的方法，所述方法包括以下步骤：

a)向所述样本中添加与偶联至荧光色素的MHC I结合的配体；

b)用流式细胞术测量血小板的平均荧光强度(MFI

c)用所述流式细胞术测量平均前向散射(FSC)参数并确定MFI

本发明的第二个目的涉及用于识别血液样本中存在的血小板群的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过实施本发明所述的方法来分析血液样本中存在的血小板；以及

b)使用步骤a)的结果来识别血小板群。

本发明的第三个目的涉及在受试者中体外诊断外周性血小板减少症或中枢性血小板减少症的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过实施本发明所述的分析方法来分析存在于受试者的血液样本中的血小板，或者通过实施本发明所述的识别方法来识别存在于受试者的血液样本中的血小板群；以及

b)使用步骤a)的结果来诊断外周性血小板减少症或中枢性血小板减少症。

本发明的第四个目的涉及用于监测中枢性血小板减少症或外周性血小板减少症的治疗疗效的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过实施本发明所述的分析方法，来分析已经经历中枢性血小板减少症或外周性血小板减少症治疗的患者的血液样本中存在的血小板，或者通过实施本发明所述的识别方法，来识别已经经历中枢性血小板减少症或外周性血小板减少症治疗的患者的血液样本中存在的血小板群；

b)使用步骤a)的结果来确定外周性血小板减少症或中枢性血小板减少症的治疗疗效。

本发明的第五个目的涉及用于预测炎性疾病或心血管疾病的发展的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过实施本发明所述的分析方法来分析存在于受试者的血液样本中的血小板，或者通过实施本发明所述的识别方法来识别存在于受试者的血液样本中的血小板群；

b)使用步骤a)的结果来预测炎性疾病或心血管疾病的发展。

本发明的第六个目的涉及试剂盒，所述试剂盒用于实施本发明所述的用于诊断、用于监测治疗疗效或用于预测炎性疾病或心血管疾病的发展的方法，所述试剂盒包含：

-与偶联至荧光色素的MHC I结合的配体；

-内标物；以及

-说明书。

附图说明

图1.年轻小鼠血小板上的MHC I分子的表面表达较高。A)小鼠血小板上TO和MHC I表达的代表性FACS分析图。将血小板用PE或Alexa-647缀合的抗GPIbβ抗体和噻唑橙(TO)标记(左子图)。选择GPIbβ+血小板，通过用由Alexa-647缀合的山羊抗小鼠二抗所显示的抗β2m抗体或PE缀合的抗MHC I抗体进行共标记来分析MHC I表达(右子图)。TO

图2.血小板老化过程中体内MHC I分子的表面表达减少。分离来自用白喉毒素(DT)处理的iDTR PF4 cre小鼠的血小板，将其生物素化并输注至WT小鼠。输注后5min、24h、48h和72h，流式细胞术分析：A)MHC I表达、B)GPIbβ表达以及C)生物素化的输注的血小板(▲)和内源性TO

图3.对于噻唑橙，HLA I分子优先由高荧光人血小板表达。A)人血小板上TO和MHCI表达的代表性FACS图。用PE缀合的抗GPIb和TO对血小板进行标记(左子图)。选择GPIbβ+血小板，并用A647缀合的抗MHC I和PE-CY7缀合的抗β2m抗体进行染色来分析MHC I表达(右子图)。TO

图4.表达高密度MHC I分子的人血小板表现出年轻血小板的特征。人血小板上的核糖体蛋白表达、TO和MHC I分子表达的代表性FACS图。将人血小板固定、透化，用PE缀合的抗GPIb、mAb核糖体P蛋白抗体、A647缀合的抗MHC I、PE-CY7缀合的抗β2m抗体和TO进行共标记，然后用FACS分析。A)选择GPIbβ+血小板。通过以深灰色突出显示TO

图5.MHC I的细胞表面表达是用于确定患者中的年轻血小板比例的可靠标准。A)通过FACS分析检测健康献血者的血液样本的TO

具体实施方式

本申请人已经开发出了以准确和可重复的方式用于分析血液样本中血小板的方法。特别是，使用该方法使得能够在体外确定血小板减少症的起源(中枢性或外周性)。

定义

“血小板”是骨髓中通过巨核细胞的分裂而产生的血细胞。哺乳动物的血小板缺乏细胞核，而人类的血小板在被脾脏或肝脏中的巨噬细胞清除之前的寿命约为7到10天。血小板是初期止血的重要成分。在人类中，血小板具有2至4微米的直径，并且其在血液中的正常浓度为每升血液150至400×10

术语“年轻血小板”是指由骨髓新产生的血小板，即年龄小于24小时、例如小于12小时的血小板。

当血小板浓度低于每升血液150×10

当血小板浓度大于每升血液400×10

血小板减少症可分为两种类型：

-中枢性或原发性血小板减少症，其由巨核细胞形成在质量和/或数量方面的缺陷引起，并导致血小板生成减少(血液血小板浓度低于每升血液150×10

-外周性血小板减少症的特点是循环型血小板计数减少，巨核细胞生成代偿性增加，因此血小板产量增加。外周性血小板减少症通常是由血小板的破坏引起的，例如在某些药物(例如肝素、奎宁)的存在下，由自身抗体或与血小板结合的抗体的作用引起。因此，外周性血小板减少症的特点是年轻血小板(有时称为未成熟血小板)比例较高。自身免疫性起源的特发性血小板减少性紫癜(ITP)是外周性血小板减少症最常见的病因。外周性血小板减少症也可以通过患者的炎症状况来解释，该炎症状况可能导致循环型血小板的消耗或具有过敏性来源。

主要组织相容性复合体I类(MHC I)分子构成自我识别系统，并向T淋巴细胞提供多肽抗原。在人类中，MHC I被称为人白细胞抗原(HLA)I类。这些分子在几乎所有有核细胞和血小板的质膜上表达。它们由α链(包括3个免疫球蛋白样结构域：α1、α2和α3)和β2微球蛋白(β2m)的非共价缔合组成。在质膜上表达的MHC I总是与稳定MHC I的肽缔合。MHC I特别地参与抗原向CD8 T淋巴细胞的呈递，是的能够鉴别自身和非自身。

如本文所使用的，术语“血液样本”包括任何含有血小板的样本。例如，血液样本是从受试者的血液中获取的。优选地，它有利地是根据本领域技术人员的最佳实践在抗凝剂存在下采集的全血样本。抗凝剂可以是EDTA或柠檬酸盐。

本发明含义中的术语“配体”表示与靶标特异性结合的分子。例如，在本发明的上下文中，与MHC I结合的配体由此表示与MHC I特异性结合的配体。

在本发明的特定实施方式中，配体不能结合到未与α链缔合的β2m链，即不能结合到可溶性β2m链。

在本发明的另一特定实施方式中，配体能够结合到未与α链缔合的β2m链。在这一特定实施方式中，有利地使用足够高浓度的配体，使得在实施本发明所述的方法时，血液样本中存在的可溶性β2m链不干扰与MHC I的结合。

在本发明的特定实施方式中，配体能够结合至MHC I的所有同种型，即同种型A(HLAA)、同种型B(HLA B)和同种型C(HLA C)。

配体可以是抗体、抗体片段、适体、蛋白、肽或小分子。本领域技术人员可以容易地获得可在本发明上下文中使用的配体。例如，可以提及适体的Selex过程或抗体的免疫和克隆过程。在优选的实施方式中，配体是抗体或抗体片段。可在本发明中使用的几种抗体是商业上可获得的，例如由杂交瘤ATCC HB-95产生的抗体W6/32，例如可从Biolegend获得的已偶联至APC的抗体W6/32，或可从Biolegend获得的已偶联至荧光团PE/Cy7的抗人β2m抗体(品目号：316318)。

术语“抗体”以其最广泛含义在本文中使用并且包括具有所需抗原结合活性的各种抗体结构，特别是单克隆抗体。这些可以是人、人源化、嵌合或非人物种抗体，例如鼠抗体。

在本发明的上下文中，配体与允许在流式细胞术中对其进行检测的手段偶联，优选荧光色素(或荧光团)。术语“荧光色素”是指在激发后能够发射荧光的分子。由荧光色素发射的荧光强度(或MFI)可以通过任何已知方法来测量，例如使用能够检测和测量荧光色素的荧光强度的流式细胞术。

“流式细胞术”是一种广泛使用的技术，它允许颗粒或细胞在激光束中高速运动，对它们进行计数和表征。流式细胞术是一种特别有利的技术，因为它允许通过在激光束前使单个粒子、分子或细胞逐个通过来测量它们的荧光强度。

本发明含义中的“内标物”允许流式细胞术中测量的荧光强度(MFI)的归一化。在本发明的上下文中，内标物优选为结合到配体的成分。特别地，内标物是配体可以吸附到其上的聚苯乙烯微球。许多适合于不同类型配体的内标物是商业上可获得的，例如“BDCompbead No.552843”标准品，当配体是包括鼠抗体的kappa链的抗体时可使用该标准品。

在本发明的含义中，“受试者”是指哺乳动物，例如狗、猫、羊、牛或人，优选地，受试者是人。在本发明的含义中，“健康受试者”是指没有出现导致血小板计数异常的任何病症并且没有服用药物的受试者。

术语“诊断”以其最广泛含义在本文中使用，并且由本领域技术人员所常用和充分理解。例如，这一术语表示确定受试者患有病症的可能性、风险或可能性。

本发明含义中的术语“治疗(treatment/treat)”或“对治疗有反应”是指病症进程的改善、减弱、逆转或抑制。特别地，病症的治疗可能包括恢复骨髓的正常血小板生成。

用于分析血小板或识别血小板群的方法

本发明涉及用于分析血液样本中存在的血小板的方法，所述方法包括以下步骤：

a)向所述样本中添加与偶联至荧光色素的MHC I结合的配体；

b)用流式细胞术测量血小板的平均荧光强度(MFI

本发明涉及用于分析血液样本中存在的血小板的方法，所述方法包括以下步骤：

a)向所述样本中添加与偶联至荧光色素的MHC I结合的配体；

b)用流式细胞术测量血小板的平均荧光强度(MFI

c)用所述流式细胞术测量平均前向散射(FSC)参数并确定MFI

本申请人确实发现血小板表面上的MHC I表达水平与血小板年龄相关。因此，较年轻的血小板在其质膜上比较年长的血小板表达更多的MHC I。

特别地，本申请人发现归一化至FSC参数的血小板表面上的MHC I表达水平与它们的年龄相关。因此，较年轻的血小板在其质膜上的MHC I分子密度比较年长的血小板更高。

步骤a)

步骤a)包括向所述样本中添加与偶联至荧光色素的MHC I结合的配体。该步骤例如在摇动下通过将荧光色素偶联的配体添加到血液样本中来实施。摇动用于使混合物均匀化，以促进标记的配体和血小板之间的接触。

孵育时间应足以使标记的配体与血小板接触。通常，对于抗体，技术人员使用的孵育时间为20min至30min，但是可以根据所使用的配体而缩短，然后可小于5min，例如小于4min、小于3min、小于2min、小于1min、小于30秒。孵育时间也可以长于5min、长于10min、或者甚至长于15min。

本发明所述的分析方法特别容易实施，因为它可以使用全血样本来实施。然而，它并不限于使用特定的血液样本。例如，它可以是含有血小板的全血的任何部分，例如富含血小板的血浆(PRP)或从全血分离的血小板。优选地，血液样本是全血样本。

在特定的实施方式中，血液样本可包含除血液样本中天然存在的组分以外的组分，例如用于调节pH的缓冲液，或合适的抗凝剂，例如EDTA或柠檬酸盐。

在特定的实施方式中，配体可选自抗体、抗体片段、适体、蛋白、肽或小分子。合适的配体量可以很容易地由实验者确定。例如，如果配体是抗体，则其可在0.1μg/mL至10μg/mL的浓度范围内添加。在饱和条件下将配体添加到样本中以确保适当的血小板标记。

在特定的实施方式中，配体是抗体或抗体片段，例如由杂交瘤ATCC HB-95产生的W6/32抗体或保留其与MHC I结合能力的片段。它也可以是结合β2m的抗体，在这种情况下，应使用足够高浓度的抗体，以便使血液中存在的可溶性β2m不会干扰该方法的实施。

配体与允许用流式细胞术对其进行检测的手段偶联，优选荧光色素(或荧光团)。配体可直接地或间接地、优选直接地与荧光色素偶联。文献中广泛描述了将配体与荧光色素偶联的方法。因此，偶联不存在特别的技术困难。

该方法不限于特定的荧光色素，只要它可以用流式细胞术检测。有利地，荧光色素是其激发波长和发射波长不干扰用于检测RNA的试剂的荧光色素。荧光团的非限制性实例如下文和实施例中所引用：FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(R-藻红蛋白)、APC(别藻蓝蛋白)、PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白(peridinin chlorophyll protein))、PE-CF594、多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)-Cy5.5、PE-德克萨斯红(PE-Texas Red)、GFP(绿色荧光蛋白)、YFP(黄色荧光蛋白)或CFP(青色荧光蛋白)。

步骤b)

步骤b)包括用流式细胞术测量血小板的平均荧光强度(MFI

在步骤b)中进行的测量允许识别由标记的配体结合的血小板，并且允许识别一个或多个血小板群、特别是年轻血小板群。

步骤c)

步骤c)包括用所述流式细胞术测量平均前向散射(FSC)参数并确定MFI

在特定的实施方式中，将MFI

将MFI

在特定的实施方式中，内标物与荧光色素偶联的配体结合，例如荧光色素偶联的配体吸附在内标物上。因此，在这一特定的实施方式中，MFI

有利地，内标物是聚苯乙烯微珠，其上吸附有荧光色素偶联的配体。例如，它可以是涂覆有抗体的聚苯乙烯微珠，该抗体与所述荧光色素偶联的配体相结合。例如，当配体是包括鼠抗体的kappa链的抗体(例如，嵌合抗体)时，可以提及可使用的商业产品“BDCompbead No.552843”。

在优选的实施方式中，本发明的方法进一步包括步骤c)用所述流式细胞术测量平均FSC扩散参数(FSC)并确定MFI

本发明还涉及用于识别血液样本中存在的血小板群、优选年轻血小板群的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过实施本发明所述的方法来分析血液样本中存在的血小板；以及

b)使用步骤a)的结果来识别血小板群、优选年轻血小板群。

根据上述参数，通过流式细胞术自动地进行血小板群的识别。

诊断方法

本发明涉及用于在受试者中体外诊断外周性血小板减少症或中枢性血小板减少症的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过实施本发明所述的用于分析血小板的方法，来分析存在于受试者的血液样本中的血小板；以及

b)使用步骤a)的结果来诊断外周性血小板减少症或中枢性血小板减少症。

根据本发明通过分析血小板获得的结果允许在受试者中诊断外周性血小板减少症。特别地，相对于在健康受试者中测量的相同参数，通过所述受试者中的参数MFI

与在健康受试者中测量的相同参数相比，所考虑的受试者中上述参数的增加反映了所考虑的受试者中年轻血小板数量的增加，并证明了骨髓活性增加，因此允许诊断外周性血小板减少症。

在优选的实施方式中，上述参数中的一个或多个的增加量级大于1.5，例如大于2、大于2.5、大于3或大于3.5。

根据本发明通过分析血小板获得的结果允许在受试者中诊断中枢性血小板减少症。特别地，通过所述受试者中的参数MFI

在特定的实施方式中，所述受试者先前已被诊断为患有血小板减少症或可能患有血小板减少症。然后，根据本发明的诊断方法将使得能够知晓血小板减少症的起源(中枢性或外周性)。

用于监测治疗疗效的方法

本发明还涉及用于监测中枢性血小板减少症或外周性血小板减少症的治疗疗效的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过实施本发明所述的分析方法，来分析已经经历中枢性血小板减少症或外周性血小板减少症治疗的患者的血液样本中存在的血小板；

b)使用步骤a)的结果来确定中枢性血小板减少症或外周性血小板减少症的治疗疗效。

预后方法

本发明还涉及用于预测炎性疾病或心血管疾病的发展的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过实施本发明所述的分析方法来分析受试者的血液样本中存在的血小板；

b)使用步骤a)的结果来预测炎性疾病或心血管疾病的发展。

在特定的实施方式中，炎性疾病为败血症。在另一特定的实施方式中，心血管疾病是动脉粥样硬化。

本发明还涉及用于在受试者中诊断外周性血小板减少症或中枢性血小板减少症、用于监测治疗疗效或用于预测炎性疾病或心血管疾病的发展的试剂盒，所述试剂盒包含：

-与偶联至荧光色素的MHC I结合的配体；

-内标物；以及

-用于实施本发明所述的体外诊断方法的说明书。

本发明还涉及用于在受试者中治疗外周性血小板减少症或中枢性血小板减少症的方法，所述方法包括：

-实施本发明所述的体外诊断方法；以及

-当诊断为阳性时，开始对受试者进行适当的治疗。

参考文献[8]中特别描述了适当的治疗，通过引用将其并入本申请，特别是第18页和第19页的“一线疗法”、“二线疗法”、“三线疗法”、“其它新制剂”和表2部分。

实施例

试剂

试剂是商业上可获得的。噻唑橙(TO)来自Sigma-Aldrich。甲苯噻嗪

抗体与流式细胞术

在我们的实验室中，制备了针对血小板糖蛋白GPIbβ胞外结构域(Ram1，[7])的大鼠单克隆抗体，并将其与Alexa647或488偶联。与别藻蓝蛋白(APC)偶联的抗HLAI小鼠抗体(克隆W6/32)(品目号：311410)、与PE-CY7偶联的人抗β2m(品目号：316318)和与APC-cy7(克隆2D1)偶联的人抗CD45(品目号：368516)来自Biolegend。与藻红蛋白(PE)偶联的小鼠抗H2(克隆M1/42)(品目号：125506)和与APC-CY7偶联的链霉亲和素(品目号：405208)购自Biolegend。小鼠(克隆S19.8)抗b2微球蛋白抗体(β2m)(品目号：555299)来自BDPharmingen。与PE-cy7(克隆30-F11)偶联的小鼠抗CD45抗体(品目号：25-0451)由Invitrogen提供。人抗核糖体P蛋白抗体由中国台湾阳明大学孙教授友情提供[1]。

将全血稀释于10倍体积的含有1％BSA和6mM EDTA的PBS中。在用一种或多种抗体标记之前，用1/200稀释的“FcR阻断”试剂(Milteny Biotec)阻断Fcy受体。在洗涤步骤后，将细胞在PBS中用1μg/ml TO反向标记15min。然后在45分钟内将样本在20倍体积的1％多聚甲醛中稀释，并通过流式细胞术(LSR Fortessa

小鼠

在购自查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)的8-10周龄的C57Bl6/J小鼠上进行实验。如前所述[2]，生产对白喉毒素受体转基因和PF4均呈阳性的小鼠(在本文中以PF4-cre/iDTR命名)。

血小板输注

通过注射白喉毒素(DT)(100ng/天，i.p.)4天，使PF4-cre/iDTR小鼠出现严重血小板减少。最后一次注射后8天，用柠檬酸盐(3.8％)作为抗凝剂，从麻醉小鼠的腹主动脉采血，并如前所述分离血小板[3]。将洗涤的交联血小板生物素化，以1.2·10

道德声明

人血液样本获得自通过Etablissement

统计分析

使用GraphPad软件(Prism 5.02)进行统计分析。

年轻小鼠血小板在其表面上表达更多的MHC I分子

首先，我们分析了小鼠血小板表面上的I类分子的表达是否依赖于它们的年龄。在小鼠中，噻唑橙(TO)标记使两个血小板群易于鉴别，其中约10％显示出强TO荧光(TO

总的来说，这些数据表明，在稳态条件下，年轻小鼠血小板在其表面上表达更多的MHC I分子。

随着血小板的老化，体内I类分子的表面表达减少

然后，我们确定了血小板上的MHC I的表面表达是否受其体内老化的影响。我们利用iDTR PF4 cre小鼠以获得年轻的同期血小板群[2]。每天给予白喉毒素(DT)4天，诱导成熟巨核细胞消融，阻止血小板生成并导致进行性血小板减少症。停止治疗后4天(第8天)，巨核细胞生成和血小板生成显著改善，导致绝大多数年轻血小板短暂存在(数据未显示和[2])。因此，在第8天从经DT处理的iDTR PF4 cre小鼠分离血小板，对其进行生物素化并输注到WT小鼠。通过流式细胞术在输注后不同时间对生物素化的输注的血小板上的MHC I表达进行分析，并与内源性血小板MHC I表达进行比较。结果表明，输注后5min，生物素化的血小板的(TO平均荧光)/(平均FSC)比率较高，与内源性TO

总的来说，这些数据突出了MHC I表达参数在鉴别年龄小于24h的年轻血小板方面的相关性。

TO

在人类中，TO

为了分析独立于血小板尺寸的血小板群中HLA I分子的分布，我们使用了与小鼠血小板相同的方法，即HLA I MFI/FSC参数的比率(图3B)。再次，我们发现TO

强烈表达HLA I分子的人血小板具有较高的核糖体蛋白含量，这是年轻血小板的特征

核糖体P蛋白抗原存在于3个核糖体亚基(RLP0、2和3)的C端部分，这是mRNA翻译所必需的[5]。由于mRNA翻译主要发生在血小板生命的最初几个小时[2]，因此有望至少在TO

在通过流式细胞术分析之前，对人血小板进行固定、透化，并用针对核糖体P蛋白抗原的抗体、抗β2m抗体、泛抗HLA I抗体、W6/32和TO共标记(图4A)。

用针对核糖体P蛋白的抗体标记显示，13.3±％(n＝4)的人血小板表达该蛋白，而在TO

血小板上HLA I分子的表达水平可用作评价患者中的年轻血小板比例的标准

为了研究这些观察结果在临床应用中的相关性，我们评估了来自健康献血者或患有与循环中年轻血小板比例增加相关的病症的患者的人血小板表面上的HLA I分子的表达。我们首先比较了健康志愿者中“HLA I

最后，我们分析了两名患有肌球蛋白9缺陷的患者的血小板表面上的HLA I分子表达，其

在通过流式细胞术分析之前，用针对β2m的抗体、泛抗HLA I抗体、W6/32和TO对每个患者的柠檬酸化的血液进行共标记。值得注意的是，尽管与健康志愿者相比，两名患者(P1和P2)的TO/FSC比率均更高，与对照相比，只有一名患者(P1)的β2m/FSC和W6/32/FSC比率较高(图5B)。考虑到TO不仅能与RNA结合而且能与颗粒物结合的事实，在TO标记前进行RNaseA处理。流式细胞术分析显示，RNaseA处理显著降低了患者1的TO

由于已知IPF的估计可能会因血小板活化而产生偏差，特别是由于聚集物的存在[6]，我们已经验证了HLA I分子的表面表达是否可以作为评估年轻血小板比例的更可靠标准。

因此，在通过流式细胞术或

这些数据表明，对于检测年轻血小板比例高的患者样本，HLA I分子的表达水平比TO标记或

对FSC(FSC-A)归一化的兴趣

a)使用本发明所述的方法分析来自7名健康献血者和1名患有巨大血小板综合征的患者的血液样本，任选地计算与FSC的比率(即，进行和不进行FSC归一化)。结果示于图6中。

对于未进行归一化而获得的结果，BSS患者可能患有外周性血小板减少症。事实上，未归一化的数据似乎表明BSS患者的血小板在其表面上表达了更多的HLA I分子。因此，这个患者将比健康献血者有更多的年轻血小板。

与FSC的比率的计算表明BSS患者血小板在其表面上并未表达更多的HLA I分子。因此，BSS患者的年轻血小板并不比健康献血者多。因此，归一化避免了假阳性。

b)使用本发明所述的方法分析来自21名健康献血者、1名患有骨髓纤维化(MF)的患者、2名患有May-Hegglin异常(MYH9)的患者和2名患有血栓性血小板减少性紫癜(ITP)的患者的血液样本，任选地计算与FSC的比率(即，进行和不进行FSC归一化)。结果示于图7中。

如果不考虑血小板的尺寸，所有患者都会被怀疑有更多的年轻血小板，因此会被标记为“外周性血小板减少症”。这一发现与MF和ITP(增强的骨髓活性)患者的病症一致，然而MYH9患者可能没有增强的骨髓活性。

与血小板尺寸的比率表明，MYH9 2患者实际上是假阳性，没有比健康献血者更多的年轻血小板。

讨论

结果表明，在流式细胞术中测量与血小板尺寸有关的MHC I表达水平对于血小板分析、特别是对于识别年轻血小板是有用的。确实显示年轻血小板在其表面上表达更多的MHC I，这种水平随着血小板年龄的增长而降低。所有这些结果都强调了MHC I/FSC比率在评估受试者中的年轻血小板比例方面的重要性。

迄今为止，临床医生通常用TO来对RNA标记进行可视化以分析样本中存在的年轻血小板(TO

此外，MHC I表达的测量避免了另一个缺点，即所分析的样本中存在聚集物会在

通过测量参数MFI

当本发明人通过测定(MFI

在本申请中作为“[参考号]”引用的参考文献：

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